Аналіз структурно-метаболічної адаптації м’язової тканини до поєднаної дії переривчастої гіпоксії та напруженої м’язової діяльності

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

УДК 612.3:612.33:612.814:577.91

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Автореферат

Особливості структурно-метаболічної адаптації м'язової тканини до поєднаної дії переривчастої гіпоксії та напруженої м'язової діяльності

Гавенаускас Броніслав Леонардасович

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис Роботу виконано у відділі з вивчення гіпоксичних станів Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук Маньковська Ірина Микитівна, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу з вивчення гіпоксичних станів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Радзієвська Марія Петрівна, Київський міський педагогічний університет ім. Б.Д. Гринченка, професор кафедри теорії і методики фізичного виховання кандидат біологічних наук Вавілова Галина Леонідівна Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, старший науковий співробітник відділу фізіології кровообігу

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка

Захист відбудеться „30” травня 2006 р. О 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 198. 01 при Інституті фізіології
ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий „30” квітня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Віддруковано з готових позитивів у друкарні ДУС. 01008, м. Київ-8, вул. Шовковична, 4-а. Об'єм 1,40 ум. др. арк. Зам. 361. Тираж 100. 2006 р.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Встановлено, що у процесі адаптації до напруженої м'язової діяльності зростає та розширюється діапазон можливостей функціональної системи дихання (ФСД) людини і тварин щодо адекватного забезпечення киснем значних метаболічних потреб м'язової тканини при інтенсивних фізичних навантаженнях і компенсації локальної гіпоксії м'язів, яка служить за цих умов тригерним механізмом розвитку гіперметаболічної гіпоксії, або гіпоксії навантаження (ГН) (Колчинская А.З. и др., 2003). Головною особливістю адаптаційних механізмів при ГН є перерозподіл енергетичних, метаболічних і структурних ресурсів організму на користь тієї тканини, де відбуваються адаптаційні перебудови, а саме - тканини скелетних м'язів. Як відомо, м'язовій тканині притаманний високий ступінь пластичності, що дозволяє їй адаптуватися до різних стимулів: скорочувальної активності (м'язові навантаження, електрична стимуляція), факторів навколишнього середовища (гіпоксія, гіпероксія, гравітація, невагомість), доставки поживних речовин тощо. Формування повноцінної адаптації м'язової тканини до регулярної фізичної діяльності, скорочення термінів досягнення такої адаптації при збереженні її ефективності - задачі, що стоять нині не тільки в практиці підготовки спортсменів високого класу, але й при розробці методів поліпшення життєдіяльності людини в сучасних гіподинамічних умовах, оптимізації ії професійної діяльності, пов'язаної з виконанням важких фізичних навантажень, реабілітації хворих з нейром'язовими захворюваннями.

Існує низка доказів того, що вищезазначена мета досягається успішніше при одночасній адаптації людини до двох типів гіпоксії - ГН і гіпоксичної гіпоксії (Баканычев А.В. 1996; Волков Н.И., 2000; Филиппов М. М., 1987; Burelle Y., 2002).

В останні роки з'явилися експериментальні та теоретичні (за допомогою інформаційних технологій) підтвердження того, що вплив гіпоксичної гіпоксії може модулювати та потенціювати метаболічні і структурні перебудови безпосередньо в м'язовій тканині при адаптації до ГН (Hoppeler H. et al., 2001; Lyabakh K. et al., 2002). Водночас було показано, що постійно діюча гіпоксична гіпоксія, наприклад в умовах високогір'я, може негативно впливати на ультраструктуру скелетних м'язів (Hoppeler H. et al., 2003). Виникла практична необхідність відділити вплив ГН від постійної дії гіпоксичної гіпоксії.

Для того, щоб досягти дисоціації гіпоксичних стимулів, були розроблені різні схеми фізичних тренувань з використанням переривчастої гіпо- і нормобаричної гіпоксії за принципами “living high - training low” або “living low - training high” (Rodriguez F.A. et al., 2003). Останнім часом у спортивній практиці успішно застосовується один з варіантів переривчастої (intermittent) гіпоксії - метод інтервального гіпоксичного тренування (ІГТ), який характеризується використанням періодичних (короткочасних) дій нормобаричної гіпоксичної гіпоксії, що чергуються з нормоксичними інтервалами приблизно такої ж тривалості, що і самі дії (Колчинская А.З. и др., 2003).

Позитивний вплив ІГТ на ФСД і кисневі режими організму при фізичних тренуваннях було показано в багатьох працях (Волков Н.И., 2000; Радзієвський П.О., 2005; Шахлина Л.Г., 1999). Проте зміни в системі транспорту кисню в м'язах і глибокі перебудови в мітохондріальному апараті м'язових клітин при поєднанні ГН, яка виникає при напруженій м'язовій діяльності, з ІГТ залишаються практично невивченими.

Установлено, що збільшення споживання кисню й активація специфічних метаболічних шляхів у м'язових клітинах під час напруженого фізичного навантаження призводить до підвищеного утворення вільних радикалів (або активних форм кисню - АФК) (Schneider G. et al., 2004), що є однією з форм оксидативного стресу. При довготривалій експозиції такого стресу (фізичному тренуванні) показано розвиток адаптаційних механізмів, які обмежують збільшення продукції АФК у м'язовій тканині (Oliveira A.R., et al. 2003; Powers S.K. et al., 1999). Останнім часом отримано дані про активацію ендогенних захисних систем (зокрема антиоксидантних) при дії переривчастої гіпоксичної гіпоксії (Архипенко Ю.В. и др., 2005; Сутковой Д.А., 2005). Проте вивчення прооксидантно-антиоксидантного стану м'язової тканини при адаптації до напруженої м'язової діяльності на фоні впливу переривчастої гіпоксії не було до цього часу самостійним завданням досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом наукової тематики відділу з вивчення гіпоксичних станів на 2001-2004 рр.: „Роль перебудови структурно-функціональних взаємовідношень у газотранспортних системах організму в розвитку гіпоксичних станів при екзо- та ендогенних впливах” (державний реєстраційний номер 0101U002634).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було дослідження метаболічних і структурних перебудов у скелетних м'язах при адаптації щурів до поєднаної дії переривчастої гіпоксичної гіпоксії і напруженої м'язової діяльності.

На моделі поєднання інтервального гіпоксичного тренування з фізичним тренуванням щурів на витривалість було визначено наступні завдання:

1. Дослідити зв'язок інтегральних показників тренованості й аеробної продуктивності організму (фізична витривалість, максимальне споживання кисню) з показниками транспорту й утилізації кисню в м'язах при дії ГН і ІГТ.

2. Дослідити зміни метаболічних показників розвитку гіпоксії м'язів при напруженій м'язовій діяльності (вміст лактату та пірувату, співвідношення лактат/піруват і НАД/НАДН, рН крові і м'язів) в процесі адаптації тварин до ГН і переривчастої гіпоксії.

3. Вивчити показники АДФ-стимульованого дихання мітохондрій при використанні різних субстратів окиснення та інгібіторів різних шляхів окиснення в скелетному м'язі щурів при дії ГН і ІГТ.

4. Виявити зміни структурних показників капілярного русла м'язів і мітохондріального апарату міоцитів, використовуючи морфометричний і стереометричний аналіз, а також ультраструктурні особливості м'язової тканини щурів при дії ГН і ІГТ.

5. Дослідити зміни прооксидантно-антиоксидантного статусу м'язової тканини щурів (інтенсивність процесу перекисного окиснення ліпідів, активність антиоксидантних ферментів) при поєднаній дії ГН і ІГТ.

Об'єкт дослідження: тканина литкового м'яза, кров, ізольовані мітохондрії м'язів.

Предмет дослідження: вплив напруженої м'язової діяльності та переривчастої нормобаричної гіпоксичної гіпоксії на процеси транспорту й утилізації кисню в м'язовій тканині, прооксидантно-антиоксидантний статус скелетного м'яза щурів.

Методи дослідження: біохімічні, фізико-хімічні (полярографічний, потенціометричний, спектрофотометричний), морфологічний з ультраструктурним аналізом і статистичний.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше показано, що при адаптації до поєднаної дії переривчастої гіпоксичної гіпоксії і ГН субкомпенсованого ступеня найбільше зростання інтегральних функціональних показників (фізична працездатність і максимальне споживання кисню) супроводжується найбільшим (у порівнянні з дією ГН і ІГТ окремо) підвищенням середньотканинного напруження кисню в скелетному м'язі (РmO2) у спокої та капіляризації м'язової тканини за даними зростання щільності капілярів.

Уперше встановлено, що саме після адаптації до поєднаної дії ГН субкомпенсованого ступеня і переривчастої гіпоксії відмічаються найменші прояви тканинної гіпоксії у скелетних м'язах (за показниками РmO2, метаболічними показниками співвідношень лактат/піруват і НАД/НАДН, рН крові та м'яза) при подальших гострих гіпоксичних впливах.

Уперше зафіксовано вірогідне збільшення чисельності інтерміофібрилярної популяції мітохондрій (ІМФМХ), паралельно з субсарколемальною популяцією (ССМХ), а також збільшення лінійних розмірів мітохондрій і суми поверхонь ССМХ і ІМФМХ в одиниці об'єму волокна зі збереженням структурної цілісності мітохондрій при адаптації м'язової тканини до поєднаної дії ГН і переривчастої гіпоксії.

Уперше зареєстровано, що саме адаптація до двох типів гіпоксії (ГН і переривчастої гіпоксичної гіпоксії) супроводжується найбільшим підвищенням ефективності та економічності роботи дихального ланцюга мітохондрій скелетного м'яза зі збільшенням ролі НАДН-оксидазного шляху окиснення в енергозабезпеченні м'язів, а також стимуляцією утворення б-кетоглутарату в амінотрансферазних реакціях.

Довгострокова поєднана дія ГН і переривчастої гіпоксичної гіпоксії створює передумови для гальмування процесів перекисного окиснення ліпідів у м'язовій тканині при гострих гіпоксичних впливах внаслідок значного збільшення потужності ферментативної ланки антиоксидантної системи захисту (зростання активності супероксиддисмутази та каталази).

Установлено, що формування адаптивних реакцій організму та м'язової тканини відбувається більш ефективно у тому випадку, коли ІГТ застосовується в останні 2 тиж 4-тижневого курсу фізичного тренування щурів з розвитком ГН субкомпенсованого ступеня.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень дозволили визначити характер і особливості функціональних, структурних і метаболічних перебудов в організмі та м'язовій тканині при адаптації до переривчастої гіпоксичної гіпоксії, при тривалій дії напруженої м'язової діяльності з розвитком гіпоксії навантаження компенсованого та субкомпенсованого ступеня, а також при адаптації до поєднаної дії ГН і переривчастої гіпоксії. Це дозволяє внести істотні доповнення в існуючі уявлення про розвиток адаптивних механізмів (особливо на тканинному та клітинному рівні) при використанні ІГТ для підвищення ефективності фізичних тренувань аеробної спрямованості.

Використаний метод застосування переривчастої гіпоксії істотно скорочує терміни досягнення адаптації скелетних м'язів до гіпоксії навантаження. Результати проведеної роботи можуть бути впроваджені в спортивній практиці, медицині праці і клініці м'язових захворювань для більш повного обґрунтування застосування методу ІГТ з метою позитивної дії на кисневі режими м'язової тканини та підвищення функціональних можливостей механізмів компенсації гіпоксії м'язів.

Отримані результати можуть бути використані у навчальному процесі при викладанні фізіології людини і тварин, нормальної і патологічної фізіології для студентів біологічних і медичних навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Формулювання мети й основних завдань роботи за участю наукового керівника, самостійний аналіз стану проблеми на основі здійсненого патентно-інформаційного пошуку, підбір і оволодіння методами дослідження, виконання експериментальної частини дисертації, статистична обробка отриманих результатів, їх трактування й узагальнення. Окремі дослідження були виконані за участю співавторів публікацій, які були співвиконавцями розділів науково-дослідних тем.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації докладалися і обговорювалися на: Конференції, присвяченій 55-річчю наукової діяльності Колчинської А.З. “Автоматизований аналіз гіпоксичних станів” (Росія, Нальчик, 2003); - YI World Congress on Mountain Medicine & High Altitude Physiology (Xining, Qinghai and Lhasa, Tibet P.R. China, 2004); IV Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, 2004); ІV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004); II Російському конгресі з патофізіології (Москва, 2004); Конференції „Гіпоксія: механізми, адаптація, корекція” (Москва, 2005); 4th Conference on Mitochondrial Physiology (Schrоcken, Vorarlberg, Austria, 2005); Міжнародній конференції “Гіпоксія, автоматизований аналіз гіпоксичних станів” (Нальчик, 2005); II Міжнародній науковій конференції „Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка” (Одеса, 2005); Засідання сектора вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (Київ, 2005).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведено на 215 статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар масою 200-220 г. Тренування із застосуванням інтервальної нормобаричної гіпоксії проводили згідно з рекомендаціями Колчинської А.З. зі співавт. (2003). Тварин поміщали в герметичну проточну камеру, в яку пропускали гіпоксичну суміш, що містить 12% О2 в азоті. Як поглинач СО2 використовували натронне вапно. ІГТ проводили протягом 2-тижневого курсу, який складався з 14 сеансів, кожний по 5 циклів: 15-хвилинне дихання гіпоксичною сумішшю чергували з 15-хвилинними
нормоксичними інтервалами. Моделювання ГН здійснювали плаванням тварин при температурі води 30-32 °С протягом 30 хв щодня. Фізичні тренування проводили в один день з ІГТ, проте через 3-4 год після проведення останнього. Ступінь ГН визначали за показниками PO2 і pH крові, а також за рівнем споживання кисню у відсотках від максимального споживання кисню (МСК) (Филиппов М.М., 1983). Тварини методом випадкового вибору були поділені на 6 груп: 1-ша - контроль (нетреновані щури); 2-га - 4-тижневий курс плавання без вантажу з розвитком ГН компенсованого ступеня (швидкість споживання кисню була 35-45% від МСК); 3-тя - 4-тижневий курс плавання з вантажем (7,0±3,0% від маси тіла) з розвитком ГН субкомпенсованого ступеня (швидкість споживання кисню була 70-75% від МСК); 4-та - 2-тижневий курс ІГТ; 5-та - 4-тижневий курс плавання з вантажем, у перші 2 тиж додавали ІГТ; 6-та - 4-тижневий курс плавання з вантажем, в останні 2 тиж додавали ІГТ. Курсу фізичних тренувань передував 7-добовий період звикання тварин до умов експерименту, протягом якого поступово збільшували тривалість плавання. До і після тренувань використовували наступні функціональні тести: на стандартне фізичне навантаження (СН) - плавання з подвійним вантажем (14,0 ± 6,0% від маси тіла) протягом 10 хв; на фізичну витривалість (ФВ) - термін плавання з подвійним вантажем до знемоги. Визначення швидкості споживання кисню (VO2) у щурів у стані спокою проводили загальноприйнятим манометричним методом (Калабухов Н.И., 1940). Для визначення МСК нами було розроблено конструкцію герметичної камери з вмонтованим манометричним датчиком і кріпленням для контейнерів з поглиначем СО2 натронним вапном. Камеру поміщали в резервуар з водою, в якому тварина могла виконувати фізичне навантаження в закритому просторі із заданим об'ємом повітря. МСК визначали при поступовому підвищенні навантаження згідно з принципами, викладеними у праці Brooks G. A. et al. (1978). Реєстрацію напруження кисню у литковому м'язі PmО2 проводили полярографічним методом за допомогою відкритого платинового електрода (Березовский В.А., 1975); pH артеріалізованої крові визначали, використовуючи мікробіоаналізатор „Radelkis” (Угорщина), pH скелетного м'яза вимірювали за методом Hermansen L. et al. (1972).

Декапітацію тварин проводили під легким ефірним наркозом з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції захисту тварин (Страсбург, 1985). Гомогенати тканини глибокої частини медіальної голівки литкового м'яза готували на 0,025 М тріс- НСІ-буфері , що містив 0,175 М КСІ (рН 7,4; 1: 9). Активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) вивчали згідно з методом Єщенко Н.Д. зі співавт. (1982). Вміст лактату та пірувату у гомогенаті литкового м'яза визначали за методами Noll F. (1974) і Бабаскіна П.П. (1976) відповідно. Співвідношення НАД/НАДН розраховували за методом Green H. зі співавт. (1995). Вивчали вміст вторинних продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-АП) (Стальная, Т.Г. и др., 1977). Стан антиоксидантної системи (АОС) оцінювали за активністю ферментів: супероксиддисмутази (СОД), каталази (КАТ). Активність СОД вивчали за методом Misra H. зі співавт. (1972), який ґрунтується на здатності СОД гальмувати реакцію аутоокиснення адреналіну при рН 10,2. Активність каталази вивчали за методом Королюк М.А. зі співавт. (1988). Концентрацію білка визначали за методом Lowry O. зі співавт. (1951). Вивчення процесу АДФ - стимульованого дихання мітохондрій (МХ) тканини литкового м'яза, що були виділені відповідно до процедури Cogswell A. M. зі співавт. (1993), проводили полярографічним методом (Кондрашова М.Н., 1973) на полярографі LP-60 (Чехословаччина). Середовище виділення містило (у ммоль/л): КCl - 100; EGTA - 5; MgSO4 - 5; тріс-HCl - 50; pH 7,4. Середовище інкубації містило (у ммоль/л): KCl - 50; KH2PO4 - 10; тріс-HCl - 25; сахарози - 250; pH 7,4. Як субстрати окиснення використовували: сукцинат натрію - СК (1 ммоль/л), б-кетоглутарат натрію - КГЛ (1 ммоль/л), глутамат натрію (3 ммоль/л), піруват натрію (3 ммоль/л). Як інгібітор СДГ застосовували малонат (2 ммоль/л). Концентрація АДФ становила 300 мкмоль/л. За отриманими хроноамперометричними кривими розраховували наступні показники: швидкість дихання МХ у стані відносного спокою (V2), швидкість фосфорилюючого (у метаболічному стані V3) та контрольованого (у метаболічному стані V4) дихання МХ, дихальний контроль за Чансом (V3/V4) (Chance B., Williams G., 1956), коефіцієнт ефективності фосфорилювання АДФ/О (Estabrook. R. W., 1967). Ультраструктуру тканини литкового м'яза досліджували електронно-мікроскопічним методом за допомогою електронного мікроскопа JEM-100 СX (Японія). Препарати для мікроскопії готували за загальноприйнятою методикою (Карупу В.Я., 1984). Вивчення морфофункціонального стану м'язової тканини проводили, оцінюючи її ультраструктуру та згідно зі стереометричними і морфометричними методами (Weibel E.R., 1979). Оцінювали кількість (n) субсарколемальних (СС) та інтерміофібрилярних (ІМФ) мітохондрій на одиницю площі, відсоток структурно змінених МХ в обох популяціях органел, діаметр (d) ССМХ та ІМФМХ, суму поверхонь ССМХ та ІМФМХ в одиниці об'єму (Sitot), кількість капілярів (nc) на одиницю площі. Результати досліджень обробляли статистично, використовуючи критерій t Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження інтегральних показників тренованості й аеробної продуктивності організму (фізична витривалість, МСК) і показників транспорту й утилізації кисню в м'язах при дії гіпоксії навантаження і ІГТ

Рис. 1 - Фізична витривалість щурів (А), максимальне споживання кисню (Б), напруження кисню у литковому м'язі (В) та щільність капілярів у литковому м'язі (Г) при різних режимах поєднання гіпоксії навантаження (ГН) упродовж 4 тиж з інтервальним гіпоксичним тренуванням (ІГТ) протягом 2 тиж (М±m; n=10)

1 - контроль; 2 - ГН компенсованого ступеня; 3 - ГН субкомпенсованого ступеня; 4 - IГТ; 5 - ГН субкомпенсованого ступеня з додаванням ІГТ у перші 2 тиж, 6 - 4-тижневий курс ГН субкомпенсованого ступеня з додаванням ІГТ в останні 2 тиж; * вірогідно порівняно з контролем (p<0,05); ** вірогідно порівняно зі значеннями до та після стандартного навантаження (p<0,05); a - контроль; b - до стандартного навантаження; c - після стандартного навантаження.

Показано, що фізична витривалість для контрольних тварин становила (10,0 ± 2,0) хв, МСК - (7,15 ± 0,3) мл·хв-1·100 г-1, рівень PmО2 - (23,5 ± 2,1) мм рт.ст., а після застосування СН цей показник знижувався на 30% щодо вихідного значення (рис. 1, А, Б, В).

Після курсу тренування до ГН компенсованого ступеня за допомогою плавання без вантажу (2-га група) ФВ і МСК вірогідно не змінювалися, PmО2 мало тенденцію до підвищення. Після проведення СН у тварин цієї групи PmО2 було аналогічним зареєстрованому у щурів 1-ї групи. У тварин 3-ї групи, які пройшли курс тренування до ГН субкомпенсованого ступеня, ФВ збільшувалася вдвічі; PmО2 і МСК (8,52 ± 0,2) мл·хв-1·100 г-1 теж вірогідно зростали щодо результатів, отриманих у 1-й і 2-й групах. PmО2 зменшувало у відповідь на СН, але не так помітно, як у тварин 2-ї групи. У тварин 4-ї групи, які проходили курс ІГТ, ФВ становила (32,0 ± 1,5) хв, тобто спостерігали підвищення більше, ніж утричі порівняно з ФВ у контрольній групі. Водночас СК мало лише тенденцію до підвищення щодо контролю: (7,98 ± 0,4) мл·хв-1·100 г-1 (р > 0,05). Рівень PmО2 підвищувався на 46% у порівнянні з контрольними значеннями. Зниження рівня PmО2 у відповідь на СН було значно меншим, ніж у тварин 1-3-ї груп. 4-тижневе тренування тварин з використанням у перші 2 тиж ІГТ (5-та група) призводило до вірогідно вищої ФВ у порівнянні зі значеннями у щурів 4-ї групи, МСК порівняно як з контролем, так і з результатами, отриманими у тварин попередніх 3-х груп, істотно збільшувалося - (9,48 ± 0,3) мл·хв-1·100 г-1 (р < 0,05). Слід відмітити, що після СН рівень PmО2 зменшувався лише на 10%. Однак саме застосування ІГТ в останні 2 тиж 4-тижневого курсу фізичних тренувань (6-та група) було найбільш ефективне: так, ФВ для цієї групи була на 60 % більшою від такої для щурів 5-ї групи і у 8 разів вищою, ніж у контролі. Рівень PmО2 сягав ще більшого зростання (у порівнянні навіть із результатами 5-ї групи) і суттєво не змінювався після СН.

Слід відмітити, що тільки у тварин 6-ї групи відбувається зниження швидкості споживання кисню (VO2) у стані спокою (на 16%): у нетренованих тварин цей показник становив (2,4 ± 0,09) мл·хв-1·100 г-1, а у тварин 6-ї групи - (2,0 ± 0,11) мл·хв-1·100 г-1 (р < 0,05). МСК у щурів 6-ї групи, навпаки, значно зростав: (11,6 ± 0,5) мл·хв-1·100 г-1. Отже, ФВ і МСК, що характеризують фізичну працездатність і аеробну продуктивність організму, підвищувались у процесі адаптації до ГН найбільше у тих тварин, які одночасно проходили курс ІГТ. VO2 mах була на 25-38% вищою у щурів, тренованих за допомогою різних режимів поєднання фізичного навантаження з ІГТ, у порівнянні з нетренованими щурами, в той час як у тренованих без допомоги ІГТ цей показник був лише на 19,5% вищим, ніж у нетренованих тварин. Відносно показника ФВ підвищення складало відповідно 5-8 разів і 3 рази. ІГТ саме по собі призвело до збільшення ФВ майже в 3,5 раза, але МСК при цьому лише мало тенденцію до підвищення. Таким чином, нами було доведено, що при поєднанні дії ІГТ і ГН (порівняно з окремим впливом адаптації до цих двох типів гіпоксії) найбільше підвищувалися ФВ і МСК, що збігається з даними, отриманими при обстеженні людей.

При цьому нами вперше встановлено, що збільшення цих інтегральних показників при адаптації до переривчастої гіпоксичної гіпоксії та напруженої м'язової діяльності супроводжується максимальним підвищенням середньотканниного PmО2 у скелетному м'язі в стані спокою (середньотканинне РО2 збільшилося до 39,5 ± 3,3 щодо 23,5 ± 2,1 мм рт. ст. у контролі). Останнє пояснюється не лише удосконаленням системи транспорту кисню до тканин (підвищення легеневої вентиляції, хвилинного об'єму кровотоку, кисневої ємності крові, регіонарного кровотоку) під впливом ІГТ і фізичних тренувань (Радзієвський П.О., 2005), а й збільшенням капіляризації м'язової тканини. Нами показано, що поєднана дія на організм гіпоксії навантаження та переривчастої гіпоксичної гіпоксії призводить до найбільшого підвищення ступеня капіляризації м'язової тканини: так, у тварин

6-ї групи кількість капілярів на 1 мм2 м'язового волокна збільшується до 2530 ± 190 щодо 1080 ± 140 у контрольних тварин.

Дослідження змін метаболічних показників м'язової тканини в процесі адаптації тварин до гіпоксії навантаження і переривчастої гіпоксії

Встановлено, що адаптація до двох типів гіпоксії найбільш сприяє мобілізації функціональних і метаболічних резервів транспорту й утилізації кисню безпосередньо у м'язовій тканини. Про це свідчить той факт, що у відповідь на СН найменші прояви тканинної гіпоксії були відзначені у тварин після адаптації до адитивного впливу ІГТ і фізичних тренувань. Так, концентрація лактату у скелетному м'язі контрольних щурів після СН значно підвищилася щодо вихідного значення - у 4,5 раза, pH крові та м'язів значно зсувалось у кислий бік (рис. 2, 3). Приблизно такі самі зміни були зареєстровані у 2-й групі щурів. Після застосування різних засобів тренування тварин (групи 3-6) підвищення вмісту лактату прогресивно зменшувалось, особливо у м'язах тварин 6-ї групи на - 35,5% вище від вихідного значення. Зсуви pH крові і м'язів у кислий бік були помітно меншими у тварин 5-ї і 6-ї груп. Співвідношення лактат/піруват, яке було використане як індикатор клітинного редокс-потенціалу, вірогідно підвищувалося після застосування СН у м'язах тварин усіх досліджуваних груп, але найменший ступінь такого підвищення був зареєстрований знову ж таки у тварин 6-ї групи (рис. 3). Цитозольний редокс-потенціал (співвідношення НАД/НАДН) зменшувався після CН: найбільше - у тварин 1-ї і 2-ї груп, найменше - на фоні застосування ІГТ (5-та і 6-та групи) (рис. 3). Отримані результати можна інтерпретувати як такі, що підтверджують відомий феномен розвитку більш тісної інтеграції між постачанням АТФ та її метаболічним запитом при адаптації м'язової тканини до ГН, що супроводжується меншою стимуляцією гліколізу (Green H. et al., 1995). Це, в свою чергу, викликає зниження продукції лактату й утилізації глюкози у м'язах і посилення спряженості між окисненням пірувату та інтенсивністю гліколізу (Burelle Y. et al., 2002). Ми вперше показали, що такі метаболічні адаптації, специфічні для скелетного м'яза, потенціюються при об'єднаному впливі ГН та ІГТ. Встановлені відмінності між метаболічними реакціями на інтенсивне фізичне навантаження можна пов'язати також із роллю мітохондріального апарату в адаптації м'язової тканини до гіпоксії та зниженням у процесі такої адаптації мітохондріальної дисфункції як базового молекулярного механізму щодо реакції м'язової тканини на дефіцит кисню (Лукья-
нова Л.Д., 2003). Тому наступний етап наших досліджень був присвячений вивченню особливостей дихальної функції мітохондрій скелетного м'яза у процесі адаптації до ГН і переривчастої гіпоксії.

Рис. 2 - Значення pH артеріалізованої крові (А) та скелетного м'яза (Б) щурів при поєднанні гіпоксії навантаження з інтервальним гіпоксичним тренуванням (М±m; n=10). Примітка: групи тварин та позначення див. рис. 1.

Рис. 3 - Вміст лактату (А), співвідношення лактат/піруват (Б), співвідношення НАД/НАДН (В) у скелетних м'язах тварин при різних режимах поєднання гіпоксії навантаження (ГН) з інтервальним гіпоксичним тренуванням (М±m; n=10). Примітка: групи тварин та позначення див. рис. 1.

Дослідження показників АДФ-стимульованого дихання мітохондрій скелетного м'яза щурів на фоні використання різних субстратів окиснення при дії гіпоксії навантаження і ІГТ

Дослідження показників функціонування МХ показали, що в усіх дослідах початкова швидкість дихання мітохондрій V2 без АДФ була низькою і добре репродуцибельною. У відповідь на додавання АДФ у полярографічну камеру було чітко зафіксовано підвищення VО2 до максимальних значень (V3) на фоні збереження високих значень дихального контролю за Чансом, що є показником високого ступеня спряженості процесів окиснення та фосфорилювання (Burelle Y. et al., 2002). Було встановлено, що у нетренованих тварин після застосування СН відбувається перерозподіл субстратів дихання на користь сукцинату: в разі окиснення сукцинату різко підвищується швидкість дихання в стані V3 та його спряження з фосфорилюванням на фоні зниження ефективності фосфорилюючого дихання (АДФ/О), при цьому за окиснення КГЛ відбувається інгібування дихальної активності мітохондрій (табл. 1, 2). Показники дихання мітохондрій у тварин 2-ї групи як до, так і після застосування СН, суттєво не відрізнялися від контрольних.

Таблиця 1 - Зміни показників АДФ-стимульованого дихання мітохондрій м'язової тканини щурів при різних режимах поєднання гіпоксії навантаження (ГН) з інтервальним гіпоксичним тренуванням (ІГТ) за умов окиснення 1 ммоль/л сукцинату натрію до та після стандартного навантаження (М±m; n=10)

Примітка: групи тварин та позначення див. рис. 1.

У тварин, адаптованих до ГН субкомпенсованого ступеня (3-тя група), за умов окиснення сукцинату після CН вірогідно збільшується дихальний контроль, але АДФ/О не змінюється порівняно зі значенням коефіцієнта, отриманого до СН (табл. 1). Після проведеного курсу ІГТ (4-та група) змінюються показники енергозабезпечення, пов'язані з окисненням як сукцинату, так і КГЛ. Так, спостерігається тенденція до зниження рівня АДФ-стимульованого дихання у 3-му та 4-му метаболічних станах порівняно зі значеннями, отриманими для контрольних тварин. При цьому у МХ скелетних м'язів щурів за умов окиснення сукцинату підвищувалася спряженість процесів дихання та окиснювального фосфорилювання. Останнє свідчить про підвищення енергетичної регуляції дихання одночасно зі збільшенням ефективності фосфорилювання за умов окиснення обох субстратів дихання. Вплив СН після курсу ІГТ дозволив виявити значну протекторну роль адаптаційних механізмів енергозабезпечення, індукованих сеансами ІГТ. Ці зміни передусім проявляються у підвищенні ефективності фосфорилювання (див. табл. 1, 2). Порівняльний аналіз показників функціонування МХ скелетних м'язів тварин 5-ї групи з контрольними засвідчив відсутність вірогідних змін за умов окиснення сукцинату, тобто активність сукцинатоксидазного шляху окиснення не змінювалась. За окиснення мітохондріями НАД-залежного субстрату - КГЛ - швидкість дихання у всіх метаболічних станах знижується порівняно з результатами контрольної групи тварин. Незважаючи на зниження інтенсивності споживання мітохондріями кисню, коефіцієнт АДФ/О був вірогідно вищим, що говорить про підвищення ефективності окиснювального фосфорилювання. При цьому відсутність змін величини дихального контролю також вказує на підтримання високого ступеня спряженості процесів окиснення та фосфорилювання у мітохондріях м'язової тканини щурів, адаптованих до поєднаної дії ІГТ і ГН субкомпенсованого ступеня (див. табл. 1, 2). Показники АДФ-стимульованого дихання мітохондрій скелетних м'язів тварин 6-ї групи свідчать про зростання ефективності роботи дихального ланцюга за окиснення НАД-залежного субстрату на фоні зниження швидкості фосфорилюючого та контрольованого дихання, що вказує на економізацію процесів енергозабезпечення. При цьому при окисненні СК збільшується лише коефіцієнт АДФ/О. мускульний гіпоксія кисень витривалість

У відповідь на СН показники дихальної функції мітохондрій у тварин 5-ї та 6-ї груп змінювались аналогічно: збільшувалося значення дихального контролю та коефіцієнта АДФ/О тільки за умов окиснення КГЛ.

Про значну залежність ефектів інтервальної гіпоксії щодо функціонування мітохондрій тканини скелетного м'яза від КГЛ, але не СК, свідчить вірогідне підвищення показника дихання у стані V3, дихального контролю за окиснення субстратів глутамату з піруватом. Відомо, що останні забезпечують інтенсивне переамінування з утворенням КГЛ за участю аланінамінотрансферази, тобто підтверджується зниження ролі окиснення сукцинату і підвищення ролі б-кетоглутарату у процесах мітохондріального енергозабезпечення. З метою виявлення “чистого” внеску КГЛ в загальне окиснення ми провели аналіз з використанням інгібітора СДГ малонату. Було показано, що усунення внеску ендогенного сукцинату в дихання мітохондрій, яке проводиться за допомогою інгібітора СДГ, тільки для тварин групи 6 (порівняно із результатами, одержаними для тварин 1-5-ї груп) супроводжувалося вірогідним підвищенням удвічі як швидкості фосфорилюючого дихання, так і дихального контролю за Чансом.

Таким чином, проведені нами дослідження показали специфічність перебудов метаболічних шляхів функціонування мітохондрій скелетних м'язів, пов'язаних з окисненням різних субстратів, при розвитку адаптації м'язової тканини до переривчастої гіпоксичної гіпоксії і ГН. Те, що найбільш позитивні результати були отримані при застосуванні ІГТ в останні 2 тиж фізичного тренування (6-та група), можна пояснити високим рівнем потенціювання всіх механізмів метаболічної адаптації м'язів, що розвивається до цього терміну, з підвищенням якості регуляції взаємозв'язку метаболізму макроергічних фосфатів і гліколізу (Powell F.L. et al., 2002). Такий рівень потенціювання припускає значне підвищення вмісту мітохондріальних білків і збільшення об'єму мітохондрій у м'язовій тканині, що знайшло підтвердження в дослідженнях, проведених за допомогою ультраструктурного, морфометричного та стереометричного аналізу.

Таблиця 2 - Зміни показників АДФ-стимульованого дихання мітохондрій м'язової тканини щурів при різних режимах поєднання гіпоксії навантаження (ГН) з інтервальним гіпоксичним тренуванням (ІГТ) за умов окиснення б-кетоглутарату натрію (1ммоль/л) до та після стандартного навантаження (М±m; n=10)

Примітка: групи тварин та позначення див. рис. 1.

Ультраструктурні особливості м'язової тканини та зміни структурних показників мітохондріального апарату міоцитів (за даними морфометричного і стереометричного аналізу) при дії ГН і ІГТ

Структурні перебудови, що виникають в тканині скелетного м'яза при тривалій дії гіпоксії різних типів, ми умовно розподілили на дві групи: деструктивного і компенсаторно-пристосувального порядку. Перші були характерні для помірних проявів тканинної гіпоксії, вони зустрічались як при окремій адаптаціїї до ГН і переривчастої гіпоксії, так і при адаптації до їх сумісної дії, але в жодному випадку не досягали такого ступеня вираженості, який, за даними літератури, був притаманний деструктивному впливу на скелетні м'язи інтенсивних фізичних тренувань на фоні постійно діючої гіпоксичної гіпоксії (Hoppeler H. et al., 2001, 2003). Ці структурні зміни торкались у першу чергу гематопаренхіматозного бар'єра (ГПБ) м'язів, що взагалі є тонким індикатором розвитку гіпоксії м'язової тканини (Маньковская И.Н. и др., 1991). Зміни ультраструктури ГПБ, які ми спостерігали, виражались посиленням гідратації ендотелію, набряком перикапілярного простору, заповненням останнього гранулярно-сітчастим білковим матеріалом і колагеновими структурами, розширенням канальців ендоплазматичної сітки ендотеліоцитів, появом мієліноподібних структур, набряком м'язових волокон у ділянці сарколеми аж до появи такого у вигляді вакуолей. У м'язових клітинах реєстрували також розширення канальців саркоплазматичного ретикулума, з'являлись осередкові зміни міофібрил, що виявлялись у розрихленні, нечіткій поперечній окресленості. Деструктивні зміни мітохондрій ендотеліоцитів, перицитів і міоцитів були однотипними і проявлялися набряком окремих мітохондрій, просвітленні їхнього матриксу, розширенні міжкристних площин, скороченні або фрагментуванні крист. Але треба відзначити, що при окремій адаптації як до ГН, так і до переривчастої гіпоксії, компенсаторно-пристосувальні зміни ультраструктури м'язової тканини домінували над деструктивними (на відміну від протилежної дії гострої гіпоксії або фізичного навантаження).

Так, компенсаторно-пристосувальні перебудови ГПБ м'язів, зареєстровані нами при адаптації до різних типів гіпоксії, полягали у розширенні просвіту капілярів, посиленні мікропіноцитозу в ендотеліоцитах, інвагінації оболонки їхніх ядер. У м'язових волокнах спостерігалося помірне потовщення міофібрил, поява значної кількості вільних рибосом і рибосом, фіксованих на мембранах саркоплазматичного ретикулума. Змінювалась ультраструктурна організація ядер міоцитів: з'являлися звивистість ядерної оболонки, ії інвагінація, розширення перинуклеарного простору. Найбільш демонстративні адаптивні зрушення відзначалися нами в ультраструктурі мітохондрій м'язових клітин: спостерігалася як іх гіпертрофія, так і гіперплазія, збільшувалася кількість крист, реєстрували їхню щільність. У цілому, морфофункціональна адаптація м'язової тканини до гіпоксії виявлялась у посиленні процесів трансендотеліального та транскапілярного транспорту кисню, інтенсифікації окиснювальних і пластичних процесів, процесу ядерно-цитоплазматичного обміну, іонного транспорту, мітохондріального біогенезу. Найбільш повно позитивні прояви структурної адаптації м'язової тканини реєстрували під час спільного впливу ІГТ і ГН, коли спостерігали чітку перевагу конструктивних реакцій над деструктивними з боку субклітинних структур м'язових волокон.

Це положення знайшло своє підтвердження і за результатами морфологічного та стереометричного аналізу. Ми показали, що ГН (2-га і 3-тя групи) викликала вірогідне збільшення загальної кількості мітохондрій обох популяцій, виражене дещо більшою мірою у субсарколемальних органел (табл. 3). При цьому збільшувались і лінійні розміри мітохондрій, досягаючи у субсарколемальних мітохондрій 0,87 мкм, а у інтерміофібрилярних, перевищуючи 1 мкм. Збільшувалась і загальна площа мітохондрій на одиницю об'єму м'язового волокна.

Такі зміни вважають одними з ознак адаптації тканини до фізичного навантаження (Hoppeler H. et al., 2001, 2003, Huang Q. et al., 2003). Однак вони не є беззаперечним свідченням покращення функціонування мітохондрій, оскільки поряд з цим встановлено збільшення відсотка органел з порушеною ультраструктурою порівняно з контролем.

Таблиця 3 - Морфометричні та стереометричні характеристики інтерміофібрилярних (ІМФ) і субсарколемальних (СС) мітохондрій литкового мяза при поєднанні гіпоксії навантаження (ГН) з інтервальним гіпоксичним тренуванням (ІГТ) (М±m; n=10)

Примітка: групи тварин та позначення див. рис. 1.

Застосування ІГТ (4-та група) призводило до подібних за спрямованістю змін у мітохондріальному апараті міоцитів. При цьому кількість видозмінених мітохондрій обох популяцій на 1мкм2 тканини була достовірно нижчою відносно встановленої у тварин, яких піддавали тривалому фізичному тренуванню. Поєднання тренувального процесу з ІГТ у перші 2 тиж фізичних тренувань (5-та група) супроводжувалося більш вираженим збільшенням кількості мітохондрій та їх загальної площі при збереженні лінійних розмірів, відносно значень у тварин 3-ї та 4-ї груп (див. табл. 3).

Такі перебудови можна вважати ознакою адаптації м'язової тканини, однак при цьому ми продовжували реєструвати наявність дещо змінених структурно МХ в обох популяціях. Дійсно конструктивний вплив адаптації до обох типів гіпоксії був виявлений відносно тканини литкового м'яза у щурів 6-ї групи (див. табл. 3). До такого висновку дозволяють прийти наступні факти: вірогідне збільшення кількості ССМХ та ІМФМХ на одиницю площі волокна відносно всіх інших груп тварин, збільшення лінійних розмірів мітохондрій, особливо суттєве в органелах субсарколемальної фракції, загальної площі поверхонь ССМХ та ІМФМХ в одиниці об'єму волокна. Особливо важливим слід вважати те, що при збільшенні загальної кількості мітохондрій зберігалася і їх ультраструктура, про що свідчило зменшення практично вдвічі відсотка структурно пошкоджених органел щодо значень у тварин 5-ї групи. Останнє дає змогу припустити наявність значного поліпшення енергозабезпечення м'яза за умов сумісної дії ІГТ і ГН у другій половині циклу фізичних тренувань.

Таким чином, можна констатувати, що як тривале фізичне навантаження, так й ІГТ, призводять до таких змін в ультраструктурі тканини литкового м'яза, які можна розглядати як адаптаційні. Однак дійсно ефективна адаптація м'язової тканини відбувається лише у тварин, які піддавалися сумісній дії напруженої м'язової діяльності і переривчастої гіпоксії, причому найбільш чітка конструктивна дія виявлялася у разі застосування ІГТ у другій половині циклу тривалого фізичного навантаження, коли адаптивні процеси в м'язовій тканині вже почали формуватися.

Дослідження змін прооксидантно-антиоксидантного статусу м'язової тканини щурів (інтенсивність процесу перекисного окиснення ліпідів, активність антиоксидантних ферментів) при поєднаній дії ГН і ІГТ

У наших дослідах було показано, що у тварин 3-ї групи, які піддавалися дії ГН субкомпенсованого ступеня протягом 4 тиж, інтенсивність ПОЛ залишалася вищою за контрольні показники на 18% (рис. 4, А). При цьому активність СОД мала тенденцію до зниження відносно контролю на 14% (див. рис. 4, Б), а активність КАТ залишалась у межах норми (див. рис. 4, В). Порівняння змін у системі ПОЛ - АОС у тварин 1-ї і 3-ї груп показало, що СН викликає різну реакцію прооксидантно-антиоксидантної системи у скелетному м'язі цих тварин.

Рис. 4 - Зміни показників прооксидантно-антиоксидантного балансу у скелетному м'язі щурів при різних режимах поєднання гіпоксії навантаження (ГН) та інтервального гіпоксичного тренування (ІГТ). Вміст ТБК-АП (А), активність супероксиддисмутази (СОД) (Б), активність каталази (КАТ) (В) (М±m; n=10). Примітка: групи тварин та позначення див. рис. 1.

Якщо у нетренованих щурів воно супроводжувалося значним підвищенням вмісту малонового діальдегіду (МДА) у м'язах (на 44% відносно контролю) і пригніченням активності антиоксидантних ферментів (СОД - на 58%, КАТ - на 32%), то у тварин 3-ї групи після СН відмічалося підвищення вмісту МДА лише на 26%, а активність СОД була нижчою від контролю лише на 29%, каталазна активність залишалася на рівні контрольних значень. Таким чином, фізичні тренування на витривалість протягом 4 тиж дещо послабили ознаки оксидативного стресу (незначне збільшення ТБК-активних продуктів) у м'язах тварин після стандартного навантаження, завдяки деякій активації ферментних ланок антиоксидантного захисту (СОД і КАТ).

Ці результати збігаються з даними інших дослідників, які відмічали позитивний вплив тривалих інтенсивних фізичних тренувань на перебіг метаболічних процесів і стан антиоксидантної системи захисту у скелетному м'язі (Phillips S.M. et al., 1996). Очевидно, помірна інтенсифікація вільнорадикальних реакцій і обмінних процесів сприяла як ефективній утилізації недоокиснених метаболітів, так і забезпеченню спряженості оксигеназних, оксидазних і синтетичних процесів, які підтримують на належному рівні активність ферментів антиоксидантного захисту. У тварин 4-ї групи двотижневий курс ІГТ не викликав підсилення процесів ПОЛ у м'язах, при цьому відмічалося підвищення активності СОД на 21%, КАТ - на 32% у порівнянні з контролем. Таким чином, двотижнева адаптація щурів до переривчастої гіпоксії призводила до значного підвищення потужності антиоксидантної системи захисту м'язової тканини щурів.