Шапероноподібні властивості компонентів апарату трансляції вищих еукаріотів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 577.152.611

577.217.535

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ШАПЕРОНОПОДІБНІ ВЛАСТИВОСТІ КОМПОНЕНТІВ АПАРАТУ ТРАНСЛЯЦІЇ ВИЩИХ ЕУКАРІОТІВ

03.00.03 - молекулярна біологія

ЛУКАШ ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

Негруцький Борис Сергійович, доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Офіційні опоненти:

Корнелюк Олександр Іванович, доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу білкової інженерії та біоінформатики;

Галкін Анатолій Павлович, доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу генетичної інженерії.

Провідна установа: Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 20 жовтня 2006 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 18 вересня 2006 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Підпала.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нативні, функціонально активні білки утворюються шляхом фолдингу новосинтезованих поліпептидних ланцюгів, внаслідок якого інформація, що міститься у лінійних полімерах амінокислот, переходить у просторову структуру (Anfinsen, 1973). Висока концентрація макромолекул у клітині (макромолекулярний краудинг), що може перевищувати 500 мг/мл (Ellis et al., 2001), зміна умов середовища (рН, температури, іонної сили, окисно-відновних властивостей середовища), а також інгібування системи деградації білків можуть призводити до утворення некоректно згорнутих проміжних продуктів фолдингу, схильних до агрегації (Kopito, 2000; Garcia-Mata et al., 1999).

Проблема неправильного фолдингу білків у клітині частково вирішується завдяки молекулярним шаперонам. Це велика група неспоріднених білкових сімейств, які, завдяки своїй властивості зв'язувати ненативні конформації білків, контролюють фолдинг і агрегацію білків всередині клітини. Останнім часом шапероноподібні функції відкрито у цілого ряду білків (Kern et al., 2003; Mehta et al., 2005; Cherepkova et al., 2006). Дана робота присвячена вивченню шапероноподібних властивостей окремих компонентів білоксинтезувального апарату вищих еукаріотів.

Фактор елонгації трансляції 1А (еEF1А) відіграє важливу роль у процесі білкового синтезу, каталізуючи GTP- залежне зв'язування аміноацил-тРНК з А- сайтом рибосоми, і є одним із найпоширеніших білків у клітині. Результати досліджень останніх років свідчать про величезну кількість так званих неканонічних функцій еEF1А. Деякі з цих функцій нагадують властивості молекулярних шаперонів. Так, наприклад, еEF1A зв'язує актинові філаменти і мікротрубочки in vitro i in vivo і, таким чином, впливає на збирання та стабільність полімерів цитоскелету (Yang et al., 1990; Shiina et al., 1994). EF1A, прокаріотний аналог еEF1A, виявляє дисульфідізомеразну активність (Richarme et al., 1998), перешкоджає агрегації білків за умов теплової денатурації, зв'язує денатуровані та розгорнуті білки і відновлює їхню функціонально активну конформацію (Kudlicki et al., 1997; Caldas et al., 1998), що свідчить про можливу участь EF1A у білковому фолдингу. Що стосується еEF1A ссавців, то дані про його участь у фолдингу білків відсутні.

Важливу роль у процесі фолдингу білків також можуть відігравати рибосоми (Hardesty et al., 2001). Існує припущення, що згортання деяких новосинтезованих поліпептидних ланцюгів може відбуватись в тунелі рибосоми, де вони захищені від агрегації та деградації, що може бути важливою передумовою для їх коректного фолдингу (Kudlicki et al., 1997; Sanyal et al., 2002; Nakatogawa et al., 2002).

Як відомо, характерною особливістю апарату трансляції вищих еукаріотів є високий рівень компартменталізації, що забезпечує ефективне функціонування цього апарату в збільшеному, порівняно з прокаріотами, об'ємі еукаріотної клітини (Ryazanov et al., 1987; Negrutskii et al., 1994). Проявом компартменталізації апарату білкового синтезу є існування мультиферментного комплексу аміноацил-тРНК синтетаз (ARS) (Deutscher et al., 1984; Mirande et al., 1991), мультисубодиничного комплексу фактора елонгації eEF1H (Carvalho et al., 1984; Ejiri et al., 1994), комплексу eEF1H з валіл-тРНК синтетазою (Motorin et al., 1991; Bec et al., 1994), а також асоціація компонентів апарату трансляції з рибосомами та цитоскелетом (Ryazanov et al., 1987; Mirande et al., 1985; Sanders et al., 1996).

Оскільки шапероноподібні властивості рибосом і еEF1А можуть бути необхідними для підтримки функціонально активних конформацій компонентів білоксинтезувального апарату в трансляційних компартментах, вивчення можливої участі еEF1A і рибосом у стабілізації та збереженні активної форми ARS є актуальним для розуміння механізмів і функціонального значення складної організації білкового синтезу у вищих еукаріотів. Важливим є той факт, що еEF1А має в розчині частково неструктуровану конформацію (Budkevich et al., 2002), що є типовим для шаперонів (Dunker et al., 2002; Tompa et al., 2004).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетними темами: "Роль неканонічних взаємодій компонентів трансляційного апарату в організації білкового синтезу у вищих еукаріотів" (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0101U009211, 2002-2005рр.); "Макромолекулярні комплекси і ченелінг тРНК в трансляційних компартментах ссавців" (НДР Міністерства освіти і науки України, № держ. реєстрації 0103U008714, 2001-2003рр.)

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення ролі 80S рибосом та eEF1A у стабілізації активної форми ARS з високим рівнем каталітичної активності.

Для досягнення даної мети необхідно було вирішити такі завдання:

Виділити в препаративних кількостях 80S рибосоми, 40S і 60S субчастинки рибосом, еЕF1А, мультиферментний комплекс ARS, індивідуальну фенілаланіл-тРНК синтетазу (PheRS) та сумарну тРНК із печінки кроля.

Вивчити вплив 80S рибосом на активність "вільних" ARS та таких, що входять до складу мультиферментного комплексу ARS.

Дослідити вплив eEF1A на термоінактивацію серил-тРНК синтетази (SerRS) та PheRS.

Методами кругового дихроїзму (КД), електрофорезу в нативних умовах і динамічного світлорозсіяння (ДСР) дослідити можливі структурні зміни молекул PheRS під час теплової денатурації.

Дослідити вплив eEF1A на можливі структурні зміни молекул термоденатурованої PheRS.

Об'єкт дослідження: вплив eEF1A і рибосом на фолдинг та стабілізацію ARS вищих еукаріотів.

Предмет дослідження: ізолейцил-тРНК синтетаза (IleRS), лейцил-тРНК синтетаза (LeuRS), PheRS, SerRS, eEF1A, рибосоми.

Методи дослідження: біохімічні методи дослідження ферментативних реакцій, метод гель-фільтрації, іонообмінна та афінна хроматографії, методи електрофорезу в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах та в агарозному гелі в нативних умовах, метод кругового дихроїзму, метод динамічного світлорозсіяння.

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі представлено експериментальні докази шапероноподібних властивостей 80S рибосом та еEF1А.

Вивчено вплив 80S рибосом та їхніх субчастинок на активність ARS вільних (PheRS) і таких, що входять до складу мультисинтетазного комплексу (LeuRS і IleRS). На прикладі PheRS вперше показано, що 80S рибосоми здатні відновлювати активність термоінактивованого ферменту і стабілізувати ферментативну активність синтетази за умов термоінактивації.

Вперше виявлено стабілізуючий та ренатуруючий ефекти eEF1A при термоінактивації PheRS і SerRS.

Методами кругового дихроїзму, електрофорезу в нативних умовах та динамічного світлорозсіяння вперше встановлено, що інкубація PheRS при 42 ^°С спричиняє руйнування 20 % - спіральних структур, зміни загального поверхневого заряду та агрегації. Додавання eEF1A призводить до руйнування агрегатів PheRS і формування біологічно активної форми PheRS, можливо, у вигляді комплексу однієї молекули ферменту та фактору.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені результати можуть бути використані для подальшого детального вивчення неканонічних взаємодій між компонентами апарату трансляції, що беруть участь у процесі каналювання субстратів у білковому синтезі, а також регуляції активності апарату білкового синтезу в клітинах вищих еукаріотів. Отримані результати використовуються в спецкурсі "Біосинтез білка" біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором самостійно проаналізовано наукову літературу за темою досліджень, разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Здобувачем особисто виділено всі необхідні препарати для проведення експериментів із вивчення шапероноподібних властивостей рибосом і eEF1А, зокрема препарати 80S рибосом та окремих 60S і 40S субчастинок рибосом, eEF1A, мультиферментного комплексу ARS та PheRS. Результати досліджень обговорено і проаналізовано з науковим керівником д.б.н., зав. лаб. біосинтезу білка Б.С. Негруцьким. Частину експериментальної роботи із вивчення впливу 80S рибосом та eEF1A на каталітичні параметри реакції аміноацилювання тРНК виконано в співробітництві з к.б.н. Г.В. Турківською, з якою автор має спільні публікації. Дисертантка вдячна за препарат SerRS, який було люб'язно надано к.б.н. З.М. Петрушенко, а також співробітнику Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України к.ф. -м.н. В.Ф. Горчеву за технічну допомогу в проведенні експериментів із визначення розмірів PheRS методом динамічного світлорозсіяння.

Автор висловлює глибоку подяку д.б.н., професорові, академіку НАН України Г.В. Єльській за постійну підтримку і велику увагу до дисертаційної роботи.

Апробація результатів роботи. Матеріали дисертації було представлено на VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, Україна, 2002); Міжгалузевій конференції молодих науковців "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2003" (Київ, Україна, 2003); Міжнародній конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології та генетики (Київ, Україна, 2003); Установчому з'їді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004); Міжнародній конференції "Aminoacyl-tRNA Synthetases: Ancient Molecules for Future Biology and Medicine" (Сеул, Корея, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах та тези 5 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини, яка має 2 підрозділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, а також висновків та переліку використаних джерел, який нараховує 168 найменувань. Роботу викладено на 125 сторінках машинописного тексту. Ілюстративний та числовий матеріал дисертації подано у вигляді 29 рисунків і 7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. У роботі було використано такі реактиви: набір 20 амінокислот, N,N-метиленбісакриламід, акриламід, бичачий сироватковий альбумін (БСА), імідазол виробництва фірми "Sigma" (США); додецилсульфат натрію, HЕPES виробництва фірми "Calbiochem" (США); дитіотреітол (DTT) виробництва фірми "Boehringer Mannheim" (Німеччина); 2-меркаптоетанол, трис, MgCl₂, гліцерин, полі(етиленгліколь) 6000, NH₄Cl виробництва фірми "Merck" (Німеччина); TEMED, PMSF, виробництва фірми "Serva" (Німеччина); фосфоцелюлоза P11, ДЕАЕ- целюлоза DE-52, фільтри GF/C виробництва фірми "Whatman" (Велика Британія); амонію персульфат, бромфеноловий синій, Кумасі R-250 і G-250, гідроксиапатит Bio Gel НТР виробництва фірми "Bio-Rad" (США); гепарин-сефароза, SP-сефароза, сефакрил S-400, сефадекс G-200 виробництва фірми "Pharmacia" (Швеція); нітроцелюлозні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм виробництва фірми "Sartorius-GmbH" (Німеччина); [³H]GTP (9 Кі/ммоль, 1 мКі/мл), [³H]GDP (11,9 Кі/ммоль, 1 мКі/мл), [¹⁴С]фенілаланін (50 Кі/моль, 100 мкКі/мл) виробництва фірми "Amersham" (Велика Британія); [¹⁴С]серин, [¹⁴С]лейцин, [¹⁴С]ізолейцин (50 Кі/моль, 100 мкКі/мл) виробництва фірми "UVVVR" (Чехія).

Одержання 40S і 60S субчастинок рибосом та реасоційованих 80S рибосом здійснювали як описано в роботах (Овчаренко и др., 1983; Bommer et al., 1996). Активність 80S рибосом визначали у реакції зв'язування [¹⁴С]АсPhe-тРНК^Phe. Рибосомні білки та рРНК одержували за схемою, описаною в роботах (Sherton et al., 1974; Chomczynsky et al., 1989).

eEF1A виділяли з печінки кролів (Shalak et al., 1997). Активність eEF1A визначали в реакції GDP/ [³H]GDP обміну. Для переведення eEF1A із GDP- в GTP- зв'язану форму необхідну кількість білка інкубували 5 хв при 37 ^°С в 20 мМ трис-HCl буферному розчині (pH 7,5), що містив 100 мМ NH₄Cl, 10 мМ MgCl₂, 0,5 мМ DTT, 0,2 мМ GDP або GTP, 25 % гліцерин.

PheRS виділяли з печінки кролів відповідно до методики (Pailliez et al., 1984) з деякими модифікаціями.

Для виділення комплексів ARS застосовували принцип методу (Deutscher et al., 1974), заснований на м'якій гомогенізації тканин із подальшою хроматографією пострибосомної надосадової фракції на сефадексі G-200. рибосома денатурація термоінактивація eef1a

Активність ARS визначали на початковій швидкості реакції аміноацилювання тРНК, коли концентрації ферментів, які використовувались, знаходились на ділянці прямолінійної залежності виходу аміноацил-тРНК від концентрації білка (Овчаренко и др., 1979; Pailliez et al., 1984). Специфічну активність ARS визначали за графіком залежності початкової швидкості реакції аміноацилювання від концентрації ферменту. За одиницю активності брали кількість ферменту, що продукує 1 нмоль Phe-тРНК за хвилину при 25 ^°С.

Для денатурації ARS очищені препарати ферментів розводили 10 мМ трис-НСl буферним розчином (рН 7,5), що містив 10 мМ 2-меркаптоетанол, і прогрівали протягом 10 хв при 42 ^°С. В контрольних експериментах для збереження активності синтетаз їх розводили буферним розчином, що також містив 4 мг/мл БСА.

Спектри КД PheRS вивчали за допомогою термостатованого спектрополяриметра Jasco-700 (Японія). Для одержання спектрів в далекому УФ-діапазоні від 250 до 190 нм використовували кювету з довжиною оптичного шляху 10 мм. Спектри PheRS вимірювали в 25 мМ К- фосфатному буферному розчині (рН 7,5), який містив 25 мМ КCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF, в інтервалі температур 4-42 ^°С. Концентрація білка становила 0,1 мг/мл. Вміст вторинних структур у молекулі білка вираховували за допомогою програм "Selcon", "K2D" і "Contin" (http://www.cryst.bbk.ac.uk/сdweb/html/home.html).

Денатурацію PheRS аналізували в 0,6 % агарозному гелі, який готували на 12 мМ СН ₃СООН-КОН (рН 7,0). PheRS розводили в 25 мМ К- фосфатному буферному розчині (рН 7,5), який містив 25 мМ KСl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF до концентрації 0,1 мг/мл і інкубували при 42 ^°С 10 хв. В якості контролю використовували нативний фермент. Перед нанесенням зразків до них додавали 1/3 розчину 80 % гліцерину з бромфеноловим синім. Час проведення електрофорезу дві години при силі струму 40 мА в 350 мМ -alanine-KOH (pH 7,5). Гель забарвлювали Кумасі R-250.

Функцію розподілу молекул PheRS за розмірами вивчали методом ДСР за допомогою термостатованого лазерного кореляційного спектрофотометра "ZetaSizer-3" Malvern Instrument, який був обладнаний корелятором multi computing correlator type 7032 ce та гелій-неоновим лазером ЛГ-111, потужністю 25 мВт та довжиною хвилі 633 нм. Вимірювання проводили в 25 мМ К- фосфатному буферному розчині (рН 7,5), який містив 25 мМ КCl, 1 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF в інтервалі температур 18-42 ^°С. Перед вимірюванням зразки центрифугували 2 год 16000 x g при 4 ^°С для видалення агрегованих форм білків. Експерименти проводили в скляних кюветах діаметром 10 мм. Реєстрацію та статистичну обробку здійснювали протягом 60-180 с за допомогою стандартної комп'ютерної програми PCS - Size mode v 1,61 (http://www.malvern.co.uk).

Результати досліджень та їхнє обговорення. Вплив 80S рибосом на активність ARS. Дослідження структурно-функціональної взаємодії ARS з рибосомами було розпочато в попередніх роботах нашого відділу (Сана и др., 1992; Белянская и др., 1998), в яких було показано, що 80S рибосоми підвищують активність та термостабільність гомологічної LeuRS. Перший розділ роботи є продовженням досліджень із вивчення впливу рибосом на активність ARS.

Оскільки дев'ять ARS в клітинах ссавців існують у вигляді високомолекулярного комплексу, важливо було дослідити вплив рибосом як на активність ферментів, що входять до складу комплексу, зокрема IleRS і LeuRS, так і індивідуальних, на прикладі PheRS. Рибосоми або субчастинки рибосом вносили безпосередньо до інкубаційної суміші для аміноацилювання тРНК. Як видно з рис. 1, активність IleRS в реакції аміноацилювання тРНК підвищується із зростанням концентрації рибосом. Максимальний рівень стимуляції IleRS спостерігали, починаючи з 0,7 мкМ концентрації рибосом. Аналогічний стимулюючий ефект виявлено і для LeuRS.

Рис. 1. Вплив 80S рибосом (), 60S () і 40S () субчастинок рибосом, БСА () та суміші рибосомних білків і рРНК () на початкову швидкість реакції синтезу [¹⁴C]Ile-тРНК; - ендогенна IleRS активність 60S субчастинок рибосом; - ендогенна IleRS активність 40S субчастинок рибосом.

БСА, як контрольний білок, що виявляє слабку шаперонну активність (Zhi et al., 1992), та суміш рРНК і рибосомних білків у відповідних молярних концентраціях не мали стимулюючого впливу на активність IleRS і LeuRS, що свідчить про специфічність впливу рибосом і необхідність нативної структури для стимуляції ферментативної активності досліджуваних ARS. Слід зазначити, що ендогенна ARS активність рибосомних субчастинок і цілих рибосом не перевищувала 0,3 % активності синтетази, що вносили в інкубаційну суміш для аміноацилювання.

Було також вивчено вплив рибосом та їхніх окремих субчастинок на кінетичні параметри реакції синтезу [¹⁴C]аміноацил-тРНК. Наведені в таблиці 1 дані свідчать, що додавання в реакційну суміш як 80S рибосом, так і окремих субчастинок рибосом (0,7 мкМ) призводить до зростання значення каталітичної константи (k_cat), що може свідчити про підвищення каталітичної активності ARS. В той же час значення константи Міхаеліса-Ментен (K_М) практично не змінюється. При додаванні 80S рибосом спостерігали зростання співвідношення k_cat/K_M майже в 2 рази, що свідчить про підвищення ефективності реакції аміноацилювання в присутності рибосом. Таким чином, з наведених даних видно, що як цілі рибосоми, так і їхні окремі субчастинки мають вплив на активність LeuRS і IleRS, хоча ефективність дії 80S рибосом значно вища. Найменш виражений ефект спостерігали в присутності 40S субчастинок рибосом.

Таблиця 1. Вплив 80S рибосом та їхніх окремих субчастинок на кінетичні параметри реакції синтезу [¹⁴C]аміноацил-тРНК

Суміш для аміноацилювання	KМ, мкМ	Vmax, пмоль/хв	kcat, хв-1	kcat/KM
IleRS
Без рибосом	0,21± 0,01	5,75 ± 0,05	4,10 ± 0,03	19,55 ± 0,08
+ 0,75 мкМ 80S рибосоми	0,19 ± 0,02	10,00 ± 0,08	7,14 ± 0,03	37,59 ± 0,10
+ 0,75 мкМ 60S субчастинки рибосом	0,31 ± 0,03	8,00 ± 0,08	5,71 ± 0,04	18,43 ± 0,12
+ 0,75 мкМ 40S субчастинки рибосом	0,30 ± 0,02	5,00 ± 0,04	3,57 ± 0,02	11,90 ± 0,08
+ 0,75 мкМ суміш рРНК і рибосомних білків	0,22 0,10	3,30 0,04	2,35 0,02	10,71 0,10
+ 0,75 мкМ БСА	0,25 0,07	3,40 0,08	2,42 0,03	9,71 0,09
LeuRS
Без рибосом	0,20± 0,07	3,40 ± 0,03	2,61 ± 0,06	13,07 ± 0,14
+ 0,75 мкМ 80S рибосоми	0,20 ± 0,06	7,80 ± 0,02	6,00 ± 0,04	30,00 ± 0,09
+ 0,75 мкМ 60S субчастинки рибосом	0,23 ± 0,05	7,20 ± 0,01	5,53 ± 0,04	24,08 ± 0,10
+ 0,75 мкМ 40S субчастинки рибосом	0,25 ± 0,06	5,90 ± 0,09	4,53 ± 0,08	18,15 ± 0,07
+ 0,75 мкМ суміш рРНК і рибосомних білків	0,20 0,09	3,00 0,08	2,31 0,03	11,53 0,10
0,75 мкМ БСА	0,23 0,06	3,20 0,10	2,46 0,09	10,70 0,06

Підвищення активності ARS у реакції аміноацилювання тРНК також може бути обумовлено інактивацією деяких інгібіторів реакції рибосомами. Одним із таких інгібіторів є неорганічний пірофосфат (РР_і), який крім того, що є продуктом реакції аміноацилювання, може відігрівати важливу роль у функціонуванні ARS. Залежно від концентрації, РР_і може впливати на порядок приєднання субстратів і, як наслідок, параметри реакції аміноацилювання тРНК, а також здатний інгібувати деякі ARS. Однак, у наших експериментах пригнічення реакції аміноацилювання під впливом РР_і спостерігали однаковою мірою як у присутності, так і у відсутності рибосом, що свідчить про те, що рибосоми не здатні запобігати дії інгібітора.

В роботах нашого відділу було показано, що очищені 80S рибосоми вищих еукаріотів мають АТРазну активність (Rodnina et al., 1994), що може впливати на конформаційний стан самої рибосоми (El'skaya et al., 1997), і, можливо, на її здатність стимулювати активність ARS. Щоб перевірити, чи не пов'язаний стимулюючий ефект рибосом із функціонуванням рибосомної АТРази, ми використали алкалоїд еметин, відомий як інгібітор рибосомної АТРази (Rodnina et al., 1994). На рис. 2 показано, що за таких концентрацій еметину (0,01-0,1 мМ), які вдвічі зменшують АТРазну активність рибосом, але не впливають на аміноацилюючу активність ARS, рівень стимуляції активності LeuRS 80S рибосомами не змінювався.

Рис. 2. Вплив різних концентрацій еметину на здатність 80S рибосом стимулювати активність LeuRS: активність LeuRS без додавання рибосом; - активність LeuRS у присутності 0,75 мкМ концентрації рибосом.

Таким чином, стимулюючий вплив 80S рибосом на активність LeuRS скоріш за все не був пов'язаний з АТPазною активністю рибосом.

На основі наведених результатів і даних літератури ми дійшли висновку, що найвірогіднішою причиною стимулюючого впливу рибосом може бути безпосередня взаємодія ARS із рибосомами, яка необхідна для підтримки їхньої функціонально активної конформації. Важливо, що максимальний рівень стимуляції активності звичайно спостерігали при роботі з LeuRS та IleRS із низькою активністю, що була втрачена в процесі очистки або при тривалому зберіганні. При використанні високоактивного комплексу ARS стимуляція активності синтетаз в його складі була незначною. Це є ще одним свідченням на користь нашого припущення, що підвищення активності ферменту в присутності рибосом може бути результатом відновлення його активної конформації.

З літератури відомо, що прокаріотні 70S рибосоми подібно до молекулярних шаперонів здатні здійснювати рефолдинг частково денатурованих білків (Chattopadhyay et al., 1994; Das et al., 1996; Kudlicki et al., 1997). На підставі цих результатів можна припустити, що і 80S рибосоми вищих еукаріотів можуть виконувати подібну до молекулярних шаперонів функцію. Пропозицію щодо шапероноподібної властивості 80S рибосом було перевірено при вивченні можливого впливу рибосом на каталітичну активність термоінактивованої PheRS. При розведенні ферменту буфером, що не містив БСА, та наступному прогріванні протягом 10 хв при 42 ^°С спостерігали зниження активності PheRS на 50-70 %. Активність такого, частково інактивованого ферменту, відновлювалась після додавання 80S рибосом (рис. 3).

Рис. 3. Залежність "реактивації" PheRS від концентрації рибосом і БСА.

Реактивацію термоінактивованої PheRS проводили 10 хв при 25 ^єС в присутності зазначених концентрацій 80S рибосом або БСА.

Для максимального відновлення активності PheRS необхідною є 0,75 мкМ концентрація 80S рибосом. Контрольний білок БСА в концентрації, що дорівнювала концентрації рибосом, не впливав на активність інактивованого ферменту. Важливо, що при додаванні 80S рибосом безпосередньо в буфер для розведення ферменту і наступному прогріванні при 42 ^°С 10 хв, активність ферменту повністю зберігалась, в той час як БСА за тих же концентрацій не виявляв подібного впливу.

Таким чином, 80S рибосоми мають властивість не тільки стимулювати активність ARS, а й відновлювати активність попередньо інактивованих синтетаз та підтримувати їхню продуктивну конформацію за умов термоденатурації.

Вплив еEF1А на термоінактивацію PheRS. еEF1А також здатний відновлювати активність термоінактивованої PheRS. Як видно з рис. 4, максимальне відновлення активності PheRS відбувалось, починаючи з 2,4 мкМ концентрації еEF1А.

Рис. 4. Залежність реактивації PheRS від концентрації еEF1А*GDP.

Реактивацію термоденатурованої PheRS проводили 10 хв при 25 ?С у присутності зазначених концентрації еEF1А*GDP або БСА.

Контрольний білок, БСА, за такої ж концентрації не впливав на активність синтетази. Співвідношення PheRS:eEF1A в наших експериментах було близьким до такого співвідношення у цитоплазмі еукаріотної клітини, в якій активно синтезуються білки (Ryazanov et al., 1987).

Також досліджено кінетичні параметри реакції аміноацилювання тРНК, яку каталізує термоінактивована PheRS або PheRS після реактивації в присутності eEF1A. Дані, наведені в таблиці 2, свідчать про те, що eEF1A впливає на каталітичну активність термоінактивованої PheRS, збільшуючи початкову швидкість реакції та рівень синтезу Phe-тРНК^Phe. Значення V_max в присутності eEF1A становило 19,6 пмоль Phe-тРНК^Phe/хв, що принаймні в два рази більше, ніж для термоінактивованого ферменту (V_max=9,33 пкмоль/хв). Значення k_cat збільшується в два рази порівняно з k_cat для денатурованого ферменту.

Таблиця 2. Кінетичні параметри реакції синтезу фенілаланіл-тРНК

Фермент	КМ, мкМ	Vmax, пмоль/хв	kсat, хв-1	kсat/КМ
Нативна PheRS	0,23 ± 0,02	28,0 ± 0,03	31,57 ± 0,05	137,26 ± 0,07
PheRS, термоінактивована при 42 °С 10 хв	0,22 ± 0,07	9,33 ± 0,1	10,38 ± 0,02	47,18 ± 0,03
PheRS, реактивована у присутності eEF1A*GDP	0,29 ± 0,03	19,6 ± 0,08	21,85 ± 0,05	75,34 ± 0,05

Під час елонгації білкового синтезу еEF1А перебуває в GTP- і GDP- зв'язаному станах. Результати дослідження шапероноподібних властивостей GDP- і

GTP- зв'язаної форм прокаріотного фактора елонгації 1А мали суперечливий характер (Kudlicki et al., 1997; Caldas et al., 1998), що може бути пов'язано із різницею у конформації цих двох форм фактора, на відміну від еукаріотного аналога. При порівнянні впливу еEF1А*GDP і еEF1А*GTP на активність термоінактивованої PheRS виявилось, що обидві форми практично однаковою мірою стимулюють реактивацію синтетази.

Щоб перевірити, чи не є ефект стимуляції ферментативної активності специфічним тільки для однієї синтетази, було досліджено вплив еEF1А на активність іншої ARS, а саме SerRS. Додавання еEF1А до термоінактивованого ферменту, як і у випадку з PheRS, призводило до відновлення активності ферменту майже до 70 % від вихідної активності ферменту.

Крім того, що еEF1А відновлює активність термоінактивованих PheRS і SerRS, він також може запобігати інактивації PheRS. Виявилось, що додавання eEF1A в буфер для розведення синтетази призводить до підтримки функціонально активної конформації PheRS на відміну від БСА (рис. 5).

Рис. 5. Стабілізація активності PheRS у присутності eEF1A*GDP: 1 - нативна PheRS; 2 - PheRS, інкубована при 42 ^єC 10 хв без додавань; 3 - PheRS, інкубована при 42 ^єC 10 хв у присутності 3,2 мкM eEF1A; 4 - PheRS, інкубована при 42 ^єC 10 хв у присутності 3,2 мкM БСА.

Оскільки функціонування молекулярних шаперонів передбачає взаємодію останніх з ненативними формами білків, у роботі важливим було виявити, які структурні зміни відбуваються в молекулах PheRS при термоінактивації, що спричиняють часткову втрату каталітичної активності ферменту. Такі зміни досліджували шляхом комбінації методів кругового дихроїзму, нативного електрофорезу та динамічного світлорозсіяння.

Вивчення впливу температури на вторинну структуру і поверхневий заряд PheRS. Щоб визначити, чи зберігає PheRS впорядкованість вторинної структури під час термоінактивації, було проведено серію вимірювань спектрів КД ферменту. Як видно з рис. 6, при 4 ^єС, 25 ^°С і 37 ^°С спектри КД практично не відрізняються. При 42 °С спостерігали зростання негативної еліптичності у ділянці 222 нм і 210 нм.

Рис. 6. Спектри КД PheRS (0,4 мкМ) в далекому УФ- діапазоні при різних температурах.

Денатурація білків завжди супроводжується змінами спектрів КД, що свідчать про часткову або повну втрату б-спіралей та в-структур. За допомогою програм "Selcon" і K2D та "Contin" було вирахувано вміст вторинних структур у молекулі PheRS до і після прогрівання при 42 ?С (табл. 3).

Таблиця 3. Вміст структур, що залишились після прогрівання PheRS при 42 °С

Структура	Вміст, %
б- спіралі	80,1
паралельні в- листи	92,4
антипаралельні в- листи	98,5

Отже, короткочасне прогрівання PheRS при 42 ?С призводить до 20 % зменшення вмісту б- спіралей, тобто впливає на вторинну структуру білка.

PheRS має позитивний сумарний поверхневий заряд при фізіологічному рН (для PheRS із печінки вівці pI = 8,0 (Pailliez et al., 1984), для PheRS із ретикулоцитів кроля рІ = 8,45 (Irvin et al., 1972). За допомогою методу агарозного електрофорезу в нативних умовах ми вирішили перевірити, чи впливає інкубація ферменту при 42 ^°С, що спричиняє часткову втрату ферментативної активності та вторинної структури PheRS, на поверхневий заряд ферменту. Як видно з рис. 7, прогрівання PheRS при 42 ^°С спричиняє зміну напрямку руху білка в гелі, що свідчить про зміну сумарного поверхневого заряду білка. Додавання eEF1A до термоденатурованої PheRS у молярному співвідношенні PheRS: eEF1A = 1:50, відновлювало електрофоретичну рухливість PheRS.

Рис. 7. Електрофореграма PheRS в агарозному гелі: 1 - нативна PheRS (0,4 мкМ); 2 - PheRS, інкубована 10 хв при 42 ^єС; 3 - термоденатуровану PheRS інкубували 10 хв при 25 ^єС в присутності eEF1A (20 мкМ) (молярне співвідношення PheRS:eEF1A = 1:50); 4 - eEF1A.

Таким чином, в результаті проведених експериментів виявлено деяке зменшення вмісту б- спіралей і в- структур у молекулі PheRS після прогрівання при 42 ^єС, що може спричиняти зміну сумарного поверхневого заряду молекули білка.

Дезагрегація як можливий механізм ренатурації PheRS фактором елонгації 1А. Для характеристики нативного і денатурованого станів PheRS було використано метод динамічного світлорозсіяння (Дамашун и др., 1998), який дозволяє визначити гідродинамічний радіус молекул в розчині - радіус Стокса .

Значення гідродинамічного радіуса R_H, одержане в наших експериментах для нативної PheRS, збігається із літературними даними. Так R_H для PheRS людини складає 6,74 нм при 20 ^єС (Moor et al., 2002), а R_H для PheRS кроля, одержане в наших експериментах - 6,9 ± 0,1 нм. Як видно з даних, представлених на рис. 8, кінетика теплової денатурації PheRS має складний характер. Через 5 хв інкубації при 42 ^єС розмір частинок у розчині зменшується до 3,4 ± 0,08 нм, що, згідно з калібрувальною кривою, приблизно відповідає молекулярній масі окремих субодиниць ферменту. Через 10 хв інкубації починають накопичуватись більші за радіусом частинки - 10,2 ± 0,1 нм. Оскільки теплова денатурація білків часто супроводжується агрегацією денатурованих молекул, великі частинки, які утворюються через 10 хв інкубації, можуть бути не чим іншим як агрегатами PheRS, що, виходячи із значення R_Н, можуть складатися з трьох молекул повного білка.

Рис. 8. Залежність гідродинамічного радіуса R_Н молекул PheRS (0,2 мкМ) від часу інкубації при 42 ?С.

Отже, втрата ферментативної активності PheRS під впливом температури пов'язана з конформаційними змінами в молекулах ферменту. Для прояву ферментативної активності фермент повинен перебувати в тетрамерній формі, а дисоціація на мономери і подальша агрегація призводить до інактивації навіть за відсутності істотного розгортання вторинних структур.

Здатність eEF1A відновлювати нативний стан денатурованої PheRS було також перевірено методом ДСР. Як видно з рис. 9, через 10 хвилин інкубації при 25 ?С у присутності eEF1А (молярне співвідношення PheRS/eEF1A = 1/50) значення гідродинамічного радіуса молекули PheRS стає близьким до такого значення для нативного ферменту. Розбіжність значень R_Н для нативної і ренатурованої синтетази можна пояснити тим, що у процесі руйнування агрегатів PheRS утворюється комплекс PheRS*eEF1A*GDP. Можливість утворення такого комплексу було показано в роботах нашого відділу і раніше (Petrushenko et al., 2002). Ренатурація PheRS фактором елонгації 1А може бути наслідком безпосередньої взаємодії між білками, при цьому цей ефект не залежить від зв'язаного нуклеотиду. Отже, результати, одержані за допомогою методу ДСР, свідчать про принципову можливість дезінтеграції під впливом eEF1A агрегатів PheRS, що утворюються в результаті термоденатурації.

Рис. 9. Залежність гідродинаміч-ного радіуса R_Н молекул термоденатурованої PheRS (0,2 мкМ) від часу інкубації при 25 ?С: - без додавань; - у присутності eEF1A (10 мкМ); - нативна PheRS.

Наведені дані дозволяють вперше запропонувати механізм шапероноподібної дії eEF1A, який може полягати як у формуванні комплексів з нативними білками, що забезпечує підтримку їх функціонально активної конформації, так і у руйнуванні агрегатів денатурованих білків, що призводить до відновлення їх функціонально активного стану.

ВИСНОВКИ

У роботі вперше показано, що рибосоми і eEF1А ссавців мають подібну до молекулярних шаперонів здатність стабілізувати і відновлювати функціонально активну форму ARS та запропоновано механізм шапероноподібної дії eEF1А. Така властивість компонентів апарату трансляції може бути важливою для підтримки активної конформації ARS в трансляційних компартментах протягом послідовних циклів елонгації.

1. Виявлено вплив 80S рибосом на каталітичну активність "вільної" PheRS та LeuRS і IleRS, що входять до складу мультиферментного комплексу ARS, причому максимальний рівень стимуляції спостерігали для ферментних препаратів із низькою активністю. Додавання 80S рибосом або 60S субчастинок рибосом призводило до зростання значень k_cat і співвідношення К_М/k_cat в 2 рази для LeuRS і IleRS, що свідчить про підвищення ефективності реакції аміноацилювання в присутності рибосом.

2. Показано на прикладі PheRS, що 80S рибосоми здатні стабілізувати ферментативну активність під час термоінактивації при 42 ^°С або відновлювати активність термоінактивованої PheRS з 30 % до 70 % від вихідної активності.

3. Виявлено стимулюючу дію eEF1A на каталітичну активність термоінактивованої PheRS. Показано, що значення k_cat збільшується в два рази порівняно з таким коефіцієнтом для інактивованого ферменту (з 10,38 ± 0,02 хв^-1 до 21,85 ± 0,05 хв^-1).

4. Виявлено стабілізуючий та ренатуруючий ефекти фактора eEF1А при термоінактивації PheRS і SerRS:

§ інкубація PheRS і SerRS при 42 ^°С 10 хв призводить до зниження каталітичної активності ферментів в 2-3 рази, а подальша інкубація з eEF1A відновлює їхню ферментативну активність до 70 % від активності нативного ферменту зі збільшенням k_cat для PheRS в два рази порівняно з цим параметром для інактивованого ферменту;

§ у присутності eEF1A активність PheRS за умов термоінактивації повністю зберігається.

5. Методами кругового дихроїзму, динамічного світлорозсіяння та електрофорезу в агарозному гелі в нативних умовах досліджено структурні зміни в молекулах PheRS за теплової денатурації. Показано, що інкубація PheRS при 42 ^°С призводить до деякої зміни б- спіральних ділянок в молекулах білка, зміни поверхневого заряду та вираженої агрегації молекул ферменту.

6. Виявлено, що в присутності eEF1А спостерігається відновлення електрофоретичної рухливості термоденатурованої PheRS і руйнування агрегатів ферменту, що утворюються в процесі термоденатурації, та формування біологічно активної форми PheRS.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лукаш Т.О., Турківська Г.В., Негруцький Б.С., Єльська Г.В. Ренатурація фенілаланіл-тРНК синтетази фактором елонгації еЕF1A // Біополімери і клітина. - 2003. - Т. 19, № 4. - C. 350-354. Особистий внесок здобувача - проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованої PheRS, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

2. Lukash T.O., Turkivska H.V., Negrutskii B.S., El'skaya A.V. Chaperone-like activity of mammalian elongation factor eEF1A: Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2004. - Vol. 36, № 7. - P. 1341-1347. Особистий внесок здобувача - самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих SerRS і PheRS, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

3. Лукаш Т.О., Турківська Г.В., Єльська Г.В. Відновлення активності аміноацил-тРНК синтетаз вищих еукаріотів та їх стабілізація в присутності рибосом // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20, № 4. - С. 316-320. Особистий внесок здобувача - проведення частини експериментів із вивчення впливу 80S рибосом на активність IleRS і LeuRS у складі мультиферментного комплексу ARS та на активність термоінактивованої PheRS, власноруч написано частину статті.

4. Лукаш Т.О. Еукаріотний фактор елонгації 1А руйнує агрегати фенілаланіл-тРНК синтетази // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 1. - С. 29-32. Особистий внесок здобувача - самостійно проведено експерименти із кругового дихроїзму та світлорозсіяння нативної, денатурованої та ренатурованої в присутності фактора елонгації 1А PheRS, власноруч написано основну частину статті.

5. Лукаш Т.О., Турківська Г.В. Шапероноподібні властивості компонентів білоксинтезувальної системи // Біополімери і клітина. - 2005. - Т. 21, № 5. - С. 381-390. Особистий внесок здобувача - в роботі підсумовано всі наявні відомості по шапероноподібним властивостям компонентів апарату трансляції та наведено власні результати, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

6. Турківська Г.В., Лукаш Т.О., Коваленко М.Й. Ренатурація аміноацил-тРНК синтетаз фактором елонгації трансляції еЕF1A // Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду. Український біохімічний журнал. - 2002. - Т.74, №4б - C. 60. Особистий внесок здобувача - самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих SerRS і PheRS.

7. Lukash T.O. Chaperone-like activity of mammalian elongation factor eEF1A: Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. - Kyiv (Ukraine), 2003. - P. 96. Особистий внесок здобувача - самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих SerRS і PheRS та стабілізуючого впливу eEF1A на активність PheRS за умов термоденатурації.

8. Лукаш Т.О. Ренатурація фенілаланіл-тРНК синтетази фактором елонгації трансляції еЕF1A // Міжгалузева конференція молодих науковців. Український біохімічний журнал. - 2003. - Т.75, №5. - C. 203-204. Особистий внесок здобувача - самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованої PheRS та стабілізуючого впливу eEF1A на активність PheRS за умов термоденатурації.

9. Lukash T.O., Turkivska H.V., Negrutskii B.S., El'skaya A.V. Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases by translational elongation factor eEF1A and ribosomes // First Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv (Ukraine), 2004. - P. 381. Особистий внесок здобувача - самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A та на активність термоінактивованої PheRS та впливу 80S рибосом на активність IleRS і LeuRS у складі мультиферментного комплексу ARS.

10. Lukash T.O., Turkivska H.V., Negrutskii B.S., El'skaya A.V. Chaperone-like activity of mammalian elongation factor eEF1A: Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases // International Conference of Aminoacyl-tRNA Synthetases: Ancient Molecules for Future Biology and Medicine. - Seoul (Korea), 2004 - P. 139. Особистий внесок здобувача - самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих ARS.

АНОТАЦІЯ

Лукаш Т.О. Шапероноподібні властивості компонентів апарату трансляції вищих еукаріотів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

В роботі подано експериментальні докази шапероноподібних властивостей 80S рибосом та eEF1A. Здатність 80S рибосом відновлювати активність частково інактивованих LeuRS, IleRS і PheRS та попереджати термоінактивацію PheRS при 42 ?С свідчить про ренатуруючі і стабілізуючі властивості рибосом. eEF1A відновлює активність термоінактивованих PheRS і SerRS і стабілізує активність PheRS за умов термоінактивації. Структурні зміни молекул PheRS, визначені методами кругового дихроїзму, динамічного світлорозсіяння і електрофорезу в агарозі в нативних умовах полягають у зміні загального поверхневого заряду молекул, 20 % зменшенні вмісту б- спіральних структур і формуванні агрегатів молекул PheRS. Показано, що eEF1A відновлює загальний поверхневий заряд молекул PheRS і зменшує рівень агрегації подібно до молекулярних шаперонів.

Шапероноподібні властивості 80S рибосом і eEF1A можуть мати особливе значення в клітинах вищих еукаріотів з високим рівнем компартменталізації. 80S рибосоми і еЕF1А можуть забезпечувати підтримку функціонально активної конформації компонентів білоксинтезувального апарату.

Ключові слова: еукаріотний фактор елонгації трансляції 1А, рибосома, шаперон, аміноацил-тРНК синтетаза, денатурація, ренатурація.

АННОТАЦИЯ

Лукаш Т.А. Шапероноподобные свойства компонентов аппарата трансляции высших эукариот. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2006.

Специфическая функция каждого белка обеспечивается его уникальной трехмерной структурой, поэтому большое значение имеет изучение молекулярных основ процессов, которые обеспечивают формирование нативных функционально активных пространственных структур белка. Чрезвычайно важную роль в этих процессах играют шапероны - белки, которые направляют процесс фолдинга полипептидной цепи и ингибируют неуместные побочные взаимодействия. Хотя в последнее время шапероноподобные функции открыты для целого ряда белков, продолжаются поиски новых белков, которые участвуют в ключевом процессе функционирования клетки - контроле качества белков.

Целью диссертационной работы является изучение возможной роли компонентов аппарата трансляции высших эукариот, а именно, 80S рибосом и eEF1А в стабилизации активной формы ARS с высоким уровнем каталитической активности.

В работе приведены экспериментальные доказательства шапероноподобных свойств 80S рибосом и eEF1А.

Изучено влияние 80S рибосом и их субчастиц на каталитическую активность LeuRS и IleRS, которые входят в состав мультиферментного комплекса ARS и индивидуальной PheRS. В присутствии 80S рибосом та 60S субчастиц рибосом соотношение k_cat/K_M возрастало почти в 2 раза, что свидетельствует об увеличении эффективности реакции аминоацилирования в присутствии рибосом.

80S рибосомы не содержали пирофосфатазной активности, поэтому увеличение активности ARS в реакции аминоацилирования тРНК не было связано с инактивацией неорганического пирофосфата - ингибитора синтетаз рибосомами. Стимуляция ARS рибосомами также не была связана с АТРазной активностью рибосом.

Максимальный уровень стимуляции активности ARS 80S рибосомами обычно наблюдался для ферментов с низкой активностью, которая была потеряна в процессе выделения и очистки, при хранении, либо при термоинактивации при 42 ?С, как в случае с PheRS. Наибольшее стимулирующее влияние имели целые 80S рибосомы и 60S субчастицы рибосом, что в принципе согласовывается с данными, полученными в работах с прокариотическими рибосомами. Предполагается, что причиной активации ARS синтетаз может быть синтетазно-рибосомное взаимодействие, необходимое для поддержания функционально активной формы ARS в трансляционных компартментах. Новосинтезированные полипептиды могут сворачиваться на рибосоме, либо во время синтеза, в тоннеле рибосомы, где они защищены от агрегации и деградации, что является важным условием для их корректного фолдингу, либо непосредственно после окончания синтеза на поверхности рибосомы. Таким образом рибосомы могут осуществлять свою шапероноподобную функцию.

Впервые выявлены стабилизирующий и ренатурирующий эффекты eEF1A при термоинактивации PheRS и SerRS. Инкубация фактора с инактивированными при 42 ^°С PheRS и SerRS приводит к восстановлению их активности с 30 до 70 %, а при термоинактивации PheRS в присутствии eEF1A активность фермента полностью сохраняется. Показано также влияние eEF1A на каталитическую активность PheRS. Значение k_cat увеличивается в два раза по сравнению с таким коэффициентом для денатурированного фермента (с 10,38 ± 0,02 мин - ¹ до 21,85 ± 0,05 мин - ¹).

Проведено детальное исследование структурных изменений в молекуле PheRS под воздействием температуры с использованием методов кругового дихроизма, электрофореза в агарозе в нативных условиях и динамического светорассеяния. PheRS представляет собой особый случай среди ARS. Этот фермент отличается своей способностью ассоциировать с рибосомами, высоким значением изоэлектрической точки (рІ = 8.45) и сложной субъединичной структурой б₂в₂-типа. Следует отметить, что отдельные субъединицы фермента, также как и их димеры не проявляют ферментативной активности. В представленной работе впервые показано, что инкубация PheRS при 42 ^°С приводит к 20 % потере б- спиральных структур, изменению суммарного поверхностного заряда молекул и их агрегации. Добавление eEF1A приводит к восстановлению суммарного поверхностного заряда молекул PheRS, разрушению агрегатов фермента и формированию биологически активной формы PheRS.

Шапероноподобные свойства 80S рибосом и eEF1А, с одной стороны, могут свидетельствовать в пользу гипотезы котрансляционного фолдинга белков. Поскольку еЕF1А является одним из самых распространенных белков в клетке, в белоксинтезирующем компартменте фактор в высокой концентрации находится в непосредственной близости с рибосомой, тем самым делая возможным постоянное сканирование новосинтезированных полипептидных цепей. eEF1А также может выполнять шаперонную функцию в условиях стресса. Следует отметить, что еЕF1А в растворе имеет частично неструктурированную конформацию, что является характерным свойством молекулярных шаперонов. Новосинтезированные, но поврежденные белки в связанном с рибосомами состоянии могут присоединять убиквитин, а еЕF1А вместе с другими регуляторными факторами могут эскортировать поврежденные новосинтезированные полипептиды к протеасомам. В данном случае можно говорить о связи между процессами белкового синтеза и белковой деградации. Кроме того, шапероноподобные свойства 80S рибосом и еЕF1А могут иметь особенное значение в клетках высших эукариот с высоким уровнем компартментализации. 80S рибосомы и еЕF1А могут обеспечивать поддержание функционально активной конформации других компонентов аппарата трансляции.

Все полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение и расширяют представления как о механизмах функционирования компонентов аппарата трансляции высших эукариот, так и об их неканонических функциях.

Ключевые слова: эукариотический фактор элонгации трансляции 1А, рибосома, шаперон, аминоацил-тРНК синтетаза, денатурация, ренатурация.

SUMMARY

Lukash T.O. Chaperone-like properties of translational components from higher eukaryotes - Manuscript.

Thesis for degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Biology, specialty 03.00.03 - Molecular Biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

The experimental evidences of chaperone-like properties of 80S ribosomes and eEF1A are presented. The efficient stimulation of partly inactivated LeuRS, IleRS and PheRS and protection of PheRS against the heat inactivation at 42 ?C indicate the refolding and stabilizing capacity of the ribosomes. eEF1A is capable to recover the activity of heat inactivated PheRS and SerRS and maintain the activity of PheRS under heat chock conditions. Structural changes in the PheRS molecules after heat inactivation, determined by the circular dichroism, dynamic light scattering and non-denaturing agarose electrophoresis, comprise change in the total surface charge, protein aggregation and 20 % decrease in б- helical structure. eEF1A is shown to restore the total surface charge of PheRS and reduce the level of aggregation similar to molecular chaperones.

...