Прояв кількісних ознак при внутрішньолінійних схрещуваннях у залежності від умов утримання батьківських особин Drosophila melanogaster Meig. і Bombyx mori L.

Размещено на http://allbest.ru

Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна

03.00.15 - Генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Прояв кількісних ознак при внутрішньолінійних схрещуваннях у залежності від умов утримання батьківських особин

Drosophila melanogaster Meig. і Bombyx mori L.

Навроцька Валерія Володимирівна

Харків-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В. Н. Каразіна

Міністерства освіти і науки України

Науковий керiвник

доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч

науки і техніки України,

Шахбазов Валерій Гайович ,

Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна

Міністерства освіти і науки України,

професор кафедри генетики та цитології

Офiцiйнi опоненти

доктор біологічних наук, професор

Злотін Олександр Зиновійович,

Харківський національний педагогічний університет

імені Г. С. Сковороди

Міністерства освіти і науки України,

професор кафедри зоології

Провiдна установа:

Одеський національний університет імені І. І. Мечнікова

(кафедра генетики та молекулярної біології)

Міністерства освіти і науки України, м. Одеса

Захист відбудеться “ 5 ” жовтня 2006 р. о 17-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. III-15.

З дисертацією можна ознойомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 29 серпня 2006 року.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 О. М. Федота

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Необхідною умовою виникнення ефекту гетерозису є наявність відмінностей між особинами, які схрещуються. Головним джерелом цих відмінностей, тобто генетичного диференціювання, є добір, але припускається існування альтернативного способу диференціювання - шляхом неоднакових умов утримання батьківських особин або різних впливів на них (Дарвин, 1950; Астауров, 1968; Шахбазов, 1972, 1992). Описані окремі випадки підвищення життєздатності організмів, батьківські особини яких перебували у різних умовах, у порівнянні з життєздатністю потомства особин, які перебували в однакових умовах існування (Umeya, 1930; Шуршикова, 1955; Шахбазов, 1966; Чепель, 1990); такий ефект розглядали як фізіологічний (Астауров, 1968; Шахбазов, 1992) або екологічний гетерозис (Злотин, 1989; Маркина и др., 2001). Але питання про реальність даного явища остаточно ще не вирішене, і механізми диференціювання, яке відбувається при впливі факторів середовища на батьківські особини і приводить до ефектів, подібних до гетерозису, також не зрозумілі (Астауров, 1968; Шахбазов, 1992).

Очевидно, що отримання такого ефекту можливе за умови, якщо фактори, які впливають на батьківські особини, здатні індукувати у гаметах масові зміни, які збереглись би в онтогенезі потомків. Такі пролонговані зміни при дії немутагенних факторів можуть бути пов'язані з епігенетичними модифікаціями гістонових білків та ДНК і транспозиціями мобільних генетичних елементів - активно досліджуваними сьогодні формами мінливості (Голубовский, 1996; Чураев, 2005; Васильева и др., 1997; Бубенщикова и др., 2002; Колотова и др., 2004; Cavalli, Paro, 1998).

Крім теоретичного значення, доказ існування явища диференціювання геному гамет, яке відбувається при середовищних впливах на батьківські особини, дослідження його механізмів має важливе практичне значення, оскільки використання цього ефекту дозволило б підвищувати життєздатність інбредних ліній, зберігаючи їх генетичні переваги.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах наукової тематики кафедри генетики і цитології Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна і є складовою теми “Вивчити генетичні, фізіологічні та біофізичні механізми і прояви ефекту гетерозису у рослин і тварин” за номером держреєстрації 0103U004270 (роки виконання - 2003-2005).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідження характеру прояву кількісних ознак при внутрішньолінійних схрещуваннях у дрозофіли та шовковичного шовкопряда у залежності від умов утримання батьківських особин, перевірка гіпотези про існування ефекту підвищення життєздатності потомства при схрещуванні особин, що піддавались різним впливам, а також з'ясування природи цього ефекту. Для досягнення мети дисертаційної роботи були поставлені такі задачі:

Дослідити прояв кількісних ознак у ліній дикого типу дрозофіли після утримання батьківських особин в однакових та різних світлових умовах. Визначити чутливість стадій гаметогенезу до впливу світла. З'ясувати особливості реакції на вплив світла мутантних ліній дрозофіли, а також ліній, у яких мутації знаходяться на генетичному фоні лінії дикого типу.

Оцінити частоту виникнення мутацій та частоту рекомбінації при впливі світла у дрозофіли, а також дослідити збереження змін кількісних ознак у поколіннях. Визначити ступінь асинапсису гомологічних хромосом дрозофіли після світлового впливу на материнську особину.

Дослідити прояв кількісних ознак у шовковичного шовкопряда після впливу мікрохвильового, лазерного випромінювання, світла на одну та обидві батьківські особини.

Об'єкт дослідження - ефект підвищення життєздатності організмів, який виникає при утриманні батьківських особин у різних умовах, та його механізми. кількісний ознака схрещування батьківський дрозофіла

Предмет дослідження - характер прояву кількісних ознак дрозофіли та шовковичного шовкопряда після однакових та різних впливів на батьківські особини, які використовуються при внутрішньолінійних схрещуваннях.

Методи дослідження - методи дослідження кількісних ознак дрозофіли і шовковичного шовкопряда, методи оцінки частоти мутацій і рекомбінації у дрозофіли, метод оцінки ступеня асинапсису політенних хромосом дрозофіли, методи математичного аналізу результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на модельному об'єкті - Drosophila melanogaster - показано можливість підвищення життєздатності потомства від внутрішньолінійних схрещувань шляхом різних світлових впливів на батьківські особини. Установлено помітне збільшення теплостійкості та передімагінальної життєздатності у потомстві від схрещування особин однієї лінії, які перебували у різних умовах середовища, у порівнянні із значеннями цих показників у потомків особин, які перебували в однакових умовах. Виявлено різну реакцію ліній дрозофіли, дикого типу і мутантних, на дію світла, а також показано диференціальну чутливість різних стадій гаметогенезу до застосованого впливу. Вперше у дрозофіли оцінені генетичні наслідки дії світла з різною довжиною хвилі (частота рецесивних і домінантних летальних мутацій, частота кросинговеру). Новими є дані про збереження змін кількісних ознак у другому поколінні після впливу, про зміни ступеня асинапсису гомологічних політенних хромосом дрозофіли та зміни ступеня прояву ознаки forked у потомків особин, які піддавались дії світла.

Новими є результати, які свідчать про можливість підвищення життєздатності шовковичного шовкопряда при внутрішньолінійному схрещуванні особин, одна з яких піддавалась впливу мікрохвильового, лазерного випромінювання, дії світла.

Вперше проведене дослідження механізмів диференціювання геному гамет при різних умовах утримання батьківських особин.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають теоретичну цінність для розуміння природи явища підвищення життєздатності при різних умовах утримання батьківських особин, які використовуються при внутрішньолінійних схрещуваннях, - важливого джерела підвищення стійкості і продуктивності організмів. Висновок про можливість отримання даного ефекту може стати основою для розробки методів зниження проявів інбредної депресії, яка обмежує використання інбридингу як методу селекції.

Результати проведеної роботи використовуються для подальших наукових досліджень і у навчальному процесі кафедри генетики і цитології ХНУ.

Особистий внесок здобувача. Усі розділи дисертаційної роботи виконані здобувачем самостійно. Аналіз отриманих результатів проводився разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені в дисертацію, були повідомлені на 7-ій Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология - наука XXI века” (Пущино, 2003), VI з'їзді Українського ентомологічного товариства (Біла Церква, 2003), XX и XXIV Міжнародних науково-практичних конференціях “Применение лазеров в медицине и биологии” (Ялта, 2003; 2005), науковій конференції молодих вчених, присвяченій 200-річчю заснування Харківського університету “Актуальні проблеми біології в дослідженнях молодих учених Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна” (Харків, 2003), ІІІ з'їзді ВТГіС “Генетика в ХХІ веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004), VIII Міжнародній науковій екологічній конференції “Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем” (Бєлгород, 2004), 1-ій Міжнародній конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005), науковій ентомологічній конференції “Загальна і прикладна ентомологія в Україні” (Львів, 2005), науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження Г. І. Семененка (Харків, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 14 друкованих праць, 5 статей (з них 4 статті у виданнях, визнаних ВАК за фахом) і 9 тез.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 182 сторінках тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ “Матеріали і методи дослідження”, три розділи власних досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновки, список використаних джерел (усього 364), додатки. Дисертація містить 41 таблицю, 10 рисунків.

Зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Мета дослідження вимагала, з одного боку, проведення експериментів з гомозиготним матеріалом, тому у роботі використані інбредні лінії, з іншого боку, застосування факторів, які можуть справити значну фізіологічну дію на організм і спричинити виникнення змін у статевих клітинах. За даними літератури, світло може стимулювати або пригнічувати життєздатність комах (Данилевский, 1961; Злотин, 1989), світлове випромінювання у різних ділянках спектру справляє різну біологічну дію (Потапенко, 1996). Мікрохвильове та лазерне випромінювання, які застосовувались у дослідах на шовковичному шовкопряді, є чинниками, здатними індукувати у цього об'єкта різкі зміни кількісних ознак, які можуть зберігатись протягом онтогенезу та іноді у наступних поколіннях (Шахбазов и др., 2003; Ронкина, 2000).

Основна частина досліджень, вивчення змін ознак життєздатності при впливі світла на батьківські особини, була проведена на модельному об'єкті - Drosophila melanogaster Meig. Використані інбредні лінії дикого типу Canton-Special (C-S) і Oregon-R (Or), ступінь інбридингу яких у більшості експериментів складав 60-120 поколінь. Частина дослідів була проведена на інбредних мутантних лініях black (b): 2-48,5, темне тіло; ebony (e): 3-70,7, чорне забарвлення тіла; white (w): 1-1,5, білі очі; forked (f): 1-56,7, зігнуті, скривлені щетинки - макрохети (інбридинг - не менше 40 поколінь), а також на лініях, в яких мутації були переведені на генетичний фон лінії C-S шляхом зворотних насичуючих схрещувань. Такі лінії розглядають як лінії із заміщеними генотипами (Тоцкий и др., 2002).

Частина досліджень була проведена на модельному об'єкті Bombyx mori L. Використані такі інбредні лінії (ступінь інбридингу - 5-7 поколінь) з порід шовковичного шовкопряда з колекцій кафедри генетики і цитології ХНУ та Інституту шовківництва УААН: Білококонна-1 (Б-1), Білококонна-2 (Б-2), Мерефа-6 (М-6), мічена за статтю порода Радянська-5 (Р-5). Також була використана мутантна лінія ch (13-9,6), у якій гусениці 1-го віку мають руде забарвлення.

У дослідах з вивчення наслідків дії світла на батьківське покоління віргінних самок і самців дрозофіли утримували окремо впродовж двох діб у різних умовах: при червоному (довжина хвилі л=660 нм), зеленому (л=565 нм), синьому (л=470 нм) світлі, а також в умовах інфрачервоного випромінювання (л=940 нм). Джерелом світла були фотонні матриці Коробова (отримані з Центру лазерної біології ХНУ). Після впливу мух схрещували у різних варіантах і аналізували кількісні ознаки потомків.

Теплостійкість (ТС) досліджували методом термотесту (Шахбазов, 1966): імаго прогрівали у водному термостаті при температурі 41єС впродовж 20 хв. і визначали відсоток особин, що вижили через 18 год. після прогріву. Визначення ТС розглядають як тест на неспецифічну стійкість (Шахбазов, 2005). Вихід імаго (ВІ) оцінювали за кількістю пустих лялечкових пупаріумів. Показник ВІ визначається величиною плодючості материнських особин та ступенем передімагінальної життєздатності їх потомків. Зміни ВІ після певного впливу на батьківське покоління характеризують зміни виживаності на передімагінальних стадіях розвитку, за умови, що даний вплив не змінює плодючості материнських особин. Показник швидкості передімагінального розвитку досліджували на синхронізованих культурах, отриманих з яєць, відкладених за 3 год. Визначали час від початку яйцекладки до виходу імаго.

Частоту домінантних і рецесивних летальних мутацій (ДЛМ і РЛМ), частоту рекомбінації досліджували за загальноприйнятими методиками (Тихомирова, 1990). Частоту ДЛМ визначали за кількістю яєць, які не розвинулись, через 48 год. після яйцекладки, оцінюючи при цьому частоту ранніх та пізніх ембріональних леталей (за відсотком відповідно світлих і жовтих яєць, що не розвинулись). Визначали також середню яйцепродукцію (ЯП) самок у різних варіантах досліду. При визначенні РЛМ у хромосомі 2 використовували методику ізогенізації. У F3 від схрещування самців, що утримувались у різних світлових умовах, з самками CyL/Pm визначали частоту появи мух дикого типу і оцінювали вплив на життєздатність (летальний, сублетальний, субвітальний, нейтральний, супервітальний) хромосоми 2. Частоту рекомбінації досліджували у хромосомі 2, використовуючи мутантну лінію bcnvg.

Експресивність ознаки forked визначали за кількістю атипових макрохет серед 5 пар торакальних і скутелярних макрохет дрозофіли за методикою П.Г. Свєтлова (1962).

Ступінь асинапсису гомологічних політенних хромосом досліджували на давлених ацетоорсеїнових препаратах слинних залоз, виготовлених за стандартною методикою (Полуэктова, Евгеньев, 1974). Визначали долю ядер з хромосомами, що асинаптують, по відношенню до загальної кількості досліджуваних ядер на препарат (Лапта, 1974).

У дослідах на шовковичному шовкопряді впливу мікрохвильового (довжина хвилі 5,6 мм, експозиція 3 хв.) і лазерного (довжина хвилі 632,8 нм, експозиція 5 хв.) випромінювання піддавали лялечок в області фоторецептора - “лобного віконця” (Шахбазов, 1961). Імаго, які вийшли з опромінених (їх позначили д - дослід) і неопромінених (позначили як к - контроль) лялечок, схрещували у варіантах: д д, д  к, к д, к к. У потомстві від цих схрещувань визначали ембріональну летальність (ЕЛ) - за відсотком загиблих яєць у кладці; вихід гусениць (ВГ) - за відсотком гусениць, які вийшли, від загальної кількості живих яєць у кладці; середню тривалість життя при голодуванні (СТЖГ) у год., теплостійкість (ТС) грени - за відношенням виходу гусениць після термічної обробки яєць (температура термотестування 45?С, експозиція 20 хв.) до виходу гусениць у контролі; масу кокона та масу шовкової оболонки, г, шовконосність (відношення маси шовкової оболонки до маси кокона, %). В експериментах по впливу світла на батьківські особини на стадії гусениці у потомстві досліджували прояви кількісних ознак, а також здатність незапліднених яєць, які походять від самок F1, до термічного партеногенезу, який проводили за методом Б. Л. Астаурова (1940). Критерієм успішності партеногенезу був відсоток пігментованих яєць від загальної кількості яєць у кладці.

Результати досліджень оброблені загальноприйнятими статистичними методами (Лакин, 1990; Рокицкий, 1978; Доспехов, 1973). Вірогідність відмінностей за тією чи іншою ознакою оцінювали за критерієм Стьюдента (при аналізі ЕЛ - за критерієм Фішера). У ряді випадків проведено дисперсійний аналіз, визначено коефіцієнти кореляції.

Результати досліджень та їх обговорення.

Прояв кількісних ознак дрозофіли при внутрішньолінійних схрещуваннях у залежності від світлових умов утримання батьківських особин. У цьому розділі досліджень порівнювали життєздатність потомства, отриманого від схрещування особин, яких утримували у різних та однакових світлових умовах. У табл. 1 наведені результати досліджень ознак ТС і ВІ у потомстві особин, які перебували в умовах червоного (їх позначили ч), зеленого (позначили як з) світла, у темноті (позначили як к - контроль). Як це видно з таблиці, у результаті дії світла даних ділянок спектру на батьківські особини значення ТС їх потомків змінюються; також виявлені зміни у загальній кількості потомків у дослідних варіантах (показник ВІ). У ряді випадків потомство від схрещування особин, які перебували у різних умовах утримання, є більш життєздатним у порівнянні з потомством особин, які піддавались однаковим впливам. Наприклад, ТС імаго у варіанті ч з у лінії C-S підвищилась не тільки відносно контролю, але й у порівнянні з ТС у варіантах ч ч та з з. Показані відмінності у реципрокних варіантах схрещування. Наприклад, ефект підвищення життєздатності потомства у варіанті ч з відсутній у реципрокній комбінації, з ч.

Таблиця 1

Кількісні ознаки у ліній дрозофіли після впливу

червоного і зеленого світла на батьківські особини (2004-2005 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Примітка. У даній таблиці і далі підкреслені значення ознак потомків варіантів, у яких батьківські особини перебували при різному освітленні, за умови, якщо вони достовірно перевищують відповідні показники мух, отриманих від схрещування особин, утримуваних в однакових умовах.

З метою оцінки дії материнських (фактор А) і батьківських особин (фактор В) та їх взаємодії проведений двохфакторний дисперсійний аналіз. У цілому для лінії C-S характерний сильний вплив материнської особини на значення показників ТС і ВІ, для лінії Or - батьківської. Внесок факторів А і В може різнитись залежно від досліджуваної ознаки і статі особин-потомків.

Двохфакторний дисперсійний аналіз (фактор А - вплив, фактор В - генотип) для ознак ТС та ВІ у даних ліній показав достовірний вплив обох факторів на значення досліджуваних показників (Р>0,99). Сила впливу фактора А при аналізі ТС самок склала 4,9%, фактора В - 74,3%. При аналізі ТС самців сила впливу фактора А дорівнювала 2,3%, фактора В - 84,6%. За ознакою ВІ сила впливу фактора А дорівнювала 7,77%, фактора В - 61,08%.

У табл. 2 представлені результати досліду, в якому батьківські особини піддавались впливу синього світла (позначили с) та інфрачервоного випромінювання (позначили і). Дані фактори при їх впливі на імаго також здатні індукувати зміни у статевих клітинах. За умови різних впливів на батьківські особини у деяких варіантах схрещування встановлено підвищення значень ТС. У лінії Or виявлені варіанти, в яких відбулось різке пригнічення ТС і ВІ.

Таблиця 2

Кількісні ознаки у ліній дрозофіли після впливу синього світла та інфрачервоного випромінювання на батьківські особини (2003-2004 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Як видно з табл. 3, мутантні лінії b, e, w, а також лінії, у яких ці мутації знаходились на генетичному фоні лінії C-S (їх позначили відповідно b(C-S), e(C-S), w(C-S)), реагували на дію червоного і зеленого світла: виявлено зміни ТС у потомстві особин, які зазнали цих впливів. Відомо, що мутації b та e, окрім змін у меланізації кутикули, зумовлюють зміни у функціонуванні зорової системи (Richardt et al., 2003; Phillips et al., 2001), у білооких мутантів w чутливість до дії світла різко підвищена (Townson et al., 1998). Однак, як видно з наведених даних, порушення фототрансдукції, пов'язане з наявністю мутацій, не спричинило відсутність відгуку на вплив світла. В усіх ліній показано зміни ТС після дії світла на батьківські особини і у деяких варіантах схрещування встановлений ефект підвищення життєздатності внаслідок утримання батьківських особин у різних світлових умовах. Установлено, що переведення мутацій на генетичний фон лінії дикого типу приводить до зміни реакції на вплив світла. Здебільшого у лініях, в яких мутації знаходились на фоні лінії C-S, відзначено більш сильні ефекти підвищення або зниження значень ТС у порівнянні з вихідними мутантними лініями в аналогічних варіантах досліду. У ряді випадків у таких ліній виявлені ефекти, що не були характерні ані для вихідних мутантних ліній, ані для лінії C-S. Зміни структури генотипу, у тому числі за рахунок насичуючих схрещувань, здатні суттєво впливати на показники життєздатності (Воробьева, Шахбазов, 1988; Хаустова и др., 2000; Тоцкий и др., 2002); результати даної роботи свідчать про можливість зміни чутливості ліній із заміщеними генотипами до впливу зовнішніх факторів.

Таблиця 3

Теплостійкість імаго мутантних ліній і ліній із заміщеними генотипами після впливу червоного і зеленого світла на батьківські особини

(у % від контролю) (2003-2004 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Метод послідовних дводобових відсадок батьківських особин, які піддавались дії світла, дозволив з'ясувати особливості реакції статевих клітин, які знаходились на момент впливу на різних стадіях гаметогенезу. З табл. 4 видно, що зміни ТС у самок лінії C-S виникають лише в 1-3 відсадках. Особини, отримані у цих відсадках, розвинулись із статевих клітин, які знаходились під час дії світла на мейотичних (у самок і самців) та постмейотичних (у самців) стадіях гаметогенезу. Подібний характер змін ТС у потомстві послідовних відсадок батьків спостерігали також у самців лінії C-S, а також у мутантній лінії w.

Результати паралельного дослідження змін ознаки ТС і ступеня прояву мутантної ознаки forked після впливу червоного і зеленого світла на батьківські особини (табл. 5) дозволяють зробити висновок, що максимальні зміни обох ознак відбуваються у тих самих варіантах (з з, з ч). Коефіцієнт кореляції між ознакою ТС та кількістю атипових макрохет склав r=+0,48 (Р>0,99). Цей результат свідчить про те, що існує єдиний механізм, який забезпечує збільшення ступеня прояву мутантної ознаки і підвищення життєздатності дрозофіли. Зміни прояву даної ознаки, описані у роботах П. Г. Свєтлова, були пов'язані в основному з впливом високої температури на материнську особину. Результати даної роботи свідчать про те, що коливання прояву ознаки forked можна викликати і дією світла на батьківське покоління.

Таблиця 4

Теплостійкість самок лінії C-S при послідовних відсадках батьківських особин, які перебували в умовах червоного та зеленого світла, % (2004-2005 рр.).

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Таблиця 5

Теплостійкість імаго та ступінь прояву ознаки (кількість атипових макрохет) у лінії forked після впливу червоного і зеленого світла на батьківські особини (2004 р.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Таким чином, у даному розділі побудована модель ефекту підвищення життєздатності інбредних ліній дрозофіли шляхом різних світлових впливів на батьківські особини. Зміни кількісних ознак при дії цього фактора можуть бути пов'язані із змінами гормонального статусу особин, батьківські особини яких зазнали дії світла. На користь цього припущення свідчать виявлені нами зміни у швидкості передімагінального розвитку особин F1, показника, пов'язаного з рівнем гормонів, і літературні дані про те, що у статевих клітинах можуть накопичуватись гормони (екдизон) (Lannot, 1986). Тривалість передімагінального розвитку у особин ліній дикого типу скоротилась у середньому на 4 год. (Р>0,95) за впливу червоного світла на материнські особини і подовжилась у середньому на 8 год. (Р>0,999) за впливу зеленого світла.

Наслідки дії світла на генетичний апарат дрозофіли. Метою досліджень цього розділу було з'ясування змін генетичного апарату, які супроводжують виникнення ефектів стимуляції або пригнічення життєздатності при впливі світла на особин батьківського покоління.

Аналіз частоти ДЛМ після дводобового впливу світла на імаго (табл. 6) показав достовірні зміни цього показника лише при дії синього світла на материнську особину. При цьому у лінії C-S у цьому варіанті зросла частота і ранніх (на 24%, Р>0,95), і пізніх (на 49%, Р>0,95) ембріональних леталей; у лінії Or зросла частота пізніх ембріональних леталей на 32% (Р>0,95). У реципрокному схрещуванні (к с) такі ефекти відсутні. Відзначено, що яйцепродукція самок істотно знижувалась після впливу синього світла та інфрачервоного випромінювання. Отже, при дії цих чинників величина ВІ може визначатись і ступенем передімагінальної життєздатності, і плодючістю батьків. З огляду на той факт, що зниження плодючості після впливу може вказувати на виникнення стрес-реакції імаго комах (Раушенбах, 1997), можна припустити, що дані чинники є стресовими для дрозофіли. Яйцепродукція при дії червоного та зеленого світла на самок не змінювалась. Це дає змогу підтвердити висновок про те, що зміни ВІ при дії цих факторів зумовлені змінами ступеня передімагінальної життєздатності.

Таблиця 6

Яйцепродукція (ЯП) і частота домінантних летальних мутацій (ДЛМ) у ліній дрозофіли при впливі світла різних ділянок спектру, % (2003-2005 рр.)

I - ступінь інбридингу, кількість поколінь; 1, 3 - відмінність від контролю Р>0,95, Р>0,999

Методика ізогенізації з допомогою лінії CyL/Pm дозволяє не тільки оцінити частоту РЛМ, але також дослідити співвідношення окремих класів хромосом (частоти мутацій), які розрізняються за їх впливом на життєздатність, що є важливим показником, який характеризує адаптивну цінність лінії (Иванюшина, Кайданов, 1982). Установлено (табл. 7) наявність відмінностей за співвідношенням різних класів мутацій між лініями у нормі (частота класів хромосом з негативним впливом на життєздатність є вищою у лінії Or), а також про зміни у балансі різних класів мутацій після впливу червоного світла: у лінії C-S виявлено збільшення частоти супервітальних мутацій, у лінії Or - зменшення числа леталей. Дія зеленого світла не спричинила виникнення змін у балансі класів мутацій. Різкі зміни у співвідношенні класів мутацій, що впливають на життєздатність, можуть бути наслідком транспозицій МГЕ, які, за даними літератури, можуть бути індуковані як дією інбридингу і добору (Кайданов и др., 1979), так і впливом зовнішніх факторів (Зайнуллин, 1998; Capy et al., 2000; Шапошников, Зайнуллин, 2000; Васильева, Ратнер, 2000). Для пояснення ефекту зміни співвідношення класів таких мутацій можна припустити й виникнення змін генної експресії, які успадковуються, що можливе при світловому впливі (Mikula, 1995).

Таблиця 7

Частота мутацій, що впливають на життєздатність, у хромосомі 2 ліній дрозофіли після впливу червоного (ч) та зеленого (з) світла на батьківську особину, % (2005 р.)

(1 - летальні, 2 - сублетальні, 3 - субвітальні, 4 - нейтральні, 5 - супервітальні)

2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,99, Р>0,999.

Дослідження частоти рекомбінації у хромосомі 2 на ділянці b-vg показало відсутність відмінностей за цим показником від контролю при аналізі співвідношення різних генотипових класів у потомстві гетерозиготних самок bcnvg/+++, що піддавались впливу червоного та зеленого світла.

Вплив світла на материнську особину спричинив збільшення частоти ядер з гомологічними хромосомами, що асинаптують, у клітинах слинних залоз личинок. Збільшення ступеня асинапсису у варіанті схрещування дослід контроль відносно контролю склало 17,7% (Р>0,99) у лінії C-S і 14,1% (Р>0,95) у лінії w.

У табл. 8 представлені результати дослідження змін ТС імаго у поколіннях F1 та F2 після впливу червоного світла на самок ліній дикого типу. Показано, що у F2 зміни ТС, які спостерігали у F1, у лінії Or збереглись в обох статей, однак, у порівнянні із значеннями ТС у першому поколінні вони менші. У лінії C-S ефект підвищення ТС зберігся тільки у самців. Щодо змін показника ВІ, то на основі даних табл. 9 можна стверджувати, що результати впливу збереглись у F2 в обох ліній. Крім того, у F2 у лінії C-S встановлений ефект, який не було відзначено у F1, - підвищення ВІ у варіанті к ч. Зважаючи на те, що показник ВІ у F2 може визначатись не лише рівнем передімагінальної життєздатності, а й плодючістю самок F1, проведені досліди з визначення їх яйцепродукції. Підвищення цього показника установлено у лінії C-S тільки у варіанті к ч, що і зумовлює збільшення ВІ у F2. Підвищення ВІ у F2 у варіанті ч к є наслідком підвищеної передімагінальної життєздатності - ефекту, який виник у F1 і зберігся у F2 після впливу. Підвищення ВІ у лінії Or відбулось у тих варіантах, у яких було встановлено збільшення яйцепродукції самок F1.

Таблиця 8

Теплостійкість імаго ліній C-S і Or у F1 та F2 після впливу червоного світла на материнську особину (у % від контролю) (2004-2005 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Таблиця 9

Вихід імаго у ліній C-S і Or у F1 та F2 після впливу червоного світла на батьківські особини (у % від контролю) (2004-2005 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Таким чином, результати цього розділу досліджень свідчать про те, що дія синього світла спричинює зростання ембріональної летальності дрозофіли, що може бути зумовлене фізіологічними причинами або бути результатом пошкодження генетичного апарата. Припускаючи те, що синє світло і інфрачервоне випромінювання є стресовими факторами для дрозофіли (оскільки було установлено зниження яйцепродукції при їх впливі), можна очікувати виникнення генотипових змін внаслідок стресової індукції транспозицій (Васильева и др., 1997). Зміни ембріональної летальності при дії червоного світла відзначені не були. Результати досліджень, у яких показано збереження ефектів змін ознак у другому поколінні після впливу червоного світла, підвищення ступеня асинапсису гомологічних хромосом при утриманні материнської особини в умовах червоного освітлення, зміни частот мутацій, що впливають на життєздатність, свідчать про те, що при дії цього фактора у гаметах виникають пролонговані зміни, які забезпечують модифікацію життєздатності потомків. Якщо ці зміни пов'язані з транспозиціями МГЕ, то ефект підвищення життєздатності організму, одна з батьківських особин якого піддавалась впливу червоного світла, зумовлений підвищенням ступеня гетерозиготності. Якщо ефекти дії цього фактора пов'язані з епігенетичними модифікаціями гістонових білків або ДНК, які модифікують структуру хромосом, то підвищення життєздатності потомства при впливі червоного світла на одну з батьківських особин можна пояснити змінами у взаємодії диференційованих гомологічних хромосом, зокрема збільшенням ступеня їх асинапсису, яке зумовлює підсилення генної активності (Шахбазов и др., 1990).

Прояв кількісних ознак шовковичного шовкопряда при внутрішньолінійних схрещуваннях у зв'язку з мікрохвильовим, лазерним, світловим впливом на батьківські особини. Як видно з табл. 10, мікрохвильове випромінювання вплинуло на життєздатність особин наступного покоління. Використані у досліді породи мали контрастну життєздатність: М-6 і Р-5 є менш життєздатними за досліджуваними показниками у порівнянні з Б-1 і Б-2.

Таблиця 10

Кількісні ознаки інбредних ліній з порід шовковичного шовкопряда після впливу мікрохвильового випромінювання на батьківські особини (2003-2004 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Особливо значні зміни за показниками ВГ, СТЖГ установлені у порід з відносно низькими значеннями цих ознак у контролі. Зміни показників ЕЛ та ТС грени відзначені в усіх досліджуваних порід. Показано підвищення показника ЕЛ при впливі застосованого фактора на обидві батьківські особини; у варіанті д к значення ЕЛ може бути вищим (у порід Б-1, Б-2, Р-5) за контроль або нижчим (порода М-6), у реципрокному варіанті значення показника достовірно нижчі за контрольні (окрім породи Б-1). У потомстві, отриманому від схрещування к д, значення ознак ТС грени, ВГ є більшими порівняно з потомством варіанту д д і контрольного, що показано для порід Р-5, М-6, Б-1. Такий самий ефект виявлений при аналізі показника СТЖГ у варіанті д к у порід Р-5 і М-6. При впливі мікрохвильового випромінювання на материнську особину (варіант д к) у наступному поколінні у породи Р-5 встановлено збільшення маси кокона самок (на 14%, Р>0,95) і самців (на 10%, Р>0,99) та збільшення маси шовкової оболонки (у самок на 17%, Р>0,95 і у самців на 18%, Р>0,95); зростання шовконосності виявлено тільки у самців (на 7%, Р>0,95). Таким чином, значення кількісних ознак є максимальними у тих варіантах, у яких впливу мікрохвильового випромінювання піддавалась одна з батьківських особин; внесок материнської та батьківської форми у значення кількісних ознак залежить від виду досліджуваної ознаки. Характер реакції на вплив мікрохвильового випромінювання залежить від генотипу породи.

Дія лазерного випромінювання на лялечки шовкопряда породи Р-5 справляла найбільший ефект у варіантах, у яких впливу фактора піддавалась материнська особина (табл. 11). За ознаками ЕЛ, ТС грени, СТЖГ гусениць (у самок), ВГ потомство комбінації д к є більш життєздатним у порівнянні з потомством комбінації д д і контролем. У варіанті д д виявлено зниження маси кокона на 18% (Р>0,99) у самок і 8% (Р>0,95) у самців; зниження маси шовкової оболонки у самок на 18%, у самців на 14% (Р>0,95). У варіанті д к зниження маси кокона у самок склало 15% (Р>0,99), у самців 7% (Р>0,95); маса шовкової оболонки зменшилась у самок на 17%, у самців на 15% (Р>0,95).

Таблиця 11

Кількісні ознаки інбредної лінії з породи Радянська-5 після дії лазерного випромінювання на батьківські особини (2002-2003 рр.)

1, 2, 3 - відмінність від контролю відповідно Р>0,95, Р>0,99, Р>0,999.

Таким чином, на відміну від впливу мікрохвильового випромінювання, лазерне випромінювання справило різний вплив на ознаки життєздатності і показники маси кокона. Показані ефекти зумовлені впливом фактора на материнську особину.

Згідно з літературними даними, мікрохвильове і лазерне випромінювання, принаймні у застосованих режимах, не є мутагенними факторами. Пролонговані ефекти, викликані дією цих факторів, можна пояснити індукцією епігенетичних змін; деякі автори припускають участь мобільних елементів у реакції на мікрохвильове випромінювання (Девятков и др., 1983), зміни частоти рекомбінації при впливі лазерного світла (Жученко, Король, 1985; Бурилков, Крочик, 1989).

При дослідженні впливу світла на батьківські особини використовували мутантну лінію ch. Гусениць 1-го віку утримували впродовж 2-х год. в умовах червоного освітлення. Імаго, що були отримані з гусениць, які зазнали впливу, схрестили з особинами, яких утримували у звичайних умовах. У наступному поколінні оцінили показник ВГ, зміни якого були показані у варіанті к д: встановлено підвищення ВГ, яке склало 108,1% від контролю (Р>0,95). Також була досліджена здатність незапліднених яєць, що були виділені із самок, батьківські особини яких піддавались впливу світла, до термічного партеногенезу. Відсоток пігментованих яєць у контролі дорівнював 22,9±3,2, у варіанті д д 60,2±3,5, д к 27,6±3,0, к д 53,2±3,9. Достовірні відмінності від контролю показані у варіантах д д, к д (Р>0,999). Таким чином, успішність партеногенезу підвищилась у тих варіантах, в яких впливу світла піддавали батьківську особину самки-засновниці клону.

ВИСНОВКИ

На основі проведеного дослідження прояву кількісних ознак у інбредних ліній дрозофіли і шовковичного шовкопряда при утриманні батьківських особин в однакових і різних умовах зроблено висновок про те, що життєздатність потомства в основному є вищою у тих варіантах схрещування, у яких особини батьківського покоління зазнавали різних впливів.

Дія світла з різною довжиною хвилі (червоного, зеленого, синього), а також інфрачервоного випромінювання на імаго дрозофіли приводить до змін значень ознак виходу імаго та теплостійкості потомків. Потомство від схрещування особин одного генотипу, які піддавались різним впливам, є більш життєздатним у порівнянні з потомством особин, які піддавались однаковим впливам. Внесок материнської та батьківської особини у значення досліджуваних показників може бути різним залежно від лінії, ознаки та статі особин-потомків.

Характер (стимуляція або пригнічення) та ступінь змін ознак життєздатності дрозофіли при дії світла залежать від генотипу. Максимальна чутливість до даного впливу характерна для ліній із заміщеними генотипами, у яких мутації (black, ebony, white) переведені на генетичний фон лінії дикого типу.

При впливі світла на стадії імаго батьківського покоління зміни виникають у статевих клітинах, які знаходяться на мейотичних (у самок і самців) і постмейотичних (у самців) стадіях гаметогенезу.

Показані паралельні зміни теплостійкості та експресивності ознаки forked після впливу світла на батьківське покоління.

Показано відсутність змін за частотою домінантних летальних мутацій після впливу червоного і зеленого світла, інфрачервоного випромінювання та підвищення ембріональної летальності при дії синього світла на материнську особину у лінії C-S на 31%, у лінії Or на 18%. Після впливу червоного світла виявлено у лінії C-S зростання на 61% частоти супервітальних мутацій у хромосомі 2, у лінії Or - зменшення на 58% частоти мутацій з негативн...