Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

УДК 577. 27

БУДОВА І ФУНКЦІЇ НІКОТИНОВИХ АЦЕТИЛХОЛІНОВИХ РЕЦЕПТОРІВ В-ЛІМФОЦИТІВ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

СКОК Марина Володимирівна

Київ-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор, академік НАН України КОМІСАРЕНКО Сергій Васильович, Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, директор інституту, завідувач відділу молекулярної імунології,

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії;

доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України ВЕСЕЛОВСЬКИЙ Микола Сергійович, Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, завідувач відділу фізіології нейронних мереж;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник МІНЧЕНКО Олександр Григорович, Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, завідувач відділу молекулярної біології.

Провідна установа - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, лабораторія сигнальних каскадів клітин.

Захист відбудеться 3 липня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 2 червня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

АНОТАЦІЯ

Скок М.В. Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2006. імунний нікотин лімфоцит ганглія

Дисертацію присвячено дослідженню нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів у порівнянні з такими автономних гангліїв. Представлені дані мають важливе теоретичне значення для розуміння загальних механізмів функціонування та взаємодії імунної та нервової систем, холінергічної регуляції процесів кровотворення та впливу нікотину на імунні реакції. З'ясовано важливі структурні особливості нікотинових рецепторів, ідентифіковано їх головні субтипи в В-лімфоцитах і декількох автономних гангліях. Визначено, що вони регулюють формування репертуару і активацію В-лімфоцитів, впливаючи на експресію антиген-специфічних рецепторів та костимуляторних молекул CD40. Показано, що нікотинові рецептори, експресовані в ранніх мієлоїдних і еритроїдних попередниках клітин крові в кістковому мозку, регулюють дозрівання цих клітин. Виявлено, що автоантитіла проти нікотинових рецепторів можуть бути причиною зниження кількості цих рецепторів в крові деяких пацієнтів з хворобою Альцгеймера, що складає основу для розробки альтернативних методів діагностики цього захворювання.

Ключові слова: нікотиновий ацетилхоліновий рецептор, В-лімфоцити, антитіла, автономні ганглії, хвороба Альцгеймера.

АННОТАЦИЯ

Скок М.В. Структура и функции никотиновых ацетилхолиновых рецепторов В-лимфоцитов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, а именно, установлению их субъединичного состава и возможных функций в В лимфоцитах сравнительно с нейронами вегетативных ганглиев. Представленные данные имеют важное теоретическое значение для понимания взаимодействия и общих механизмов функционирования иммунной и нервной систем, холинергической регуляции процессов кроветворения и влияния никотина на иммунные процессы.

В процессе выполнения исследований создан уникальный инструмент - функционально активные антитела против фрагментов альфа и бета субъединиц никотинового рецептора, которые фактически являются селективными блокаторами разных его субтипов. Использование таких антител позволило выяснить важные структурные особенности рецептора, в частности, конформацию соответствующего антигенного фрагмента, локализацию центра связывания метилликаконитина, характер пост-трансляционных модификаций и роль структурных субъединиц в функционировании рецептора. С помощью антител были идентифицированы основные субтипы никотиновых рецепторов в нескольких вегетативных ганглиях и показано, что их состав отражает функциональную гетерогенность нейронов как внутри ганглия, так и между ганглиями разной локализации. Методом связывания антител и радиоактивных лигандов установлена экспрессия двух субтипов никотинового рецептора в В-лимфоцитах и в предшественниках клеток крови. В функциональных тестах in vitro показано, что эти рецепторы опосредуют стимулирующее действие никотина на пролиферацию трансформированных В-лимфоцитов. На моделях мышей, нокаутных по генам отдельных субъединиц никотинового рецептора, и химерных мышей, которые содержали лишь часть клеток крови нокаутных животных, установлено, что никотиновые рецепторы регулируют как развитие лимфоцитов в первичных лимфоидных органах, так и их активацию в иммунном ответе. В частности, показано, что активация никотиновых рецепторов способствует выживанию предшественников В-лимфоцитов в ходе негативного отбора и тем самым расширению до-иммунного репертуара их антигенных специфичностей. В зрелых В-лимфоцитах никотиновые рецепторы сдерживают активацию и гуморальный иммунный ответ. Молекулярный механизм такого влияния связан с регуляцией экспрессии антиген-специфичного рецептора и костимуляторной молекулы СD40. Установлено, что никотиновые рецепторы двух субтипов: a4(a5)b2 и a7(a5b4), - выполняют разные функции в лимфоцитах и, возможно, отвечают на ацетилхолин разного происхождения.

Исследование роли никотиновых рецепторов в процессах кроветворения показало, что лимфоциты - не единственные клетки, дифференцировка которых регулируется через эти рецепторы. Экспрессия рецепторов двух субтипов была найдена в клетках костного мозга, а отсутствие или десенситизация этих рецепторов нарушала образование и созревание ранних миелоидных и эритроидных предшественников клеток крови.

Никотиновые рецепторы были идентифицированы также на лейкоцитах периферической крови людей. Зафиксировано их снижение у части больных болезнью Альцгеймера, которая также сопровождается уменьшением количества подобных рецепторов в мозге. Найдено, что причиной снижения количества никотиновых рецепторов на клетках крови могут быть аутоантитела. Таким образом, впервые показано, что одним из патогенных факторов болезни Альцгеймера может быть аутоиммунная реакция. Обнаружение связи между болезнью, снижением числа рецепторов на клетках крови и наличием аутоантител создает возможность разработки альтернативных методов диагностики этого заболевания.

Полученные данные устанавливают молекулярную основу холинергической регуляции гемопоэза, иммунопоэза и активации лимфоцитов и свидетельствуют о важной роли ацетилхолина не-нейронального происхождения как медиатора при кооперации иммунокомпетентных клеток.

Ключевые слова: никотиновый ацетилхолиновый рецептор, В-лимфоциты, антитела, вегетативные ганглии, болезнь Альцгеймера.

SUMMARY

Skok M.V. Structure and functions of nicotinic acetylcholine receptors of B lymphocytes. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree by specialty 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

The thesis deals with the study of nicotinic acetylcholine receptors in B lymphocytes compared to the neurons of autonomic ganglia. The presented data helps to clarify the general mechanisms underlying functioning and interaction of nerve and immune systems, as well as cholinergic regulation of haemopoiesis and the effects of nicotine on immune reactions. The subunit composition of nicotinic receptors expressed in lymphocytes and in several autonomic ganglia has been identified. These receptors were shown to influence the antigen-specific repertoire of B lymphocytes and their activation during the immune response through B cell receptor and co-stimulatory molecule CD40. Nicotinic receptors expressed in the myeloid and erythroid blood cell precursors in the bone marrow regulate their maturation. Nicotinic receptors were found decreased in the blood leukocytes of some patients with Alzheimer disease due to the presence of autoantibodies that forms a basis for the development of alternative diagnostic tests of this disease.

Key words: nicotinic acetylcholine receptor, В lymphocytes, antibodies, autonomic ganglia, Alzheimer disease.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Життєдіяльність організмів вищих тварин базується на гармонійній взаємодії функціонально різних спеціалізованих систем. Прикладом є нервова та імунна системи. Нервові клітини здатні до електричного збудження, вони утворюються в ембріогенезі і посідають постійне місце в головному і спинному мозку, автономних гангліях і сплетіннях. Лімфоцити, напроти, утворюються постійно протягом життя, мігрують по організму і не обмінюються електричними сигналами. Лімфоцити експресують унікальні антиген-специфічні рецептори, різноманіття яких фактично відповідає різноманіттю антигенів навколишнього середовища. За своєю складністю імунна система наближається до нервової, яка теж генерує безліч типів відповіді на базі обмеженої кількості типів клітин. В ході досліджень, проведених в останні роки, було з'ясовано, що нервова і імунна системи тісно пов'язані між собою і з ендокринною системою, утворюючи функціональну нейро-імуно-ендокринну тріаду. Молекулярною основою такої взаємодії є рецептори і медіатори, які використовують спільно всі три системи. Так, нервові і імунні клітини мають рецептори до гормонів, нервові і ендокринні клітини - до цитокінів, продукованих лімфоцитами, а лімфоцити відповідають на медіатори нейронального походження, такі, як ацетилхолін, ендорфіни, енкефаліни, речовина Р, а також адреналін і норадреналін, і, відповідно, експресують рецептори до них. Вивчення таких рецепторів допомагає зрозуміти механізми взаємозв'язку нервової та імунної систем і спільні принципи їх функціонування.

Ацетилхолін продукується нервовими закінченнями холінергічних волокон, які інервують первинні лімфоїдні органи - тимус і кістковий мозок. На додаток, він синтезується самими лімфоцитами, тобто може бути їх ауто/паракринним регулятором. Дія ацетилхоліну на клітини опосередкована двома типами рецепторів: мускариновими і нікотиновими. Ми вибрали для своїх досліджень рецептор нікотинового типу, тому що саме такі рецептори опосередкують швидку синаптичну передачу в автономних гангліях, які також були об'єктом нашої уваги. Крім того, вони є провідниками дії на клітини нікотину, який потрапляє в організм людини при палінні тютюну, тому вивчення ролі цих рецепторів в життєдіяльності лімфоцитів фактично розкриває молекулярні механізми дії нікотину на імунну систему.

Нікотинові ацетилхолінові рецептори (нАХР) традиційно вивчали в м'язових клітинах, пізніше - в нейронах центральної і автономної нервової системи. За своєю будовою вони належать до суперродини іонних каналів, що відкриваються лігандами, і складаються із п'яти однакових (гомопентамери) або різних (гетеропентамери) субодиниць. В залежності від комбінацій субодиниць нАХР мають різну фармакологічну чутливість, іонну селективність і кінетичні характеристики каналу. В м'язових і нервових клітинах нАХР виконують електропровідні функції, сприяючи утворенню електричних потенціалів, і регулюють діяльність інших типів рецепторів.

В останні роки з'являється все більше даних про наявність нАХР в незбудливих тканинах: шкірі, епітелії дихальних шляхів, ендотелії судин та клітинах крові. На відміну від нервових і м'язових клітин, в незбудливих клітинах активація нАХР не призводить до електричного збудження, а регулює базові клітинні функції, такі, як проліферація, адгезія, міграція. Механізми функціонування нАХР в цих клітинах остаточно не з'ясовано.

Функціональне значення нАХР для імунних процесів підтверджується наявністю імунопатологій у людей і тварин, що вживають нікотин. На початку наших досліджень в літературі існували дані про наявність нАХР в Т-лімфоцитах і їх роль в імунних процесах, однак були практично відсутні відомості стосовно В-лімфоцитів, які є головними провідниками гуморального імунітету. Головним завданням нашої роботи стало визначити, чи присутні нАХР в В-лімфоцитах, схожі вони чи відрізняються від відповідних рецепторів нервових клітин і які функції виконують в імунній системі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України протягом 1995-2005 рр. Дисертація безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: „Дослідження імунохімічної структури антигенів і розвитку імунної відповіді до них” (1994 -1998), „Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів”, розділ ІІ „Вивчення будови та функцій нікотинових та протеазо-активованих рецепторів на лімфоцитах”, ДР № 0104U003280 (1999 - 2003, 2004 - 2008) та „Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики і лікування, розділ VIIІ - „Вивчення експресії нікотинових ацетилхолінових рецепторів на лімфоцитах і їхньої ролі в нормі та за патологічних умов”, ДР № 0102V006218 (2002 - 2006). Крім того, роботу було підтримано міжнародними програмами Європейського співтовариства: РЕСО (грант ERBCIPDCT940244): „Міастенія гравіс та моноклональні антитіла до ацетилхолінового рецептору”, підрозділ „Моноклональні антитіла до фрагментів нейронального нікотинового ацетилхолінового рецептору” (1995-1997); INTAS-Ukraine (грант 0056): „Роль структури функціонально важливих доменів в альфа-субодиницях різних нейрональних ацетилхолінових рецепторів, що визначають їх фармакологію та фізіологічне значення” (1997-2000); стипендії Олександра фон Гумбольдта (1998 - 1999), двох стипендій EMBO (ASTF 9656 та 9953) за темою „Вивчення лімфоцитів у мишей, нокаутних за генами альфа4, бета2 та альфа7 субодиниць нікотинового рецептору” (2000-2003) та Українсько-французької програми спільних досліджень „Дніпро” (договір М-115-2003) за темою „Структура і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів: потенційна роль нікотину в імунітеті і канцерогенезі лімфоцитів” (2003-2004), а також гранту УНТЦ-NASA (NN05) „Вплив мікрогравітації на клітини, що продукують антитіла” (2002-2003). Відповідно, частину досліджень було виконано дисертантом в лабораторії сигналингу лімфоцитів Інституту Генетики Університету м. Кьольн, Німеччина, та у відділі рецепторів і когніції Інституту Пастера в Парижі, Франція.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначення наявності, субодиничного складу та функцій нАХР в В-лімфоцитах.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- Створити інструмент для вивчення - одержати функціонально активні антитіла, специфічні до різних субодиниць нАХР.

- За допомогою отриманих антитіл визначити субодиничну будову нАХР в В-лімфоцитах та автономних гангліях різної локалізації.

- Вивчити властивості та можливі функції нАХР в клітинних лініях В-лімфоцитарного походження - мієломі та гібридомі.

- Вивчити характер експресії нАХР та їх роль в процесах розвитку і активації нормальних В-лімфоцитів.

- Вивчити роль нАХР в процесах кровотворення.

- Визначити значення нАХР, експресованого лейкоцитами периферичної крові, як потенційного діагностичного маркера при хворобі Альцгеймера.

Об'єкт дослідження. Нікотиновий ацетилхоліновий рецептор, експресований в нейронах автономних гангліїв та лімфоцитах.

Предмет дослідження. Субодинична будова та функції нАХР В-лімфоцитів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено експресію нАХР в В-лімфоцитах за допомогою радіоактивних лігандів і отриманих нами полі- та моноклональних антитіл, специфічних до певних субодиниць нАХР. Антитіла, отримані проти синтетичних пептидів, специфічно зв'язуються з відповідними ділянками різних субодиниць нАХР і блокують електропровідні функції нАХР в нервових клітинах, тобто, фактично, є селективними блокаторами різних за субодиничним складом субтипів нАХР.

Вивчено субодиничну будову нАХР В-лімфоцитів мишей. Показано, що як трансформовані, так і нормальні В-лімфоцити експресують нАХР a4(a5)b2 і a7(a5b4) субтипів. За своїми властивостями нАХР лімфоцитів схожі на рецептори нервових клітин: нікотин впливає на кількість рецепторів, представлених на мембрані, вони підлягають десенситизації за підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію, а передача сигналу всередину клітини потребує відкриття іонного каналу.

Вперше проведений порівняльний аналіз субодиничної будови нАХР В-лімфоцитів і нейронів автономних гангліїв. Показано, що головним субтипом нАХР верхнього шийного та інтракардіального гангліїв щура і нижнього брижового ганглію та підслизового сплетіння морської свинки є a3a5(b4), a4 -вмісні нАХР локалізовано переважно на нейронах спеціальної морфологічної будови, а експресія a7-вмісних нАХР суттєво відрізняється в гангліях різної локалізації, причому рецептори останнього субтипу можуть бути як гомомерними, так і гетеромерними, і виконувати регуляторні функції.

За допомогою одержаних моноклональних антитіл визначено амінокислотні залишки, критичні для утворення епітопу, а також будову відповідної ділянки нАХР. Показано, що фрагмент 181-192 a3 субодиниці нАХР у складі нативного рецептора має витягнуту конформацію.

Визначено роль нАХР в життєдіяльності клітинних ліній В-лімфоцитарного походження. Показано, що в клітинах гібридом активація нАХР стимулює проліферацію і опосередковано впливає на кількість продукованих антитіл.

Вперше визначено роль нАХР в розвитку нормальних В-лімфоцитів і розкрито механізм участі нАХР в формуванні репертуару їх специфічностей. Знайдено, що обидва субтипи нАХР сприяють виживанню нормальних В-лімфоцитів в кістковому мозку, обмежуючи процеси відбору і сприяючи розширенню імунного репертуару. Показано, що субтипи нАХР подібним чином опосередкують і розвиток Т-лімфоцитів в тимусі. На відміну, розмір популяцій зрілих Т- і В-лімфоцитів контролюється нАХР тільки a7 субтипу. Це дає підставу вважати, що саме рецептори субтипу a4(a5)b2 опосередкують нервову регуляцію імунопоезу, в той час, як a7-вмісні рецептори переважно відповідають на ацетилхолін не-нейронального походження.

Визначено роль нАХР В-лімфоцитів в регуляції імунної відповіді. Знайдено, що рецептори субтипу a4(a5)b2 стримують активацію зрілих В-лімфоцитів і, відповідно, обмежують гуморальну імунну відповідь. Молекулярний механізм такого впливу пов'язаний з регуляцією кількості антиген-специфічних рецепторів та костимуляторних молекул CD40. Таким чином, вперше показано, що експресія і активація нАХР пов'язані з експресією і функціонуванням головних активаційних молекул В-лімфоцитів.

Вперше показано роль нАХР в процесах кровотворення. Визначено, що як a7-, так і a4b2-вмісні нАХР експресовано на попередниках мієлоїдного і еритроїдного рядів клітин крові, причому, подібно до лімфоцитів, присутність a4b2 нАХР є характерною для ранніх стадій їх диференціювання, в той час, як зрілі форми експресують переважно a7-вмісні рецептори. Останні регулюють утворення і дозрівання попередників моноцитів і гранулоцитів, а нАХР b2-вмісного субтипу впливають на розвиток попередників клітин червоного ряду.

Вперше продемонстровано, що при хворобі Альцгеймера зменшується кількість нАХР в лейкоцитах периферичної крові і причиною такого зменшення можуть бути автоімунна відповідь на нАХР.

Практичне значення роботи. Одержані результати свідчать про те, що нікотинові рецептори відіграють важливу роль в процесах розвитку і активації В-лімфоцитів. Фактично, вони розкривають молекулярний механізм дії нікотину на утворення репертуару В-лімфоцитів і гуморальну ланку імунної відповіді. Згідно з отриманими даними, нікотин сприяє проліферації/виживанню попередників В-лімфоцитів, що розширює потенційний спектр їх специфічностей, але пригнічує продукцію сироваткових ІgG, тобто імунну відповідь на антигени оточення. Це означає, що паління тютюну знижує опір організму потенційним інфекціям на рівні В-лімфоцитів і одночасно сприяє автоімунним і В лімфопроліферативним захворюванням. Крім того, наші дані вперше показують, що нікотин, який потрапляє в організм при палінні, впливає на процеси кровотворення.

Практичне значення мають результати про те, що нейродегенеративне захворювання (хвороба Альцгеймера), для якого показано зниження кількості нАХР в мозку, супроводжується також зниженням кількості цих рецепторів на лейкоцитах периферичної крові. Це означає, що визначення нАХР на клітинах крові може бути не-інвазійним діагностичним тестом, а наявність автоантитіл проти нАХР в плазмі крові - одним із факторів ризику і, можливо, показником етіології хвороби Альцгеймера.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1995-2005 рр. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних літератури, проведено науковий аналіз експериментальних даних, сформульовано основні положення та висновки. Автором особисто одержані результати досліджень, що викладені у підрозділах 3.1, 3.5 - 3.7: 3.1 - в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, 3.5 - 3.7 - в Інституті Пастера в Парижі. Підрозділ 3.2 виконано у співробітництві з лабораторією макромолекулярної фізики та хімії Політехнічної школи м. Нансі, Франція (експерименти з двомірного ядерного магнітного резонансу з використанням отриманих автором антитіл проводив д-р Р.Вандерессе); підрозділ 3.3 - у співробітництві з відділом фізіології вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (цитохімічні дослідження з використанням отриманих автором антитіл проведено д-ром Л.Войтенко, електрофізіологічні - д-рами С.Войтенко, С.Глушаковим, О.Пурнинь, О.Коваль та О.Грігоровим); підрозділи 3.4 і 3.9 - у співробітництві з молодшим науковим співробітником Л.М.Коваль (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна); підрозділи 3.1.3 і 3.5.2 - з молодшим науковим співробітником О.Ю.Лихмус (Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна). В підрозділі 3.8 морфологічний аналіз відбитків кісткового мозку, селезінки і мазків крові, підготовлених автором, проведений доктором біологічних наук А.С.Зверковою (Інститут гематології та трансфузіології МОЗ України). Синтез пептидів нАХР був проведений співробітниками Еллінського Інституту Пастера (Афіни, Греція), відділу хімії Університету м. Іоанніни (Греція) і лабораторії нейропептидних рецепторів Інституту біоорганічної хімії ім. Шемякіна-Овчіннікова РАН (Москва, Росія), рекомбінантний екстраклітинний домен a4 субодиниці одержано з Еллінського Інституту Пастера. Зразки крові хворих на хворобу Альцгеймера і здорових людей відповідного віку надано доктором медичних наук Н.Ю.Бачинською (Інститут геронтології АМН України).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було оприлюднено на наукових семінарах Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (1999 - 2004 рр.), сесії Відділення молекулярної біології, біохімії, експериментальної та клінічної фізіології НАН України (2004 р.), VIII Українському біохімічному з'їзді (м. Чернівці, 2002 р.), Третій Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі, Крим, 2003 р.), Першому (Інагураційному) Українському з'їзді з клітинної біології (Львів, 2004 р.), а також на 17^th Summer Meeting on Molecular Biology “Immuno-Neuro-Endocrine Interactions”, ( Пенн Стейт, США, 1998 р.), 5^th IUBMB Conference on the Biochemistry of Health and Diseases, (Єрусалим, Ізраїль, 1998 р.), міжнародній конференції “Neuronal Nicotinic Receptors: From Structure to Therapeutics “, (Венеція, Італія, 1999 р.), John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology (Пущино, Росія, 2000 р., 2002 р.), 26^th European Peptide Symposium, (Монпельє, Франція, 2000 р.), Конференції “Membranes and Signaling”, (Київ, 2000 р.), ESN Conference on “Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders”, (Перуджа, Італія 2001), 4^th and 5^th Parnas Conferences (Вроцлав, Польща, 2002 р. і Київ, 2005 р.), 12^th International Congress of Immunology and 4^th Annual Conference of FOCIS, (Монреаль, Канада, 2004 р.), XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, (Сідней, Австралія, 2005 р.) та International Workshop “New Insights in Cell proliferation, Autophagy and Apoptosis: Fundamental and Medical Aspects”, (Одеса, 2005 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 39 друкованих праць, з них один підручник, статей в періодичних наукових спеціальних виданнях України, що включені в перелік, затверджений ВАК України, та міжнародних наукових журналах - 22, тез доповідей - 16 .

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 299 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури (14 підрозділів), експериментальної частини, що включає розділ „Матеріали і методи досліджень” (10 підрозділів), „Результати досліджень” (9 підрозділів) та „Обговорення результатів” (5 підрозділів), а також заключення, висновків, списку використаної літератури (359 найменувань), містить 13 таблиць, 88 рисунків, 256 сторінок основної текстової частини.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури детально висвітлено сучасні дані про структуру молекули та функції нАХР в центральній і автономній нервовій системі. Представлено дані щодо ролі нАХР в утворенні нікотинової залежності та в патогенезі нейродегенеративних захворювань. Також наведено дані про наявність і функції нАХР в незбудливих клітинах, включаючи Т-лімфоцити, і обґрунтовано доцільність досліджень, проведених в ході виконання дисертаційної роботи.

Матеріали і методи

Антитіла проти a і b субодиниць нАХР отримували шляхом імунізації кролів і мишей синтетичними фрагментами a3(181-192), a4(181-192), a5(180-191), a7(179-190), b2(190-200), b4(189-199), кон'югованими до гемоцианіну. Гібридоми одержували за описаною методикою (Harlow and Lane, 1989). Антитіла виділяли із сироватки крові та культуральної рідини афінною хроматографією на відповідних пептидах, імобілізованих на АН-сефарозі. Визначення специфічності та афінності антитіл проводили методом сорбційного імуноферментного аналізу (ІФА).

Цитохімічне забарвлення як щойно виділених, так і культивованих нейронів автономних гангліїв проводили антитілами проти субодиниць нАХР, які проявляли пероксидазним кон'югатом антитіл проти імуноглобулінів кроля або миші. Альтернативно, антитіла проти нАХР кон'югували з біотином, і їх зв'язування виявляли авідином, міченим ізотіоцианатом флуоресцеїну (ФІТЦ). Відповідно, клітини аналізували під світловим або флуоресцентним мікроскопом.

Електрофізіологічні дослідження. Мембранні струми та потенціали, викликані аплікацією ацетилхоліну, вивчали методом „петч-клемп” в конфігурації ціла клітина. Синаптичну відповідь в нейронах нижнього брижового ганглію вивчали подразнюючи пре-гангліонарний нерв прямокутними поштовхами деполяризуючого струму, відповідь оцінювали з використанням стандартної методики внутрішньоклітинного відведення потенціалів.

Експресію та субодиничний склад нАХР в лімфоцитах вивчали шляхом зв'язування радіоактивних лігандів: ³Н-епібатидину і ¹²⁵І-a -бунгаротоксину, - а також антитіл проти субодиниць нАХР. Нормальні В лімфоцити виділяли шляхом магнітного сортування. Зв'язування антитіл оцінювали за допомогою клітинного ІФА або протокової цитофлуориметрії.

Афінне виділення a4 субодиниці нАХР із мозку та селезінки щурів проводили на антитілах проти a4 субодиниці, імобілізованих на АН-сефарозі перйодатним способом. Вуглеводний склад виділеної субодиниці вивчали методом лектин-блотів з використанням біотинільованих лектинів, специфічних до вуглеводних залишків різної природи.

Культивування клітин проводили в поживному середовищі RPMI 1640 з додаванням 20 мМ L-глютаміну, 50 мкг/мл гентаміцину та 10% ембріональної сироватки теляти. Проліферацію клітин оцінювали підрахуванням кількості живих клітин в гемоцитометрі за допомогою трипанового синього або фотометричним методом, за включенням тріазолілу блакитного.

Мишей, нокаутних за генами a4, b2 та a7 субодиниць нАХР, утримували і аналізували в Інституті Пастера в Парижі. Химерних мишей одержували шляхом ін'єкції суміші клітин кісткового мозку мишей дикого типу і нокаутних в опромінених реципієнтів дикого типу. Співвідношення клітин різного походження у химерних мишей оцінювали за наявністю алотипічного маркеру Ly 5.1 або Ly 5.2. Розмір клітинних субпопуляцій в кістковому мозку, селезінці та тимусі мишей і експресію клітинних маркерів вивчали методом протокової цитофлуориметрії з використанням біотинільованих антитіл проти субодиниць нАХР, а також антитіл проти маркерів диференціювання лімфоцитів, мічених флуоресцентними барвниками.

Кількість сироваткових імуноглобулінв та природних антитіл, а також антитіл проти цитохрому с в сироватці крові мишей після імунізації визначали методом сорбційного імуноферментного аналізу, а кількість клітин, що продукують антитіла в селезінці, - методом імуноферментних відбитків на планшетах, вкритих відповідними антигенами або антитілами проти IgM та IgG.

Активацію В-лімфоцитів в культурі визначали за включенням ³Н-тимідину після додавання антитіл проти CD40. Збагачення популяції В-лімфоцитів проводили шляхом магнітного сортування на колонках Milteniy Biotech з використанням магнітних кульок, кон'югованих з антитілами проти маркерів CD43 (негативна селекція) або CD45R (B220) (позитивна селекція).

Лейкоцити периферичної крові людей виділяли центрифугуванням в градієнті щільності фіколу. Їх адсорбували в лунках полістирольних планшетів шляхом висушування при 37^оС і аналізували методом клітинного ІФА з антитілами проти субодиниць нАХР. Паралельно зразки плазми крові аналізували на наявність антитіл проти нАХР методом звичайного сорбційного ІФА, де як адсорбований антиген використовували рекомбінантний екстраклітинний фрагмент a4 субодиниці нАХР.

Отримання та характеристика антитіл проти синтетичних пептидів нАХР. Оригінальність нашого підходу полягала в тому, що антитіла повинні були поєднувати в собі високу селективність до гомологічних субодиниць нАХР і функціональну активність. Дизайн антигенних пептидів було проведено за відомою амінокислотною послідовністю a3, a4, a5, a7, b2 та b4 субодиниць нАХР щура. Для синтезу було обрано фрагменти альфа-субодиниць, які містили залишок цистеїну в положенні 192 (191 і 189 для субодиниць a5 і a7, відповідно) та залишок тирозину в положенні 190 (188 для субодиниці a7). За даними численних досліджень, ці залишки входять до складу сайту зв'язування ацетилхоліну. Фрагменти бета-субодиниць було обрано за гомологічним положенням в послідовності і, відповідно, розташуванням в будові нАХР.

З метою підвищення імуногенності синтетичні пептиди було кон'юговано до білкових носіїв: гемоцианіну равлика і бичачого сироваткового альбуміну, - за допомогою глютарового альдегіду. Цей метод кон'югації виявився кращим у порівнянні з використанням N-сукциніміділ 3-(2-піридилдітіо) пропіонату, оскільки забезпечував більшу щільність пептидних епітопів на поверхні білка та не викликав утворення антитіл проти сайту кон'югації. Миші і кролі, імунізовані кон'югатами пептид-гемоцианін, продукували антитіла, які зв'язували відповідний пептид, кон'югований до альбуміну, і не впізнавали пептиди гомологічних субодиниць. Потенціальну перехресну реактивність сироваткових антитіл було зведено до мінімуму після їх афінного очищення на імобілізованих пептидах.

Відповідно, моноклональні антитіла, отримані до фрагментів a3 і a5 субодиниць, впізнавали свої антигенні пептиди, але не фрагменти інших субодиниць.

Кролячі, афінно очищені антитіла проти пептидів бета-субодиниць також вибірково зв'язували свої антигенні пептиди і не впізнавали фрагментів інших субодиниць.

Зв'язування анти-пептидних антитіл з нативним нАХР на нервових клітинах. Щоб з'ясувати, чи зв'язуються антитіла, отримані проти пептидних фрагментів, з нативним рецептором, було використано клітини феохромоцитоми РС-12, а також культивовані клітини автономних гангліїв, які експресують нАХР різних субтипів. Методом протокової цитофлуориметрії було показано, що клітини РС-12, які, як відомо із літературних джерел, експресують a3, a5 та a7 субодиниці нАХР, зв'язували антитіла проти пептидів a3(181-192), a5(180-191), a7(179-190) і не зв'язували антитіла проти пептиду a4(181-192).

Культивовані клітини верхнього шийного ганглію щура, які також експресують a3, a5 та a7 субодиниці, демонстрували позитивне забарвлення в цитохімічних експериментах з мАт 1D6, мАт 1Е10 та кролячими антитілами проти пептиду a7 субодиниці. На відміну, антитіла проти фрагменту a4(181-192) мітили клітини, які за своїми морфологічними ознаками відрізнялись від нейронів, позитивних за міткою інших антитіл.

Оскільки антитіла було отримано проти фрагменту, який містив елементи сайту зв'язування ацетилхоліну, ми очікували, що вони будуть конкурувати з ацетилхоліном і зменшувати його вплив на клітини. Дійсно, мАт 1D6 дозозалежно знижувало амплітуду струмів, індукованих ацетилхоліном, в недисоційованих нейронах верхнього шийного ганглію щура; ефект розвивався досить швидко і був майже не оберненим. Послідовне додавання антитіл проти фрагментів різних субодиниць викликало додаткове зменшення амплітуди мембранного струму кожним наступним антитілом.

Ці дані свідчили на користь того, що антитіла, отримані проти пептидних фрагментів нАХР, впізнають нативний рецептор, експресований на нервових клітинах, розрізняють субодиниці рецептору і, завдяки своїй функціональній активності, фактично є селективними блокаторами різних субтипів нАХР. Такий висновок дозволив нам використати ці антитіла для вивчення особливостей будови рецептору як такого, а також субодиничного складу нАХР в нейронах автономних гангліїв і лімфоцитів.

Особливості будови нАХР, з'ясовані за допомогою антитіл проти пептидів альфа- і бета-субодиниць. Дослідження взаємодії моноклональних антитіл 1D6 та 1Е10 з похідними пептидів a3(181-192) і a5(180-191), в яких амінокислотні залишки почергово заміщали на залишки аланіну, дозволило визначити залишки, що утворюють епітоп. В пептиді a3(181-192) найбільш важливими для зв'язування антитілом 1D6 виявились залишки His-6 (186), Pro-2 (182) та Asn-11 (191). В пептиді a5(180-191) до складу епітопу увійшли залишки Lys-5(184), Thr-9(188), Arg-8(187) та Ser-11(190). Таким чином, для обох вивчених пар пептид-антитіло критичні для зв'язування амінокислотні залишки знаходились в центральній частині пептиду. Конформацію пептиду a3(181-192) в присутності антитіла 1D6 було вивчено методом двомірного ядерного магнітного резонансу. Як показано на рис.5, антитіло стабілізувало пептид у витягнутій конформації, причому С-кінцева частина була більш жорсткою, ніж N-кінець. Було зроблено висновок, що принаймні залишки 6-11 (186-191) пептиду знаходяться у безпосередньому контакті з антитілом. Це співпадало із даними вивчення похідних пептидів, а також із знаходженням імунодомінантних залишків пептиду a5(180-191).

Оскільки антитіла впізнавали пептид a3(181-192) у складі нативного рецептору, було припущено, що відповідний фрагмент нАХР також має витягнуту конформацію. Це припущення знайшло підтвердження у зробленому згодом рентгенструктурному аналізі ацетилхолін-зв'язуючого білка молюска Limnea stagnalis, який є аналогом позаклітинного домену нАХР. Згідно із моделлю, створеною на основі цього аналізу, фрагмент a3(181-192) входить до складу стрічки b9 і дійсно має витягнуту вторинну і третинну будову (Brejk et al., 2001).

На препаратах підслизового сплетіння морської свинки зв'язування антитіл проти фрагменту a7(179-190) в цитохімічних експериментах блокувалось метиллікаконітином - специфічним блокатором a7-вмісних нАХР. Це дозволило дійти висновку, що сайт зв'язування метиллікаконітину включає амінокислотні залишки фрагменту a7(179-190).

Важливим результатом, отриманим в електрофізіологічних дослідженнях, була здатність антитіл проти фрагментів a5 і b4 субодиниць блокувати мембранні струми, індуковані ацетилхоліном, і пост-синаптичні потенціали, викликані подразненням пре-гангліонарного нерва. Ці субодиниці не містять сайтів зв'язування ацетилхоліну, а a5 субодиниця навіть не є сусідньою з цим сайтом. Функціональну активність антитіл в цьому випадку можна було пояснити лише обмеженнями, які зв'язування антитіла накладало на конформаційні зміни, що відбуваються при активації рецептору. Як витікає із структурних моделей функціонування нАХР, при відкритті іонного каналу всі п'ять субодиниць пентаметру повертаються проти годинникової стрілки, в результаті чого діаметр центральної пори збільшується. Блокувальна активність антитіл проти структурних субодиниць, виявлена в наших експериментах, свідчить про важливість цих субодиниць в функціонуванні рецептору і підтверджує гіпотезу про різні конформаційні стани нАХР в процесі відкриття каналу.

Вуглеводний компонент і його роль для утворення нативної конформації нАХР. Нікотиновий рецептор має декілька потенційних сайтів N- і О-глікозилювання в N-кінцевому позаклітинному домені a субодиниць, де знаходяться також сайти зв'язування агоністів та конкурентних антагоністів (Paterson and Nordberg, 2000). Дані про вуглеводний склад нейрональних нАХР в літературі відсутні. Між тим, саме пост-трансляційні модифікації могли б визначати особливості функціонування нАХР одного й того ж підтипу в нервовій та імунній системах. Тому ми поставили завдання порівняти склад вуглеводних залишків в a4 субодиниці нАХР, виділеній із мозку або селезінки щурів. Дослідження показали, що у складі a4-субодиниці нАХР знаходяться залишки галактози і N-ацетилгалактозаміну, глюкози і N-ацетилглюкозаміну, манози і фукози, приєднані до поліпептидного ланцюга N-глікозидними зв'язками, а також залишки галактози, приєднані О-глікозидним зв'язком. В імуноблотінгу визначаються дві ізоформи a4-субодиниці, що відрізняються за складом вуглеводних залишків і, вірогідно, відповідають різним ступеням пост-трансляційних модифікацій. Оскільки залишки галактози (N-ацетилгалактозаміну) визначались в обох ізоформах, можна вважати, що саме вони першими приєднуються до аспарагінових залишків білкового ланцюга. Пізніше галактозні компоненти ускладнюються залишками глюкози, манози і фукози. Таким чином, ми вперше визначили якісний склад вуглеводних залишків, що входять до складу a4-субодиниці нАХР, і продемонстрували наявність О-глікозилювання цього білка. Очевидно, що немає суттєвої різниці в якісному складі вуглеводів, які глікозилюють a4-субодиниці із мозку і селезінки. Можливо, різниця виявляється у кількісному співвідношенні вуглеводних залишків, але з'ясування цього питання потребує більш детальних досліджень.

Будова і розташування нАХР на нейронах автономної нервової системи. Використання отриманих нами антитіл в імуноцитохімічних та електрофізіологічних експериментах дозволило визначити субодиничний склад і особливості розташування нАХР на нейронах декількох автономних гангліїв: верхнього шийного та інтракардіального гангліїв щура і нижнього брижового ганглію та підслизового сплетіння кишківника морської свинки. Найбільш поширеними в усіх гангліях виявились a3-, a5- і a7-субодиниці, для нижнього брижового ганглію було також визначено наявність b4-субодиниці. Ці дані було підтверджено електрофізіологічними дослідженнями: антитіла, які зв'язувались з нейронами певних гангліїв, були здатні модулювати мембранні струми, індуковані ацетилхоліном, або збуджуючі пост-синаптичні потенціали, викликані подразненням пре-гангліонарних нервів. Було з'ясовано, що нейрони всередині ганглію і між гангліями різної локалізації відрізнялись за своїми морфологічними ознаками і, відповідно, експресували різні набори нАХР. Зокрема, субодиничний склад нАХР великих (діаметром близько 50 мкм) гангліонарних нейронів відрізнявся від такого в дрібних (6-18 мкм) клітинах. В верхньому шийному і інтракардіальному гангліях дрібні клітини зв'язували антитіла проти a4-субодиниці, в нижньому брижовому ганглії - антитіла проти a4- і a7-субодиниць.

Послідовна аплікація антитіл проти різних субодиниць в цитохімічному пофарбуванні і в електрофізіологічних дослідженнях дозволила визначити взаємне розташування цих субодиниць на клітині. Так, всі клітини верхнього шийного ганглію несли подвійну мітку при використанні пар антитіл проти пептидів a3, a5 і a7 субодиниць. Це означало, що відповідні субодиниці входять до складу різних рецепторів, розташованих досить далеко один від одного, або знаходяться у складі одного рецептору, але з різних боків пентаметру, як, наприклад, a3 і a5 субодиниці. Однак послідовне використання пари антитіл проти a3- і a5-субодиниць в електрофізіологічних експериментах показало, що вони дають додатковий ефект. Це означало, що субодиниці входять до складу різних рецепторів, тобто є рецептори, що містять a5-субодиниці, але не містять a3-субодиниці. За нашими даними, a5-субодиниця могла входити до складу гетеромерного рецептору a7a5. В нейронах підслизового сплетіння морської свинки, напроти, послідовна аплікація антитіл проти a3- і a5-субодиниць не давала додаткового ефекту в електрофізіологічних дослідженнях. Це ясно вказувало на те, що в цих клітинах a3- і a5-субодиниці об'єднані в один головний субтип рецептору. Подвійне забарвлення антитілами проти a5- і a7- субодиниць у комбінації з метиллікаконітином виявило в нейронах підслизового сплетіння наявність трьох субтипів нАХР: гетеромерного a3a5 (подвійна мітка для a5- і a7-специфічних антитіл, низька чутливість до МЛА); гомомерного a7 (подвійна мітка для a5- і a7-специфічних антитіл, висока чутливість до МЛА) і гетеромерного a7a5 (конкуренція антитіл проти a5- і a7-субодиниць, висока чутливість до МЛА). Таким чином, в нейронах підслизового сплетіння морської свинки вперше було показано наявність гетеромерних a7- вмісних нАХР, які раніше було визначено у верхньому шийному (Cuevas and Berg, 1998) і інтракардіальному (Kirchgessner and Lin, 1998) гангліях щура за їх фармакологічною чутливістю та швидкістю десенситизації.

Широкий спектр знайдених субтипів нАХР, природно, ставив питання про доцільність такого різноманіття і функції окремих субтипів. За літературними даними, вони відрізняються за своїми кінетичними властивостями і фармакологічною чутливістю, але знайти зв'язок між субтипами нАХР і фізіологічними функціями, які вони опосередковують, досі не вдається. Використання нашого експериментального підходу, який об'єднував структурний і функціональний аналіз, дозволило зрозуміти деякі деталі функціонування певних субтипів нАХР в автономних гангліях.

По-перше, ми показали, що один і той самий нейрон ганглію, як правило, експресує декілька субтипів нАХР. Використання в функціональних тестах блокувальних антитіл, специфічних до різних субодиниць нАХР, дозволило нам визначити внесок кожного субтипу в загальну клітинну відповідь. Так, у верхньому шийному ганглії максимальне пригнічення амплітуди мембранних струмів, індукованих ацетилхоліном, викликали антитіла проти a7-субодиниці (до 80%), тобто очевидно, що a7-вмісний субтип нАХР був головним в реалізації мембранної провідності під дією ацетилхоліну в цьому ганглії. Натомість, в підслизовому сплетінні a7-специфічні антитіла пригнічували мембранні струми всього на 24%, а головним субтипом був a3a5, який відповідав за 60-65% провідності. В нижньому брижовому ганглії суперфузування препарату розчином, що містив суміш a3- і a5-специфічних антитіл, повністю усувало синаптичні відповіді нейронів, тобто синаптичну передачу було опосередковано виключно a3a5 субтипом нАХР. Додавання ж до розчину антитіл проти a7 субодиниці або метиллікаконітину - специфічного блокатору a7-вмісних нАХР - призводило до збільшення синаптичної відповіді! При цьому, як зазначалось вище, a7 субодиниця була представлена не на головних гангліонарних нейронах, від яких проводили реєстрацію відповіді, а на дрібних клітинах, які оточували великі нейрони. Це означало, що в нижньому брижовому ганглії a7-вмісні нАХР локалізовані поза-синаптично і їх блокування призводить до полегшення синаптичної передачі, тобто в фізіологічних умовах такі рецептори виконують гальмівну роль.

Отримані нами дані свідчать про те, що кожен із обстежених гангліїв має індивідуальний склад нейронів і, відповідно, набір нАХР. Загальним для всіх гангліїв є присутність субтипу a3a5(b4). Найбільші розбіжності стосуються a4- і a7-вмісних нАХР, які часто локалізовані на окремих типах клітин. Навіть в межах одного ганглію внесок окремих субодиниць суттєво різнився від нейрону до нейрону, що вказувало на функціональну гетерогенність нейронів всередині ганглію. Представлені дані дають підставу вважати, що кожний субтип нАХР має спеціальне функціональне навантаження і набір експресованих субтипів певним чином відображає функціональні особливості нейронів і гангліїв.

Автономні ганглії є „проміжними станціями”, що передають сигнали від центральної нервової системи до периферичних органів: гладеньких м'язів і залоз. Фактично, нАХР отримують сигнали від пре-гангліонарних нервів і трансформують їх для подальшого проходження до органів-мішеней. При цьому кожен нейрон отримує декілька пре-гангліонарних входів, а із одного ганглія, як правило, виходить декілька нервів до різних за природою органів: судин, стінок кишок або залоз. Результати наших досліджень показують, що молекулярною основою гетерогенності пре-гангліонарної інервації та функціональної пост-гангліонарної активності може бути спектр субтипів нАХР, представлених на індивідуальних нейронах в межах одного ганглію. З нашої точки зору, набір нАХР у певному нейроні (ганглії) залежить від джерела пре-гангліонарної інервації. Здається вірогідним припустити, що набір субтипів нАХР, представлених в ганглії, є подібним до такого у відділі центральної нервової системи, із якого походять нейрони цього ганглію і із якого вони отримують сигнали.

По відношенню до головної мети роботи, результати, отримані на нейронах автономних гангліїв, мають важливе порівняльне значення. Вони демонструють, що на одній клітині може бути представлено декілька субтипів нАХР, які виконують різні функції. Вони також дають змогу припустити, що субтипи нАХР, представлені на лімфоцитах, певною мірою залежать від інервації імунних органів.

Субтипи нАХР, представлені в В-лімфоцитах. Ми вивчили субтипи нАХР В-лімфоцитів двома методами: шляхом зв'язування радіоактивних лігандів і специфічних антитіл. Як нормальні В-лімфоцити, так і пухлинні клітини В-лімфоцитарного походження зв'язували ³Н-епібатидин (селективний агоніст гетеромерних нАХР) і ¹²⁵І- a-бунгаротоксин (специфічний блокатор м'язових і a7-вмісних нАХР). При цьому кількість центрів зв'язування епібатидину була однаковою у нормальних В-лімфоцитів і клітин мієломи (12,200 ± 3,200 і 10170 ± 1100, відповідно), а кількість центрів зв'язування a-бунгаротоксину - вдвічі більшою у пухлинних клітин, які постійно діляться (6,730 ± 370), ніж у нормальних В-лімфоцитів, що знаходяться у спокої (3,130 ± 750). Це дало нам підставу вважати, що присутність нАХР, які зв'язують a-бунгаротоксин, певним чином пов'язана з проліферативними процесами в клітинах. Використання специфічних антитіл показало, що як нормальні, так і малігнізовані В-лімфоцити експресують переважно a4-, a7- і b2- субодиниці.

Аналіз даних функціональних тестів та літературних даних про дозволені сполучення субодиниць свідчив, що вони можуть бути поєднані в комбінаціях (a4)₂(b2)₃ і (a7)₅. Таким чином, подібно до нейронів автономних гангліїв, В-лімфоцити експресували різні субтипи нАХР. Хоча з лімфоцитами ми не проводили подвійного забарвлення, зв'язування антитіл з гомогенними клітинами гібридом і очищеними популяціями нормальних В-лімфоцитів свідчить про те, що в одній клітині експресовані обидва субтипи. І лімфоцити, і нейрони гангліїв експресували a7-вмісні нАХР. З іншого боку, в лімфоцитах ми не знайшли a3a5b4-субтипу рецептору, який є найбільш характерним для автономних гангліїв. Натомість, було знайдено a4b2-вмісний субтип, який є головним в центральній нервовій системі і, за нашими даними, зустрічається на окремому морфологічному типі нейронів автономних гангліїв. На відміну від автономних гангліїв, в мозку нАХР не задіяні в електричній відповіді нейронів, а регулюють здебільшого діяльність інших (наприклад, допамінових) рецепторів. a7-вмісні нАХР також часто локалізовані поза-синаптично (як в нижньому брижовому ганглії) і виконують регуляторну роль. Оскільки електричну відповідь лімфоцитів на нікотинові агоністи не зафіксовано, доцільним було припустити, що знайдені нами субтипи нАХР виконують регуляторні функції. Тому перш за все ми вивчили вплив нікотину на життєдіяльність В-лімфоцитів.

Роль нАХР в регуляції проліферації лімфоцитів. Нікотин, присутній в культурі клітин гібридоми протягом 4-5 днів, сприяв їх проліферації.

Напроти, a-кобратоксин і „слабкий токсин”, які є конкурентними антагоністами a7-вмісних нАХР, пригнічували проліферацію клітин гібридоми і підвищували кількість секретованих ними антитіл. Цього не відбувалося під дією нейротоксину 2, який переважно блокує нАХР м'язового типу. При цьому продукція антитіл зменшувалась під дією нікотину і збільшувалась під дією токсинів. Оскільки для клітин гібридоми існує дві можливості: поділ або секреція антитіл, - отримані результати означали, що a7-вмісні нАХР приймають участь в регуляції проліферації цих клітин. Пряме визначення кількості антитіл, зв'язаних в клітинному ІФА, показало, що клітини гібридоми, які вийшли із клітинного циклу і міцно прикріпилися до дна культурального флакону, містили значно менше a4- і a7-вмісних нАХР, ніж клітини, що інтенсивно ділилися.