Вплив радіаційних, термічних та хімічних чинників на різних стадіях онтогенезу на тривалість життя та біологічний вік Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В.Н. КАРАЗІНА

УДК 612.68-019:577.95:577.71

ВПЛИВ РАДІАЦІЙНИХ, ТЕРМІЧНИХ ТА ХІМІЧНИХ ЧИННИКІВ НА РІЗНИХ СТАДІЯХ ОНТОГЕНЕЗУ НА ТРИВАЛІСТЬ ЖИТТЯ ТА БІОЛОГІЧНИЙ ВІК Drosophila melanogaster

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КОШЕЛЬ НАТАЛІЯ МИХАЙЛІВНА

Харків 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті геронтології АМН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Войтенко Володимир Платонович, Інститут геронтології АМН України (м. Київ), завідувач лабораторії математичного моделювання процесів старіння.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Коробейніков Георгій Валерійович, Державний науково-дослідний інститут фізичної культури і спорту (м. Київ), заступник директора з науково-дослідної роботи;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Ільїн Володимир Миколайович, Національний університет фізичного виховання та спорту України (м. Київ), завідувач кафедри біології людини.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра фізіології людини і тварин.

Захист відбудеться “ 19 ” квітня 2006 р. о 14 : 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий “ 15 ” березня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В.І. Падалко

Размещено на http://www.allbest.ru/

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Аналіз механізмів старіння є одним з перспективних напрямків досліджень в експериментальній біології і медицині, від якого можна чекати розкриття нових фундаментальних механізмів життєдіяльності і розробки методів спрямованої корекції функціональної активності систем цілісного організму. У зв'язку із загостренням демографічної кризи в Україні та підвищенням рівня забрудненості територій (зокрема, внаслідок аварії на ЧАЕС) зросла потреба у проведенні досліджень, присвячених вивченню впливу чинників оточуючого середовища на життєздатність та темп старіння організмів.

В останні роки з'являється все більша кількість робіт, присвячених математичному моделюванню процесів старіння. У контексті даного напрямку досліджень безсумнівний інтерес представляє комплексна оцінка впливу широкого спектру факторів навколишнього середовища, що детермінують вікову смертність (температура, радіація, тощо), з використанням сучасних статистичних методів. Зазвичай подібні роботи проводяться за матеріалами демографічних таблиць смертності. Такий підхід має ряд недоліків, що, насамперед, пов'язано з неможливістю здійснення на людині прямого експерименту по вивченню різних впливів, що модифікують старіння. У рамках даного напрямку додаткові можливості для одержання інформації може надати вивчення вікової смертності лабораторних тварин при різних експериментальних впливах. Одна з проблем аналізу вікової смертності з використанням сучасних статистичних підходів полягає у виборі адекватного модельного організму. Чи не найпоширенішим з-поміж модельних об'єктів для проведення досліджень по вивченню впливу чинників навколишнього середовища на життєздатність організму, зокрема, його біологічний вік (БВ), репродуктивний потенціал, смертність та тривалість життя (ТЖ), є дрозофіла.

Дуже важливими є дослідження, присвячені пошуку засобів адаптації організму до дії ушкоджуючих факторів. Одним з таких факторів є рентгенівське опромінення, особливу увагу до якого прикуто після аварії на ЧАЕС. Саме рентгенівське опромінення найчастіше використовується з метою моделювання темпу старіння. Це пов'язане з неспецифічним характером його впливу на різні системи організму. Висловлюється припущення, що рентгенівське опромінення може призводити до прискорення старіння організму (Виленчик М.М., 1987, Фролькис В.В., Мурадян Х.К., 1992). Одним з засобів протидії впливу ушкоджуючих чинників, і, зокрема, радіації, є реалізація механізму адаптивного відгуку, який полягає в тому, що попередня експозиція в умовах м'якого стресу може збільшувати виживання після сильного стресу (Krebs R.A., Loeschke V. 1994, Smirnova O.A., Yonezawa M., 2003). У зв'язку з цим велике значення має пошук засобів активізації механізму адаптивного відгуку з метою нівелювання шкідливих ефектів певних факторів оточення.

Відомо, що чутливість тварин до опромінення та інших ушкоджуючих факторів не є однаковою на різних стадіях онтогенезу (яким відповідають різні можливості адаптації і гомеостазу) (Кудряшев Ю.Б., 1983; Москалев Ю.И., 1991). Проте, дані про особливості впливу радіації та інших чинників оточення на різних стадіях онтогенезу на біологічний вік тварин та перебіг процесу старіння практично відсутні, що обумовлює актуальність таких досліджень. Також нову інформацію щодо факторів, які модифікують темп старіння та смертність, можна отримати завдяки використанню сучасних статистичних моделей, зокрема, моделей Гомперця та біологічного віку, а також застосуванню методів багатомірної статистики, зокрема, моделі факторного аналізу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Базовими для підготовки та подання дисертаційної роботи, в яких здобувач приймала участь у проведенні досліджень та аналізі результатів, були такі науково-дослідні роботи, виконані у межах наукової тематики Інституту геронтології АМН України:

- Математичне і експериментальне моделювання впливу екологічних факторів на старіння, вікову смертність та тривалість життя і медико-демографічна оцінка наслідків аварії на ЧАЕС (1992-1995 рр., номер державної реєстрації UA01002438P).

- Вплив екологiчних стресiв на розвиток, старiння та тривалiсть життя Drosophila melanogaster (1996-1998 рр., номер державної реєстрації 0196U001300).

- Вплив стресів у ранньому онтогенезі на біологічний вік, тривалість життя та структурно-функціональні характеристики геному Drosophila melanogaster (1999-2001 рр., номер державної реєстрації 0199U000637).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення змін біологічного віку, смертності та тривалості життя Drosophila melanogaster, спричинених впливом ушкоджуючих чинників фізичної та хімічної природи на різних стадіях онтогенезу комах.

Для вирішення поставленої мети були визначені наступні завдання:

- дослідити вплив рентгенівського опромінення на різних стадіях онтогенезу Drosophila melanogaster (стадії яйця та імаго комах) на інтенсивність метаболізму, локомоторну активність, репродуктивну активність, темп старіння та (ТЖ);

- порівняти вплив однакової дози гострого (400 Гр) та фракціонованого (150 Гр - 30 хв перерви - 250 Гр) опромінення молодих комах на їх БВ та динаміку смертності;

- дослідити комбінований вплив рентгенівського опромінення та інкорпорованих радіонуклідів (цезію та стронцію) на темп смертності та ТЖ дрозофіл;

- вивчити модифікуючий вплив температури на різних стадіях розвитку на темп смертності та ТЖ опромінених комах;

- дослідити комбінований вплив нітрату алюмінію та опромінення на БВ та ТЖ комах;

- вивчити вплив ауринтрикарбонової кислоти після опромінення дрозофіл різними дозами радіації на стадії яйця на БВ та ТЖ комах.

Об'єкт дослідження: біологічний вік, смертність та тривалість життя Drosophila melanogaster.

Предмет дослідження: зміни темпу старіння аутбредної лабораторної популяції дрозофіл в залежності від сили впливу ушкоджуючого фактору (зокрема, іонізуючого опромінення) та стадії розвитку, на якій здійснюється цей вплив. опромінення онтогенез комаха метаболізм

Методи дослідження: фізіологічні, морфологічні (електронно-мікроскопічний аналіз), популяційні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено, що опромінення молодих імаго дрозофіл може призводити до короткочасної стимуляції їх фізіологічних показників з подальшим підвищенням (погіршенням) біологічного віку та смертності комах. Продемонстровано, що опромінення Drosophila melanogaster на стадії яйця спричинює підвищення рівня смертності молодих комах, а опромінення дорослих комах (імаго) прискорює темп старіння. Показано, що опромінення дрозофіл у малій дозі (0,5 Гр) на стадії яйця викликає розвиток в клітинах мозку імаго дрозофіли гіперплазію та гіпертрофію мітохондрій, що свідчить про функціональне напруження внутрішньоклітинних систем, а опромінення дрозофіл у великій дозі (4 Гр) призводить до виражених деструктивних змін в клітинах мозку (нейронах та глії), що нагадують вікові. Показано зниження з віком чутливості дрозофіл до опромінювання на стадії імаго. Виявлено статеві відмінності реакції комах на стрес: самці демонструють нижчу толерантність до стресу порівняно із самками, але кращу спроможність у досягненні гормезисних ефектів. Показано, що застосування теплового шоку перед опроміненням на стадії імаго спричинює більший радіопротекторний ефект, ніж після опромінення. Продемонстровано, що застосування хімічних препаратів (нітрат алюмінію та ауринтрикарбонова кислота) у дозах, що не чинять негативного впливу на фізіологічні параметри неопромінених комах, може спричинити токсичні ефекти у опромінених.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їх аналіз доповнюють та поглиблюють сучасні уявлення про характер фізіологічних змін в процесі старіння організму. У роботі застосовано системний підхід, що полягає в одночасному вивченні декількох фізіологічних маркерів старіння (з наступним визначенням такого інтегрального показника, як біологічний вік) і вікової смертності в експериментальних популяціях. Це дозволило одержати інформацію про характер впливу навколишнього середовища на процеси, пов'язані зі зміною фізіологічних систем організму і вікової смертності.

На основі результатів дослідження розроблено експериментальну модель, яка дозволяє оцінювати вплив чинників будь-якої природи на темп старіння. Ця модель може бути використана в експериментально-геронтологічних дослідженнях з метою вивчення механізмів дії стресуючих факторів на організм. Опрацьовано метод визначення біологічного віку Drosophila melanogaster, який може бути використаний в експериментальній геронтології для оцінки інтегральної життєздатності (біологічного віку) комах при вивченні експериментальних модифікацій темпу старіння.

Застосування системного підходу при вивченні експериментальних модифікацій темп старіння дрозофіли, що полягає в одночасному вивченні смертності і біологічного віку мух, представляє суттєве теоретичне та практичне значення, та дає змогу використовувати дрозофілу як перспективний модельний об'єкт для експериментальних досліджень процесів старіння на популяційному рівні.

Особистий внесок здобувача полягає у підготовці та проведенні експериментальних досліджень, інтерпретації одержаних результатів. Усі експериментальні дані, використані в дисертації, отримані при безпосередній участі автора роботи. Головна ідея роботи була запропонована науковим керівником, а її практичне виконання належить дисертанту. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено пошук та аналіз наукової літератури, статистична обробка результатів досліджень, аналіз та узагальнення одержаних даних, сформульовані основні положення та висновки, апробація результатів дослідження та підготовка до друку робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднені на засіданнях сектору біології старіння Інституту геронтології АМН України, науковій конференції “Прискорене старіння: зв'язок з віковою патологією” (Київ, 1992); на конференціях молодих вчених в Інституті геронтології АМН України (1993, 1999-2005); на II з'їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), науково-практичній конференції "Застосування геропротекторів для попередження прискореного старіння" (Київ, 1996 р.), міжнародних симпозіумах "Біологічні механізми старіння" (Харків, 1998, 2000, 2002, 2004 рр.), ІІ Європейському конгресі по біогеронтології (м. Санкт-Петербург, 2000 р.), ІІ Українському з'їзді геронтологів та геріатрів (2000 р.), на засіданні Харківського відділення Українського товариства геронтологів та геріатрів (Харків, 2002). Результати дослідження увійшли у звіти лабораторії.

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені в 14 статтях, 6 препринтах та 18 тезах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 173 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 34 рисунками, 25 таблицями. Вона складається із вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого опису об'єктів та методів дослідження, 4 розділів, в яких викладено результати досліджень, розділу, присвяченого аналізу і узагальненню отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел із 281 найменувань.

Основний зміст роботи

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведено на аутбредній лабораторній популяції Drosophila melanogaster лінії Oregon-R. Виживаність комах на передімагінальних стадіях визначали як частку мух, які пройшли повний цикл розвитку (від яйця до імаго). Для визначення імагінальної ТЖ використовували по 100-200 комах у кожній з експериментальних груп. Для кожної групи розраховували середню ТЖ (СТЖ) і максимальну ТЖ (МТЖ) (яку розраховували як СТЖ останніх 10 % мух, що вижили (Дубина Т.Л., Разумович А.Н., 1975)).

Визначення біологічного віку мух здійснювали за допомогою батареї тестів (Вайсерман О.М., 1992), до складу якої входили такі показники:

індукована локомоторна активність (фототаксис);

стійкість до теплового шоку;

стійкість до позбавлення корму.

Інтенсивність смертності визначали як логарифм кількості померлих комах за певний проміжок часу (ln (Rt)). Рівняння Гомперця (Гаврилов Л.А., 1987) має вигляд:

ln (Rt) = (КВ) + C,

де Rt - смертність популяції, - коефіціент (кут нахилу прямої, який характеризує швидкість вимирання), КВ - календарний вік, С - вільний член рівняння (вихідний рівень пошкоджень).

З метою вивченням комбінованого впливу чинників оточення на ТЖ та БВ комах використовували:

температурний стрес на стадії яйця дрозофіл (37^ОС протягом 1 год, 7^ОС протягом 1 год), на стадії імаго дрозофіл (35,5 0,5 ^ОС протягом 2 год);

додавання геропромотору нітрату алюмінію (Al (NO₃)_{3 *} 9H₂O) у концентрації 20 г/л корму на стадії імаго дрозофіл протягом трьох діб (у віці 3-6 діб);

додавання інгібітору апоптозу ауринтрикарбонової кислоти (Mogil R.J., Shi Y., et al., 1994) у концентрації 100 мг/л корму на стадії личинки дрозофіл.

Рентгенівське опромінення здійснювали одноразово на стадії яйця (у дозах 0,1; 0,3; 0,5; 1; 2 та 4 Гр) та імаго (у дозах 56; 108; 160; 240 та 400 Гр). Співвідношення рентгена з міжнародною одиницею: 1Р = 2,58 10^-4 Кл/кг, оскільки 1 Гр = 100 Р, то 1 Гр = 2,58 10^-2 Кл/кг.

Для оцінки життєздатності мух у кожній з експериментальних груп визначали:

масу тіла;

інтенсивність метаболізму (по концентрації СО₂);

індуковану локомоторну активність (фототаксис та геотаксис);

стійкість до позбавлення корму;

стійкість до теплового шоку;

репродуктивну активність самок (фекандильність та фертильність).

Для порівняльної характеристики змін, спричинених опроміненням з такими при нормальному старінні дрозофіл, нами було проведено електронно-мікроскопічне дослідження мозку дрозофіл: інтактних різного віку (дорослих та старих) та дорослих комах після радіаційного опромінення на стадії яйця (0,5 та 4 Гр). Оцінку ультраструктурних змін мозку дрозофіл проводили із застосуванням методів електронної мікроскопії співробітниками лабораторії морфології Інституту геронтології АМН України під керівництвом Квітницької-Рижової Т.Ю. Об'єктом ультраструктурного аналізу були обрані lamina ganglionaris - медіальна частина мозку, що межує з оком, а також центральні частини мозку, що входять до складу так званих “грибовидних тіл”, що беруть початок з pedunculus і формують декілька долей, та ділянки, особливо багаті на клітини, що оточують “грибовидні тіла” (Crittenden J., et al., 1998; Ito K., et al., 1998). Для електронномікроскопічних досліджень ультратонкі зрізи голови комах фіксували у 2,5% розчині глютаральдегіду на фосфатному буфері (рН 7,4) протягом 4 годин при температурі +4С. Дофіксація в 2% розчині осмієвої кислоти на такому ж буфері протягом 2 годин і подальше заливання в епон-аралдитну суміш виконувались за загальноприйнятими методами (Уикли Б., 1975). Ультратонкі зрізи готували на ультратомі LKB- III (Швеція).

Для статистичного опрацювання отриманих результатів використовували регресійний, кореляційний, дисперсійний і факторний методи статистичного аналізу за допомогою програм “STATGRAPHICS” (STATGRAPHICS, 1987), “STATISTICA 5.0” (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1997) та спеціалізованих програм, написаних в лабораторії математичного моделювання процесів старіння Інституту геронтології для розрахунку біологічного віку та тривалості життя. Достовірність відхилень середніх значень показників оцінювали за допомогою критерію Ст'юдента, для визначення достовірності відхилень кривих вимирання застосовували непараметричний критерій Колмогорова-Смирнова.

Основні результати досліджень та їх обговорення

Вплив рентгенівського опромінення на різних стадіях онтогенезу на життєздатність та темп старіння Drosophila melanogaster

Вплив опромінення на стадії яйця на життєздатність та тривалість життя імаго Drosophila melanogaster та їх нащадків. Підвищення інтересу до проблеми віддалених наслідків опромінення, а також ствердження деяких авторів про те, що потенціал ТЖ визначається на ранніх стадіях життя (Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С., 1991; Yonemura et al., 1991) спонукало нас до вивчення впливу опромінення на передімагінальних стадіях на життєздатність імаго дрозофіл та нащадків першого покоління. Мух на стадії яйця опромінювали рентгенівськими променями у дозах 0,1; 0,3; 0,5; 1; 2 і 4 Гр. Виявлено достовірне зниження смертності на передімагінальних стадіях у мух, опромінених у дозі 0,1 Гр (в 3 рази у порівнянні з контролем), а у мух, опромінених у дозах 1 Гр, 2 Гр та 4 Гр - виявлено підвищення смертності в 2, 3 та 4 рази відповідно у порівнянні з контролем. СТЖ самців, опромінених на стадії яйця (рис.1) вже починаючи з дози 0,1 Гр достовірно знижується у порівнянні з контролем. МТЖ також знижується у самців, опромінених у дозах 0,3; 1 та 2 Гр. У самців, що зазнали опромінення у дозах 2 та 4 Гр, спостерігали підвищення маси тіла, підвищення інтенсивності метаболізму (табл.1). Зниження локомоторної активності у порівнянні з контролем спостерігали у комах, опромінених у дозі 1 Гр та більше (табл.1, табл.2). Менші дози опромінення (0,1, 0,3 та 0,5 Гр) достовірно не вплинули на показники життєздатності. В поколінні F₁ виявлено гормезис (збільшення ТЖ) у самців, батьки яких були опромінені у дозах менше 1 Гр.

Рис. 1 Характер зміни середньої тривалості життя із збільшенням дози опромінення дрозофіл на стадії яйця

Примітка: * - p < 0,05 порівняно з контролем.

Аналіз динаміки виживання імаго дрозофіли за допомогою моделі Гомперця продемонстрував, що підвищення смертності опромінених самців відбувається в основному за рахунок збільшення ініціальних ушкоджень організму (достовірне підвищення параметру R₀ в моделі Гомперця). Опромінення менше впливало на темп смертності самок у порівнянні із самцями, що узгоджується з їх вищою резистентністю до опромінення. Виявлено нелінійний характер зміни показників життєздатності та ТЖ комах із збільшенням дози опромінення.

Можна припустити, що при опроміненні на стадії яйця накопичення пошкоджень в соматичних клітинах призвело до зниження життєздатності та ТЖ мух. Оскільки статеві клітини з летальним та сублетальним рівнем пошкоджень втрачають репродуктивну активність після опромінення і відбраковуються добором, що проходить перед заплідненням, не залишаючи нащадків, можна припустити, що після опромінення не втрачають своєї репродуктивної активності тільки найбільш життєздатні клітини (з підвищеною радіорезистентністю), тобто, відбувається селекція гамет. Можливо, саме цим пояснюється гормезис за ТЖ, виявлений у нащадків опромінених батьків. Віддалені наслідки опромінення виразніше проявлялися у самців.

Таблиця 1

Вплив рентгенівського опромінення на стадії яйця на показники життєздатності самців імаго D. melanogaster

Доза, Гр	М, мкг	ІМ, мл/СО2 (мг·с·105)	ФT, с	ГT, с
0,0	918 14	9,97 0,22	2,86 0,13	4,60 0,13
0,1	949 16	8,92 0,61	3,00 0,09	4,27 0,12
0,3	923 12	9,30 0,65	3,20 0,11	4,80 0,14
0,5	946 11	8,71 0,77	2,40 0,13*	4,40 0,13
1,0	881 3*	7,54 0,90*	3,40 0,13**	5,13 0,09***
2,0	963 16*	10,30 0,67	4,47 0,35***	7,00 0,61***
4,0	999 9***	11,90 0,66*	4,19 0,24***	7,87 0,93***

Примітки:

1. * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001 у порівнянні з контрольною групою (0 Гр);

2. М - маса тіла, ІМ - інтенсивність метаболізму, ФТ - фототаксис, ГТ - геотаксис.

Таблиця 2

Вплив рентгенівського опромінення на стадії яйця на показники життєздатності самок імаго D. melanogaster

Доза, Гр	М, мкг	ІМ, мл/СО2 (мг·с·105)	ФT, с	ГT, с
0,0	1412 30	9,17 0,50	4,46 0,19	13,08 1,21
0,1	1390 38	9,77 0,59	4,27 0,27	14,42 1,49
0,3	1380 21	9,90 0,38	4,73 0,28	10,38 0,88
0,5	1458 11	9,80 0,58	4,07 0,21	12,87 0,84
1,0	1350 22	10,50 0,77	4,53 0,19	6,33 0,69***
2,0	1516 39	10,30 0,43	5,20 0,28*	10,64 0,83
4,0	1560 24**	7,38 0,33**	5,60 0,27**	17,87 1,30**

Примітки:

1. * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001 у порівнянні з контрольною групою (0 Гр);

2. М - маса тіла, ІМ - інтенсивність метаболізму, ФТ - фототаксис, ГТ - геотаксис.

Реактивні зміни ультраструктури мозку імаго Drosophila melanogaster за умов іонізуючого опромінення у ранньому онтогенезі. Виявлено, що при старінні в клітинах мозку дрозофіли відбуваються вікові зміни ультраструктури, що носять деструктивний, інволютивний характер: ущільнення цито- і каріоплазми клітин, їх набряк та вакуолізація, набряк ядра і цитоплазми нейронів з деструкцією практично усіх внутрішньоцитоплазматичних органел, накопичення в цитоплазмі клітин (як нейронів, так і глії) великої кількості щільних тілець, вторинних лізосом, пігментних гранул, ліпідних включень та мембранних залишків, інтрамітохондріальних кристалічних включень та поліморфних внутрішньоядерних включень, підвищення рівня вірусних включень (як в ядрі, так і в цитоплазмі) у порівнянні з молодими комахами. Під впливом малих доз опромінення (0,5 Гр) в клітинах мозку дрозофіл розвивались помірні деструктивні зміни, що загалом нагадували вікові, та досить демонстративні зміни (насамперед, гіперплазія та гіпертрофія мітохондрій), що свідчили про функціональне напруження та підвищення функціональної активності деяких внутрішньоклітинних систем. Під впливом великої дози опромінення (4 Гр) на стадії яйця в клітинах мозку імаго дрозофіли розвивалися виражені деструктивні зміни, що нагадували вікові, але були більш глибокими та руйнівними. Водночас відбувались і процеси гіперплазії гранулярного ендоплазматичного ретикулуму та рибосом, а також гіпертрофії мітохондрій, збільшувалась кількість ламелярних структур гліального походження, які оточували нейрони, що свідчить про розвиток компенсаторних процесів та збільшення функціональної активності частини клітин на фоні тяжких деструктивних змін іншої частини.

Вплив на тривалість життя опромінення на різних стадіях онтогенезу імаго Drosophila melanogaster. Одним із підходів до рішення питання про співвідношення природного і індукованого радіації старіння є опромінення експериментальних тварин на різних стадіях онтогенезу (Giess M.C., 1980; Фролькис В.В., Мурадян Х.К., 1992). При вивченні впливу однократного опромінення на різних стадіях імагінального життя як для самців (6, 13, 20 діб), так і для самок (6, 18, 26 діб) було показано, що ступінь скорочення ТЖ опромінених мух знаходиться в прямій залежності від дози опромінення. Показано, що більш чутливі до впливу опромінення самці. Якщо у самок до статистично достовірного скорочення СТЖ у порівнянні з контролем (неопроміненими мухами) призводив тільки вплив у найбільшій з використаних доз (400 Гр), то у самців СТЖ починає скорочуватися вже починаючи з дози 56 Гр. Із збільшенням віку опромінення у дозі 400 Гр інтенсивність перебігу старіння наближається до такої в контролі (рис. 2.). Це може пояснюватись як зниженням з віком чутливості до опромінення, так і наявністю певного рівня міцності організму, сумісного з життям, нижче якого зниження параметрів життєздатності неможливе. Опромінення в дозах менших за 400 Гр майже не вплинуло на темп старіння (за моделлю Гомперця). Аналіз інтенсивності смертності комах відразу після опромінення дозою 400 Гр у старшій віковій групі виявив статеві відмінності в характері смертності: у самців спостерігали підвищення рівня ініціальних ушкоджень, тобто, смертність підвищувалася в результаті розвитку радіаційного синдрому, ніяк не пов'язаного із старінням, а у самок наведені дози опромінення призводять до підвищення темпу старіння. За даними дисперсійного аналізу, опромінення на більш пізніх стадіях впливає насамперед на чинники "дорослої" смертності. Виявлена закономірність може свідчити про те, що при опроміненні на ранніх стадіях імагінального онтогенезу (6 діб) мухи, завдяки значній потужності гомеостатичних систем, можуть акумулювати радіаційні ушкодження з їхньою наступною реалізацією в більш пізніх вікових періодах. У той же час опромінення у віці 18 та 26 діб призводить до негайного реагування опромінених популяцій дрозофіли, що виражається в збільшенні смертності безпосередньо після опромінення. Оскільки, як показано нами раніше, чинник пізнього виживання відображає ендогенну компоненту старіння, можна припустити, що в першому випадку мова йде про пострадіаційне прискорення старіння, а в другому - про розвиток радіаційного синдрому, що має до старіння опосередковане відношення. Чим молодше вік, в якому здійснювали опромінення, тим виразніше змінювався темп постаріння комах. З підвищенням віку опромінення радіаційна смертність накладається на ефект нормальної смертності і може свідчити, що з віком чутливість до опромінення знижується.

Рис. 2 Інтенсивність смертності самців дрозофіл, опромінених на стадії імаго у віці 6, 13 та 20 діб

Порівняння впливу гострого та фракціонованого рентгенівського опромiнення на бiологiчний вiк, темп старіння та тривалiсть життя Drosophila melanogaster. Порівняння однакових доз гострого і фракціонованого опромінення імаго дрозофіл дозволило виявити, що при фракціонуванні дози знижується негативний вплив опромінення на ТЖ (рис. 3.). Тоді, як гостре опромiнювання мух в молодому вiцi призводило до зниження середньої та максимальної ТЖ комах, спричиняло підвищення їх БВ, прискорювало темп старіння, фракціонування дози опромінення в меншій мірі знижувало середню ТЖ самців, підвищувало їх БВ і, навіть, підвищувало ередню ТЖ самок та знижувало їх БВ (підвищення витривалості до стресів) у порівнянні з контролем (що свідчить про кращу резистентність самок до опромінювання). У опромінених самок спостерігали пригнічення фекандильності. Виявлено віддалений ефект гострого опромінення - зміну смертності і БВ через 20-30 діб після опромінення.

Рис. 3 Криві виживання Drosophila melanogaster після опромінення в гострому та фракціонованому режимах

Примітка. lx - кількість мух, що дожили до віку х.

Комбінований вплив інкорпорованих радіонуклідів та зовнішнього опромінення на передімагінальних стадіях на тривалість життя імаго дрозофіли. Проведено вивчення впливу інкорпорованих радіонуклідів (¹³⁷Cs та ⁹⁰Sr на передімагінальних стадіях) на ТЖ Drosophila melanogaster. Всі впливи спричиняли достовірне (p<0,001) зниження ТЖ комах. Біологічна ефективність ⁹⁰Sr була вище у порівнянні із ¹³⁷Cs. Зовнішнє опромінення комах на стадії личинки модифікувало формування накопиченої дози інкорпорованих радіонуклідів.

Модифікації радіаційного ефекту Drosophila melanogaster термічними та хімічними чинниками

Температурні модифікації радіаційного ефекту. Застосування теплового шоку (37 ^оС, 1 год) і холодового шоку (7 ^оС, 1 год) до опромінення D. melanogaster на стадії яйця у дозі 2 Гр призвело до підвищення чутливості мух до опромінення, ще більшому зниженню СТЖ і МТЖ у порівнянні з опроміненим контролем, зниженню рухової активності, але деякі показники життєдіяльності поліпшувались: підвищувалась витривалість до голодування, підвищувалась фекандильність самок.

Тепловий шок (ТШ) 35,5 0,5 ^о С протягом 2 год до і після рентгенівського опромінення (РО) дрозофіл на стадії імаго у дозі 400 Гр призводив до достовірного підвищення МТЖ як у самців, так і у самок у порівнянні з опроміненими комахами. ТШ перед опроміненням спричинював більший радіопротекторний ефект, ніж ТШ після опромінення. Підвищення БВ у самців в групах “РО + ТШ” і “ТШ + РО” і зниження такого у самок (порівняно з опроміненими мухами) ще раз підтверджує вищу витривалість самок до опромінення (рис. 4.).

Рис. 4 Біологічний вік самців та самок дрозофіл, які до рентгенівського опромінення (РО) дозою 400 Гр на стадії імаго підлягали обробці тепловим шоком (ТШ) 35,5 0,5 ^о С протягом 2-х годин

Примітки: * - p < 0,05 у порівнянні з контролем; # - p < 0,05 порівняно з опроміненими комахами.

Модифікація радіаційного ефекту за допомогою нітрату алюмінію. Для оцінки комплексного впливу геропромотору нітрату алюмінію (Karlik S.J., et.al., 1980, Bjorksten J., 1980) та рентгенівського опромінення на ТЖ дрозофіл, хімікат в концентрації 20 г/л додавали у корм на стадії імаго з 3 по 6 добу перед опроміненням у дозі 400 Гр. Збіг ряду симптомів радіаційного ураження і дисбалансу алюмінію в організмі дозволив припустити, що найбільш вірогідним результатом буде адитивність вивчених факторів або їх синергізм. Однак, отримані нами результати дозволяють зробити висновок, що сумації пошкоджуючих ефектів опромінення і нітрату алюмінію не відбувається. Споживання хімікату опроміненими мухами (ТЖ яких була значно нижче, ніж у інтактних комах), призводило до статистично значимого скорочення ТЖ (p<0,01) у порівнянні з опроміненими мухами, котрим хімікат не додавали. В той же час виявлено, що можливо не тільки послаблення негативного впливу радіаційного фактору за допомогою солей алюмінію (зниження БВ самок), але й покращання життєздатності (як виживання, так і БВ) при їх додаванні в корм неопроміненого контролю. Таким чином, додавання до корму мух нітрату алюмінію може приводити до ефекту "парадоксального стимулювання" (гормезису): зменшення БВ у порівнянні з інтактним контролем (у самців - при тестуванні на 25 добу та на 32 добу імагінального життя, у самок - на 6 добу імагінального життя). У всіх інших варіантах впливу БВ був вищий у порівнянні з контрольним рівнем. Негативний вплив на виживання мух реалізується перш за все безпосередньо після застосування хімікату, але потім послаблюється (більше впливає на СТЖ, ніж на МТЖ). Висловлюється припущення, що нітрат алюмінію змінює темп вікової смертності мух внаслідок своїй токсичності, а не модифікації темпу старіння як такого.

Рис. 5 Інтенсивність смертності дрозофіл, що вживали нітрат алюмінію (Ал) після опромінення на стадії імаго у дозі 400 Гр

Примітка. ln(Rt) - логарифм інтенсивності смертності

Модифікація радіаційного ефекту ауринтрикарбоновою кислотою. Радіація спроможна індукувати апоптоз, у тому числі й у дрозофіли (Зайнуллін В.Г., 1999). Беручи до уваги, що дерегуляція контролю апоптозу є кроком, що лімітує швидкість старіння (Tomei L.D., 1998), можна припустити, що радіація змінює темп природного старіння організму, дерегулюючи контроль механізмів апоптозу. Додавання інгібітору апоптозу ауринтрикарбонової кислоти (АТК) до корму дрозофіл на передімагінальних стадіях (100 мг/л) показало, що препарат здатен суттєво змінювати резистентність комах до опромінення, але сам по собі у такій дозі не спричиняв помітного впливу на ТЖ. У комах, що вживали АТК, не виявлено змін за ТЖ у порівнянні з контролем. Додавання АТК при опроміненні самців у дозі 0,5 Гр призвело до вираженого радіопротекторного ефекту: СТЖ достовірно збільшилася у порівнянні не тільки з опроміненим контролем, а й з інтактним контролем (тобто, в даному випадку спостерігався не тільки радіопротекторний, а й геропротекторний ефект). Додавання АТК на передімагінальних стадіях призвело до зниження локомоторної активності (ЛА) імаго у порівнянні з контролем. Виявлено зниження ЛА у опромінених самців. Застосування АТК у комбінації з опроміненням призводило до ще більш вираженого зниження ЛА. Аналіз отриманих даних дозволяє зробити висновок, що АТК може демонструвати радіопротекторний (і навіть геропротекторний) ефект.

Висновки

Досліджені радіаційні, фізичні та хімічні фактори істотно змінюють перебіг фізіологічних процесів, зумовлених природним старінням; вплив цих факторів залежить від стадії онтогенезу дрозофіли і статі комах. Найбільші зміни темпу старіння зумовлені радіаційним чинником; його ефект неоднозначно модифікується впливом теплового шоку, застосуванням алюмінію та ауринтрикарбонової кислоти.

Виявлено статеві відмінності реакції комах на опромінення: самці демонструють нижчу резистентність до радіації порівняно із самками, але кращу спроможність у вияві гормезисних ефектів.

Продемонстровано нелінійний характер змін як фізіологічних показників, так і тривалості життя Drosophila melanogaster після опромінення у різних дозах: великі дози спричиняють радіаційний синдром, середні - прискорюють темп смертності, а в діапазоні малих доз можливі прояви радіаційного гормезису.

Виявлено відмінності біологічного ефекту радіації в залежності від стадії розвитку комах, на якій здійснюється радіаційний вплив: опромінення на стадії яйця спричиняє підвищення рівня смертності молодих комах, не впливаючи на темп старіння тих, що вижили, а опромінення на стадії імаго прискорює темп старіння.

Опромінення дрозофіл у дозі 0,5 Гр на стадії яйця викликало розвиток в клітинах мозку імаго гіперплазію та гіпертрофію мітохондрій, що свідчить про функціональне напруження деяких внутрішньоклітинних систем. Опромінення у дозі 4 Гр на стадії яйця призводило до виражених деструктивних змін, що нагадували вікові, а саме: ущільнення цито- і каріоплазми нейронів, їх набряк та вакуолізацію, накопичення в цитоплазмі клітин (як нейронів, так і глії) великої кількості щільних тілець, вторинних лізосом, пігментних гранул, ліпідних включень та мембранних залишків, підвищення рівня вірусних включень (як в ядрі, так і в цитоплазмі). Водночас відбувались і процеси гіперплазії гранулярного ендоплазматичного ретикулуму та рибосом, а також гіпертрофії мітохондрій, збільшувалась кількість ламелярних структур гліального походження, які оточують нейрони, що свідчить про розвиток компенсаторних процесів та збільшення функціональної активності частини клітин на фоні тяжких деструктивних змін іншої частини.

При опроміненні у дозі 400 Гр на стадії імаго комах виявлено короткочасну стимуляцію фізіологічних показників та віддалений негативний ефект (через 20-25 діб після опромінення), який проявлявся у підвищенні біологічного віку та смертності комах. Опромінення молодих імаго викликало прискорення темпу старіння, а опромінення імаго у другій половині життя призвело до розвитку радіаційного синдрому. З віком чутливість до опромінення у дрозофіл на стадії імаго знижувалася.

Додавання інкорпорованих радіонуклідів (¹³⁷Cs та ⁹⁰Sr) в корм на передімагінальних стадіях Drosophila melanogaster призводило до достовірного зниження ТЖ комах. Біологічна ефективність ⁹⁰Sr була вище у порівнянні із ¹³⁷Cs. Зовнішнє опромінення комах на стадії личинки модифікувало формування накопиченої дози інкорпорованих радіонуклідів.

Продемонстровано що застосування теплового шоку перед опроміненням на стадії яйця призводить до модифікації радіаційних ефектів: короткочасній стимуляції деяких фізіологічних показників з подальшим зниженням тривалості життя. Застосування теплового шоку перед опроміненням на стадії імаго спричинює більший радіопротекторний ефект, ніж після опромінення.

Додавання до корму мух нітрату алюмінію у дозі 20 г/л привело до гормезису (покращення біологічного віку та подовження тривалості життя комах), а у поєднанні з опромінюванням у великій дозі (400 Гр) посилювало негативний ефект радіації.

Застосування інгібітору апоптозу ауринтрикарбонової кислоти (АТК) після опромінення у малій дозі (0,5 Гр) на стадії яйця спричинювало радіопротекторний ефект; при опроміненні у великій дозі (2 Гр) застосування АТК збільшувало ушкоджуючий ефект радіації.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Коваль О.А., Кошель Н.М., Вайсерман А.М., Войтенко В.П. Радиационное старение Drosophila melanogaster // Пробл. старения и долголетия. 1994. 4, №2. 193-202. (Здобувач досліджував смертність комах та розраховував їх тривалість життя, проводив статистичну обробку отриманих даних).

Вайсерман О.М., Кошель Н.М., Войтенко В.П. Тривалість життя Drosophila melanogaster після рентгенівського опромінення на стадії личинки // Биологический Вестник Харьковского ун-та. 1998. 2, № 1. 34-37. (Здобувач здійснював методику опромінення комах на стадії личинки, досліджував смертність комах та розраховував їх тривалість життя).

Кошель Н.М., Вайсерман А.М., Войтенко В.П. Влияние облучения на стадии яйца на жизнеспособность и продолжительность жизни имаго Drosophila melanogaster и их потомков // Пробл. старения и долголетия. 1999. 8, № 1. 16-21. (Особистий внесок здобувача полягає у налагодження методик визначення інтенсивності метаболізму та маси тіла комах, розрахунку темпу вимирання комах, оформленні отриманих даних в таблиці та рисунки).

Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Войтенко В.П. Влияние рентгеновского облучения в раннем онтогенезе на жизнеспособность и продолжительность жизни Drosophila melanogaster // Пробл. старения и долголетия. 2000. 9, № 1. 33-41. (Здобувач приймав участь у формуванні таблиць смертності комах, застосуванні моделі Гомперця до даних смертності, статистичній обробці отриманих даних).

Войтенко В.П., Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Мозжухина Т.Г., Литошенко А.Я. Влияние рентгеновсого облучения в раннем онтогенезе на структурно-функциональную организацию ДНК и продолжительность жизни Drosophila melanogaster // Пробл. старения и долголетия. 2000. 9, № 4. 323-330 (Особистий внесок здобувача полягає у підготовці біологічного матеріалу для морфологічних та молекулярних досліджень, формуванні таблиці смертності та розрахунку тривалості життя комах).

Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Войтенко В.П. Гормезис та його можлива роль при експериментальному вивченні геропротекторів // Биологический Вестник Харьковского ун-та. 2000. 4, № 1-2. 37-41. (Здобувач приймав участь у проведенні тестів для розрахунку БВ комах (тест на локомоторну активність, витривалість до стресів (тепловий шок та позбавлення корму), здійснював статистичне порівняння отриманих даних).

Vaiserman A.M., Koshel N.M., Voitenko V.P. Influence of a x-ray irradiation in early ontogenesis on viability and duration of life in Drosophila melanogaster // Problems of ageing and longevity. 2000. V. 8, N 4, P. 10-15 (Дисертант проводив тестування фізіологічних змін комах на стадії імаго, розраховував тривалість життя, здійснював статистичне порівняння даних).

Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Войтенко В.П. Взаимосвязь репродуктивной активности и продолжительности жизни Drosophila melanogaster // Пробл. старения и долголетия. 2001. 10, № 1. 11-21. (Здобувач проводив заміри репродуктивної активності комах, готував таблицю смертності мух).

Кошель Н.М., Вайсерман А.М., Савінова В.А., Войтенко В.П. Температурні модифікації радіаційного ефекту у Drosophila melanogaster // Вісник Черкаського ун-ту. Біол. науки. 2002. вип. 32. С. 92-97. (Здобувач виконував експериментальну частину по вивченню тривалості життя та фізіологічних параметрів комах, розраховував біологічний вік комах).

Кошель Н.М., Вайсерман О.М., Савінова В.А., Войтенко В.П. Модифікація радіаційно-індукованого старіння Drosophila melanogaster за допомогою інгібітору апоптозу ауринтрикарбонової кислоти // Вісник Черкаського ун-ту. Біол. науки. 2002. вип. 39. С. 84-87 (Дисертант виконував експериментальну частину по вивченню тривалості життя та фізіологічних параметрів комах, здійснював статистичну обробку отриманих даних, готував текст статті).

Вайсерман А.М., Литошенко А.Я., Квитницкая-Рыжова Т.Ю., Кошель Н.М., Мозжухина Т.Г., Михальский С.А., Войтенко В.П. Молекулярные и клеточные аспекты радиационного гормезиса у Drosophila melanogaster // Цитология и генетика. 2003. 37, № 3. С. 41-48 (Особистий внесок здобувача полягає у підготовці біологічного матеріалу для морфологічних та молекулярних досліджень, підготовці таблиць смертності, розрахунок тривалості життя комах та вимірюванні ряду фізіологічних параметрів комах).

Vaiserman A.M., Koshel N.M., Litoshenko A.Y., Mozzhukhina T.G., Voitenko V.P. Effects of X-irradiation in early ontogenesis on the longevity and amount of the S1 nuclease-sensitive DNA sites in adult Drosophila melanogaster // Biogerontology. 2003. 4. P. 9-14 (Дисертант виконував експериментальну частину по вивченню тривалості життя та фізіологічних параметрів комах, проводив статистичну обробку результатів дослідження).

Кошель Н.М., Вайсерман А.М., Кутлахмєдов Ю.О., Михєєв О.М., Войтенко В.П. Вплив інкорпорованих радіонуклідів на тривалість життя Drosophila melanogaster. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології. Київ, 2004. Вип. 10. с. 347-352 (Дисертант фіксував смертність комах, розраховував середню та максимальну тривалість життя та проводив статистичне порівняння отриманих даних).

Vaiserman A.M., Koshel N.M., Mechova L.V., Voitenko V.P. Cross-life stage and cross-generational effects of irradiations at the egg stage on Drosophila melanogaster life histories // Biogerontology. 2004. 5. P. 327-337 (Дисертант опрацьовував методику опромінення комах на стадії яйця, приймав участь у підготовці таблиці смертності, розраховував середню та максимальну тривалість життя комах, проводив статистичне порівняння результатів дослідження).

Анотація

Кошель Н.М. Вплив радіаційних, термічних та хімічних чинників на різних стадіях онтогенезу на тривалість життя та біологічний вік Drosophila melanogaster - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню змін біологічного віку та тривалості життя Drosophila melanogaster, спричинених впливом чинників фізичної та хімічної природи на різних стадіях онтогенезу комах.

Показано, що опромінення мух на стадії яйця спричинює підвищення рівня смертності молодих дорослих комах (імаго), а опромінення на імагінальній стадії прискорює темп старіння. При опроміненні імаго виявлено короткочасну фізіологічну стимуляцію з подальшим погіршенням (підвищенням) біологічного віку та смертності комах. Опромінення на стадії яйця у малій дозі призвело до ультраструктурних змін клітин мозку імаго, які свідчать про функціональне напруження внутрішньоклітинних систем, а опромінення у великій дозі призвело до виражених деструктивних змін, що нагадують вікові. Показано зниження з віком чутливості мух до опромінення. Виявлено статеві відмінності реакції комах на стрес: самці демонструють нижчу резистентність до стресу порівняно із самками, але кращу спроможність прояву гормезисних ефектів. Показано, що застосування теплового шоку перед опроміненням спричинює більший радіопротекторний ефект, ніж після опромінення. Застосування хімічних препаратів (нітрат алюмінію та ауринтрикарбонова кислота) у дозах, що не чинять негативного впливу на фізіологічні параметри неопромінених комах, може спричинити токсичні ефекти у опромінених.

Ключові слова: життєздатність, біологічний вік, опромінення, інтенсивність смертності, тривалість життя, Drosophila melanogaster.

Аннотация

Кошель Н.М. Влияние радиационных, термических и химических факторов на разных стадиях онтогенеза на продолжительность жизни и биологический возраст Drosophila melanogaster - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных - Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2005.

Диссертация посвящена изучению изменений биологического возраста и длительности жизни Drosophila melanogaster, вызванных влиянием факторов физической и химической природы на разных стадиях развития мух.

Выявлена нелинейная зависимость изменения физиологических показателей и длительности жизни Drosophila melanogaster от дозы рентгеновского облучения. Показано, что облучение мух на стадии яйца вызывает увеличение уровня смертности молодых мух (имаго), а облучение на имагинальной стадии ускоряет темп старения. Сразу после облучения насекомых на стадии имаго в дозе 400 Гр выявлена кратковременная стимуляция физиологических показателей (снижение биологического возраста), с дальнейшим повышением биологического возраста и смертности насекомых (ускорение темпа старения).

Облучение дрозофил на стадии яйца в дозе 0,5 Гр привело к ультраструктурным изменениям клеток мозга имаго (гиперплазия и гипертрофия митохондрий), которые свидетельствуют о функциональном напряжении внутриклеточных систем, а облучение в дозе 4 Гр на стадии яйца приводило к выраженным деструктивным изменениям, сходным с изменениями в нервных клетках при нормальном старении дрозофил, а именно: уплотнение цито- и кариоплазмы клеток, набухание их и вакуолизацию, набухание ядра и цитоплазмы нейронов с деструкцией практически всех внутренних цитоплазматичних органел, накопление в цитоплазме клеток (как нейронов, так и глии) большого количества плотных телец, вторичных лизосом, пигментных гранул, липидных включений и мембранных остатков, интрамитохондриальных кристаллических включений и полиморфных внутриядерных включений, повышение уровня вирусных включений (как в ядре, так и в цитоплазме). Вместе с тем происходили и процессы гиперплазии гранулярного эндоплазматического ретикулума и рибосом, а также гипертрофия митохондрий, увеличивалось количество ламелярных структур глиального происхождения, которые окружают нейроны, что свидетельствует о развитии компенсаторных процессов и увеличении функциональной активности части клеток на фоне тяжелых деструктивных изменений другой части.

...