Бактеріальний рак винограду (діагностика та поширення на півдні України)

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 579.25:632.35:634.8.03/.05

БАКТЕРІАЛЬНИЙ РАК ВИНОГРАДУ (ДІАГНОСТИКА ТА ПОШИРЕННЯ НА ПІВДНІ УКРАЇНИ)

06.01.11 - фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ліманська Наталія Вікторівна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана в Одеському національному університеті ім. І.І. Мечникова Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Мілкус Борис Наумович,

Одеський національний університет

ім. І.І. Мечникова,

професор кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор, членкор УААН

Цилюрик Анатолій Васильович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри захисту лісу

кандидат біологічних наук, професор

Каленич Федір Семенович,

Інститут садівництва УААН,

завідувач лабораторії захисту рослин

Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України,

відділ фітопатогенних бактерій, м. Київ

Захист відбудеться “07” квітня 2006 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, кімн. 41

Автореферат розісланий “03” березня 2006 р.

Вчений секретар

cпеціалізованої вченої ради Мороз М. С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

агробактерія пихлинотвірний виноград

Актуальність теми. Бактеріальний рак винограду - поширене шкідливе захворювання, яке завдає значних економічних збитків промисловому виноградарству усіх країн світу. В Україні бактеріальний рак уражує виноград на території усіх областей його культивування. У Донецькій області в 50-х роках минулого століття від бактеріального раку загинуло 75 % молодих насаджень (Негруль, 1952). Обстеження виноградників Одеської області, проведене в середині 70-х років, показало, що цим захворюванням уражено 43,3 % рослин (Чернышева, Назарчук, 1975). В Криму на початку 80-х років частка кущів, інфікованих бактеріальним раком, на окремих насадженнях складала 53,8 %, а в Закарпатті - 44,3 % (Панфилова, 1982; Севрюкова, 1984).

Збудниками бактеріального раку винограду є Agrobacterium vitis Ophel and Kerr 1990, у ряді випадків - Agrobacterium tumefaciens (Smith and Townsend 1907) Conn 1942 (Sule, 1994; Burr, 1998; Lastra, 2000). Ефективні заходи захисту винограду від бактеріального раку не розроблені, за винятком обмеження поширення хвороби з садивним матеріалом. Оскільки бактеріальний рак часто є латентною інфекцією, відбирання лози з безсимптомних кущів для вирощування саджанців призводить до поширення збудника разом з підщепним та прищепним матеріалом. У ґрунт виноградника патоген заноситься із зараженим садивним матеріалом, внаслідок чого ґрунт також може слугувати джерелом інфекції (Burr, 1984, 1995; Bazzi, 1987).

Останнім часом збільшилися обсяги імпорту до України садивного матеріалу винограду із зарубіжних країн, особливо з країн Європейського Економічного Союзу (ЄЕС), де система сертифікації не передбачає тестування на наявність збудника бактеріального раку (Walter, 1998). В Україні діагностика бактеріального раку винограду ґрунтується на визначенні патогенності виділених штамів агробактерій методом зараження індикаторних рослин. Метод потребує значних витрат часу, трудоємкий, і не завжди дозволяє отримати достовірні результати. У зв'язку з цим актуальною постає розробка молекулярно-генетичних методів діагностики, які дозволяють у найкоротший термін виявити наявність патогена. Використання таких методів діагностики, як метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), уможливило б за короткий термін проведення скринінгу великої кількості зразків та вивчення поширення збудника бактеріального раку на виноградниках України, в тому числі - в імпортованому та вітчизняному садивному матеріалі. Подібні дослідження в сучасний період є необхідними для запобігання подальшого поширення захворювання і для виробництва високоякісного садивного матеріалу, який задовольняв би потреби виноградарства України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з науково-дослідницькими роботами кафедри мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І.Мечникова у рамках спільного українсько-молдовського проекту “Розробка молекулярно-біологічних і серологічних методів діагностики вірусів і збудників бактеріального раку винограду” за підтримкою держбюджетної теми Міністерства освіти і науки України № М/214-2004 (наказ № 630 від 29.07.04), а також у рамках виконання науково-технічної роботи 6.05.51 “Розробка технології отримання діагностикума для виявлення збудника бактеріального раку винограду” за підтримкою держбюджетної теми Міністерства освіти і науки України (ДЗ/165-05 наказ № 440 від 26.07.05).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи була оптимізація методів діагностики бактеріального раку винограду і вивчення його поширення на виноградниках півдня України.

Для досягнення мети дослідження були поставлені такі задачі:

оптимізувати методи виявлення пухлинотвірних видів Agrobacterium в тканинах винограду та ґрунті за допомогою ПЛР;

порівняти методи визначення патогенності штамів агробактерій, які ґрунтуються на зараженні індикаторних рослин та ПЛР з використанням праймерів до послідовності ipt (онкоген пухлинотвірних агробактерій);

виявити органи винограду, тестування яких дозволить отримати найдостовірніший результат про наявність зараження винограду на бактеріальний рак;

провести порівняльне дослідження поширення бактеріального раку на винограді у вигляді латентної інфекції і захворювання з візуальними симптомами;

встановити розповсюдження бактеріального раку на різних сортах винограду;

визначити наявність патогенних A. vitis та A. tumefaciens в сертифікованому садивному матеріалі, що імпортується до України з країн ЄЕС;

дослідити ґрунт на виноградниках та ділянках, що призначені для закладання виноградників, на наявність збудника бактеріального раку;

дослідити ґрунт на виноградниках, уражених збудником бактеріального раку, в різні періоди року та визначити тривалість виживання збудника бактеріального раку в південних чорноземних ґрунтах.

Об'єкт дослідження. Насадження винограду півдня України, культури агробактерій, виділені із 705 зразків рослинного матеріалу виноградників півдня України і посадкового матеріалу, імпортованого з країн ЄЕС, та з 431 зразка ґрунту виноградників, а також колекційні штами A. tumefaciens С58, A. vitis АТ1, A. vitis АВ3, А. tumefaciens FA2 і A. radiobacter К55, люб'язно надані доктором E. Szegedi (Угорщина) і доктором T. J. Burr (США).

Предмет дослідження. Діагностика збудника бактеріального раку винограду за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції, здатність виділених штамів Agrobacterium до пухлиноутворення на тест-рослинах, видима і латентна зараженість бактеріальним раком насаджень різних сортів винограду, які культивуються на півдні України, і садивного матеріалу, імпортованого з країн ЄЕС, а також інфікованість патогенними штамами A. vitis і A. tumefaciens ґрунту виноградників.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували метод візуального фітосанітарного обстеження, метод зараження тест-рослин, мікробіологічні та молекулярно-біологічні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів.

Для діагностики збудника бактеріального раку винограду вперше в Україні застосовано метод полімеразної ланцюгової реакції; виявлено зараженість пухлинотвірними штамами Agrobacterium садивного матеріалу, імпортованого з країн ЄЕС, і виробничих насаджень деяких сортів винограду, що широко культивуються на півдні України; встановлено зараженість агробактеріями ґрунту виноградників деяких регіонів півдня України. Показано, що в південних чорноземних ґрунтах збудник бактеріального раку винограду може зберігатися принаймні протягом двох років, або не виявлятися вже через 6 місяців після викорчовування уражених кущів. Показано, що в одних й тих самих місцях відбору проб ґрунту дослідної ділянки пухлинотвірні штами Agrobacterium можуть бути присутніми або не виявлятися в різні сезони відбору проб.

Практичне значення одержаних результатів.

- Оптимізовано методику діагностики збудника бактеріального раку винограду на основі полімеразної ланцюгової реакції.

- Показано, що використання у діагностиці бактеріального раку винограду даної методики ПЛР дозволяє виявити більш широкий спектр потенційно патогенних штамів агробактерій у порівнянні з методом зараження індикаторних рослин.

- Показано, що для встановлення інфікованості патогенними Agrobacterium на рослині слід відбирати здерев'янілі пагони, корені та пухлинну тканину.

- Відібрані насадження винограду, вільні від пухлинотвірних штамів Agrobacterium, рекомендовані нами для відбору матеріалу, що використовується у процесі вегетативного розмноження винограду.

- Виявлені ділянки, ґрунт яких не містить збудника бактеріального раку винограду. Дані ділянки рекомендовані нами для закладки виробничих і маточних насаджень.

Оптимізована методика діагностики збудника бактеріального раку методом ПЛР впроваджена при виробництві садивного матеріалу у лабораторії прищеплювального комплексу ЗАТ “Одеський коньячний завод”, що підтверджено відповідним актом.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконано пошук та аналіз літературних джерел за темою дисертації, підібрано та модифіковано методи дослідження, проведено планування експериментів, фітосанітарне обстеження, виділення агробактерій із навколишнього середовища, пробопідготовку зразків, тестування проб методами зараження тест - рослин та ПЛР, а також аналіз отриманих результатів і оформлення роботи. Фітосанітарне обстеження і виділення агробактерій із здерев'янілих пагонів, коренів, пухлин, ґрунту проводились автором разом з професором кафедри мікробіології та вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова Мілкусом Б.Н., науковим співробітником Конуп Л.О., пробопідготовка та тестування зразків, що досліджувалися методами зараження тест-рослин і ПЛР - разом з аспіранткою Жунько І.Д., які є співавторами відповідних публікацій. Постановка задач та обґрунтування науково-практичних висновків проводились сумісно з науковим керівником професором Мілкусом Б.Н. Друковані роботи підготовлені автором за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені для обговорення на науково-практичній конференції молодих вчених, присвяченій 175-річчю ІВіВ “Магарач” (Ялта, вересень 2003), 14-й міжнародній конференції ICVG (Локоротондо, Італія, 12-17 вересня 2003), Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 15-17 вересня 2004), міжнародній науковій конференції “Проблеми збереження, відновлення та збагачення біорізноманітності в умовах антропогенно зміненого середовища” (Кривий Ріг, 16-19 травня 2005), міжнародній конференції “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія” (Київ, 4-6 жовтня 2005), ювілейній 60-й науковій конференції професорсько-викладацького складу і наукових співробітників ОНУ ім. І.І. Мечникова (Одеса, 23 - 24 листопада, 2005 року).

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені у 5 статтях, опублікованих у профільних журналах, 1 стаття - у збірнику наукових праць, і в 4 тезах, опублікованих за матеріалами з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 164 сторінках комп'ютерного тексту і складається зі вступу, загальної характеристики роботи, огляду літератури, опису умов, матеріалів і методів дослідження, експериментальної частини, висновків та переліку посилань, який містить 232 найменування, в тому числі 185 - іноземною мовою. Робота містить 21 таблицю, 23 рисунки і 5 додатків.

Висловлюю щиру подяку колективу лабораторії вірусології, мікробіології і агрохімії ЗАТ “Одеський коньячний завод” і колективу відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, особисто - завідувачу д.б.н., члену-кореспонденту НАН України Малюті С.С. і к.б.н. Телегеєву Г.Д.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Складається з 9-ти підрозділів, в яких розглянуто систематичне положення та біологічні властивості бактерій видів Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis. Докладно висвітлено будову генетичного апарату пухлинотвірних штамів Agrobacterium, патогенез та поширеність захворювання, сприйнятливість рослин до ураження бактеріальним раком, методи виявлення патогенних агробактерій та заходи захисту рослин.

УМОВИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Матеріалом дослідження слугували культури агробактерій, виділені з 705 зразків рослинного матеріалу з виноградників півдня України і садивного матеріалу, імпортованого з країн ЄЕС, та з 431 зразка ґрунту виноградників, а також колекційні штами A. tumefaciens С58, A. vitis АТ1, A. vitis АВ3, А. tumefaciens FA2 і A. radiobacter К55. Методом візуального фітосанітарного обстеження досліджували насадження винограду прищепних та підщепних сортів у АСТ “Украгро” Одеської області). Проводили обстеження фітосанітарного стану кожного куща (Леманова, 1988).

Агробактерії із здерев'янілої лози та коренів виділяли згідно методу Я. Лехоцки (Lehoczky, 1971). Для виділення використовували середовище Рой і Сасера (Roy, Sasser, 1983; Manulis et al., 2002). Пасоку використовували для прямого аналізу методом ПЛР, а також підрощували на середовищі Рой і Сасера для збільшення кількості бактеріальної біомаси (Szegedi, Bottka, 2002). Агробактерії виділяли з пухлин (Методические указания, 1981).

Ґрунт для дослідження на присутність збудника бактеріального раку відбирали у ризосфері кущів винограду, в міжряддях виноградника і на ділянках, призначених для закладання виноградників. Із ґрунту агробактерії виділяли за модифікованою методикою (Krimi et al., 2002; Лиманская, 2003).

Для тестування в ПЛР використовували одно-дводобові культури агробактерій, які виросли на картопляному агарі (Haas et al., 1995). Для виділення ДНК агробактерій використовували набір “ДНК-сорб“ фірми “АмплиСенс” (Росія). ДНК також виділяли методом теплового лізису бактеріальних суспензій згідно з J. Haas et al. (1995) і E. Szegedi and S. Bottka (2002).

Реакційну суміш для проведення ПЛР для виявлення збудника бактеріального раку готували згідно з J. Haas et al. (1995), проте концентрації низки компонентів і параметри ампліфікації були змінені (Мілкус та інші, 2005).

У якості тест-рослин використовували томати (Lycopersicon esculentum Mill.), зелені чубуки винограду (Vitis vinifera L.) та диски коренеплодів моркви (Daucus carrota L.). Зараження тест-рослин проводили за загальноприйнятими методиками (Леманова, 1988; Goodman et al., 1993).

Отримані результати обробляли засобами математичної статистики на основі пакета прикладних програм “Statistica 6.0”. Оцінку відмінності між вибірками проводили за допомогою критерію Пірсона (ч2) (Доспехов, 1985).

ФІТОСАНІТАРНЕ ВІЗУАЛЬНЕ ОБСТЕЖЕННЯ ВИНОГРАДНИКІВ

Ураженість сорту Каберне Совіньон на окремих ділянках АСТ “Украгро” Одеської області становила від 0,3 до 11 %. Різний відсоток хворих кущів на окремих ділянках виноградника, імовірно, пов'язаний з походженням садивного матеріалу. Так, на виноградниках, закладених садивним матеріалом, імпортованим у 1999-му році, бактеріальний рак був виявлений у 0,3 % кущів, а на виноградниках, посадковий матеріал для закладки яких був імпортований у 2000-му році, кількість уражених кущів становила від 7,0 до 11 %.

Серед рослин сорту Мерло рожевий у 2002 році відмічено 0,1 % хворих на бактеріальний рак кущів, а в 2003 році кількість рослин з симптомами бактеріального раку становила 13 %, тобто збільшилася за один рік у 130 разів. Збільшення кількості хворих рослин у вказані роки спостерігалось також на насадженнях сорту Піно чорний (0,23 % у порівнянні з 0,003 %) і Шардоне (0,15 % у порівнянні з 0,05 %).

На виноградниках сорту Мускат олександрійський виявлено 16,0 % кущів, хворих на бактеріальний рак.

Обстежені ділянки виноградників були закладені посадковим матеріалом, імпортованим із Франції. До системи сертифікації посадкового матеріалу винограду, прийнятої Європейським економічним співтовариством, не входить тестування рослин на наявність збудника бактеріального раку винограду, внаслідок чого імпортований садивний матеріал може бути латентно інфікованим. На підщепних сортах V. berlandieri x V. riparia Кобера 5ББ, V. berlandieri x V. riparia CO4, V. riparia x V. rupestris 101-14 та V. riparia x V. rupestris 3309 методом візуального обстеження рослини із симптомами захворювання на бактеріальний рак виявлені не були.

ОПТИМІЗАЦІЯ МЕТОДИКИ ПЛР ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ПУХЛИНОТВІРНИХ АГРОБАКТЕРІЙ

У ході дослідження тест-система для виявлення збудника бактеріального раку винограду на основі ПЛР була нами оптимізована. Об'єм реакційної суміші для проведення ПЛР, запропонованої J. Haas et al. (1995), був зменшений з 50 мкл до 20 мкл. Використовували п'ятикратний буфер для проведення ПЛР з крезоловим червоним фірми “АмплиСенс” (Росія). Реакційна суміш містила 0,5 мкМ кожного з праймерів. Після оптимізації складу реакційної суміші концентрація Mg++ становила 2 ммоль. Кількість одиниць Taq-полімерази у реакційній суміші була збільшена до 2 Од. Оптимізована реакційна суміш була застосована для ампліфікації ДНК агробактерій з праймерами ipt і з праймерами virD2. Бактеріальну ДНК для проведення ПЛР виділяли декількома способами, і для тестування зразків був обраний метод Szegedi and Bottka (2002). Температура відпалу була підвищена до 52 єС у порівнянні з 50 єС, запропонованими J. Haas et al. (1995). Оптимізована методика ПЛР застосовувалась нами у подальшому для тестування ДНК штамів агробактерій, виділених з тканин винограду і ґрунту (рис.1).

В літературі малочисельні дані щодо співвідношення virD2- і ipt-позитивних штамів серед агробактерій, виділених на виноградниках (Haas et al., 1995; Lastra et al., 2000; Manulis et al., 2002). Наші дослідження показали, що не всі virD2-позитивні штами агробактерій, виділені із здерев'янілих пагонів винограду та ґрунту виноградників на півдні України, виявились ipt-позитивними (рис. 2).

Для перевірки рослин на зараженість збудником бактеріального раку при виробництві посадкового матеріалу слід тестувати ДНК виділених штамів агробактерій як з праймерами до послідовності ipt, так і з праймерами до послідовності virD2, що узгоджується з даними попередніх дослідників (Haas et al., 1995; Manulis et al., 2002).

ЗАРАЖЕННЯ ТЕСТ-РОСЛИН ВИДІЛЕНИМИ ШТАМАМИ АГРОБАКТЕРІЙ

Зелені чубуки винограду заражали штамами агробактерій, які були протестовані методом ПЛР на наявність гену патогенності ipt і визначені як ipt-позитивні. Пухлиноутворення на чубуках винограду спричинили лише 45,45 % ipt-позитивних штамів. Відсутність пухлиноутворення на винограді деякими штамами агробактерій, що несуть ген патогенності ipt, вірогідно, пов'язана із специфічністю низки штамів по відношенню до сорту рослини-живителя (Ferreira, van Zyl, 1986).

Крім того, як відомо з даних попередніх дослідників, штами, що несуть гени патогенності і не спричиняють захворювання на рослині, можуть нести невеликі плазміди IncW або IncQ груп несумісності, присутність яких у геномі пригнічує здатність штаму агробактерії до пухлиноутворення (Миклашевичюс и др., 1988).

У наступному експерименті ipt-позитивними штамами агробактерій, виділеними з лози і ґрунту виноградника, заражали три види тест-рослин: молоді рослини томатів, зелені чубуки винограду і диски коренеплодів моркви. На зелених чубуках винограду симптоми бактеріального раку проявила найбільша кількість штамів (56,4 %) (рис. 3).

Пухлиноутворення частіше спричиняли штами, виділені з лози винограду (52,6 %). Серед штамів агробактерій, вилучених з ґрунту, симптоми зараження на зелених чубуках винограду спричиняли менший відсоток штамів, а саме - 33,3 %. Пухлиноутворення на одній з трьох використаних тест-рослин спричиняла найбільша кількість штамів агробактерій - 35,0 %. Здатність до пухлиноутворення на двох з трьох використаних індикаторних рослин була у 30,0 % досліджених штамів. Найменша кількість штамів агробактерій (5,0 %) спричиняли симптоми бактеріального раку на усіх трьох тест-рослинах. Частина ipt-позитивних штамів агробактерій, а саме - 28,2 %, не спричиняли симптомів бактеріального раку на жодній з тест-рослин. Тестування методом ПЛР ДНК агробактерій на наявність послідовності ipt дозволяє виявити не тільки ті штами, котрі б спричиняли пухлиноутворення на використаних рослинах-індикаторах, але й більш широкий спектр потенційно небезпечних штамів агробактерій.

ВИЯВЛЕННЯ ПАТОГЕННИХ АГРОБАКТЕРІЙ У ЗДЕРЕВ'ЯНІЛИХ ПАГОНАХ, КОРЕНЯХ, ПАСОЦІ ТА ПУХЛИНАХ ВИНОГРАДУ

Виявлено інфікованість пухлинотвірними штамами A. tumefaciens і A. vitis насаджень деяких сортів, які широко культивуються на півдні України (табл. 1).

Таблиця 1. - Зараженість збудником бактеріального раку деяких сортів, виявлена методом ПЛР (2003 - 2005 рр.)

Сорт	Господарство	Регіон культивування рослин	Кількість інфікованих рослин, %
Мерло рожевий	ТОВ “Технолог”	Одеська область	15,0
Страшенський	Агрофірма радгосп “Білозерський”	Херсонська область	10,0
Цитронний Магарача	ВАТ “Ампелос”	АР Крим	7,2
Восторг	Агрофірма радгосп “Білозерський”	Херсонська область	25,0
Мускат олександрійський	АСТ “Украгро”	Одеська область	40,0
Сапераві	ВАТ “Жовтневе”	Одеська область	11,5
V. berlandieri x V. riparia Кобера 5ББ	АСТ “Украгро”	Одеська область	6,2
V. berlandieri x V. riparia Кобера 5ББ	ВАТ “Старокримське”	АР Крим	30,0

Зараженість сорту Каберне Совіньон у обстежених господарствах становила від 0 до 33,3 % (табл. 2).

Таблиця 2. - Зараженість збудником бактеріального раку сорту Каберне Совіньон (2003 - 2005 рр.)

Господарство	Область	Інфікованість лози, %
АСТ ”Украгро”, виноградник № 1 (2000-й рік посадки)	Одеська	27,3
АСТ “Украгро”, виноградник № 2 (2000-й рік посадки)	Одеська	35,0
АСТ ”Украгро”, 1999-й рік посадки	Одеська	0
Виноконцерн ”Шабо”, № 1	Одеська	8,8
Виноконцерн ”Шабо”, № 2	Одеська	24,1
ТОВ ”Технолог”	Одеська	21,4
ВАТ ”Радсад”	Миколаївська	33,3

При тестуванні сертифікованого посадкового матеріалу винограду сорту Каберне Совіньон, імпортованого з Франції, виявлено, що латентно інфікованими збудником бактеріального раку були 13,3 % саджанців дослідженої партії.

Показано, що кущі клонів винограду так само, як і звичайний посадковий матеріал, можуть містити пухлинотвірні штами агробактерій.

Тестування методом ПЛР ДНК культур агробактерій, виділених із зразків здерев'янілих пагонів та коренів винограду, дозволило встановити, що кількість латентно інфікованих рослин перевищувала кількість рослин із симптомами захворювання на бактеріальний рак (рис. 4).

Дані, отримані при тестуванні зразків пагонів та коренів, свідчать про нерівномірний розподіл агробактерій у рослині. Так, патоген може виділятися із коренів рослини і не виділятися з лози тієї ж самої рослини і навпаки, виділятися тільки з лози куща. Повне уявлення про поширеність збудника бактеріального раку можна отримати при тестуванні здерев'янілих пагонів і коренів рослини винограду.

На насадженнях сорту V. berlandieri x V. riparia Кобера 5ББ у АСТ “Украгро” рослин з симптомами бактеріального раку не було, тоді як методом ПЛР виявлено 6,2 % латентно інфікованих кущів.

Виявлення збудника бактеріального раку методом ПЛР безпосередньо у пасоці не призвело до позитивних результатів, що співпадає з даними Е. Szegedi and S. Bottka (2002). Для детекції патогенних штамів A. vitis і A. tumefaciens у пасоці нами у подальшому застосовувався метод біо-ПЛР.

Виділення патогенних штамів агробактерій із пухлинної тканини винограду не завжди було можливим. Збудник бактеріального раку був виділений нами з 60 % зразків пухлин, відібраних на виноградниках, і з 40 % зразків пухлин саджанців імпортованого посадкового матеріалу.

Агробактерії виділяли з пухлин, що утворилися у результаті зараження зелених чубуків винограду штамами збудника бактеріального раку, в геномі яких методом ПЛР було встановлено наявність гена ipt. Агробактерії, котрі несли ген ipt, виявлялися лише у 17,6 % пухлин. Вірогідно, штами, ідентифіковані раніше як ipt-позитивні, втратили досліджений ген патогенності (Belanger et al., 1995) або ж були присутніми у тканинах пухлини у незначних кількостях, недостатніх для виявлення (Перепнихатка, 1984; Cubero et al., 1999). Для діагностики бактеріального раку винограду необхідно аналізувати разом з тканинами пухлин тканини лози і коренів рослин.

ВИЯВЛЕННЯ ПАТОГЕННИХ АГРОБАКТЕРІЙ У ҐРУНТІ ВИНОГРАДНИКА

Показано, що наявність на винограднику великої кількості уражених бактеріальним раком рослин (40,0 %) супроводжується контамінацією ґрунту: пухлинотвірні агробактерії виявлялися в 47,1 % досліджених зразків. На ділянці, де відмічався невеликий відсоток уражених рослин (0,24 %), збудник бактеріального раку у ґрунті не виявлявся.

Патогенні агробактерії виділялися як із ґрунту ризосфери кущів винограду, так і зразків ґрунту міжрядь виноградників (табл. 3).

Таблиця 3. Виявлення збудника бактеріального раку у ризосфері та міжряддях кущів виноградників сорту Каберне Совіньон 2000 року посадки

Господарство	Кількість зразків ґрунту, які містили патоген, %	Співвідношення інфікованих зразків ризосфера/міжряддя
	ризосфера	міжряддя
АСТ “Украгро” (№ 1)	21,0	20,0	1,05
АСТ “Украгро” (№ 2)	22,4	11,8	1,9
АСТ “Украгро” (№ 3)	9,0	30,0	0,3
ТОВ “Технолог”	25,0	0	-

Отримані результати свідчать про нерівномірне поширення пухлинотвірних агробактерій у ґрунті виноградників.

Для вивчення термінів виживання патогенних агробактерій у південному малогумусному чорноземі на винограднику нами було проведено тестування методом ПЛР ДНК культур агробактерій, вилучених з ґрунту виноградника 2000 року посадки, де восени 2002 року були видалені рослини, уражені бактеріальним раком. На місце видалених кущів весною 2003 року були висаджені саджанці винограду такого ж сорту (Каберне Совіньон). Виявлено, що пухлинотвірні агробактерії у південному малогумусному чорноземі в залежності від ділянки зберігалися на винограднику принаймні два роки після викорчовування уражених бактеріальним раком рослин або не виявлялися вже через шість місяців після викорчовування.

Для встановлення термінів виживання агробактерій на ділянці, де виноград деякий час не культивувався, відбирали зразки на полі, де напротязі 27 років культивувався виноград, а після його викорчовування два роки - пшениця. При тестуванні методом ПЛР ДНК культур агробактерій, які були виділені з ґрунту, виявлено, що 20,0 % зразків містили збудника бактеріального раку. Патоген зберігався на досліджуваній ділянці щонайменше протягом двох років після видалення кущів винограду.

Дослідження показали поширеність збудника бактеріального раку у ґрунті виноградників деяких господарств півдня України (табл. 4).

Таблиця 4. - Виявлення збудника бактеріального раку у зразках ґрунту виноградників деяких регіонів півдня України

Регіон	Господарство	Кількість зразків, які містили збудника бактеріального раку, %
Одеська область	АСТ “Украгро”	0 - 47,1
	ТОВ “Технолог”	0 - 48,0
	Виноконцерн “Шабо”	33,3
Миколаївська область	ВАТ “Радсад”	37,5
АР Крим	КССП “Ізумрудний”, № 1	5,0
	КССП “Ізумрудний”, № 2	3,0
	ІВіВ “Магарач”	0
	ДП агрофірма “Завітне”	0
	Держпідприємство “Садовод”	0
	ДП завод-радгосп ім. П. Осіпенко	7,7

У різні сезони на винограднику відмічена різна кількість зразків ґрунту ризосфери, що містять патогенні агробактерії (рис. 5).

Таке ж саме явище спостерігалося для зразків ґрунту міжрядь (рис. 6).

На дослідженому винограднику відмічені міжряддя і кущі (табл. 5, табл. 6), у ризосфері яких збудник бактеріального раку виділявся в кожен з сезонів.

Таблиця 5. - Виявлення патогенних агробактерій у ґрунті міжрядь у різні сезони

Дати відбору зразків	№ точок відбору зразків
29.09.03	25.03.04	15.07.04	14.11.04
+	-	-	-	8а*, 15а
+	+	-	+	6а
-	+	-	-	7а, 17а, 18а, 20а
-	-	+	+	1а, 9а, 10а, 11а
-	-	+	-	2а, 3а, 4а
-	-	-	+	16а
+	+	+	+	5а

Примітка: міжряддя розташовані напроти куща з відповідним номером

У ґрунті міжрядь, розташованих напроти досліджених рослин, патогенні штами агробактерій виявляються у той самий сезон, що і популяції патогена у ризосфері даних кущів, або ж незалежно від інфікованості ризосфери відповідного куща.

Таблиця 6. Виявлення патогенних агробактерій у ґрунті ризосфери у різні сезони

Дати відбору зразків	№ досліджуваних кущів
27.06.03	29.09.03	25.03.04	15.07.04	14.11.04
+	-	-	-	-	18
+	+	-	-	-	12, 15
+	+	+	-	-	10
+	-	+	-	-	20
+	-	-	-	+	2, 19
-	+	-	-	-	5
-	-	-	+	-	1
-	-	-	+	+	3, 4, 11, 16
-	-	-	-	+	14
-	+	-	+	-	8
-	+	-	+	+	13
+	+	+	+	+	7, 9

Із ґрунту міжрядь і ризосфери одних і тих самих кущів винограду патоген виявлявся перманентно або не виявлявся у різні сезони відбору проб, тому більш чітку інформацію щодо поширення збудника бактеріального раку на ділянці можна отримати при тестуванні зразків ґрунту, відібраних напротязі декількох сезонів.

ВИСНОВКИ

1. Бактеріальний рак винограду поширений на виноградниках півдня України, де зараженість кущів окремих сортів, виявлена методом ПЛР, становила від 0 до 40,0 % в залежності від сприйнятливості сорту і походження посадкового матеріалу, що свідчить про необхідність відбору для виробництва посадкового матеріалу винограду у данному регіоні насаджень, вільних від патогенних агробактерій.

2. Для півдня України показана висока (до 47,1 %) інфікованість ґрунту деяких ділянок уражених виноградників патогенними агробактеріями, що вказує на необхідність тестування ґрунту перед закладенням насаджень у дослідженому регіоні.

3. Вперше в Україні метод ПЛР застосовано для діагностики бактеріального раку і запроваджено у систему виробництва високоякісного посадкового матеріалу. Оптимізовані методика діагностики та тест-система на основі методу ПЛР для виявлення збудника бактеріального раку у здерев'янілих пагонах, коренях, пухлинах, пасоці винограду, ґрунті.

4. Визначення патогенності штамів агробактерій, виділених з винограду і ґрунту виноградника на півдні України, методом зараження трьох видів тест-рослин (виноград, томати і морква) у порівнянні з методом ПЛР з використанням праймерів до послідовності ipt дозволяє виявити тільки 70 % штамів, що несуть даний ген патогенності.

5. Діагностику бактеріального раку винограду необхідно проводити на основі ПЛР-аналізу, оскільки кількість латентно інфікованих рослин, виявлена при тестуванні здерев'янілих пагонів та коренів методом ПЛР, була у 1,6 - 6,2 разу вищою за кількість рослин із симптомами захворювання.

6. Для діагностики бактеріального раку винограду необхідно відбирати для аналізу одночасно здерев'янілі пагони, корені та пухлини досліджуваних рослин через те, що агробактерії у рослині розподілені нерівномірно, а в пухлинній тканині збудник виявляється не завжди.

7. Одним з джерел розповсюдження патогенних агробактерій в Україні є імпортований посадковий матеріал, не сертифікований на наявність збудника бактеріального раку, інфікованість якого в латентній формі досягала 13 %.

8. В південному малогумусному чорноземі на півдні України збудник бактеріального раку може не виявлятися вже через 6 місяців після викорчовування заражених кущів винограду, або може зберігатися принаймні протягом двох років. Для вивчення поширення збудника бактеріального раку необхідно тестувати ґрунт ділянки протягом декількох сезонів.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

При виробництві садивного матеріалу винограду необхідно тестувати рослини, призначені для вегетативного розмноження, або відібрані здерев'янілі чубуки прищепних та підщепних сортів на наявність збудника бактеріального раку за допомогою методу діагностики, заснованого на ПЛР. Застосування оптимізованої тест-системи для виявлення пухлинотвірних Agrobacterium методом ПЛР дозволяє скоротити затрати часу на діагностику захворювання.

Для діагностики бактеріального раку у рослині слід відбирати з куща здерев'янілі пагони, корені та пухлинну тканину.

При виборі ділянки, призначеної для закладення виноградника, необхідним є тестування зразків ґрунту на наявність збудника бактеріального раку.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лиманская Н.В. Выявление Agrobacterium vitis в почве виноградника // Виноградарство и виноделие: Сб. научн. тр. - Ялта: Изд-во института винограда и вина “Магарач”, 2003. - С. 29 - 31. (Здобувачем проведено вилучення штамів збудника, тестування штамів методом ПЛР, зроблено висновки, оформлено статтю).

2. Лиманская Н.В., Жунько И.Д., Конуп Л.А., Милкус Б.Н. Применение полимеразной цепной реакции для диагностики A. vitis // Виноградарство и виноделие. - 2003. - № 6. - С. 14 - 16. (Здобувачем проведено виділення штамів агробактерій, тестування штамів методом ПЛР, зроблено висновки).

3. Ліманська Н.В. Діагностика бактеріального раку винограду методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням двох пар праймерів // Вісник Одеського національного університету. - 2004. - Т. 9, № 5. - С. 177 - 182. (Здобувачем проведено виділення штамів агробактерій, тестування штамів методом ПЛР, зроблено висновки, оформлено статтю).

4. Ліманська Н.В. Наявність патогенних штамів Agrobacterium vitis у ґрунті виноградників // Вісник аграрної науки. - 2005. - № 2. - С. 81 - 83. (Здобувачем проведено виділення штамів агробактерій, тестування штамів методом ПЛР, зроблено висновки, оформлено статтю).

5. Лиманская Н.В., Жунько И.Д., Милкус Б.Н., Конуп Л.А. Бактериальный рак на импортных саженцах винограда и в почве на винограднике // Праці міжнар. наук. конф. “Проблеми збереження, відновлення та збагачення біорізноманітності в умовах антропогенно зміненого середовища”. - Дніпропетровськ: Проспект, 2005. - С. 453 - 454.

6. Ліманська Н.В., Жунько І.Д., Мілкус Б.Н., Конуп Л.О. Виявлення ipt-позитивних штамів агробактерій у тканинах винограду методом ПЛР // Вісник Одеського національного університету. - 2005. - Т. 10, № 3. - С. 143 - 147. (Здобувачем проведено виділення штамів агробактерій, тестування штамів методом ПЛР, зараження тест-рослин штамами патогенних агробактерій, зроблено висновки, оформлено статтю).

7. Мілкус Б.Н., Конуп Л.О., Ліманська Н.В., Жунько І.Д. Діагностика вірусів і збудника бактеріального раку винограду за допомогою полімеразної ланцюгової реакції // Тези Х З'їзду Товариства мікробіологів України. - Одеса: “Астропринт”, 2004. - С. 286.

8. Мілкус Б.Н., Конуп Л.О., Жунько І.Д., Ліманська Н.В. Тестування деяких сортів винограду на наявність збудника бактеріального раку і вірусів коротковузля та скручування листя // Мікробіол. журн. - 2005. - Т. 67, № 1. - С. 41 - 48. (Здобувачем проведено виділення штамів агробактерій, тестування штамів методом ПЛР, зроблено висновки, оформлено статтю).

9. Мілкус Б.Н., Конуп Л.О., Ліманська Н.В., Жунько І.Д. Бактериальные заболевания винограда в Украине // Зб. статей учасн. міжнар. наук. конф. “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія”. - Житомир: Державн. екологічн. університет, 2005. - С. 59 - 63.

10. Konup L., Limanskaya N., Zhunko I., Milkus B. The production of grapevine certified planting material in the Ukraine // Proc. 14th ICVG Conf. - Locorotondo (Italy), 2003. - P. 164.

 Ліманська Н.В. Бактеріальний рак винограду (діагностика та поширення на півдні України). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 06.01.11 - фітопатологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2006.

Дисертація присвячена вивченню поширення збудника бактеріального раку на виноградниках півдня України, а також оптимізації методики діагностики захворювання.

Бактеріальний рак винограду поширений на виноградниках півдня України. Зараженість рослин окремих сортів, виявлена напротязі 2002 - 2005 років, становила від 0 до 40 %. На виноградниках, де росте велика кількість кущів, заражених збудником бактеріального раку (40 %), спостерігається високий відсоток зразків ґрунту (47,1 %), що містять пухлинотвірні штами Agrobacterium vitis i A. tumefaciens.

Залежно від ділянки збудник бактеріального раку може не виявлятися у південних чорноземних ґрунтах уже через шість місяців після викорчовування дворічних заражених кущів, або може зберігатися не менш, ніж два роки. Вперше в Україні для виявлення патогенних агробактерій у здерев'янілих пагонах, коренях, пухлинах, пасоці і ґрунті було застосовано оптимізовану методику, засновану на полімеразній ланцюговій реакції. Виявлено, що латентно зараженими збудником бактеріального раку є не тільки звичайний посадковий матеріал, але й клоновий матеріал, в тому числі - імпортований. Для вивчення поширення пухлинотвірних агробактерій у ґрунті виноградника доцільним є тестування зразків, відібраних впродовж декількох сезонів.

Ключові слова: бактеріальний рак винограду, Agrobacterium, полімеразна ланцюгова реакція, посадковий матеріал, ґрунт виноградників.

Лиманская Н.В. Бактериальный рак винограда (диагностика и распространенность на юге Украины). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению распространенности возбудителя бактериального рака на виноградниках юга Украины, а также оптимизации методики диагностики заболевания.

Бактериальный рак винограда распространен на виноградниках юга Украины. Зараженность растений отдельных сортов, выявленная на протяжении 2002 - 2005 годов, составляла от 0 до 40 %. На виноградниках, где произрастает большое количество кустов, пораженных возбудителем бактериального рака (40 %), наблюдается высокий процент проб почвы (47,1 %), содержащих опухолеобразующие штаммы Agrobacterium vitis и A. tumefaciens.

В зависимости от участка возбудитель бактериального рака может не выявляться в южных черноземных почвах уже через шесть месяцев после выкорчевки двухлетних зараженных кустов, а может сохраняться в них не менее двух лет. Впервые в Украине для выявления патогенных агробактерий в одревесневшей лозе, корнях, опухолях, пасоке и почве была применена оптимизированная методика, основанная на полимеразной цепной реакции. Выявлено, что латентно инфицированным возбудителем бактериального рака является не только рядовой посадочный материал, но и клоновый материал, в том числе - импортированный. Для изучения распространенности опухолеобразующих агробактерий в почве целесообразным является тестирование образцов, отобранных в течение нескольких сезонов.

Ключевые слова: бактериальный рак винограда, Agrobacterium, полимеразная цепная реакция, посадочный материал, почва виноградников.

Limanska N.V. Crown gall of grape (diagnostics and spread on the South Ukraine). - Manuscript.

Thesis for the candidate's degree by speciality 06.01.11 - phytopathology - National Agrarian University, Kyiv, 2006.

In this work we investigated the crown gall disease spread on the Ukrainian vineyards, and optimized a PCR based method for diagnostics of crown gall.

The crown gall of grape is spread on the South part of the Ukraine. Our investigations conducted during 2002 - 2005 years revealed that in some vineyards up to 40 % of some scion and rootstock cultivars were infected with pathogenic Agrobacterium vitis and A. tumefaciens. The percentage of diseased grapevines depended on cultivar susceptibility and the origin of planting material.

For the first time in the Ukraine the pathogenic agrobacteria were detected in wooden shoots, roots, galls, bleeding sap and soil by PCR based technique that was optimized in our research.

PCR analyses allowed us to reveal that the amount of grapevines infected in latent stage was 1,6 - 6,2 times higher than the amount of plants with crown gall symptoms.

By inoculation of three plants (grapevine, tomato, carrot) with agrobacteria strains isolated from the South Ukraine vineyards only 70,0 % of strains contained an ipt gene could be detected.

The PCR tests of cultures isolated from grapevine shoots and roots confirmed that agrobacteria in grapevines were distributed irregularly.

After experimental inoculation of grapevines the crown gall agent could not be detected in all tumours. We recommend to test wooden shoots, roots and tissue resembling tumour tissue from the original investigated plant to avoid false negative diagnostics results.

We revealed that both regular planting material and clones including imported planting material were infected with crown gall agent.

Vineyards with high number of infected grapevines (40 %) reveal high number of soil samples contaminated with pathogenic A. vitis and A. tumefaciens (47,1 %). In one investigated vineyard (south black soils also known as south chernozem) eradication of the crown galled plants resulted in pathogen elimination within 6 months. However in other vineyards crown gall agent could be detected at least after 2 years upon infected plants eradication. In different seasons the numbers of soil samples containing tumorigenic agrobacteria in the investigated vineyard were not the same. Our results suggest the expediency of soil sampling for tumorigenic agrobacteria detection during several seasons to study the spread of the pathogens in the investigated plot.

We identified vineyards free from crown gall agent and recommended them for grapevine planting material production. Plots where soil didn't contain tumorigenic agrobacteria were recommended as planting sites for vineyards.

Key words: crown gall of grape, Agrobacterium, polimerase chain reaction, planting material, vineyard soil.

Размещено на Allbest.ru

...