Метаболіти бактерій роду Pseudomonas як селективний фактор стійкості цукрових буряків до бактеріальних хвороб

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Метаболіти бактерій роду Pseudomonas як селективний фактор стійкості цукрових буряків до бактеріальних хвороб

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Створення форм сортів і гібридів рослин цукрових буряків, стійких до захворювання, є одним із важливих напрямів біотехнології. Це обумовлено великими втратами врожаю цукрових буряків, які спричинені грибними, бактеріальними і вірусними захворюваннями. В Україні втрати врожаю цукрових буряків від бактеріозів внаслідок загибелі рослин, зниження врожайності і цукристості коренеплодів складають близько 20% (Запольская и др., 2003). Цю проблему складно вирішити, використовуючи агротехнічні, хімічні і біологічні заходи захисту рослин, оскільки вони не мають достатньої ефективності.

Цукрові буряки - важлива технічна культура, яка є основним джерелом сировини для цукрової промисловості України, оскільки містить 19 - 22% цукру. Такі сорти як Ялтушківський однонасінний 64, Білоцерківський однонасінний 45, диплоїдні гібриди Ялтушківський ЧС 72, Верхняцький ЧС 63, триплоїдні гібриди Каверось, Роберта широко вирощуються в зоні Лісостепу та Поліссі. Вони перевищують стандарт за врожайністю коренів на 12,7%, за збором цукру - на 13,3% (Роїк, 2003).

Одержання нових сортів цукрових буряків як дворічної культури триває 15 - 16 років (Зубенко, 1989). Одним із нових перспективних шляхів підвищення ефективності селекційного процесу є використання сучасних методів біотехнології, які дозволяють розширити спектр генетичної різноманітності (сомаклональна варіабельність, соматична гібридизація, індукований мутагенез, генетична інженерія) і скоротити термін проведення селекції. Значне місце в вирішенні цих задач займає клітинна селекція, яка грунтується на відборі клітинних популяцій, стійких до селективного фактора (Балков, 1987, Роїк і ін, 2004).

На сьогодні в нашій країні і в світі досягнуті значні результати в клітинній селекції. Зокрема, створені лінії картоплі, стійкі до фітофторозу (Кукушина, Дорошенко, 1987); томатів - до альтернаріозу (Аврова, 1994); рису - до пірікуляріозу (Данлади, 2000); люцерни і конюшини - до фузаріозу (Мазин и др., 1994, Масленников и др., 1994); кормових буряків - до бактеріозів (Губанова и др., 1999, Губанова и др., 2000) тощо. Як правило в якості селективного чинника використовуються фітотоксичні метаболіти білкової і небілкової природи, виділені із патогенів.

Виходячи з цього надзвичайно актуальною є розробка біотехнологічних схем клітинної селекції з використанням індукованого мутагенезу для одержання форм цукрових буряків, стійких до найбільш шкодочинних збудників бактеріозів Pseudomonas syringae pv. aptata (Brown & Jamieson 1913) Young, Dye & Wilkie 1978 та Pseudomonas wieringae (Elliot) Savulesku 1947. Крім того, важливим є виділення фітотоксичних метаболітів збудників, які відіграють ключову роль у патогенезі і можуть бути успішно застосовані в клітинній селекції як селективний фактор. Вивченню цієї проблеми і присвячена дана дисертація.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямом науково-дослідної тематики кафедри екобіотехнології та біорізноманіття за темою «Фізіолого-біохімічні і біотехнологічні дослідження в підвищенні ефективності селекції цукрових буряків» (№ державної реєстрації 0104U004555).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було вивчення можливості використання експериментального мутагенезу і клітинної селекції в біотехнології рослинних клітин для одержання калюсних ліній і рослин-регенерантів цукрових буряків, резистентних до фітотоксичних метаболітів Pseudomonas syringae pv. aptata ((Brown & Jamieson 1913) Young, Dye & Wilkie 1978) та Pseudomonas wieringae ((Elliot) Savulesku 1947). Для досягнення цієї мети були поставлені наступні основні завдання:

Ш вивчити морфогенетичну активність різних сортів і гібридів цукрових буряків та відібрати для подальшої роботи матеріал з високим морфогенетичним потенціалом in vitro;

Ш одержати і дослідити хімічний склад, фітотоксичну і серологічну активність метаболітів P. syringae pv. aptata та P. wieringae та можливість їхнього використання як селективних факторів для клітинної селекції;

Ш розробити схему клітинної селекції цукрових буряків in vitro;

Ш вивчити можливість використання індукованого мутагенезу у селекції клітинних ліній цукрових буряків на стійкість до P. syringae pv. aptata та P. wieringae;

Ш дослідити реакцію клітин та рослин на стрес;

Ш оцінити стійкість рослин-регенерантів, одержаних в результаті селекції, до збудників бактеріозів і перевірити господарсько цінні ознаки.

Об'єкти дослідження: фітопатогенні бактерії P. syringae pv. aptata і P. wieringae та їхні метаболіти, як селективні чинники, сорти і гібриди цукрових буряків.

Предметом дослідження: були фітотоксичні властивості метаболітів P. syringae pv. aptata і P. wieringae, можливість використання методів експериментального мутагенезу і клітинної селекції для одержання стійких до даних патогенів рослин цукрових буряків.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використано фітопатологічні, біохімічні, серологічні, біотехнологічні методи досліджень. Ліпополісахариди екстрагували 0,85% розчином хлориду натрію, фітотоксичну активність одержаних препаратів визначали за допомогою загальноприйнятих мікробіологічних методів. Резистентні калюсні лінії і рослини-регенеранти цукрових буряків одержували переривчастим методом відбору.

Наукова новизна одержаних результатів.

· Вперше розроблені і запропоновані методи клітинної селекції та індукованого мутагенезу in vitro в біотехнології клітин цукрових буряків, які дозволяють одержувати калюсні лінії і рослини цукрових буряків з підвищеною стійкістю до збудників бактеріозів P. syringae pv. aptata і P. wieringae.

· Запропоновані три схеми селекції in vitro для цукрових буряків, які базуються на культивуванні калюсних або суспензійних клітинних культур після обробки мутагенами протягом 3 - 15 пасажів з чередуванням селективних і неселективних умов.

· Вперше показана доцільність використання в якості селективного фактора фітотоксичних метаболітів фітопатогенних бактерій.

· Встановлено, що метаболіти Pseudomonas syringae pv. aptata і Pseudomonas wieringae, використані як селективний фактор у концентраціях 6,0% і 8,0% та 0,6% і 0,8%, відповідно, здатні підвищувати стійкість рослин цукрових буряків до бактеріозів на 2 - 6 бали (9 бальна шкала).

· Доведено, що підвищення стійкості на клітинному та тканинному рівнях, експресується на рівні рослин-регенерантів.

· Показана участь пероксидази в адаптації клітин до дії стрес-фактора.

· Виявлено, що N-нітрозо-N-метилсечовина індукує генетичні зміни в клітинах, які дозволяють одержувати мутантні рослини з підвищеною стійкістю до збудників бактеріозів з найбільшою ефективністю.

· Вперше, в результаті клітинної селекції одержані рослини-регенеранти, які перевищують стійкість вихідних форм до дії досліджуваних патогенів на 2 - 4 бали, а для окремих генотипів на 6 балів.

Практичне значення одержаних результатів. На основі одержаних результатів розроблені методичні рекомендації «Клітинна селекція калюсних ліній цукрових буряків на стійкість до збудника бактеріозу Pseudomonas syringae pv. aptata», які запропоновані біотехнологічним і селекційним центрам, науково-дослідним закладам. Результати роботи можуть бути використані для створення нових сортів і гібридів цукрових буряків, стійких до фітопатогенів P. syringae pv. aptata і P. wieringae та розробці методів боротьби з бактеріальними хворобами рослин у сільському господарстві. Вищезазначені методичні рекомендації використовуються для проведення лабораторно-практичних занять студентів вищих навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, одержана автором особисто. Автором одержано калюсні лінії і рослини-регенеранти цукрових буряків в умовах in vitro, отримано ліпополісахарид-білкові комплекси P. syringae pv. aptata та P. wieringae та вивчено їхню серологічну і фітотоксичну активності, вивчено вплив культурального фільтрату P. syringae pv. aptata і P. wieringae на ріст і розвиток калюсних ліній, запропоновано схеми проведення клітинної селекції для одержання резистентних рослин-регенерантів цукрових буряків. Вибір теми, планування окремих розділів, аналіз результатів, їхнє узагальнення, формулювання основних положень і висновків, підготовку до друку наукових статей проведено особисто за консультації наукового керівника дисертаційної роботи к.б.н. О.Л. Кляченко.

Вивчення хімічного складу препаратів ЛПСБ P. syringae pv. aptata та P. wieringae, активності та ізоферментного спектру пероксидаз резистентних калюсних ліній і рослин-регенерантів цукрових буряків здійснювали спільно з к.б.н. Л.М. Ващенко, яка є співавтором публікацій дисертанта.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на: Міжнародній науково-практичній конференції «Прийоми підвищення урожайності рослин: від продуктивності фотосинтезу до сучасних біотехнологій» (Київ, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції «Принципи і методи оптимізації селекційного процесу сільськогосподарських рослин» (Мінск, 2005); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології НАН України (Київ, 2005); ІІІ Московському міжнародному конгресі «Біотехнологія: стан і перспективи розвитку» (Москва, 2005); 9-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених (Пущино, 2005); ХІІ Міжнародній конференції студентів, аспірантів і молодих вчених «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів «Стан та перспективи розвитку агропромислового виробництва в сучасних умовах» (Кіровоград, 2005); Міжнародній конференції «Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія» (Київ, 2005); Науковій конференції молодих учених «Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології» (Ужгород, 2005).

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 13 наукових працях, з них 5 статей у фахових наукових виданнях, 8 матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 174 сторінках машинописного тексту. Складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 5 розділів експериментальної частини, обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел літератури, який містить 279 посилання, в т.ч. 118 іноземних авторів. Дисертаційна робота містить 26 таблиць і 20 рисунків.

Основний зміст роботи

рослина регенерант серологічний селективний

Розділ 1. Огляд літератури

В огляді літератури, який складається з 4 підрозділів, висвітлено біологічні властивості збудників захворювань цукрових буряків, описано вплив фітопатогенних бактерій на фізіолого-біохімічні властивості рослин, розглянуто відомості про зміну активності антиокисних ферментів за інфікування рослин збудниками бактеріозів, а також про їхнє значення у формуванні системної стійкості, наведено дані щодо хімічного складу і будови ліпополісахаридів P. syringae pv. аptata і P. wieringae та їхньої біологічної активності і ролі в розвитку бактеріозів. Проаналізовано дослідження з клітинної селекції рослин на стійкість до фітопатогенів. Обгрунтовано перспективність методів біотехнології для одержання форм цукрових буряків з підвищеною стійкістю до фітопатогенів.

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об'єктами досліджень були 12 генотипів цукрових буряків з різною стійкістю до церкоспорозу: чутливі - диплоїдні гібриди Ялтушківський ЧС 72, Український ЧС 70, Верхняцький ЧС 63, Уладово-Верхняцький ЧС 37, триплоїдні гібриди Олександрія, Каверось, відносно стійкі - сорти Білоцерківський однонасінний 45, Ялтушківський однонасінний 64, триплоїдні гібриди Білоцерківський ЧС 57, Лена, Перла, Роберта; фітопатогенні бактерії: Pseudomonas syringae pv. aptata (Brown & Jamieson 1913) Young, Dye & Wilkie 1978 штами 8544, 8545, Pseudomonas wieringae (Elliot) Savulesku (1947) штами 7921, 7922, 7923, Pseudomonas syringae pv. syringae 8414 Van Hall 1902. Фітотоксичні та серологічні властивості цих бактерій вивчали загальноприйнятими методами (Бельтюкова и др., 1968).

ЛПС екстрагували 0,85%-м водним розчином NaCl (Захарова, Косенко, 1982) та очищали діалізом і ультрацентрифугуванням. Вміст білка визначали методом O. Lowry et al. (1951), вуглеводів - за реакцією з фенолом та сірчаною кислотою, 2-кето-3-дезоксиоктонової кислоти - за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Захарова, Косенко, 1982), жирних кислот - методом газорідинної хроматографії метилових ефірів жирних кислот (Brian, Gardner, 1967).

Дослідження культури ізольованих клітин, тканин і органів рослин цукрових буряків проводили відповідно з методичними вказівками (Мусієнко, Панюта, 2001).

Для одержання резистентних клітинних ліній цукрових буряків застосовували переривчастий метод відбору (Маруненко, 1991). Калюс або суспензійні культури висівали на агаризоване селективне середовище (Бутенко, 1986, Урманцева, 1988). Для селекції використовували: фільтрат культуральної рідини (бактерії культивували протягом 5 діб в картопляному бульйоні при температурі 28°С); суспензію клітин, прогрітих при 100°С протягом 2,5 год., так як прогріті клитини це О-антигени, роль яких виконують ЛПС (Бельтюкова, 1968).

З метою індукцій мутацій в клітинах цукрових буряків використовували високоефективні мутагени: N-нітрозо-N-метилсечовина в рідкому поживному середовищі при рН=5,6, клітини інкубували в розчині мутагену конценрацією від 5 мМхгод до 25 мМхгод; г-опромінення, сумарна доза якого складала 20 Гр протягом 14 хв (Каранова, 1999).

Активність пероксидази вимірювали спектрофотометричним методом за оптичною густиною продуктів реакції, які утворилися при окисленні гваякола за певний проміжок часу (Ермакова, 1987). Для електофоретичного розділення ізоферментів пероксидази використовували вертикальні блоки 7,5% поліакриламідного геля, застосовуючи систему геля №1 з тріс-гліциновим електродним буфером рН 8,3, запропоновану Маурером Г. (Маурер, 1971).

Для характеристики цитологічних особливостей клітинних популяцій культури фіксували в суміші Карнуа, тимчасові препарати фарбували розчином оцетоорсеіну (Паушева, 1980).

Стійкість до бактеріальних хвороб визначали за допомогою: 1) рослини призначені для оцінки, віком 3 ? 4 тижні, виймали із пробірок, звільняли від агару, корінці їх підрізали і поміщали в суспензію клітин титром 20 млрд. кл/мл (експозиція ? 10 хв.), потім рослини висаджували в горшки з торфом; 2) штучне зараження здійснювали інокуляцією листків уколом крізь краплину бактеріальної суспензії титром 10⁹ кл/мл за стандартом мутності (Бельтюкова, 1968). Облік штучного зараження рослин проводили за 9-ти бальною шкалою (Иванова, 1987)

Цукристість коренеплодів і кількість сухих речовин визначали за (Починко, 1976).

Розділ 3. Калюсогенез і органогенез цукрових буряків (Beta vulgaris L) в культурі in vitro

Клітинна і тканинна селекція рослин базується на культивуванні в стресових умовах in vitro калюсних і суспензійних клітин. Але клітини, які пройшли цикл селекції in vitro, як правило, частково або повністю втрачають здатність до морфогенезу. Тому вивчення впливу генотипу, стану первинного експлантата і гормонального складу поживного середовища на процес калюсогенезу і органогенезу є першочерговим завданням при проведенні робіт з клітинної селекції. Для цукрових буряків ці роботи є особливо актуальними, що пояснюється великою залежністю регенераційного потенціалу його клітин і тканин від генотипу, експлантата і тривалості їхнього культивування in vitro.

Cегменти стебла, листків, сім'ядольних листків та черешків цукрових буряків всіх генотипів культивували на поживному середовищі Мурасіге-Скуга (МС), з різним вмістом фітогормонів. Аналіз приросту сирої маси калюсу і частоти калюсоутворення в залежності від вмісту цитокініна і ауксина в поживному середовищі дозволив зробити висновок, що лише поєднання 6-бензиламінопурину (6-БАП) і нафтилоцтової кислоти (НОК) в певних концентраціях (МС1 - 0,4 мг/л 6-БАП і 2,0 мг/л НОК; МС2 - 0,02 мг/л 6-БАП і 0,1 мг/л НОК) призводить до утворення рихлого світло жовтого добре пасуємого калюсу. Найкраще утворення калюсу спостерігали на експлантатах справжніх і сім'ядольних листків як для гібридів, так і для сортів. При цьому приріст калюсної маси на середовищі МС1 в середньому складав для сортів Ялтушківський однонасінний 64 - 1,12 ± 0,13 г., Білоцерківський однонасінний 45 - 1,56 ± 0,24 г.; для диплоїдних гібридів: Ялтушківський ЧС 72 - 0,67 ± 0,24 г., Верхняцький ЧС 63 - 0,63 ± 0,20 г.; для триплоїдних гібридів: Лена - 1,64 ± 0,06 г., Каверось - 0,98 ± 0,11 г. Приріст калюсної маси на середовищі МС2 був на 4 - 34% нижче, ніж на середовищі МС1.

В результаті проведених досліджень підібрано оптимальні концентрації регуляторів росту для одержання рихлого калюсу 0,4 мг/л 6-БАП і 2,0 мг/л НОК та встановлено, що активність калюсоутворення в основному залежить від вихідного генотипу і типу первинного експлантата.

Суспензійну культуру одержували із добре проліферуючої калюсної тканини світло-жовтого кольору рихлої консистенції всіх генотипів цукрових буряків. Лінії досліджуваних генотипів характеризуються поступовим вступом клітин в активне ділення. Як і при калюсогенезі ріст суспензійних культур сортів Білоцерківський однонасінний 45 і Ялтушківський однонасінний 64, триплоїдних гібридів Перла, Лена, Роберта значно перевищує в лінійній фазі диплоїдні гібриди Український ЧС 70, Верхняцький ЧС 63, Уладово-Верхняцький ЧС 37, Ялтушківський ЧС 72. Вміст клітин в 1 мл середовища у них був в 1,5 рази вище, ніж у диплоїдних гібридів.

Встановлено, що відношення числа мертвих і живих клітин є стабільною величиною в процесі культивування in vitro і складає для сотрів Білоцерківський однонасінний 45 і Ялтушківський однонасінний 64 7:2, для триплоїдних гібридів Перла, Лена, Роберта 8:3; Білоцерківський ЧС 57, Олександрія, Каверось 9:1, для диплоїдних гібридів Український ЧС 70, Верхняцький ЧС 63, Уладово-Верхняцький ЧС 37, Ялтушківський ЧС 72 8:1.

За ступенем агрегованості в усіх суспензійних культурах були виділені три фракції: поодинокі клітини, дрібні і крупні агрегати (більше 50 клітин в агрегаті). Встановлено, що в І пасажі в суспензіях переважали поодинокі клітини, відсоток яких складає 60 - 100%. В IV пасажі частка поодиноких клітин знижувалася до 50%, а співвідношення дрібних і крупних агрегатів було близько 1:1. В VII пасажі відмічалося подальше зниження кількості поодиноких клітин в суспензії не більше 1 - 2%. Тому для подальших досліджень використовували суспензію на 8 ? 10 добу культувування, яка складалася після відстоювання на 78 - 86% із поодиноких клітин і дрібних агрегатів.

Однією із важливих і складних проблем сучасної біотехнології є регенерація цілих рослин із ізольованих клітин, яким властива тотипотентність (реалізація нормального морфогенезу). У всіх генотипів найкраще формування мікророзеток цукрових буряків із морфогенного калюсу спостерігалось на середовищі МС5 з невисоким вмістом 6-БАП (0,05 мг/л), в присутності ауксинів. Частота формування морфогенного калюсу на даному середовищі у вище перерахованих генотипів сягала 51 - 58%. Найбільшою здатністю до регенерації характеризувались калюсні лінії сортів Білоцерківський однонасінний 45, Ялтушківський однонасінний 64 і триплоїдних гібридів Роберта, Лена, Перла, дещо меншою - диплоїдних гібридів Український ЧС 70, Верхняцький ЧС 63, Уладово-Верхняцький ЧС 37, Ялтушківський ЧС 72 (табл. 1).

Таблиця 1. Морфогенез і регенерація пагонів в калюсній культурі сортів та гібридів цукрових буряків на середовищі МС5

Рослини, вирощені із первинного або субкультивованого калюсу цукрових буряків через 3 - 4 тижні після закладання досліду, розмножували живцюванням і для подальших досліджень використовували мікроживці довжиною 1 - 2 см з вкороченими листками, які мають пазушні меристеми. Мікроживці висаджували на свіжі модифіковані поживні середовища МС4, МС5 з додаванням 1 - 2 мг/л індолілмасляної кислоти (ІМК), 10 - 25 мг/л аскорбінової кислоти, 0,05 мг/л 6-БАП, 1,0 - 2,5 мг/л гіберелової кислоти (ГК).

Важливим етапом в одержанні рослин, готових для висадки в грунт, є процес вкорінення проростків, що розвиваються із ізоляту. Для укорінення відбирали пагони з розвинутими листками одного розміру і висаджували на поживне середовище. Найкращі результати вкорінення сортів і гібридів цукрових буряків відмічали на середовищі МС8, яке містить НОК в концентрації 0,5 мг/л.

Таким чином, в результаті проведених досліджень запропоновані модифікації середовища Мурасіге-Скуга для індукції морфогенезу і укорінення рослин-регенерантів цукрових буряків in vitro з метою створення вихідного селекційного матеріалу.

Розділ 4. Характеристика ліпополісахарид-білкових комплексів

Pseudomonas syringae pv. aptata та Pseudomonas wieringae

В дослідженнях використовували штами бактерій: P. syringae pv. aptata 8544, 8545, P. wieringae 7921, 7922, 7923 та P. syringae pv. syringae 8414. Всі штами за штучного зараження в лабораторних умовах проявили патогенні властивості на цукрових буряках. Агресивність їх була різна. Крім того, всі штами спричинювали реакцію надчутливості на тютюні (табл. 2).

Таблиця 2. Характеристика патогенних властивостей штамів

Примітка. + - інтенсивність некротичної реакції

Для подальших досліджень ми відібрали штами P. syringae pv. aptata 8544, P. wieringae 7922, як найбільш агресивні по відношенню до рослини-хазяїна.

Ліпополісахарид-білкові комплекси (ЛПСБ) досліджуваних штамів характеризувалися наявністю вуглеводів, білка, моносахаридів, 2-кето - 3-дезоксиоктонової кислоти (КДО), яка є характерним компонентом ЛПС (табл. 3).

ЛПСБ P. syringae pv. аptata 8544 містить 32,5% вуглеводів, ЛПСБ P. wieringae 7922 - 25,5%. В ЛПСБ обох штамів міститься значна кількість білка: в ЛПСБ P. syringae pv. аptata 8544 - 10,3%, в ЛПСБ P. wieringae 7922 - 11,5%. В одержаних нами препаратах білок не відокремлюється від ЛПС за осадження їх ультрацентрифугуванням. Це свідчить про те, що білок і ЛПС утворюють ліпополісахарид-білковий комплекс.

ЛПСБ P. wieringae 7922 характеризувався високою О-специфічною активністю в гомологічній системі в реакціях кільцепреципітації (титр 1:500000), він утворював не менше двух чітких ліній агарпреципітації в тесті Оухтерлоні. ЛПСБ P. syringae pv. aptata 8544 також був активним в наведених реакціях (титр 1:100000 в реакції кільцепреципітації, одна чітка лінія в агарпреципітації).

В жирнокислотному складі досліджуваних нами ЛПСБ виявлені насичені (додеканова, гексадеканова, октадеканова), ненасичені (гексадеценова, октадецено-ва), циклопропанові (cis - 9,10 - метилгексадеканова) та гідроксизаміщені (3-гідрокси - деканова, 2-гідроксидодеканова) жирні кислоти, що характерно для фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas. У клітинах бактерій виявлені жирні кислоти переважно з парним числом вуглецевих атомів. З них ненасичені жирні кислоти становили 49,59% для P. syringae pv. aptata 8544, 49,21% - для P. wieringae 7922.

Таблиця 3. Хімічний склад і серологічна активність препаратів ЛПСБ P. syringae pv. аptata 8544 і P. wieringae 7922 (від сухої маси ЛПСБ)

Для підтвердження можливості використання прогрітих клітин (ПК) і культуральних фільтратів (КФ) досліджуваних штамів в селекції цукрових буряків перевіряли їхню фітотоксичну активність в середовищі МС. Вже через 3 - 4 години у середовищі з ПК (P. wieringae 7922 0,6; 0,8%; P. syringae pv. aptata 8544 6,0; 8,0%) або з КФ (P. syringae pv. аptata 18%; P. wieringae 6%) спостерігали втрату тургору у листках, а через 24 год в'янення цілих рослин. Про антигенну активність ПК P. syringae pv. аptata та P. wieringae в твердому поживному середовищі (після 3-тижневого їх кокультивування) з О-гомологічною антисироваткою свідчила зона преципітації шириною 8 мм. Таким чином, фітотоксичні метаболіти досліджуваних штамів P. syringae pv. аptata 8544 та P. wieringae 7922 за тривалого кокультивування в МС-середовищі для калюсної тканини цукрових буряків зберігають свою фітотоксичну і серологічну активність, що підтверджує доцільність їхнього використання при одержанні стійких клітинних ліній цукрових буряків.

Розділ 5. Розробка методичних підходів для одержання форм цукрових буряків, стійких до P. syringae pv. аptata та P. wieringae

Інтерес дослідників до фітотоксичних метаболітів патогенних бактерій в останній час зріс в зв'язку з розвитком нетрадиційних методів підвищення стійкості рослин до збудників бактеріальних захворювань, а саме клітинної селекції, коли в якості селективного агенту в більшості випадків використовують культуральний фільтрат (КФ) (сумарний токсин) патогена. Для одержання стійких форм цукрових буряків до P. syringae pv. аptata 8544 і P. wieringae 7922 нами було проведено експерименти за схемою, наведеною на рисунку 1.

Для визначення частоти утворення спонтанних резистентних клонів калюси цукрових буряків висаджували в селективні умови без обробки мутагенами (рис. 1). Селекція на стійкість передбачала встановлення сублетальних конценрацій для бактеріальних метаболітів, що базувалось на порівняльному вивченні дії різних концентрацій КФ на ріст суспензійної культури.

Присутність сублетальних концентрацій 18% КФ Pseudomonas syringae pv. aptata 8544 і 6% КФ Pseudomonas wieringae 7922 в селективних середовищах викликала різке зниження життєздатності клітинних колоній.

Після трьох пасажів калюсу в умовах селективного середовища резистентні експлантати пересаджували на звичайне середовище і культивували протягом 6 тижнів для збереження їх регенераційної здатності. Оскільки в разі сильного пресінгу токсичних метаболітів калюсна тканина повністю втрачає морфогенетичну здатність, був використаний переривчастий метод відбору. Для оцінки стабільності стійкості відібрані калюси повторно культивували на середовищі з метаболітами. При цьому вони поділялись на дві групи: у першої життєздатність була обумовлена адаптацією - ця група калюсних ліній загинула, у другої - лінії активно продовжували ріст, що, можливо, визначалось генетичними змінами. В таблиці 4 наведено стабільність резистентності до КФ серед відібраних калюсних клонів для триплоїдних і диплоїдних калюсних ліній, для калюсних ліній сортів.

Таблиця 4. Стабільність резистентності клітинних ліній, відібраних на поживному середовищі з КФ P. wieringae 7922 та P. syringae pv. аptata 8544 (% стабільних ліній)

З метою індукції мутацій в клітинах цукрових буряків, які б сприяли росту калюсних клітин на селективних середовищах із підвищеною концентрацією фітотоксичних метаболітів використовували високоефективні мутагени г-опромінення і N-нітрозо-N-метилсечовину (N-НМС).

Нами було визначено чутливість калюсних тканин цукрових буряків до ПК P. syringae pv. aptata 8544 і ПК P. wieringae 7922. Істотне зменшення приросту калюсної маси спостерігали за концентрацій ПК P. wieringae 7922 0,6 - 0,8% і P. syringae pv. aptata 8544 6,0 - 8,0%. За обробки клітин цукрових буряків г-опроміненням інтенсивність калюсоутворення на середовищі з 8% ПК P. syringae pv. aptata 8544 і 0,8% ПК P. wieringae 7922 підвищувалася порівняно з інтенсивністю калюсоутворення клітин на цих середовищах без обробки г-опроміненням (табл. 5).

Таблиця 5. Інтенсивність калюсоутворення ліній цукрових буряків на середовищі з ПК P. syringae pv. aptata 8544 та P. wieringae 7922

Таким чином, г-опромінення індукує зміни у клітинах, які дозволили їм стабільно рости на селективному середовищі. Нами відмічено утворення поодиноких колоній на селективному середовищі і стимуляцію їхнього росту вже через 2,5 тижні культивування, тоді як в варіантах без обробки г-опроміненням лише через 4 тижні.

Нами також було вивчено можливість використання для селекції хімічного мутагена N-НМС. Всі досліджені дози мутагена інгібували ріст калюсних тканин. При цьому було відмічено: сублетальну дію на малих дозах (2,5; 5,0 мМхгод) і летальну дію 10 мМхгод та 25 мМхгод. Для подальшої роботи було взято концентрацію 5,0 мМ/год N-НМС. Оскільки відсоток виживання калюсних ліній за концентрацій 8,0% ПК P. syringae pv. aptata 8544 і 0,8% ПК P. wieringae 7922 був відносно високий, з метою інтенсифікації відбору клітин на стійкість концентрацію ПК в поживному середовищі було підвищено для P. syringae pv. aptata 8544 до 24 - 40% та для P. wieringae 7922 до 12 - 28%.

При висіві клітин без обробки N-НМС на середовище із зазначеними концентраціями ПК спостерігали утворення лише нежиттєздатних колоній, тоді як індуковані N-НМС варіанти виявилися більш життєздатними і продовжували з різною інтенсивністю рости на селективних середовищах. Найменша концентрація ПК не впливала на приріст калюсної тканини. Концентрація ПК в середовищі 40% P. syringae pv. аptata 8544 та 28% P. wieringae 7922 виявилась летальною і до кінця першого пасажу всі калюси загинули. Найбільш оптимальними для наших цілій виявились дози ПК P. wieringae 7922 18% і P. syringae pv. aptata 8544 32%, за яких спостерігали суттєве зменшення приросту калюсної маси і частка калюсів здатних до росту не перевищувала 20%. Таким чином, встановлено, що використання високоефективного мутагена N-НМС дозволяє проводити відбір клітинних ліній із підвищеною стійкістю з найбільшою ефективністю.

Нами були одержані стійкі до фітотоксичних метаболітів патогенів клітинні лінії. Однак протягом тривалого селективного відбору деякі з них втратили морфогенетичну компетентність. Найбільшою здатністю до морфогенезу в селективних умовах характеризувались лінії сортів і триплоїдних гібридів Перла, Лена, Роберта, дещо меншою - диплоїдних гібридів. В цілому морфогенетичний потенціал калюсних тканин генотипів із підвищеною стійкістю Білоцерківський однонасінний 45, Ялтушківський однонасінний 64, Лена, Перла, Роберта пригнічувався значно менше ніж у чутливих генотипів. Кількість одержаних резистентних рослин-регенерантів у сортів і триплоїдних гібридів була у два рази вища ніж у диплоїдних гібридів (табл. 6).

Таблиця 6. Вихід резистентних рослин-регенерантів до P. syringae pv. аptata 8544 та P. wieringae 7922

Серед одержаних рослин-регенерантів лише 10 - 20% ліній (в залежності від сорту та гібриду) мали нормальний фізіологічний розвиток, 60 - 84% регенерантів залишилися без розвитку. Регенеранти з різними відхиленнями: розеточні, низькорослі та альбіноси в подальшій роботі не використовували. Для укорінення резистентних рослин-регенерантів цукрових буряків пагони висаджували на поживні середовища доповнені регуляторами росту ІМК, НОК та селективним агентом. Одержані стійкі рослини-регенеранти цукрових буряків відрізнялись повільним ростом і довготривалим укоріненням. Проте здатність рослин-регенерантів утворювати корені як на контрольному, так і на селективному середовищах визначалася генотипом рослин цукрових буряків.

Розділ 6. Реакція клітин та рослин на стрес

Важливою проблемою в дослідженнях з клітинної селекції на стійкість до збудників захворювань є виявлення механізмів резистентності калюсних клітин і рослин-регенерантів до дії стресового фактора.

Нами було виявлено, що сублетальні концентрації ПК і N-НМС спричинюють зміни рівня плоїдності клітин калюсних ліній, що призводить до поліплоїдизації тканин. В шостому пасажі відбувається стабілізація клітинної популяції на певному рівні плоїдності: для диплоїдних ліній це 4х, триплоїдних - 6х. Нами встановлено, що тетраплоїдні і гексаплоїдні клітини стійкіші до дії стресового чинника, ніж модальні класи 2х і 3х.

В літературних джерелах вказувалось на можливість використання показників активності пероксидаз при розробці тестів для оцінки стійкості до збудників, а також значну захисну роль ізоферментів пероксидази в генетичному забезпеченні толерантності рослин до бактеріальних захворювань. За тривалого культивування клітин в стандартних умовах не спостерігали змін пероксидазної активності. Всі досліджувані генотипи були розділені на дві групи. До першої групи відносяться більш стійкі генотипи сортів і триплоїдних гібридів Лена, Перла, Роберта, Білоцерківський ЧС 57. Для даної групи активність пероксидази при 18% ПК P. wieringae залишалася відносно стабільною, тоді як при 32% ПК P. syringae pv. aptata постійно збільшувалася (рис. 2). До другої групи відносяться чутливі генотипи: диплоїдних гібридів і триплоїдних гібридів Олександрія, Каверось. Для даної групи вже в I пасажі при 18% ПК P. wieringae спостерігали значне підвищення пероксидазної активності на 30 - 50% порівняно з контролем, тоді як при 32% ПК P. syringae pv. aptata активність пероксидази залишалася на рівні контролю (рис. 3). У рослин-регенерантів, одержаних після селекції, активність пероксидази в 2 - 2,5 раза вища в порівнянні з рослинами контрольного варіанту.

За розділення ізоферментів пероксидаз рослин цукрових буряків у 7,5% поліакриламідному гелі виявили їх гетерогенність, яка проявлялася в появі нових чи відсутності певних ізоформ пероксидази. В контрольних варіантах сорту Білоцерківський однонасінний 45 виявляється три зони пероксидазної активності з електрофоретичною рухливістю (Rf) 0,09, 0,12 і 0,17 відповідно (рис. 4). На електрофореграмі контрольного варіанту триплоїдного гібриду Роберта виявляється дві зони з Rf 0,09 та 0,17. У рослин одержаних після проведення селекції спостерігали зміни в спектрах пероксидазної активності. У сорту Білоцерківський однонасінний 45 відмічали зникнення зони пероксидазної активності з Rf 0,12 і появу зон з Rf 0,03 і 0,05. У триплоїдного гібриду Роберта після повної схеми селекції спостерігали появу зони з Rf 0,12.

Таким чином, нами встановлено, що після селекції у рослин цукрових буряків підвищення активності пероксидази супроводжується появою нових форм і зникненням деяких старих форм цього фермента. Активність пероксидази може бути одним із маркерів стійкості для відбору рослин-регенерантів із підвищеною стійкістю до патогенів.

Розділ 7. Оцінка стійкості рослин до збудників бактеріозів і перевірка господарсько цінних ознак

Методом штучного зараження нами була здійснена перевірка рослин-регенерантів цукрових буряків на стійкість до збудників. Серед рослин кожного з досліджуваних генотипів, одержаних на селективних середовищах, спостерігали утворення ліній як із підвищеною стійкістю, так і більш чутливих. Більш стійкі до збудників на рівні регенерантів лінії зустрічаються частіше у рослин, одержаних з більш стійких генотипів.

В результаті селекції з 108 ліній досліджуваного матеріалу, одержаного за схемою селекції 1 ? 22,3% ліній мали стійкість вище контролю; з 124 ліній, одержаних за схемою 2 - 29,5%; з 140 ліній, одержаних за схемою селекції 3 - 43,5%. Таким чином, нами встановлено, що найбільшим балом стійкості характеризувалися рослини-регенеранти одержані методом клітинної селекції з використанням ПК і високоефективного мутагену N-НМС.

Враховуючи можливий побічний вплив селекції необхідна всеохоплююча перевірка селекційного матеріалу. Встановлено, що цукристість коренеплодів та маса коренеплодів після селекції не зменшується, що говорить на користь використання запропонованих схем селекції для одержання рослин із підвищеною стійкістю до P. syringae pv. аptata і P. wieringae.

Висновки

1. Вперше для цукрових буряків використана нова біотехнологічна система - культура соматичних клітин рослин in vitro, яка дозволяє одержувати рослини, що мають підвищену стійкість до фітопатогенних бактерій Pseudomonas syringae pv. аptata та Pseudomonas wieringae. Основою методу є культивування оброблених мутагенами калюсних і суспензійних культур на поживних середовищах, які містять фітотоксичні метаболіти бактерій.

2. Проведено порівняльне вивчення морфогенетичного потенціалу тканин і органів цукрових буряків. При цьому виявлено залежність морфогенезу від різноманітних факторів: типу експлантата, вихідного генотипу, середовища і умов культивування. Підібрано оптимальні концентрації регуляторів росту для індукції калюсогенезу (0,4 мг/л 6-БАП і 2,0 мг/л НОК) і морфогенезу (2 мг/л ІМК, 0,05 мг/л 6-БАП, 2,5 мг/л ГК) в культурі in vitro цукрових буряків.

3. Встановлено, що культуральний фільтрат та прогріті клітини P. syringae pv. аptata і P. wieringae мають фітотоксичні властивості та можуть бути використані як селективний фактор. Концентрацію фітотоксичних метаболітів для проведення селекції необхідно підбирати в залежності від сортів і гібридів цукрових буряків.

4. Показано, що використання індукованого мутагенезу в селекції на стійкість до збудників бактеріозів дозволяє прискорити процес селекції і з високою ефективністю проводити відбір клітинних ліній із підвищеною стійкістю. Найбільш ефективним індуктором мутагенезу є N-НМС в коцентрації 5 мМхгод.

5. Найбільш придатною для відбору рослин-регенерантів із підвищеною стійкістю до P. syringae pv. аptata і P. wieringae була наступна схема селекції: обробка калюсних тканин N-НМС > 1-2 пасажі на селективному середовищі > 3-4-й пасажі на контрольному середовищі > 5-6-й пасажі на селективному середовищі > середовище для морфогенезу, що містить прогріті клітини фітопатогенних бактерій > регенерація рослин на середовищі з прогрітими клітинами.

6. В клітинах цукрових буряків дія селективного фактора спричинювала підвищення активності пероксидази. Після проведення селекції одержано рослини-регенеранти, які характеризувалися стабільною високою активністю пероксидази, що супроводжувалось появою та зникненням певних ізоформ. Активність пероксидази у рослин із підвищеною стійкістю до збудників бактеріозів Pseudomonas syringae pv. аptata і Pseudomonas wieringae перевищувала на 55% таку у чутливих рослин. Показана можливість використання пероксидази як стабільного біохімічного маркера стійкості до бактеріальних патогенів.

7. Одержано рослини-регенеранти сортів Білоцерківський однонасінний 45 і Ялтушківський однонасінний 64 з підвищеною стійкістю до Pseudomonas syringae pv. аptata і Pseudomonas wieringae. У рослин цукрових буряків із підвищеною стійкістю до збудників бактеріозів після селекції цукристість коренеплодів не знизилась.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Коломієць Ю.В. Особливості морфогенезу цукрових буряків (Beta vulgaris L) в культурі in vitro // Аграрна наука і освіта - 2004. - Т. 5, №5-6. - С. 21 - 26.

2. Коломієць Ю.В. Використання культури клітин цукрових буряків в селекції на стійкість до Рseudomonas wieringae // Аграрна наука і освіта - 2005. - Т. 6, №1-2. - С. 24 - 29.

3. Кляченко О.Л., Коломієць Ю.В. Розробка методичних підходів для одержання форм цукрових буряків, стійких до Pseudomonas syringae pv. аptata // Науковий вісник НАУ - 2005. - Т. 84. - С. 254 - 263. (Здобувачем особисто визначено чутливість клітинних ліній цукрових буряків до різних концентрацій культурального фільтрату збудника бактеріозу P. syringae pv. аptata, розроблено схему селекції для одержання резистентних калюсних клітин, одержано рослини-регенеранти із підвищеною стійкістю до P. syringae pv. аptata).

4. Коломієць Ю.В., Кляченко О.Л. Особливості ризогенезу форм цукрових буряків стійких до збудників бактеріозу Pseudomonas syringae pv. aptata та Pseudomonas wieringae // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. - 2005. - Вип. 32. - С. 75 - 81. (Здобувачем особисто вивчено особливості ризогенезу форм цукрових буряків на селективних середовищах з різною концентрацією прогрітих клітин P. syringae pv. aptata та P. wieringae).

5. Коломієць Ю.В., Яковлєва Л.М., Кляченко О.Л., Ващенко Л.М. Метаболіти бактерій роду Рseudomonas як селективний фактор стійкості цукрових буряків до бактеріозів // Мікробіол. журн. - 2005. - Т. 67, №6. - С. 64 - 72. (Здобувачем особисто досліджено активність метаболітів бактерій роду Pseudomonas і можливість використання їх як селективних факторів для клітинної селекції, одержано на селективних середовищах клітинні клони та рослини-регенеранти цукрових буряків і проаналізовано їх стійкість до бактеріозів в умовах in vitro і in vivo).

6. Коломиец Ю.В. Бактерии рода Pseudomonas - возбудители заболеваний сахарной свеклы // Международная научно-практическая конференция «Приемы повышения урожайности растений: от продуктивности фотосинтеза к современным биотехнологиям» (Киев, 22 - 23 мая 2003): Материалы конференции. - Киев, 2003. - С. 81 - 83.

7. Коломієць Ю.В. Каллюсообразующая и регенерационная способность клеточных линий сахарной свеклы, устойчивых к Pseudomonas wieringae // ІІІ Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14 - 18 марта 2005): Материалы конгресса. - Москва, 2005. - С. 258.

8. Коломиец Ю.В., Кляченко О.Л. Отбор клеточных линий сахарной свеклы, устойчивых к Pseudomonas syringae pv. аptata и Pseudomonas wieringae // 9-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука ХХІ века» (Пущино, 18 - 22 апреля 2005): Сборник тезисов. - Пущино, 2005. - С. 351.

9. Коломиец Ю.В., Кляченко О.Л. Влияние регуляторов роста на ризогенез сахарной свеклы в культуре in vitro // ХII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005): Сборник тезисов. - Москва, 2005. - С. 99 - 100.

10. Кляченко О.Л., Коломиец Ю.В. Использование методов биотехнологии и экспериментального мутагенеза в селекции сахарной свеклы // Международная научно-практическая конференция «Принципы и методы оптимизации селекционного процесса сельскохозяйственных растений» (Жодино, 14 - 15 июля 2005): Материалы конференции. - Жодино, 2005. - С. 262 - 267.

11. Коломієць Ю.В., Кляченко О.Л., Ващенко Л.М. Клітинний добір у селекції цукрових буряків на стійкість проти збудників бактеріозів // Всеукраїнська науково-практична конференція молодих вчених і спеціалістів «Стан та ...