ААК52739

54

2х10^-21

RdRp, Helicobasidium mompa dsRNA mycovirus, aa 338 to 397

BAC23065

56

3х10^-14

RdRp, Oyster mushroom isometric virus II, aa 379 to 440

ААР74192

48

2х10^-11

RdRp, Ceratocystis polonica partitivirus, aa 421 to 467

ААР79988

48

6х10^-6

рBV7/1

CI protein, Beet mosaic virus, aa 137

to 220

NP_954623

97

2х10^-43

pBV8/1

RdRp, Heterobasidion annosum partitivirus, aa 198 to 276

ААК52739

53

5х10^-18

RdRp, Oyster mushroom isometric virus II, aa 447 to 523

ААР74192

43

7х10^-7

RdRp, Helicobasidium mompa dsRNA mycovirus, aa 338 to 397

BAC23065

36

6х10^-6

pBV12/1

RdRp, Heterobasidion annosum partitivirus, aa 126 to 238

ААК52739

53

3х10^-35

RdRp, Helicobasidium mompa dsRNA mycovirus, aa 338 to 442

BAC23065

48

6х10^-22

RdRp, Oyster mushroom isometric virus II, aa 379 to 457

ААР74192

50

2х10^-16

RdRp, Ceratocystis polonica partitivirus, aa 421 to 486

ААР79988

43

1х10^-8

pBV14/1

Polyprotein Beet mosaic virus, aa 1781

to 1875

NP_954611

78

2х10^-36

* - РНК-залежна РНК полімераза

При виділенні вірус-специфічних длРНК з рослинних екстрактів нами паралельно виділено і длРНК міковірусів з грибів, якими одночасно були уражені рослини цукрових буряків. Окрім длРНК, які представляли реплікативну форму потівірусу мозаїки, водночас зафіксовано длРНК неописаного раніше міковірусу, геном якого представлений двома фрагментами длРНК, розміром 1,8 та 1,9 kbp.

Порівняльний генетичний аналіз і ідентифікація відомих та раніше не описаних вірусів цукрових буряків. Аналіз амінокислотних послідовностей, які кодують клоновані нами кДНК клони, виявив високий ступінь гомології (близько 50%) у клонів pBV1, 2, 8, 12 із частковими послідовностями РзРп міковірусів, що уражують фітопатогенні базідіальні гриби Heterobasidion annosum та Helicobasidium mompa. Встановлено, що ці віруси, згідно існуючої класифікації, належать до родини Рartitiviridae, а також до інших длРНК міковірусів цієї родини (табл. 3).

Таблиця 3

Результат комп'ютерного BLAST аналізу pBV клонів на гомологію

Назва вірусу	Гомологія, %	GenBank номер	E values
Heterobasidion аnnosum Partitivirus	54	ААК52739	4х10-47
Helicobasidium mompa dsRNA mycovirus	43	ВАС23065	9х10-25
Oyster mushroom isometric virus II	44	ААР74192	9х10-24
Ceratocystis polonica Partitivirus	35	ААР79988	1х10-9
Atkinsonella hypoxylon Рartitivirus	31	NP604475	3х10-9
Gremmeniella abietina RNA virus MS1	33	NP659027	2х10-7
Rhizoctonia solani virus	29	NP620659	2х10-7
Penicillium stoloniferum virus S	35	ААN86834	2х10-6
Discula destructiva virus 1	34	NP116716	3х10-6
Zygosaccharomyces bailii virus Z	27	NP624325	1х10-5
Mycovirus Fuso V	34	NP624350	2х10-5
Fusarium poae virus 1	25	NP624349	0,13

Комп'ютерний аналіз деяких часткових амінокислотних послідовностей, що кодуються длРНК елементами виділеними з листків цукрових буряків, підтвердив високий ступінь гомології до РзРп міковірусів, які належать до родини Рartitiviridae. З метою встановлення родинних стосунків між послідовностями РзРп, що кодуються длРНК елементами з цукрових буряків та РзРп міковірусів, які належать до родини Рartitiviridae, проведено філогенетичний аналіз згідно бази даних DDBJ/EMBL/GenBank за допомогою програми BLAST. Із використанням двох різних і незалежних методів найменших квадратів та parsimony із пакету програм PHYLIP (версія 3.5) для оцінки філогенії нами побудовано дендрограми філогенетичних взаємовідносин між обраними таксономічними одиницями. З'ясовано, що амінокислотні послідовності клонів pBV 2,8,12 частково перекриваються та гомологічні висококонсервативній карбоксі-термінальній ділянці РзРп, водночас, як клон pBV1 був гомологічний аміно-термінальній частині РзРп

На підставі амінокислотних послідовностей трьох клонів pBV 2, 8 і 12 нами виведено єдину консервативну послідовність, довжиною у 139 а.з. (pBV2.8.12). Передбачувану амінокислотну послідовність pBV2.8.12 використовували в подальшому філогенетичному аналізі та для побудови дендрограм. Вирівнювання часткової амінокислотної послідовності передбачуваного клону pBV2.8.12 із послідовностями РзРп 12 міковірусів показало, що останній містить V та VI консервативні мотиви, згідно класифікації [J. Bruenn, 1991], які характерні для вірусних полімераз .

Кластерний аналіз дендрограми, побудованої за методом найменших квадратів, показав, що в родині Рartitiviridae можна виділити три групи. Перша із них об'єднує віруси грибів Heterobasidion annosum, Helicobasidium mompa, Oyster mushroom та клон pBV2.8.12, друга - віруси Gremmeniella abietina, Mycovirus Fuso V, Discula destructiva і Penicillium stoloniferum; третя - віруси Fusarium poae, Rhizoctonia solani, Ceratocystis polonica та Atkinsonella hypoxylon (рис. 16, А). Подібні кластери нами зафіксовано при аналізі дендрограми, побудованої методом parsimony (рис. 16, В). Часткова послідовність pBV2.8.12 увійшла у один кластер із першою групою вірусів родини Рartitiviridae, що свідчить про належність передбачуваної послідовності pBV2.8.12 до фрагментів длРНК із цієї групи міковірусів. При цьому міковірус Zygosaccharomyces bailii, який належить до родини Totiviridae, не ввійшов у кластер із вірусами з родини Рartitiviridae, що підтверджує його інше систематичне положення. Доведено, що систематичне положення криптичного вірусу цукрових буряків (Beet cryptic virus 3) згідно амінокислотної послідовності передбачуваної репліками яка депонована у GenBank під номером AAB27624 [Xie et al, 1993], можна ставити під сумнів.

Кластерний аналіз показав, що репліказа криптовірусу цукрових буряків не входить у єдиний кластер із репліказами вірусів, що належать до родини Рartitiviridae, а займає віддаленіше положення. На підставі одержаних даних, нами висунуто тезу щодо доповнення теорії існування криптичних вірусів і перегляду систематичного положення криптовірусу цукрових буряків, якщо він взагалі існує в природі. Таким чином, встановлено, що частина ізольованих та клонованих длРНК елементів, виділених із листків цукрових буряків, належать до неописаного раніше міковірусу із родини Рartitiviridae.

Ідентифікація змішаних фіто- та міковірозів на рослинах цукрових буряків. Перевірка продуктивних сортів цукрових буряків в Україні на присутність міковірусів методами реверс-транскрипції сполученої з ПЛР (РТ-ПЛР) та Нозерн-блот гібридизації проведена в господарствах Київської (зразки 1-6), Полтавської (зразки 7-12) та Вінницької (зразки 13-18) областей з травня по жовтень 2000 - 2004 рр. Водночас нами було проаналізовано окремо листковий матеріал (зразки 19, 20) та кореневу систему із землею (зразки 21, 22) рослин цукрових буряків із Полтавської області. Негативним контролем слугували листки оздоровлених рослин буряків, введених у культуру in vitro (зразок 23). Дизайн праймерів для розробки РТ ПЛР тест-системи на виявлення нового міковірусу грунтувався на основі виведеної нуклеотидної послідовності клону, який кодує висококонсервативну ділянку РзРп

Розмір ПЛР продукту, передбаченого тест-системою, становив 259 п.н.з. Нами проведено скринінг зразків цукрових буряків та показано наявність продукту ампліфікації, відповідного розміру, що свідчить про присутність у відповідних пробах длРНК елементів, які належать до нового міковірусу. При цьому визначено, що найураженішими виявилися зразки цукрових буряків, які відібрані в Полтавській та Вінницькій областях України.

З метою доведення належності длРНК елементів з цукрових буряків, виділених з різних регіонів України до єдиного вірусного агенту, і встановлення розміру длРНК фрагмента, що кодує РзРп міковірусного походження, нами здійснено гібридизаційний аналіз. Гібридизацію зразків длРНК проводили із міченим радіоактивною міткою продуктом РТ-ПЛР, що представляв собою фрагмент РзРп нового міковірусу. Згідно даних гібридизаційного аналізу, позитивний специфічний сигнал виявлено із фрагментами длРНК, розміром близько 1,9 т.п.н. (рис. 20). На підставі одержаних даних можна стверджувати, що фрагмент длРНК, виділений із цукрових буряків розміром близько 1,9 т.п.н., кодує РзРп неописаного раніше міковірусу з родини Partitiviridaе. Звідси випливає, що фрагмент длРНК, розміром 1,6 т.п.н. - кодує білок оболонки цього вірусу. Цей факт підтверджено також і тим, що обидва фрагменти длРНК (1,6 та 1,9 т.п.н.) виділяються виключно спільно.

Зафіксовано, що виділений і ідентифікований нами фрагмент длРНК, розміром 1,9 т.п.н., має філогенетичну спорідненість (гомологія 40-50%) із генами РзРп, які кодуються міковірусами, й уражують гриби з родини базідіоміцетів, таких як Heterobasidion annosum або Helicobasidium mompa. Ці гриби викликають кореневу гниль хвойних (Heterobasidion annosum) або фруктових дерев (Helicobasidium mompa). Серед мікологічних захворювань цукрових буряків, що спричиняють кореневу гниль, описано відомі захворювання бурої та червоної гнилі коренеплодів. Буру гниль індукує гриб Rhizoctonia solani Kuehn, червону - Rhizoctonia violacea (crocorum) Tul., відома також телеоморфа гриба червоної гнилі Helicobasidium purpureum Pat., (відділ Basidiomycota) [Пидопличко, 1978; Пересыпкин, 1987].

Отже, що фрагменти длРНК розміром 1,6 та 1,9 т.п.н., виділені з листків цукрових буряків, належать міковірусу з родини Partitiviridae, який уражує не цукрові буряки, а гриб кореневої гнилі, що на них паразитує. На користь нашого припущення свідчить факт, що обидва фрагмента (1,6 та 1,9 т.п.н.) виділяються одночасно з кореневих волосків коренеплоду цукрових буряків, один з яких - длРНК 1,9 т.п.н., виявляв позитивний сигнал при гібридизаційному аналізі.

Вивчення видового складу мікроміцетів уражених вірусами листків, коренеплодів та ризосфери цукрових буряків. Надалі нашим завданням було ідентифікувати гриб-хазяїн для нового міковірусу з робочою назвою - Helicobasidium purpureum Рartitivirus. При дослідженні видового складу мікроміцетів листків виділено у чисту культуру та ідентифіковано близько 30 видів грибів, що відносяться до 14 родів: Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Cladosporium, Fusarium, Geotrichium, Gliocladium, Mucor, Mycelia sterilia, Penicillium, Phoma, Stemphylium, Trichoderma, Ulocladium. Для ендофітної мікобіоти характерним було переважання видів роду Alternaria, частота зустрічальності яких становила 85,7%; меншою мірою зустрічалися види роду Trichoderma (42,9%). В окремих випадках, із частотою зустрічальності 14,3%, виявлено представники родів Ulocladium, Stemphylium, Phoma, Mycelia sterilia, які були характерними лише для ендофітної мікобіоти та види Penіcillium, Acremonium, Gliocladium, Cladosporium, Aureobasidium, що відмічено і в філоплані, але в значно більшій кількості. Частка невизначених видів становила 2%. Найбільше різноманіття грибів було зафіксовано у зразка із Полтавської області із симптомами вірусного гофрування листків. Їх кількість становила 7 видів на 1 см² листка. В інших варіантах вона коливалась від 2 до 3 видів на 1 см² листка.

Для філоплани цукрових буряків характерними є види Cladosporium, із частотою зустрічальності 100% (в кількості 40-78 КУО/см²). Дещо рідше зустрічалися - види р. Trichoderma та Aureobasidium (71,4%), кількість яких становила 8-12 КУО/см² для Trichoderma та 24-36 КУО/см² для Aureobasidium. В поодиноких випадках визначено колонії представників рр. Acremonium, Alternaria, Fusarium, Gliocladium, Mucor, Basidiomycetes. Частота зустрічальності у них коливалась від 14,5% до 29%, а кількість від 1 до 3 КУО/см². Найбільше різноманіття видів виявлено у варіанті із симптомами жовтухи в Київській області. При цьому вилучено 14 видів грибів з 1см², на деяких зразках їх кількість коливалася в межах 3-8 видів/см².

Таким чином, серед збудників внутрішньої інфекції філоплани відмічено патогенний гриб Phoma betaе - збудник фомозу або зональної плямистості. Крім того, в значній кількості вилучено види Alternaria alternata та Cladosporium cladosporioides. В окремих випадках серед ендофітів листків цукрових буряків визначено Stemphylium sp. та Ulocladium sp. Поверхнева мікобіота представлена більшою кількістю і значнішою кількістю видів, серед яких переважали Cladosporium cladosporiodes, Cl. herbarum, Aureobasidium pullulans та Trichoderma harzianum. Серед факультативних паразитів поверхневої інфекції виявлено види грибів Fusarium oxysporum та Cladosporium spp. В циклі свого розвитку гриби потрапляють безпосередньо в грунт у вигляді спор або з рештками рослин. Отже, грунт є одним із основних джерел інфекції філоплани і коренеплодів. Саме тому деякі з вищенаведених грибів є спільними збудниками хвороб як листків, так і коренів.

При дослідженні видового складу коренеплодів та ризосфери цукрових буряків нами ідентифіковано гриби, що відносяться до 24 родів. З поверхні коренеплодів найчастіше зустрічались види р. Fusarium, що становили 47,28 % від загальної кількості вилучених грибів. Цей рід в основному був представлений F. oxysporum (21,20%), F. gibbosum (9,24%), F. solani (4,89%), F. solani var. redolens ( 3,8%) та іншими. Значна частка припадала також на види родів Rhizopus (9,78%), Chaetomium (7,61%) та Alternaria (7,07%). В незначній кількості відмічено Rhizoctonia violacea (crocorum) (1,09%). Частка невизначених видів становила 6,08%. Видовий склад ризосфери цукрових буряків суттєво відрізнявся: види р. Fusarium, Verticillium та Trichoderma становили всього по 8,12%, натомість домінуючу позицію займали види Penіcillium- 31,2%. Вид Rhizoctonia violacea (crocorum) становив всього 0,43%.

Отже, мікобіота філоплани, коренеплодів та ризосфери цукрового буряка була представлена видами родів: Alternaria, Trichoderma, Cladosporium, Acremonium, Penicillium, Fusarium, а також Mycelia sterilia. З листків нами ізольовано декілька представників роду Basidiomysetes.

Виділення в чисту культуру різних штамів грибів, уражених вірусом та біотехнологія їх культивування в умовах in vitro. За попередніми даними молекулярно-біологічної ідентифікації клонованих фрагментів із цукрових буряків (безпосередньо 1,9 п.н.з) встановлено, що такий фрагмент геному міковірусу за ознакою ураження характерний для грибів роду Basidiomycetes. Саме тому серед виділених грибів у чисту культуру нами обрано п'ять мікокультур, які, згідно аналізів, віднесено до цього роду. Культури даних грибів при вирощуванні in vitro формували потужно розвинений і переважно білий повітряний міцелій. Штам виділених грибів №4 мав оранжевий, а №5 - червоний колір забарвлення. Вирощування ізоляту №3 на КГА через 21 добу показало появу примордіїв та початок ростових процесів плодових тіл, що характерно для роду Basidiomycetes.

Біохімічна і молекулярно-біологічна ідентифікація нового міковірусу Helicobasidium purpureum Partitivirus, виділеного з листків цукрових буряків та міцелію мікроскопічних грибів. Для підтвердження ідентичності длРНК фрагментів, виділених з листків цукрових буряків із длРНК фрагментами і міцелію мікроскопічних грибів, нами проведено порівняльний аналіз методами електрофорезу длРНК в 6% ПААГ та РТ-ПЛР. Електрофоретичний аналіз длРНК, виділених з міцелію грибів, показав наявність двох очікуваних фрагментів длРНК у пробах № 3 і 5 розміром близько 1,9 та 2,0 т.п.н. (рис. 22, А). Однак концентрація длРНК з міцелію грибів була набагато нижча, ніж у разі виділення длРНК з листків цукрових буряків (проба № 6). Згідно з отриманими раніше даними, фрагмент длРНК розміром 2,0 т.п.н. кодує РНК-залежну РНК полімеразу (репліказу), який має високий ступінь гомології до ферменту, що кодують представники міковірусів з родини Partitiviridae [Doods, 1984; Мельничук, Валверді, 2001].

Специфічний продукт ПЛР розміром 258 п.н. виявлено у пробах № 2, 3 і 5. Наявність ПЛР продукту у пробах № 3 і 5 узгоджується з даними наявності фрагментів длРНК у цих пробах. У пробі № 2 фрагменти длРНК не виявлено, однак дані ПЛР показали присутність специфічного продукту. Це може відбуватися за умов надвисокої чутливості методу ПЛР порівняно з методом виділення та візуалізації длРНК у ПААГ. Одержані дані свідчать, що ізоляти грибів (проби № 2, 3 та 5), уражені новим міковірусом, названим нами як Helicobasidium purpureum Рartitivirus. Проби № 1 та № 4 не містили фрагментів длРНК і були ПЛР-негативними.

Кількісний аналіз дволанцюгових РНК міковірусу Helicobasidium purpureum Partitivirus при ураженні чистих культур грибів методом ПЛР у реальному часі. Аналізували кДНК-копії, одержані в реакції реверс-транскрипції із длРНК, які виділяли із міцелію чистої культури грибів, ідентифікованих нами попередньо як Mycelia sterilia, white, проби № 1, 2 та 3. Відмічено, що на початку ПЛР реакції (цикли 1-8) продукти ампліфікації флуоресцентною міткою ще не виявлялися і знаходились на рівні фонового сигналу флуоресценції. Протягом експоненціальної стадії кінетики ПЛР спостерігали пряму залежність кількості флуоресценції від циклу ПЛР. Починаючи з 15 циклу у деяких зразків зафіксовано вихід продукту на початок стадії плато, що свідчить про набуття ПЛР статусу насичення. Аналіз кривих ампліфікації виявив збільшення рівня репортерної флуоресценції на останніх циклах ампліфікації (25-28 цикли) у деяких пробах, які в подальшому виявилися негативними. Визначено, що продукт реакції ампліфікації виглядає у вигляді піка і має температуру плавлення T_m 78,8±0,4С. Для димерів праймерів остання не перевищувала 71,8С. Виявлення критичного циклу (Ct), дозволило визначити початкову концентрацію ДНК-мішені, десятинний логарифм якої (log₁₀) прямо пропорційний Ct. За допомогою очищеного ПЛР продукту (калібрувальний стандарт) - специфічної ДНК-мішені розміром у 260 п.н.з. із концентрацією 7,710¹⁰ копій в µл, емпірично підібрана серія стандартних розведень, значення Ct яких підпадало у діапазон відповідних значень досліджуваних зразків. Найдостовірніші результати одержано при використанні серії двократних розведень ДНК-стандарту .

Лінійна залежність Ct від [log₁₀] концентрації продуктів реакції зберігалася у діапазоні 7,7 10¹⁰ - 0,48 10¹⁰ копій із коефіцієнтом регресії (R²) 0.987.

Відносне стандартне відхилення значень Сt (standard deviation) для кожного із зразків було нижче 1,5%. Згідно отриманих результатів (рис. 23 та 24), початкова концентрація (копійність) длРНК міковірусу в зразках 3 і 2 складала 7,33 х 10¹⁰ (SD 0,612) та 6,7 х 10⁹ (SD 0,096) копій длРНК на 50 мг міцелію. Це свідчить про високий рівень ураження мікокультур описаним вперше вірусом Helicobasidium purpureum Partitivirus. Одночасно із цим показано високий рівень специфічності та чутливості власно розробленої молекулярно-біолоігчної тест-системи ПЛР у реальному часі із чітко визначеною кількістю розведення ПЛР продукту.

Молекулярна ідентифікація вірусінфікованих мікроміцетів, які паразитують на цукрових буряках. Припущення про спільне походження і розвиток грибних інфекцій в трьох культурах (Mycelia sterilia, white 1, 2, та 3) з цукрових буряків в умовах in vitro підтверджено результатами молекулярно-біологічної ідентифікації з використанням тест-ситеми сіквенсу ITS-регіону рибосомальних генів у грибів.

Встановлено, що Mycelia sterilia, white 1 належить до Peniophora, sp. (Eukaryota; Fungi; Basidiomycota; Hymenomycetes; Homobasidiomycetes; Aphyllophorales; Lachnocladiaceae; Peniophora), Mycelia sterilia, white 2 - до Thanatephorus, sp. (який є анаморфою Rhizoctonia solani), детальніше таксономічне положення (Eukaryota; Fungi; Basidiomycota; Hymenomycetes; Homobasidiomycetes; Ceratobasidiales; Ceratobasidiaceae; Thanatephorus. (anamorph: Rhizoctonia solani). Mycelia sterilia, white 3 - до Schizophyllum, sp. (Eukaryota; Fungi; Basidiomycota; Hymenomycetes; Homobasidiomycetes; Agaricales; Schizophyllaceae; Schizophyllum). Візуальна оцінка росту колоній та застосування мікроскопічного аналізу дозволило нам встановити схожість грибних культур і віднести їх до відділу Basidiomycota. Для підтвердження цього проведено молекулярну ідентифікацію з метою визначення класифікаційних й таксономічних ознак культур, і особливо тих мікокультур, що уражені міковірусом Helicobasidium purpureum Partitivirus з метою використання їх в біотехнологічних маніпуляціях та при проведенні біоконтролю за розвитком грибних інфекцій цукрових буряків.

Ультраструктура та цитопатологія Helicobasidium purpureum Partitivirus на мікроміцетах цукрових буряків. Для вивчення мікроскопічної організації клітин вірус інфікованої грибної культури за результатами ПЛР аналізу відібрано клітини міцелію зразку № 3 (Schizophyllum, sp). Встановлено, що вони циліндричної форми і оточені відносно щільною клітинною оболонкою. Зафіксовано, що вірусні частинки правильної сферичної форми із виразними капсомерами вірусного капсиду і класичною для міковірусів зернистою структурою, знаходяться без особливої просторової організації й мають доволі значну щільність та концентрацію

Нами були досліджені також чисті грибні культури, які культивувались в умовах in vitro. Аналіз вперше показав присутність вірусу в пробі № 5 (Mycelia sterilia, red), а згодом, після проведення ПЛР діагностики і в ізолятах № 3 та 2 (рис. 30). Міковіруси, які виявлені в пробі №3 (Schizophyllum, sp) мікроскопічно на ультратонких зрізах, повністю підтверджують результати, що отримані методами хроматографії длРНК та ПЛР. Вірусні частинки відзначаються правильною сферичною формою діаметром 30 - 40 нм, із капсомерами вірусного капсиду із типом симетрії Т=3.

Таким чином, одержані дані підтвердили наші попередні результати щодо належності виділених длРНК-елементів розміром 1,8 та 2,0 т.п.н. не криптичному вірусу цукрових буряків, а новому міковірусу мікроскопічного гриба, якого ми назвали Helicobasidium purpureum Partitivirus. Така назва віруса пояснюється тим, що його ідентифікували вперше мікроскопічно із культури гриба № 5 (Mycelia sterilia, red) - червоної гнилі - Rhizoctonia violacea (Crocorum) Tul., у якої відома також телеоморфа гриба червоної гнилі Helicobasidium purpureum Pat., (відділ Basidiomycota).

Оптимізація біотехнологічного процесу з введення, оздоровлення, клонування та адаптації безвірусних рослин на прикладі хмелю in vivo в промислових масштабах України. Протягом 1997 - 2004 рр. нами виконано чисельні досліди з отримання in vitro клонованих і оздоровлених рослин хмелю на безвірусній основі за допомогою методів біотехнології. Наступну адаптацію in vivo проводили із використанням торф'яних та адаптаційних контейнерів багаторазового використання

Зафіксовано факт, що динаміка росту таких рослин на 12 тижнів після висадження на поля складала щонайменше 170 - 175 см від кореневища рослин. Відпрацьована нами технологія клонування та польової інтродукції ароматичних сортів хмелю на безвірусній основі повністю відповідає можливостям господарств з її втілення до масового застосування у хмелегосподарствах України з метою отримання продуктивних живців. Так, оздоровлені in vitro рослини хмелю сорту Заграва перед формуванням промислових плантацій, мають значні переваги у розвитку кореневої системи порівняно із контрольними, які були отримані вегетативним шляхом і культивували in vivo на маточнику протягом 120 діб.

Зазначимо, що на плантаціях хмелю в с. Сінгури Житомирської області на площі 7,6 га протягом 2005 р. отримано вже другий врожай обсягом понад 13 ц/га високоцінної та конкурентноспроможної продукції - хмелевої шишки. Відмічено підвищення вмісту альфа-кислоти в шишках сорту Заграва з 6,5 до 9,8%, а у Слов'янки з 5,6 до 7,7, врожайності на 20 - 25%, а якості сировини у чотири рази.

Методом добору із сестринської форми сорту Слов'янка за вірусологічними та молекулярно-біологічними показниками створено новий сорт хмелю Національний. Клітинну селекцію сортових ліній здійснювали методом добору клітини із високим рівнем стійкості до хімічних та фізичних факторів при оздоровленні в умовах in vitro. Для масового розмноження сорту із вмістом альфа - кислоти 9,5 - 11,0% застосовували мікроклональне розмноження в умовах in vitro із подальшою адаптацією до умов відкритого грунту. Сорт зареєстровано Державною службою з охорони прав на сорти рослин України № 0471 від 26 грудня 2003 р.

ВИСНОВКИ

1. Вперше вдосконалено і впроваджено в лабораторну практику методику виділення і очистки дволанцюгових вірусних РНК з рослин та грибів шляхом хроматографії в градієнті целюлози.

2. Оптимізовано процедури отримання дволанцюгових геномних РНК міковірусів і реплікативних РНК фітовірусів із рослин картоплі, перцю, хмелю та цукрових буряків.

3. Вперше в Україні на прикладі трансгенних сортів картоплі, стійких до колорадського жука, розроблено молекулярно-біологічну систему тестування генетично-модифікованих рослин шляхом ПЛР-ідентифікації 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти та гена Cry IIIA.

4. Методом електронної мікроскопії, імуноферментного аналізу і ПЛР встановлено, що трансгенні сорти картоплі NL Russet Burbank, Superior та Atlantic значно уражуються X-, Y- та S- вірусами картоплі в польових умовах. Вірусна інфекція спричиняє надзвичайно високу чутливість бульб до кореневих гнилей та плісняви.

5. На основі РТ ПЛР розроблено молекулярно-біологічну систему ідентифікації вірусних РНК, за якою встановлено, що клоновані фрагменти дволанцюгових РНК, виділених із цукрових буряків, проявляють спорідненість до деяких генів фітовірусів і міковірусів.

6. За даними електронної мікроскопії, аналізу клонованих фрагментів длРНК та філогенетичних дерев, побудованих за вирівнюванням амінокислотних послідовностей фрагментів гена РНК-залежної РНК-полімерази, ідентифіковано новий міковірус Helicobasidium purpureum Рartitivirus.

7. Вперше отримано і зареєстровано в світових генетичних банках даних нуклеотидну та амінокислотну послідовності фрагмента гена РНК-залежної РНК-полімерази міковірусу Helicobasidium purpureum Рartitivirus (AY949837 та AAX53614), а також нуклеотидну послідовність фрагмента гена цитоплазматичних включень (CI) ізоляту потівірусу мозаїки буряків, виділеного в Україні.

8. Вперше визначено видовий склад мікроміцетів у листках, коренеплодах та ризосфері цукрових буряків і отримано чисті культури грибів, уражених вірусами.

9. Методом електронної мікроскопії ультратонких зрізів інфікованих грибних культур показано цитоплазматичну локалізацію вірусу Helicobasidium purpureum Рartitivirus і його негативний вплив на клітинну стінку та органоїди гриба.

10. За нуклеотидними послідовностями внутрішніх трансляційних спейсерів рибосомальних генів визначено належність вірусінфікованих культур базидіальних грибів до родів Peniofora, Thanatephorus, Schizophillum.

11. Встановлено високий рівень ураження деяких чистих культур мікроміцетів міковірусом Helicobasidium purpureum Рartitivirus. Концентрація вірусу в культурі Schizophillum sp., визначена методом ПЛР у реальному часі, становить 7, 33 х 10¹⁰ вірусних часток на 50 мг міцелію.

12. Вперше в Україні розроблено і впроваджено біотехнологію формування промислових плантацій хмелю на безвірусній основі, яка включає оздоровлення, добір, клонування та розмноження садивного матеріалу in vitro, а також адаптацію рослин до умов відкритого ґрунту.

13. Показано, що розроблена біотехнологія отримання саджанців хмелю значно переважає традиційну технологію прямого вегетативного живцювання за розвитком первинної кореневої системи рослин, ступенем їх стійкості до фітопатогенів, а також врожайністю і товарною якістю хмелевої шишки.

14. Шляхом селекційного добору клітин із сестринської форми сорту Слов'янка за критерієм високої стійкості до хімічних та фізичних факторів при оздоровленні рослин in vitro створено і зареєстровано в Україні новий сорт хмелю Національний.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Левенко Б.О. Основи біотехнології рослин. Посібник: - 2000, К.: Ей-Бі-Сі - 248с. (Здобувачем виконано біля третини роботи із залученням отриманих власноруч наукових результатів).

2. Мельничук М.Д., Кожукало В.Є, Смирнова С.О., Мартин Г.Г. Лабораторний практикум із загальної фітовірусології. - К:, НАУ, 2002 - 261с. (Здобувач автор 2-х розділів і відповідальний за редакцію та видання).

3. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин: Підручник. - К.:, ПоліграфКонсалтинг, 2003. - 520 с. (Дисертантом написано 7 із 19 розділів роботи).

4. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Клюваденко А.А., Пінчук А.П. Практикум з біотехнології рослин. - К.: НАУ, 2005.-114 с. (Здобувачем підготовлено тему "Отримання безвірусних рослин in vitro" і здійснено загальну редакцію видання).

5. Мельничук М.Д. Фітовірусологія. Посібник. - К.: ПоліграфКонсалтинг, 2005. - 200с.

6. Мельничук М.Д. Проблема карлавірусної інфекції хмелю в Україні // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 1998, №4. - С. 28 - 33.

7. Мельничук М.Д. Діагностика та ідентифікація РНК-вмісних вірусів рослин на стадії бінарних форм РНК при реплікації в клітині // Бюл. Ін-ту

8. с.-г. мікробіол. - 2000, №8, - С. 13 - 15.

9. Мельничук М.Д. Реакция сверхчувствительности растений при инфицировании фитовирусами // Бюл. Ін-ту с.-г. мікробіол. - 2000. - №6. - С. 25-28.

10. Мельничук М.Д. Біологічні основи по отриманню та використанню трансгенних рослин стійких до вірусних патогенів // Аграрна наука та освіта. - 2000. - №1. - С. 36 - 42.

11. Мельничук М.Д. Ідентифікація моно- та змішаних вірозів цукрового буряку (Beta vulgaris L.) // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2002. - №40. - С. 23 - 27.

12. Мельничук М.Д., Смирнова С.О., Кожукало В.Є. Діагностика та ідентифікація вірусів хмелю (Humulus lupulus L.) новітньої української селекції // Бюл. Ін-ту с.-г. мікробіол. - 2000. - №7. -С. 37-38. (Здобувачем здійснено пошук, узагальнено дані, проведено первинне виділення та обговорення результатів).

13. Мельничук М.Д., Клюваденко А.А. Давиденко О.А. Отримання безвірусного посадкового матеріалу хмелю (Humulus lupulus L.) в умовах in vitro // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2000. - №29. - С. 47 - 52. (Здобувачем здійснено керівництво роботою, контролювання фітогормонального складу середовища, оптимізовано технологію адаптації рослин до умов in vivo, підготовлено матеріали до публікації).

14. Мельничук М.Д., Валверді Р.А. Діагностика та ідентифікація РНК-вмісних фітовірусів на стадії їх біосинтезу шляхом вивчення фізико-хімічних властивостей вірусних дволанцюгових РНК // Доп. НАН України. - 2001.- № 3. - С. 175 - 179. (Дисертантом виконано планування експерименту, методичну роботу, проведено обговорення результатів і підготовку публікації до друку, окрім графічних схем та відбору зразків, які виконано із співавтором).

15. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г., Стеценко В.С. Фітовіруси на трансгенній картоплі. Діагностика та ідентифікація на сортах стійких щодо колорадського жука // Захист рослин. - 2001.- №8. - С 32. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків, діагностику рослин, виділення длРНК, обговорення результатів та підготовку публікації до друку).

16. Мельничук М.Д., Кожукало В.Є., Оверченко В.В., Смирнова С.О. Методичні підходи по виділенню та очистці карлавірусу хмелю на плантаціях світової колекції в Україні // Аграрна наука та освіта. - 2001. - 2, № 1. - С. 5 - 10. (Здобувачем проведено планування досліду, виділення вірусу, обговорення результатів та підготовлено публікацію до друку спільно із співавторами).

17. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Аналіз гена капсидного білка вірусу мозаїки люцерни (CP AlMV), клонованого у вектор для трансформації рослин pBI 121 // Мікробіол. журн. - 2001.- 63, №4. - С. 62 - 69. (Дисертантом сплановано і частково проведено методичні роботи з біотехнологічних маніпуляцій із ізольованими генами).

18. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Ідентифікація фітовірусів, що інфікують трансгенну картоплю, стійку до колорадського жука // Мікробіол. журн. - 2002. - 63, №6. - С. 53 - 60. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків, виділення длРНК, опрацьовано і розроблено у співавторстві модифікацію ІФА, впроваджено метод діагностики шляхом виділення длРНК із інфікованих рослин картоплі, здійснено обговорення результатів та підготовлено публікацію до друку).

19. Мельничук М.Д., Дубін А.В., Спиридонов В.Г., Мельничук С.Д. Детекція та ідентифікація трансгенів у генетично-модифікованих рослинах на прикладі Bt-картоплі // Мікробіол. журн. - 2002. - 64, №3. - С. 26 - 32. (Здобувачем відібрано інфіковані і контрольні рослинні зразки, виділено длРНК, розроблено у співавторстві тест-систему на виявлення трансгену CryIIIA та 35S промотору, проведено обговорення результатів та підготовку публікації до друку).

20. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О. Морфофізіологічні та біохімічні зміни рослин перцю (Capsicum anuum L.) при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2002. - №50. - С. 13 - 18. (Здобувачем проведено планування експерименту, експериментальне вирощування інокульованих рослин, діагностику вірусоносійства шляхом виділення длРНК ВТМ із інфікованих рослин перцю).

21. Мельничук М.Д., Оверченко В.В., Бойко О.А., Бойко А.Л. Карлавіруси в агроценозах // Захист рослин. - 2002. - №11. - С. 13. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків хмелю, виділено карлавірус хмелю та підготовлено публікацію до друку).

22. Мельничук М.Д., Кожукало В.Е., Дьячкова О.А., Сытник С.К., Алексеенко И.П., Смирнова С.А. Влияние вируса табачной мозаики на ультраструктуру клеток мезофилла листа перца Capsicum annum L. // Мікробіол. журн. - 2002. - 64, № 6. - С. 35 - 40. (Дисертантом проведено електронно-мікроскопічний аналіз вірусу тютюнової мозаїки із інфікованих рослин перцю, обговорення та інтерпретацію результатів до друку).

23. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О., Олексієнко І.П. Зміни активності пероксидази рослин перцю та тютюну інфікованих вірусом тютюнової мозаїки // Физиология и биохимия культ. растений. - 2003. - 35, №1. - С.43 - 47. (Здобувачем заплановано експеримент, проведено аналіз та обговорення результатів).

24. Мельничук М.Д., Дубин А.В., Сытник С.К. Идентификация и определение локализации вирусной РНК в хлоропластах перца (Capsicum annum L.) методом полимеразной цепной реакции // Мікробіол. журн. - 2003. - 65, № 3. - С. 54 - 59. (Дисертантом розроблено методику ідентифікації РНК методом РТ ПЛР і проведено узагальнення результатів).

25. Мельничук М.Д., Оверченко В.В., Дубін О.В. Діагностика латентного вірусу хмелю на сортах української селекції // Мікробіол. журн. - 2003. - 65, № 4. - С. 43 - 50. (Здобувачем проведено виділення длРНК карлавірусу хмелю, розроблено діагностикум на вірусоносійство шляхом виділення длРНК із експериментально інфікованих індикаторних рослин та обговорення результатів).

26. Мельничук М.Д., Клюваденко А.А., Михайличенко К.П. Технологія отримання морфогенного калуса хмелю (Humulus lupulus L.) гірких сортів на безвірусній основі в умовах in vitro // Аграрна наука та освіта. - 2003. - 4, №3 - 4. - С.15- 21. (Здобувачем розроблено загальну схему дослідження, оптимізовано склад живильних середовищ, здійснено узагальнення результатів до друку).

27. Мельничук М.Д., Дубін О.В. Тестування та оптимізація умов проведення ISSR-PCR при аналізі геному хмелю (Humulus lupulus L.). // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2004. - №73. - С. 17 - 21. (Дисертантом розроблено загальну схему дослідження, оптимізовано умови та параметри генетичного аналізу геному хмелю біотехнологічними підходами).

28. Мельничук М.Д., Дубін О.В., Дьячкова О.О., Кожукало В.Є. ISSR-PCR та RAPD в оцінці молекулярно-генетичного поліморфізму сортів хмелю (Humulus lupulus L.) // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2004. - №77. - С. 47 - 54. (Здобувачем сплановано експеримент, проведено аналіз результатів дослідження, оптимізовано умови та параметри електрофорезу фрагментів кДНК).

29. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г., Смирнова С.О. Ідентифікація вірусних дволанцюгових РНК, виділених з цукрових буряків (Beta vulgaris) // Доп. НАН України. - 2004. - №5, - С. 174-180. (Здобувачем проведено планування експерименту, складено загальну схему дослідження, біотехнологічними підходами розроблено стратегію подальшого вивчення неописаного раніше вірусу).

30. Мельничук М.Д., Сивик А.Є. Генетичні модифікації рослин. Методи виявлення у світовій практиці // Захист рослин. - 2004. - 6. - С. 8 - 11. (Дисертантом сплановано дослідження і подано логічний підхід з стратегії ідентифікації ГМО в лабораторних дослідженнях).

31. Мельничук М.Д., Заграфова М.Й., Клюваденко А.А. та ін. Біологічні технології та економічна ефективність створення маточників хмелю для промислових плантацій // Аграрна наука та освіта. - 2004. - 5, № 3-4. - С. 20-25. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків хмелю, комплекс вірусолого-біотехнологічних робіт з оздоровлення від фітопатогенів та клонального мікророзмноження згідно власної запатентованої технології, аналіз результатів та редагування публікації).

32. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Филогенетический анализ частичной последовательности вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы, кодируемой двухцепочечными РНК элементами из сахарной свеклы (Beta vulgaris) // Доп. НАН України. 2004. - № 9. - С. 167-171. (Здобувачем вперше проведено повний генетичний аналіз вірусного фермента, ідентифіковано геном нового вірусу шляхом запропонованої власно модифікованої методики виділення длРНК, підготовлено до друку публікацію).

33. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Молекулярная идентичность двухцепочечных РНК-элементов вирусной природы, выделенных из сахарной свеклы // Мікробіол. журн. - 2005. - 67, № 2.- С. 55-62. (Здобувачем проведено моніторингові дослідження по розповсюдженню міковірусу із цукрових буряків в різних регіонах України, виділення і ідентифікацію фрагментів длРНК, їх клонування, селекцію клонів, сиквенування, ідентифіковано новий міковірус та підготовлено до друку публікацію).

34. Мельничук М.Д., Зубова Т.Н., Смирнова С.О., Спиридонов В.Г. Видовий склад мікроміцетів листя, коренеплодів і ризосфери цукрового буряка // Мікробіол. журн. - 2005. - 67, №3.- С. 44-50. (Здобувачем проведено роботи з оптимізації живильних середовищ по культивуванню мікокультур виділених із цукрових буряків, розроблено біотехнологію культивування інфікованих міковірусами грибів в умовах in vitro).

35. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г., Олексієнко І.П. Особливості вірусних дволанцюгових РНК, виділених з мікроскопічних грибів, що паразитують на цукрових буряках // Мікробіол. журн. - 2005. - 67, №4. - С. 52 - 58. (Здобувачем проведено експеримент з виділення длРНК із мікокультур з цукрових буряків, пророблено мікроскопічний аналіз мікокультур і нативного міковірусу, розроблено біотехнологію культивування та зберігання інфікованих міковірусами грибів, підготовлено публікацію до друку).

36. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Біонебезпека трансгенних технологій з використанням 35S промотору // Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми. Зб. доп. наук. конф. Інститут цукрових буряків УААН, - 2002. - С. 83 - 88. (Дисертантом складено літературний огляд із даної проблеми, обговорено результати з ідентифікації 35S промотору трансгенних рослин із рослин Bt-картоплі та підготовлено публікацію до друку).

37. Ібатуллін І.І., Городній М.М., Кривенок М.Я., Дубровін В.О., Ільчук М.М., Мельничук М.Д., Мельничук С.Д., Пасічник Н.А., Строчинський А.А., Угнівенко А.М., Хмельницький Г.О. Наукове забезпечення сталого розвитку сільського господарства в Поліссі України. Монографія в 2-х томах. Кабінет Міністрів України, НАУ, К.: Вид-во ТОВ "Алефа", 2004.т.1 - С. 446 - 455. (Здобувачем підготовлено главу монографії в розрізі біотехнології в хмелярстві, здійснено загальне редагування видання).

38. Ібатуллін І.І., Городній М.М., Кривенок М.Я., Дубровін В.О., Ільчук М.М., Мельничук М.Д., Мельничук С.Д., Пасічник Н.А., Строчинський А.А., Угнівенко А.М., Хмельницький Г.О. Наукове забезпечення сталого розвитку сільського господарства в лісостепу України. Монографія в 2-х томах. Кабінет Міністрів України, НАУ - К.: Вид-во ТОВ "Алефа", 2003. т.2 - С. 645 - 650. (Здобувачем підготовлено практичні матеріали із власних досліджень в розрізі фітовірусології та біотехнології рослин, здійснено загальне редагування видання).

39. Пат. України на винахід №59131/7 А01Н4/00 // Спосіб клонального мікророзмноження хмелю (Humulus lupulus L.) ароматичних сортів. Мельничук М.Д. - Опубл. 15.05.2005, Бюл. № 5.

40. Пат. України на винахід №55096/7 С12Q1/68 // Спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів. Мельничук М.Д. - Опубл. 16.08.2004, Бюл. № 8.

41. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Пінчук А.П., Клюваденко А.А. Методичні рекомендації для мікроклонального розмноження деревних та трав'янистих рослин. - К.:НАУ, 2004. - 37с.

42. Kripkyy O.E., Melnychuk M.D., Kripkyy Ol.E. Developing of methods for obtaining embriogenic callus and protoplasts from hops (Humulus lupulus L.). II International Symposium on Plant Biotechnology. (4 - 8 October, Kiev, Ukraine). - 1998. - P.67.

43. Мельничук М.Д., Мартин Г.Г., Смирнова С.О. Мікроскопічне дослідження карлавіруса виділеного з рослин хмелю в умовах України //

44. Тез. доп. між нар. конф. “Біологічні ресурси та віруси” (Київ, 7 -10 вересня), Київ - 1998. - С. 92.

45. Melnychuk M.D., Martyn G.G., Smyrnova S.O., Kozhukalo V.E., Koshevski I.I. In vitro obtaining and microscopy investigations virus-free hop (Humulus lupulus L.). International Hop Growers Convention. (27 - 30 July, Pulawy, Poland).- 1999. - Р.136

46. Melnychuk M.D., Martyn G.G., Klyuvadenko A.A., Davidenko O.A. Obtaining of the virus-free hops (Humulus lupulus L.) seedlings from the apical morphogenic callus. Biologia, 54 Suppl. 7, 1999. - Р.72

47. Melnychuk M., Klyuvadenko A., Davydenko O., Spyrydonov V. Direct and indirect in vitro morphogenesis of the hop (Humulus lupulus) // 37^th Croatian symposium on agriculture with an International Participation. (Opatija, February 19 - 23). - 2001. - Р.252.

48. Мельничук М.Д., Давиденко О.А., Клюваденко А.А. Морфогенез та розмноження рослин хмелю (Humulus lupulus L.) на безвірусній основі в умовах in vitro // Тез. доп. ІІІ Міжнародної конф. “Біологічні ресурси та віруси”. (Київ, 11 -15 вересня). - Київ:2001. - С. 85.

49. Melnychuk M.D. Pathological interactions of the hop (Humulus lupulus L.) Carlavirus with cells and organoids membranes // Междунар. конф. молодых учених, посвященной 185 - летию Харьковского государственного аграрного университета им. В.В. Докучаева. (Харьков, 26 - 28 сентября). - Харьков:2001. - С. 59 - 60.

50. Melnychuk M.D., Dyachkova O.O, Smirnova S.O. Some reciprocal morphophisiological and biochemical reactions of plants at biological stress under virus infection // Abstracs Internat.Symp. "Plant under Environmental Stress" (Moscow, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, October 23 -28, 2001). Moscow: Publishing Houses of Peoples Friendship University of Russia. - 2001. - P.187-188.

51. Мельничук М.Д., Вознюк С.І., Мельничук А.В. Біологічні технології на шляху підняття ефективності, якості та безпеки сировини хмелю в Україні // Тез. доп. ІІІ Між нар. науково-практичної конф. “Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів: збагачення раціону харчування: медичні проблеми, практичні рішення” (Київ, 13-14 травня

52. 2004 р.). - Київ: 2004. - С.6.

53. Мельничук М.Д. Клонування рослин як спосіб підвищення сільськогосподарського виробництва // Сільське господарство: наука і практика: Матеріали V симпозіуму Україна-Австрія (Київ, 9-11 вересня 2004р.). - К.: ЗАТ “Ніч лава”, 2004. - С. 153-154.

АНОТАЦІЯ

Мельничук М.Д. Молекулярно-біологічне вивчення геномних і реплікативних РНК фіто- та міковірусів як основа для створення рослинних біотехнологій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальностями 03.00.06 - вірусологія та 03.00.20 - біотехнологія. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2006.

Робота присвячена створенню і впровадженню в Україні системи вірусологічних біотехнологій для ідентифікації фітовірусів і міковірусів та оздоровлення рослин від інфекційних хвороб.

Вдосконалено методику, оптимізовано процедури і розроблено молекулярно-біологічні тест-системи для виділення, очистки й ідентифікації дволанцюгових вірусних РНК з рослин та грибів. За результатами електронно-мікроскопічних досліджень, клонування фрагментів длРНК та аналізу філогенетичних дерев, побудованих за вирівнюванням амінокислотних послідовностей фрагментів гена РНК-залежної РНК-полімерази, ідентифіковано новий міковірус Helicobasidium purpureum Рartitivirus.

Вперше визначено видовий склад мікроміцетів в листках, коренеплодах та ризосфері цукрових буряків, отримано чисті культури грибів, уражених вірусами. За нуклеотидними послідовностями внутрішніх трансляційних спейсерів рибосомальних генів визначено належність вірусінфікованих культур мікроміцетів до родів Peniofora, Thanatephorus, Schizophillum. З'ясовано причетність міковірусів до виникнення гнилей коренеплодів цукрових буряків, що викликаються мікроміцетами, і показано можливість оцінки шкодочинності мікопатогенів за наявністю в рослинах вірусних длРНК.

Важливі науково-технічні розробки дисертаційної роботи, зокрема спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів, клонального мікророзмноження ароматичних сортів хмелю та новий сорт хмелю “Національний” захищені патентами на винаходи та свідоцтвом про авторство на сорт рослин.

Впровадження розробок у виробництво та їх висока ефективність підтверджена 5 актами та 3 довідками.

Ключові слова: фітовіруси, міковіруси, мікроміцети, картопля, хміль, цукрові буряки, дволанцюгові РНК, кДНК, реверс-транскрипція, сиквенс, полімеразно-ланцюгова реакція, біотехнологія, діагностика, ідентифікація, оздоровлення.

М.Д. Мельничук. Молекулярно-биологическое изучение геномных и репликативных РНК фито- и миковирусов как основа для создания растительных биотехнологий. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальностям 03.00.06 - вирусология и 03.00.20 - биотехнология.

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2006.

Работа посвящена созданию и внедрению в Украине системы вирусологических биотехнологий для идентификации фитовирусов и миковирусов и оздоровления растений от инфекционных болезней.

Усовершенствовано методику, оптимизировано процедуры и разработано молекулярно-биологические тест-системы для выделения, очистки и идентификации двуцепочечных вирусных РНК из растений и грибов.

Разработано первую отечественную молекулярно-биологическую ПЦР тест-систему по идентификации 35S промотора вируса мозаики цветной капусты и гена Cry IIIA в геномах трансгенных сортов картофеля, устойчивых к колорадскому жуку для выявления генетически-модифицированных растений картофеля.

Показано существование смешанных фито- и миковирусных инфекций на растениях сахарной свеклы, которые выявляются сродством двуцепочечных РНК, выделенных с растений, с геномными РНК фитовирусов и миковирусов. По результатам электронно-микроскопических исследований, клонирования фрагментов длРНК и анализа филогенетических деревьев, построенных по выравниванию аминокислотных последовательностей фрагментов гена РНК-зависимой РНК-полимеразы, с растений сахарной свеклы идентифицировано новый миковирус Helicobasidium purpureum Рartitivirus.

...