Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

Оксененко Світлана Вячеславівна

УДК 577.155.08:546.131.599.323.4

Вміст ліпідів у тканинах щурів за дії хлоридів важких металів та в умовах профілактичного введення пентоксифіліну

03.00.04 ? біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ ? 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, м. Харків.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Каліман Павло Авксентійович Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, професор кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доктор медичних наук, професор Жуков Віктор Іванович Харківський державний медичний університет, завідувач кафедри біохімії;

доктор біологічних наук, професор Войціцький Володимир Михайлович Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії.

Провідна установа - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України, відділ біохімії коферментів, м. Київ

Захист відбудеться “20” січня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони, 13, корпус № 4, к. № 41.

Автореферат розісланий “17” грудня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Калінін І.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сьогодні перед людством гостро постало ціле коло питань, пов'язаних із агресивністю навколишнього середовища, зокрема, із дією солей важких металів. Накопичені дані щодо цього не дають змоги уявити цілісну картину відповіді метаболізму на екстремальні умови існування. Недостатньо висвітленими залишаються питання участі ліпідного ланцюга обміну, що зумовлює необхідність у подальших дослідженнях, які дозволять краще зрозуміти природу багатьох захворювань, відкрити нові перспективні профілактичні та терапевтичні підходи.

Ліпіди відіграють ключову роль у структурно-функціональній організації клітин і регуляції метаболізму. Вони є складовими компонентами біологічних мембран і не тільки впливають на метаболізм шляхом компартменталізації субстратів, коферментів, ефекторів, а й самі виступають як кофактори і регулятори активності мембранозв'язаних ферментів (Fielding C.J. et.al., 2004, Magee T. et.al., 1992, Pinto F.T., et.al., 2002). Зокрема, фосфатидилсерин (ФС) та фосфатидилгліцерол у плазматичній мембрані активують Na, K-ATPазу, діацилгіцерид (ДГ) і ФС - протеїнкіназу С (РКС), кардіоліпін (КЛ) внутрішньої мітохондріальної мембрани - креатинкіназу, а фосфатидилхолін (ФХ) - в-гідроксибутиратдегідрогеназу. При окисленні 5-10% жирних кислот (ЖК) у мембранних фосфоліпідах (ФЛ) саркоплазматичного ретикулуму знижується активність Ca-ATPази та NADPH-дегідрогенази (Геннис Р., 1997). З огляду на вище зазначене, участь деяких представників класу ліпідів у формуванні та проведенні регуляторних сигналів є безперечною, що уможливлює зв'язок організму з навколишнім середовищем. У разі дії екзогенних чинників, здатних завдати шкоди, розвивається так званий оксидативний стрес (Каліман П.А., 2002), при якому збільшується вміст активних метаболітів оксигену (АМО), мобілізуються системи антиоксидантного захисту (АОЗ), активуються метаболічні шляхи, які забезпечують виживання в екстремальних умовах (Land S.C., 1993, Каліман П.А., 2002). Серед численних процесів спостерігається активація фосфоліпаз (Ito Y. et.al., 1997), запуск метаболізму арахідонової кислоти (Kogteva G.S. et.al., 1998), активація протеїнкіназ (Kyriakis J.M. et.al., 1996), протеолітичних ферментів та факторів транскрипції (Каліман П.А. и др., 2000, Самохін А.О., 2003, Land S.C., 1993), окисна модифікація ліпідів, білків, нуклеїнових кислот (Asatryan L. et.al., 2003). При дії хлоридів меркурію та кобальту (HgCl2, CoCl2) спостерігається гіпоксія у тканинах, активується ціла низка супутніх адаптаційних та патологічних процесів, у тому числі за участю ліпідів (Buttyan R. et. al., 2003, Chun Y.S. et.al., 2000, Nieto E. et. al., 2002). З огляду на все зазначене вивчення ролі ліпідів у реалізації відповіді організму на дію чинників ушкодження, пошук засобів профілактики можливих порушень їх обміну є актуальним і своєчасним, тим більше сьогодні, коли відбувається значне забруднення навколишнього середовища, у тому числі й солями важких металів.

В таких умовах як профілактичний засіб, можна використовувати пентоксифілін (ПФ), який зменшує прояви гіпоксії завдяки поліпшенню кровопостачання тканин, отже й покращує метаболізм загалом. Головними механізмами дії ПФ є інгібування фосфодіестерази та пригнічення активації шляху опосередкованого ядерним фактором каппа-в, що призводить до уповільнення утворення цитокінів та різних клітинних факторів. Тобто ПФ здатен діяти за тими ж механізмами, що й солі важких металів, але у протилежному напрямі (Gavella M. et.al., 1994, Vincenti F.G. et.al., 1993, Hung K.Y. et.al., 2003, Oh G.S. et.al., 2003).

У працях інших авторів показано, що введення HgCl2, CoCl2 активує ліпопероксидацію у тканинах печінки, нирок, легень (Соколик В.В., 2001, Шабі Б.К., 1999). При цьому CoCl2 призводить до підвищення концентрації у сироватці крові загальних ліпопротеїнів (ЛП), зокрема атерогенних, збільшує ступінь їх пероксидації, зменшує вміст ЛП у цитозолі печінки, викликає зміни її ліпідного складу (Загайко А.Л., 1999, Беанзен Г.Ж., 1996, Шаламов Р.В., 1999). Викладені у цих працях положення стали підґрунтям нашого дослідження та зумовили необхідність більш глибокого вивчення біохімічних характеристик тканин функціонально різних органів та субклітинних фракцій ключового органа ліпідного обміну - печінки під дією солей важких металів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота безпосередньо зв'язана з дослідженнями, що проводяться на кафедрі біохімії Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (“Роль гему та гемопротеїнів в регуляції адаптації метаболізму при оксидативному стресі”, № державної реєстрації 0100U003323) та в Державній установі “Інститут терапії ім. Л.Т.Малої АМН України” (“Окислювальний стрес як фактор дестабілізації клітинних мембран та системи внутрішньоклітинної регуляції”, № державної реєстрації 0101U000147).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи - встановити відповідь ліпідного ланцюга метаболізму на дію сублетальних доз солей важких металів та виявити профілактичне значення пентоксифіліну.

Для досягнення мети сформульовано такі задачі:

1. Визначити склад ліпідів тканин внутрішніх органів при введенні HgCl2, CoCl2, а також при введенні ПФ.

2. Визначити ліпідний склад сироватки крові та окремих субклітинних фракцій печінки, а саме ядер, мітохондрій, лізосом, мікросом, цитозолю після введення солей важких металів (HgCl2, CoCl2, хлориду кадмію (CdCl2)).

3. Дослідити вплив HgCl2, CoCl2, ПФ на вміст продуктів ліпопероксидації у тканинах органів, а також HgCl2, CoCl2, CdCl2 - у субклітинних фракціях печінки.

4. Виявити зміни ліпідного складу та продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) за умов дії хлоридів важких металів у динаміці.

Об'єкт дослідження - перетворення ліпідів тканин функціонально різних органів, сироватки крові та субклітинних фракцій клітин печінки щурів (ядер, мітохондрій, лізосом, мікросом, цитозолю) при дії хлоридів важких металів та при профілактичному введенні пентоксифіліну.

Предмет дослідження - показники ліпідного складу і вміст продуктів ПОЛ.

Методи дослідження. Центрифугування та ультрацентрифугування (розділення клітин печінки на субклітинні фракції), тонкошарова і газорідинна хроматографія (отримання загальних фосфоліпідів (ЗФЛ), неетерифікованого холестеролу (ХС), ефірів холестеролу (ЕХ), моногліцеридів (МГ), ДГ, тригліцеридів (ТГ), вільних жирних кислот (ВЖК), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), ФХ, сфінгомієліну (СМ), фосфатидилінозитолу (ФІ), ФС, фосфатидилетаноламіну (ФЕ), фосфатидової кислоти (ФК), КЛ, розділення ВЖК), фотометрія (кількісне визначення загальних ліпідів, окремих ліпідів, активних до тіобарбітурової кислоти (ТБК) продуктів, визначення активності маркерних ферментів субклітинних фракцій, сіалових кислот, білків), електрофорез (реєстрація наявності DNA у пробі), статистично-аналітичний метод (базисна статистика з визначенням M - середнього і m - похибки середнього, непараметрична - U-критерію Вілкоксона-Манна-Уітні, проведення кореляційного аналізу із розрахуванням r- критерію Пірсона).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено порівняльне вивчення дії хлоридів важких металів на ліпідний склад тканин функціонально різних органів і субклітинних фракцій печінки з метою виявлення відповіді ліпідного ланцюга обміну на вплив сублетальних доз солей важких металів. Уперше під дією хлоридів важких металів оцінено профілактичне значення пентоксифіліну. Уперше було виявлено такі факти:

1. У тканинах досліджених органів введення CoCl2, HgCl2, окрім активації ліпопероксидації спричиняє гіперхолестеринемію нирок, серця та аорти. Також під дією HgCl2, CoCl2 відбувається накопичення ЛФХ у більшості органів, ЗФЛ - у серці та нирках.

2. ПФ впливає на ліпідний склад тканин досліджуваних органів. Застосування ПФ перед введенням HgCl2, CoCl2 частково попереджає накопичення ТБК-активних продуктів. Крім того, ПФ загалом стабілізує вміст нейтральних ліпідів (НЛ) і ФЛ.

3. При введенні солей важких металів через 2 і 24 год спостерігається зменшення вмісту ЗФЛ, ЕХ (HgCl2, CoCl2, CdCl2), ХС (HgCl2, CdCl2), а також арахідонової кислоти (HgCl2) сироватки крові.

4. У субклітинних фракціях печінки через 2 і 24 год позначаються масштабні зміни ліпідного складу: у мітохондріях - зменшення, у лізосомах - підвищення рівня ЗФЛ, у більшості субклітинних фракцій - збільшення вмісту ФК (HgCl2, CoCl2, CdCl2), у мікросомах - зменшення співвідношення ФЕ/ ФХ (HgCl2 - 2 і 24 год, CoCl2 - 24 год). Встановлено зниження рівня ХС у мікросомах і цитозолі через 2 год, однак зростання його - у лізосомах через 2 і 24 год (HgCl2, CoCl2, CdCl2). Через 2 і 24 год спостерігається зниження вмісту арахідонової кислоти (С 20:4) у лізосомах (HgCl2, CoCl2, CdCl2) і мітохондріях (HgCl2), але її накопичення - у мікросомах і цитозолі (CdCl2, CoCl2). Всі ці зміни свідчать про перебудову обмінних процесів, що, до речі, частково відбувається на тлі активації ПОЛ в ядрах, цитозолі, мітохондріях.

Практичне значення одержаних результатів. За результатами дослідження отримано два патенти, у яких викладено підходи для оцінки ефективності призначення ПФ, що може знайти практичне застосування у практиці охорони здоров'я. Викладені у роботі положення також дають змогу поглибити уявлення про механізми виникнення професійних захворювань та про вплив несприятливих умов на якість життя.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана під керівництвом доктора біологічних наук, завідувача кафедри біохімії Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Калімана П.А. Експериментальне дослідження складу ВЖК проводилося у співробітництві з кандидатом біологічних наук, старшим науковим співробітником Державної установи “Інститут терапії ім. Л.Т.Малої АМН України” Кобзарем А.І., з яким автор має декілька спільних публікацій. Решта дослідів, статистична обробка, узагальнення отриманих даних здійснювались особисто. Обговорення результатів проводилося разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації було викладено на засіданнях кафедри біохімії Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна та наукових конференціях Державної установи “Інститут терапії ім. Л.Т.Малої АМН України” (2000-2003 рр.). Матеріали були особисто представлені на конференції молодих учених “Харківщина - тобі пошук молодих” (Харків, 2002 р.); на міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (Ялта, 2003 р.); “Биология - наука 21 столетия” (Пущино, 2003 р.); “Каразинські читання” (Харків, 2003 р.); “Вчені майбутнього” (Одеса, 2003 р.); на 4-й геронтологічній конференції молодих учених (Київ, 2003 р.).

Публікації матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 9 статей, 8 із яких увійшли до переліку видань ВАК, 17 тез доповідей, отримано 2 патенти.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаних джерел, що включає 325 найменувань, 271 з яких є іншомовними. Робота викладена на 172 сторінках рукопису, ілюстрована 40 таблицями, 6 рисунками.

пентоксифілін печінка щур хлорид

Огляд літератури. Огляд складається з 3 підрозділів, які містять 3 підпункти. У підрозділі 1.1 обговорюються сучасні відомості про будову, функції мембран, деякі аспекти метаболізму ліпідів та їх функціональної ролі. У підрозділі 1.2 даються загальні положення про вільнорадикальне окислення (ВРО) та ПОЛ, а у 1.3 - про дію важких металів.

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на базі Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна та Державної установи “Інститут терапії ім. Л.Т. Малої АМН України”. У роботі використовували щурів - самців популяції Wistar із масою тіла 150-180 г, що утримувалися в стандартних умовах віварію. Усі ін'єкції здійснювали внутрішньочеревинно, маніпуляції проводили під хлоралозно - уретановим наркозом (Сидоряк Н.Г., 1985). Тварин було поділено на групи залежно від завдання дослідження: контроль - щури, яким вводили фізіологічний розчин; щури, яким вводили HgCl2 в дозі 0,7 мг/ 100 г маси тіла (LD50) та декапітували через 0,5, 2, 24, 96 год (Maines M.D., 1977); тварини, які отримували ін'єкцію CoCl2 в дозі 3 мг/ 100 г маси тіла (6/10 LD50) (Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1986) і декапітували через 2 і 24 год; тварини, що отримували ін'єкцію ПФ в дозі 15 мг/ 100 г маси тіла (Бєлоусова І.П., 1998), декапітували через 4 год; щури, яким вводили ПФ за 2 год до введення HgCl2 або CoCl2 і декапітували через 4 год від початку експерименту; щури, яким вводили розчин CdCl2 у дозі 1/10 LD50 1,4 мг/ 100 г маси тіла (Kikuchi G., 1983), декапітували через 2 і 24 год. Субклітинні фракції одержували шляхом диференційного центрифугування та ультрацентрифугування. Для контролю чистоти отриманих фракцій визначали активність маркерних ферментів, наявність DNA і вміст сіалових кислот (Финдлей Д.Б. и др., 1990). З існуючих продуктів ПОЛ визначали концентрацію активних до ТБК продуктів (Орехович В.Н., 1977). Екстракцію ліпідів із біологічного матеріалу здійснювали за методом Блайя та Дайера за модифікацією (Bligh, E.G., Dyer W.J., 1956). Загальні ліпіди визначали окремим методом (Грибанов Г.А., 1975). Ліпіди фракціонували методом тонкошарової хроматографії на сілікагелевих платівках `Silufol' та `Sorbfil'. Загальні ліпіди розділяли на класи (ЗФЛ, МГ, ХС, ДГ, ВЖК, ТГ, ЕХ) за допомогою розчинників - гептан: діетиловий ефір: крижана оцтова кислота (60:40:2) (Финдлей Д.Б. и др., 1990). Для фракціонування ФЛ використовували суміш розчинників - хлороформ: етанол: вода: триетаноламін (30:35:7:35), так одержували ЛФХ, ФХ, СМ, ФІ, ФС, ФЕ, ФК, КЛ (Leray C. et.al., 1987). ВЖК, що були отримані методом тонкошарової хроматографії, потім розділяли з використанням газорідинної хроматографії (Синяк К.М. и др., 1976). Ідентифікацію ліпідних фракцій проводили за допомогою стандартних розчинів фірм Fluka та Sigma (США), кольорових реакцій на окремі функціональні групи ліпідів. Кількісне визначення отриманих фракцій нейтральних ліпідів здійснювали відповідними методами (Tixer M. et.al., 1974, Колб В.Г. и др., 1982, Финдлей Д.Б. и др., 1990).

Рівень ФЛ досліджували за неорганічним фосфатом, що входить до їх складу, за методом Фіске і Суббароу з модифікаціями Бартлета (Sandhu R., 1976).

Здобуті експериментальні дані були оброблені за допомогою методів базисної статистики, вірогідність розбіжностей між групами оцінювали непараметричним методом із використанням U-критерію Вілкоксона-Манна-Уітні. Взаємозв'язок між змінами складу ліпідів і вмістом продуктів ПОЛ встановлювали за допомогою кореляційного аналізу із визначенням r-критерію Пірсона. Статистично-аналітичну обробку здійснювали за допомогою комп'ютерної програми Statistica 6.0.

Результати дослідження та їх обговорення

Вплив HgCl2 і CoCl2 на вміст окремих фракцій НЛ і ФЛ різних тканин щурів. Під час дослідження було показано, що через 2 год після введення HgCl2 у печінці зменшувалась концентрація ХС, ЕХ, що, скоріш за все, вказувало на активацію катаболізму ліпідів у цьому органі (табл. 1). Тоді ж зменшувався вміст ЕХ у нирках, що може зумовлюватися прискоренням окисних реакцій. Водночас змінювався ліпідний склад й стінки аорти, зокрема підвищувався рівень ЕХ, що, разом із збільшенням вмісту ХС у серці та нирках, свідчить про здатність HgCl2 викликати гіперхолестеролемію. Через 96 год (табл. 2) відбувались подібні явища у тканинах нирок і серця.

Таблиця 1. Вміст ХС, ЕХ тканин внутрішніх органів щурів після введення HgCl2, CoCl2, ПФ, Мm, n=6

*- Вірогідні зміни порівняно: а - з контролем, в - з ПФ, с - з HgCl2, d - з CoCl2 (р0,05)

Введення CoCl2 тваринам викликало зменшення вмісту ЕХ через 2 год у тканинах печінки (див. табл. 1). У інших органах були зафіксовані такі зміни: збільшувався рівень ХС у серці та аорті, ЕХ - у аорті, тобто визначалася гіперхолестеролемія. Ці дані підтверджуються отриманими раніше результатами досліджень впливу CoCl2 на ліпідний обмін (Шаламов Р.В., 1999) та можуть розглядатися як ще один доказ того, що під дією HgCl2 і CoCl2 відбувається вивільнення ліпідів із печінки у кров у складі ліпопротеїнів дуже низької щільності із подальшим потраплянням їх до клітин інших органів (Загайко А.Л., 1999).

Таблиця 2. Вміст ХС і ЕХ у тканинах серця і нирок щурів за умов введення HgCl2 (96 год), Мm, n=6

*- Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05)

Загальновідоме застосування лікарських засобів, здатних поліпшити метаболізм в умовах оксидативного стресу. Тому у цьому дослідженні ПФ - препарат, який поліпшує кровопостачання, справді перешкоджав впливу солей важких металів на цілу низку вивчених показників. А саме, при використанні його перед HgCl2 нормалізувався вміст ХС у тканинах нирок.

При сумісній ін'єкції ПФ та CoCl2 визначено вплив ПФ на рівень цього ліпіду у серці у бік стабілізації. Рівень ХС і ЕХ досліджених тканин не досягав контрольних позначок. Тобто у разі попереднього до солей важких металів введення ПФ справляв частковий профілактичний вплив, який може розглядатися як причетність ефектів ПФ до гальмування секреції ліпідів печінкою та зменшення надходження їх до інших органів, що характеризує його як гіполіпідемічний препарат.

Про можливий вплив солей важких металів на активність фосфоліпаз, зокрема А2, свідчить накопичення ЛФХ у тканинах серця та аорти за дії CoCl2, а у печінці та аорті - HgCl2 (табл. 3).

Не можна обминути увагою і збільшення концентрації ЗФЛ при введенні HgCl2 і CoCl2 у серці, нирках. Це могло відбуватися через захоплення ЛП із крові, про можливість якого в умовах дії CoCl2 було зроблено припущення у більш ранніх дослідженнях (Шаламов Р.В., 1999, Загайко А.Л., 1999). Попереднє введення ПФ лише у деяких групах нормалізувало вище зазначені зміни.

Так, це спостерігалося щодо ЗФЛ у тварин при сумісному введенні ПФ із HgCl2 (серце і нирки) і СоCl2 (серце). Варто зазначити, що по відношенню до ЛФХ стабілізуючі властивості ПФ були найбільш виразними у печінці.

На підставі цих спостережень можна висунути гіпотезу, що у змінах ліпідного складу під впливом розглянутих солей важких металів (HgCl2, СоCl2) реалізація загальних для них і для ПФ механізмів відбувається незначною мірою, тобто задіяними є не лише циклічний аденозинмонофосфат (cAMP) та PKC (Yamatani K. et.al, 1998, Hasebe Y. et.al., 2000).

Таблиця 3. Вміст ЗФЛ та ЛФХ в органах щурів за умов дії солей важких металів та ПФ, мкмоль/ г тканини, Мm, n=6

* - Вірогідні зміни порівняно: а - з контролем, в - з ПФ, с - з HgCl2, d - з CoCl2 (р0,05)

Особливий біологічний інтерес становлять коливання ліпідного складу аорти, де під час нашого дослідження визначено збільшення вмісту супутника активації ліпопероксидації - ЛФХ (HgCl2, CoCl2). Це може бути зумовлено поглинанням перекисно ушкоджених ліпідів у складі ЛП частинок, порушенням зворотного транспорту ліпідів та безпосередньою активацією ПОЛ в артеріальній стінці, і, як відомо, є факторами ризику атеросклеротичних змін у судинах та підтверджує висунуте раніш припущення про атерогенність CoCl2 (Загайко А.Л., 1999). Слід також зазначити перешкоджаючу дію ПФ на спричинені солями важких металів зміни складу ФЛ у артеріальній стінці. Разом із цим, і сам ПФ у ній збільшував вміст ЛФХ, що, через відому здатність цього препарату підвищувати рівень cAMP у клітині, може зумовлюватися його впливом на активність ліполітичних ферментів. Подібна картина також відбувалась у серці.

У сироватці крові при введенні солей важких металів також спостерігались суттєві зміни ліпідного складу (табл. 4). Так, через 2 год відзначалось зменшення концентрації ХС (CdCl2) та ЕХ (HgCl2, CoCl2, CdCl2), котре могло спричинюватись захопленням деякими органами НЛ у складі ЛП, що підтверджувалось й іншими авторами для CoCl2 (Загайко А.Л., 1999). При введенні солей важких металів серед найбільш вагомих змін щодо складу ВЖК у сироватці крові слід зазначити такі, як зменшення вмісту арахідонової кислоти (С 20:4) за умов впливу HgCl2 (2 і 24 год).

Таблиця 4. Вміст деяких ліпідів сироватки крові щурів під дією солей важких металів, Мm, n=6

* - Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05); С 20:4 - арахідонова кислота

У більшості субклітинних фракцій за цих умов зазначалось збільшення вмісту ФК, що, скоріш за все, відбувається через активацію фосфоліпази D та використання гліцерофосфоліпідів у клітинній сигналізації, що, зокрема, спостерігалося в мікросомах (табл. 5). Оскільки саме ФК є ключовим ліпідом, через який утворюється багато інших, то різке зростання його рівня могло мати значні біологічні наслідки, створивши умови для активації ліпогенезу.

Відомо, що для переважної більшості клітин метилювання ФЕ до ФХ реалізується у мікросомах (Cui Z., 1993).

Визначення ФЕ/ ФХ співвідношення дозволяє оцінити інтенсивність цього процесу (Андрушенко І.І., 2003). В умовах даного дослідження при введенні HgCl2 через 2 і 24 год, CoCl2 - через 24 год це співвідношення зменшувалося.

Крім того, як через 2, так і через 24 год у мітохондріях спостерігалось зменшення вмісту КЛ (HgCl2, CoCl2, CdCl2), найімовірніше, внаслідок пероксидації його ненасичених ЖК.

Розділення мітохондрій та лізосом печінки дозволило вирішити поставлене у попередніх дослідженнях запитання - яка ж саме з цих двох фракцій за дії CoCl2 відповідальна за накопичення ЗФЛ (Шаламов Р.В., 1999). У цій роботі доведено, що саме лізосоми є тим місцем у клітині, де накопичуються ліпіди.

Визначено, що у лізосомах - головному місці деградації ендогенного та екзогенного матеріалу, після введення CoCl2 відбувається накопичення ЗФЛ, що було і при дії HgCl2 і CdCl2. Це, разом із зменшенням їх концентрації у сироватці крові, може вказувати на захоплення ФЛ у складі відповідних ЛП (Климов А.Н., 1999). Так само імовірним є надходження через 2 і 24 год до лізосом ушкоджених фрагментів із мітохондрій при введенні HgCl2, CoCl2, CdCl2, із мікросом - CdCl2. Накопичення ФЛ у лізосомах може відображати пригнічення активності ліполітичних ферментів цього органоїда, що, як відомо, є токсичним і викликає хвороби накопичення (Vance D.E., Vance J., 2002).

Таблиця 5. Вміст ЗФЛ, ФК, КЛ, ФХ, ЛФХ (нмоль/ мг білка), а також ФЕ/ ФХ- співвідношення у деяких субклітинних фракціях печінки щурів, Мm, n=6

* - Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05)

У цитозолі ж печінки через 2 год після дії HgCl2, CdCl2 спостерігалось збільшення рівня ЛФХ та зменшення - ФХ, що, імовірно, було через активацію цитозольної фосфоліпази А2 (Hara S., 1995). Однак введення CoCl2 через 2 і 24 год, навпаки, збільшувало вміст ФХ.

Припустима за умов впливу HgCl2 і CdCl2 активація фосфоліпаз A2 може зумовлюватися реалізацією будь-якого з відомих механізмів: через Са2+ - залежний та незалежний, які, як відомо, індукуються АМО. Крім того, ці ферменти у цитозолі мають N-термінальний Са2+-залежний домен, через який відбувається транслокація їх на мембрани (Зубчак В.М., 1999). Який шлях активації при цьому переважає - залежить від типу тканини та діючого стимулу (Leslic C.C., 1997). За зазначених умов можливо й збільшення утворення цього ферменту (Clarke S.D., Abraham S., 1992), що, як відомо, відбувається завдяки подовженню часу півжиття mRNA фосфоліпази А2 під впливом широкого кола стимулів (Leslie C.C., 1997).

Динаміка змін складу НЛ привернула увагу до лізосомальної фракції клітин печінки, де через 2 і 24 год після введення HgCl2, CoCl2, CdCl2 збільшувалась концентрація ХС, що може вказувати на порушення ліполізу (табл. 6). Встановлене при цьому зменшення вмісту ХС у мікросомах і цитозолі під дією HgCl2, CoCl2, CdCl2 (2 год) могло зумовлюватися його транспортуванням до інших органоїдів клітин печінки або пригніченням синтезу.

Таблиця 6. Вміст ХС у деяких субклітинних фракціях печінки щурів при уведенні солей важких металів, нмоль/ мг білка, Мm, n=6

* - Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05)

Серед вагоміших змін складу ВЖК при дослідженні (табл. 7), на наш погляд, слід зазначити зміни вмісту арахідонової кислоти (С 20:4). Так, через 2 год після введення тваринам HgCl2 спостерігалось зменшення її концентрації у лізосомах і мітохондріях печінки, а CdCl2 - у лізосомах цього ж органа. Подібна картина була і через 24 год у лізосомах (CoCl2, CdCl2), мітохондріях (HgCl2). Це може відображати використання ЖК у синтезі ейкозаноїдів (Miyahara T. et.al., 2001). Про це ж свідчить збільшення вмісту арахідонової кислоти (С 20:4) у головному місці синтезу ейкозаноїдів - мікросомах, а також у цитозолі за дії CdCl2 (2 і 24 год), CoCl2 (24 год).

Слід зазначити, що HgCl2 (2 і 24 год) не спричиняв накопичення арахідонової кислоти (С 20:4) ні у цитозолі, ні у мікросомах печінки, що може пояснюватись блокуванням SH-груп відповідних ферментів або більш ранньою відповіддю клітини на дію іонів меркурію, припустимо, спрямовану на використання арахідонату (С 20:4) в утворенні ейкозаноїдів.

Виявлені зміни концентрації арахідонової кислоти (С 20:4) мають значні наслідки, оскільки відома її здатність опосередковувати метаболічні перетворення ліпідів, процеси диференціації, запалення, цитотоксичність (Leslic C.C., 1997).

Таблиця 7. Вміст арахідонової кислоти (С 20:4) у субклітинних фракціях печінки щурів за введення солей важких металів, нмоль/ мг білка, Мm, n=5

* - Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05)

Вплив HgCl2, CoCl2, ПФ на стан ПОЛ тканин печінки, серця, нирок, аорти і субклітинних фракцій печінки щурів. З досліджень, які проводилися раніше, відомо, що як CoCl2 так і HgCl2 викликають активацію різних ланок GSH- залежної системи АОЗ, діють по-різному на вміст небілкових тіолів кожного органа, зокрема, печінки та нирок (Соколик В.В., 2001). Активація ліпопероксидації, котра при цьому спостерігається (Соколик В.В., 2001, Шабі Б.К., 1999), відбувається за різними механізмами (Соколик В.В., 2001, Farina M. et.al., 2003, Christova T.Y. et.al., 2003). Відомо, що накопичення ТБК-активних продуктів під впливом HgCl2 переважно призводить до виснаження тіолової ланки АОЗ (Соколик В.В., 2001), а CoCl2 - викликає заміщення інших металів у молекулах, впливає на окисно-відновні реакції. У ході цього дослідження виявлені органні особливості змін вмісту активних до ТБК продуктів, зокрема, дані табл. 8 свідчать, що через 2 год вони накопичуються у печінці (CoCl2 і HgCl2), серці (CoCl2), нирках (CoCl2 і HgCl2), аорті (HgCl2). Зазначені залежні від органа та діючої речовини розбіжності у вмісті активних до ТБК продуктів могли зумовлюватись органотропністю цих сполук, особливостями жирнокислотного складу та активації систем АОЗ.

Таблиця 8. Вміст ТБК-активних продуктів органів щурів при уведенні солей важких металів та ПФ, нмоль/ мг ліпідів, Мm, n=6

* - Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05)

У разі же введення ПФ перед солями важких металів практично нормалізувалася концентрація ТБК-активних продуктів: у печінці, коли він вводився перед CoCl2, в аорті - коли перед HgCl2. Відсутність стабілізації вмісту ТБК- активних продуктів у нирках могла свідчити про більш значну ушкоджуючу дію досліджених речовин на цей орган, імовірно, завдяки тому, що тут не спрацьовував адаптаційний механізм за участю небілкових тіолів (Соколик В.В., 2001). Однак слід зазначити, що введення самого ПФ, як сторонньої для організму речовини, впливало на інтенсивність ПОЛ (Самохіна Л.М., Бондар Т.Н., Оксененко С.В., 2003, Оксененко С.В., Каліман П.А., 2003, Kaliman P.A., Oksenenko S., 2002). Це видно зі збільшення вмісту ТБК-активних продуктів у тканинах нирок, що може зумовлюватися значним функціональним навантаженням на них як орган виведення. Визначено, що коливання вмісту ТБК-активних продуктів корелює зі змінами рівня деяких ліпідних фракцій, зокрема із ЛФХ. Так визначено, що коефіцієнт кореляції Пірсона r, який складає 0,94 у печінці (CoCl2), має рівень значущості 0,057. Це підтверджує взаємозв'язок активації пероксидації ліпідів з одним з проявів ліпідної тріади пошкодження - накопиченням ЛФХ (Климов А.Н., 1999). Кореляційний зв'язок спостерігався і щодо вмісту ЗФЛ, саме таке було у серці при дії пентоксифіліну (r = 0,99, р<0,05).

При введенні CoCl2, HgCl2, CdCl2 активація пероксидації ліпідів спостерігалася також в окремих субклітинних фракціях.

Це підтверджується прикладом збільшення вмісту активних до ТБК продуктів у ядрах, мітохондріях, цитозолі печінки щурів як через 2 так і 24 год. Цей продукт пероксидації ліпідів у лізосомах накопичувався під впливом CdCl2, а у мікросомах цього не спостерігалося зовсім (табл. 9).

Таблиця 9. Вміст ТБК-активних продуктів у субклітинних фракціях печінки щурів при введенні солей важких металів, нмоль/ мг ліпідів, Мm, n=5

* - Вірогідні зміни порівняно з контролем (р0,05)

Встановлені подібні зміни у накопиченні ТБК-активних продуктів після введення HgCl2, CoCl2, CdCl2 у субклітинних фракціях печінки можуть зумовлюватися спільними рисами у їх механізмах дії, схожим субклітинним розподілом, із переважним накопиченням іонів у цитозолі, а далі - у ядрах, мітохондріях, лізосомах печінки (Войнар А.И., 1962). Визначено, що рівень ТБК-активних продуктів тут лише інколи корелював із вмістом ліпідів. Це, наприклад, стосується вмісту ЗФЛ, із яким концентрація ТБК-активних продуктів зв'язана із рівнем значущості 0,05. Так, коефіцієнт Пірсона r при дії CoCl2 у лізосомах складав - 0,94 (24 год).

Слід зазначити, що ці зміни ліпідного складу органоїдів, наприклад коливання рівнів ХС, ФЛ, арахідонової кислоти (С 20:4) і продуктів ПОЛ, можуть регулювати обмінні процеси організму, також впливаючи на фізичний стан мембран, що, як відомо, впливає на активність зв'язаних із мембранами ферментів (Зубчак В.М., 1999).

Висновки

1. У дисертації вирішено проблему відповіді ліпідного ланцюга метаболізму на дію сублетальних доз солей важких металів, а саме, хлоридів меркурію, кобальту, кадмію, шляхом визначення ліпідного складу та вмісту продуктів ліпопероксидації тканин функціонально різних органів, субклітинних фракцій печінки, сироватки крові щурів у динаміці. Виявлено вплив пентоксифіліну як профілактичного засобу від ушкодження, що розвивається на тлі дії вказаних солей. Описані у цьому дослідженні кількісні зміни розширюють існуючі уявлення як про організацію ліпідних компонентів у структурі клітин, так і про їх важливу функціональну роль.

2. Виявлено гіперхолестеролемічні властивості солей меркурію і кобальту, що видно з накопичення неетерифікованого холестеролу під впливом хлориду меркурію у нирках і серці (2 і 96 год), хлориду кобальту - у серці та артеріальній стінці (2 год). Гіперхолестеролемія більш виразна у стінці аорти, оскільки при дії цих солей виявляється також у перевантаженні її ефірами холестеролу (2 год). Ушкоджуючий вплив солей важких металів на тканини підтверджується накопиченням лізофосфатидилхоліну у серці та аорті при дії хлориду кобальту (2 год), у печінці, аорті - хлориду меркурію (2 год). Виявлена в умовах впливу солей важких металів зміна складу нейтральних ліпідів і фосфоліпідів частково гальмується попереднім введенням пентоксифіліну.

3. У реалізації відповіді на введення солей важких металів виявлена активна участь системи міжтканинного і внутрішньоклітинного ліпідного транспорту, зокрема фосфоліпідів. Як правило, під впливом хлоридів меркурію, кобальту, кадмію (2 і 24 год) зменшується концентрація загальних фосфоліпідів у сироватці крові, мітохондріях печінки, збільшується - у лізосомах цього органа. А під впливом хлоридів меркурію та кобальту (2 год) накопичуються загальні фосфоліпіди у тканині серця і нирок.

4. Зменшується співвідношення фосфатидилетаноламін/ фосфатидилхолін у мікросомах печінки під впливом хлоридів меркурію (2 і 24 год) та кобальту (24 год), і накопичується фосфатидова кислота у більшості субклітинних фракцій при дії хлоридів меркурію, кобальту, кадмію.

5. Хлориди меркурію, кобальту, кадмію впливають на перерозподіл холестеролу і його ефірів між субклітинними фракціями печінки, з переважним надходженням до лізосом, внаслідок чого знижується рівень ефірів холестеролу та його неетерифікованої форми у сироватці крові (2 і 24 год), мікросомах і цитозолі печінки (2 год), та спостерігається накопичення останньої у її лізосомах (2 і 24 год).

6. Встановлено, що хлориди важких металів модифікують склад вільних жирних кислот субклітинних фракцій печінки та сироватки крові, особливо знижується рівень арахідонової кислоти у сироватці крові під дією хлориду меркурію, у мітохондріях і лізосомах печінки - під дією хлоридів меркурію, кобальту, кадмію. Мікросоми та цитозоль печінки виявляють здатність накопичувати арахідонову кислоту під впливом хлоридів кобальту і кадмію. Ці ефекти спостерігаються і через 2, і через 24 год.

7. Показано, що хлориди меркурію, кобальту активують процеси ліпопероксидації у тканинах досліджених органів, що проявляється в накопиченні активних до тіобарбітурової кислоти продуктів, а саме під впливом хлориду меркурію у печінці, нирках, аорті, хлориду кобальту - у печінці, серці, нирках. Серед усіх субклітинних фракцій печінки найчутливішими до ліпопероксидації є ядра, мітохондрії, цитозоль. Встановлено кореляційний зв'язок зі змінами ліпідного складу. Застосування пентоксифіліну частково сприяє стабілізації процесів перекисного окислення ліпідів у тканинах досліджених органів.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Каліман П.А., Оксененко С.В. Вплив хлориду ртуті на вміст деяких ліпідів та продуктів їхньої пероксидації в окремих органах щурів// Укр. біохім. журн. 2002. - Т. 74, №4. - С.102-108. (Особисто автором отримано всі експериментальні дані, наведені в статті, обговорення результатів здійснено за участю наукового керівника).

2. Оксененко С.В. Вплив пентоксифіліну на метаболізм фосфоліпідів та перекисне окислення їх у печінці і нирках за оксидативного стресу, який спричинено введенням хлориду кобальту// Укр. біохім. журн. Матеріали VIII Укр. біохім. з'їзду. м. Чернівці. - 2002. - Т. 72, №4б, - С. 231.

3. Каліман П.А., Оксененко С.В. Вплив пентоксифіліну та хлориду ртуті на метаболізм ліпідів та їх пероксидацію в деяких органах щурів// Вісник проб. біол. та мед. - 2002. - №5. - С.71-80. (Особисто автором отримано всі експериментальні дані, наведені в статті, обговорення результатів здійснено за участю наукового керівника).

4. Самохіна Л.М., Бондар Т.Н., Оксененко С.В. Вплив пентоксифіліну на показники перекисного окислення ліпідів та вміст нітриту за умов інтоксикації хлоридом кобальту// Совр. пробл. токсикол. - 2003. - №4. - С. 51-54. (Особисто автором отримано експериментальні дані складу продуктів перекисного окислення ліпідів, обговорення результатів здійснено за участю кандидата біологічних наук, ведучого наукового співробітника Державної установи “Інститут терапії імені Л.Т.Малої АМН України” Самохіної Л.М.).

5. Оксененко С.В., Каліман П.А. Вплив пентоксифіліну на ліпідний спектр серця у щурів за умов введення циклогексиміду// Мед. хімія. - 2003. - Т. 5, №3. - С. 5-9. (Особисто автором отримано всі експериментальні дані, наведені в статті, обговорення результатів здійснено за участю наукового керівника).

6. Оксененко С.В., Каліман П.А. Метаболізм ліпідів та їх перекисне окислення при введенні пентоксифіліну та хлориду кобальту в деяких органах щурів// Мед. хімія. - 2003. - Т. 5, №2. - С. 21-27. (Особисто автором отримано всі експериментальні дані, наведені в статті, обговорення результатів здійснено за участю наукового керівника).

7. Оксененко С.В., Каліман П.А., Кобзар А.І. Жирні кислоти та фосфоліпіди субклітинних фракцій печінки щурів за умов введення хлориду кобальту// Вісник проб. біол. та мед. - 2004. - №1. - С.34-40. (Особисто автором отримано експериментальні дані складу фосфоліпідів, вміст вільних жирних кислот досліджувався разом із кандидатом біологічних наук, старшим науковим співробітником Державної установи “Інститут терапії імені Л.Т.Малої АМН України” Кобзарем А.І., обговорення результатів здійснено за участю наукового керівника).

8. Оксененко С.В., Каліман П.А. Пероксидація ліпідів та спектр ліпідів аорти щурів за умов введення хлоридів меркурію та кобальту. Можливі шляхи корекції пентоксифіліном// Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. - 2004. - Вип. 13. - С. 149-154. (Особисто автором отримано всі експериментальні дані, наведені в статті, обговорення результатів здійснено за участю наукового керівника).

9. Оксененко С.В., Кобзар А.І. Склад ліпідів та інтенсивність їх перекисного окислення у лізосомах печінки щурів за умов експериментального кадміозу// Біологія тварин. - 2004. - Т. 6, №1-2. - Р.152-156. (Особисто автором отримано експериментальні дані складу ліпідів та продуктів їх перекисного окислення, вміст вільних жирних кислот досліджувався разом із кандидатом біологічних наук, старшим науковим співробітником Державної установи “Інститут терапії імені Л.Т.Малої АМН України” Кобзарем А.І.).

10. Kaliman P.A., Oksenenko S. Effect of cycloheximide and pentoxyfilline on metabolism of neutral lipids and lipoperoxidation of rat's liver and kidneys// Annaales universitatis mariae curie-sklodowska. Lublin-Polonia. - 2002. - Vol. 15, №42. - Р. 453-456.

11. Оксененко С.В. Состояние липопероксидации в стенке аорты крыс при введении солей тяжелых металлов и циклогексимида// Материалы республиканской научно-практической конференции “Атеросклероз и атеротромбоз: новое в патогенезе, клинике, лечении”/ Под. ред. Л.Т. Малой. - Харьков.: Торнадо, 2001. - С. 87-88.

12. Оксененко С.В. Влияние хлорида ртути на уровень некоторых фракций липидов и процессы их перекисного окисления у крыс// Материалы республиканской научно-практической конференции молодых ученых “Достижения и перспективы развития терапии в канун XXI века”. - Харьков. - 2000. - С. 48-49.

13. Оксененко С.В., Загайко А.Л. Пероксидні модифікації ліпопротеїнів та деякі показники атерогенезу у щурів при оксидативному стресі, що викликаний введенням хлориду кобальту// Конф. молодих вчених "Актуальні проблеми фармакології та токсикології". Інститут фармакології та токсикології АМН України. - Київ.- Ліки. - №5. - 2000. - С. 28-29.

14. Оксененко С.В. Вплив пентоксифіліну та хлориду ртуті на метаболізм ліпідів та активність перекисного окислення ліпідів життєво важливих органів щурів// Материалы 4-й всеукраинской научно-практической конф. “Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов”/ АМН Украины. НИИ терапии и др./ Под. ред. Л.Т.Малой. - Харьков. 2002. - С. 240-241.

15. Спосіб контролю ефективності призначення пентоксифіліну: деклараційний патент України № 52021 А, МПК А 61К31152, G01№33/48/ Оксененко С.В., Самохіна Л.М., Каліман П.А. - №2001129240; Заявлено від 29.12.2001 р.; Опубл. 16.12.02 р., Бюл. №12. - 4 с.

16. Спосіб оцінки розвитку побічних ефектів пентоксифіліну: деклараційний патент України №54811 А, МПК А 61К31/52, G 01№33/48/ Самохіна Л.М., Оксененко С.В., Каліман П.А. - №2002043199; Заявлено від 18.04.2002 р.; Опубл. 17.03.03 р., Бюл. №3. - 5 с.

17. Оксененко С.В. Вплив пентоксифіліну на обмін фосфоліпідів нирок за умов розвитку оксидативного стресу в експерименті// Матеріали конференції “Прогресуючи нефропатії і ремоделювання серцевосудинної системи - сучасні уявлення про механізми розвитку, нове в діагностиці, лікуванні та профілактиці”. - Харків. - 2003. - С. 57-58.

18. Оксененко С. Експериментальні дослідження впливу пентоксифіліну на спектр загальних ліпідів та процеси ліпопероксидації у печінці та нирках за умов введення хлориду кобальту// Матеріали 7-го міжнародного медичного конгресу студентів та молодих учених. - Тернопіль: Укрмедкнига. - 2003. - С. 205.

19. Оксененко С.В. Спектр вільних жирних кислот за умов дії хлоридів кобальту та ртуті// Матеріали конференції “Вчені майбутнього”. - Одеса. - 2003. - С. 17.

20. Оксененко С.В., Каліман П.А., Кобзарь А.И. Влияние хлорида кобальта на свободные жирные кислоты печени крыс// Матеріали міждисциплінарної науково-практичної конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” - Ялта/ Харків: Українська Асоціація “Жінки в науці та освіті”, Харківський національний університет. - 2003. - С. 98.

21. Оксененко С.В. Ліпідний спектр та перекисне окислення ліпідів у щурів за окислювального стресу як фактор розвитку передчасного старіння // Тези доповідей 4-тої Української конференції молодих вчених, присвячена пам'яті академіка В.В. Фролькіса. - Київ: Інститут геронтології АМНУ. - 2003. - С.173-174.

22. Оксененко С.В. Влияние пентоксифиллина на липидный спектр аорты в условиях оксидативного стресса// Матеріали науково-практичної конференції “Атеросклероз та атеротромбоз: патогенез, клініка, лікування”. - Харків. - 2003. - С. 127.

23. Оксененко С.В. Влияние оксидативного стресса, вызванного хлоридами кобальта и ртути, на метаболизм липидов сердца// Матеріали наукових праць української науково-практичної конференції з міжнародною участю “Нові напрямки в діагностиці, лікуванні і профілактиці артеріальної гіпертензії та її ускладнень”. - Харків. - 2002. - С. 185-186.

24. Оксененко С.В. Спектр липидов субклеточных фракций печени крыс при введении хлорида ртути// Матеріалі конференции “Биология - наука XXI века. 7-ая Пущинская школа-конференция молодіх ученіх”. - Пущино. - 2003. - С. 358-359.

25. Оксененко С.В. Склад ліпідів у ядрах печінки щурів за умов дії хлориду кадмію// Тези доповідей “Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології”. - 2004. - С. 56.

26. Оксененко С.В. Ліпідний склад плазматичних мембран печінки щурів при дії хлориду кадмію// Матеріали 8-го міжнародного медичного конгресу студентів та молодих учених. - Тернопіль: Укрмедкнига. - 2004. - С. 146.

27. Оксененко С.В. Ліпідний...