Структурно-функціональна організація політенних хромосом Drosophila Melanogaster meig. у звязку з ефектом гетерозису, ізогенізацією та впливом щільності культури

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Структурно-функціональна організація політенних хромосом Drosophila Melanogaster meig. у зв?язку з ефектом гетерозису, ізогенізацією та впливом щільності культури

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Однією з актуальних задач сучасної генетики є з'ясування механізмів дії несприятливих факторів на генному та хромосомному рівні. Ця проблема піддається ретельному дослідженню [Маркель А.Л., Бородин П.М., 1990; Parsel D., Lindquist S., 1993; Раушенбах И.Ю. и др., 2001; Хлебодарова Т.М., 2002; Грунтенко Н.Е. и др., 2004], але багато питань залишаються невирішеними. У даному аспекті особливості структурно-функціональної організації інтерфазних хромосом вивчені недостатньо.

Одним із розповсюджених екологічних стресових факторів, що діють у природних умовах та у значній мірі визначають індивідуальне пристосування організмів є висока щільність популяції [Раушенбах И.Ю., 1990]. Особливо значущим для розуміння генетичних механізмів дії та адаптації до цього фактора є дослідження показників активності ядерного геному. Наявні дані з цього питання щодо ступеня політенії й транскрипційної активності генів, отримані на модельному об'єкті - Drosophila melanogaster, неповні та суперечливі [Беляева Е.С., Жимулев И. Ф, 1974; Рарог М.А. и др., 1999].

Як відомо, генотип є провідним чинником, що визначає пристосованість організмів. З цього погляду актуальним як у теоретичному, так і в практичному плані є дослідження дії інбридингу, гібридизації та ізогенізації хромосом, як процесу одержання гомозиготних диплоїдів, на хромосомному рівні. Гетерозис привертає до себе увагу дослідників як потужний резерв підвищення неспецифічної стійкості та поліпшення інших господарсько корисних ознак організмів [Шахбазов В.Г., 2001; 2003]. Перехід до ізогенних ліній значно підвищує ефективність генетичних досліджень та дозволяє вирішити цілий ряд теоретичних і практичних задач селекції. Незважаючи на тривалий період вивчення цих явищ, багато питань залишаються недостатньо з'ясованими, що перешкоджає більш планомірному їх використанню у практичній селекції. Значною мірою це стосується розвитку теоретичних уявлень щодо генетичних механізмів впливу ізогенізації хромосом, диференційної стійкості генотипів, ефекту гетерозису і модифікації його проявів залежно від дії стресових факторів. У зв'язку з означеним значний науковий інтерес представляє дослідження особливостей структури та функціональної активності політенних хромосом слинних залоз, зокрема пуфової активності, ступеня політенії, гомологічної й негомологичної кон'югації гігантських хромосом, у інбредних ліній і гібридів дрозофіли в умовах різної щільності культури та при ізогенізації хромосом.

В умовах дії несприятливих факторів, крім вивчення модифікаційної мінливості, окремий інтерес становить також дослідження мутаційних процесів, враховуючи їх внесок у формування спадкової мінливості. Зокрема, доцільним і новим є визначення впливу щільності культури і генотипу дрозофіли на нерівну гомологічну рекомбінацію - процес, що має суттєве еволюційне значення [Betrбn E., Long M., 2002; Jelesko J.G. et al., 1999].

Зв?язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукової тематики відділу генетики науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і є складовою тем «Дослідження дії іонізуючого і неіонізуючого випромінювання на геном і механізмів стресового та антистресового впливу» за номером держреєстрації 0103U004274 (2003-2005) та «Вивчити генетичні, фізіологічні та біофізичні механізми і прояви ефекту гетерозису у рослин і тварин» за номером держреєстрації 0103U004270 (2003-2005).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідження структурно-функціональних особливостей хромосом і прояву адаптивно важливих ознак у D. melanogaster у зв'язку з ефектом гетерозису, ізогенізацією і щільністю культури.

Виходячи із загальної мети роботи, були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити прояв адаптивно важливих ознак дрозофіли та експресивності ознаки Bar залежно від генотипу і щільності культури.

2. Оцінити розходження за ступенем політенії й активністю пуфіювання гігантських хромосом у особин інбредних ліній і гібридів F₁ дрозофіли в умовах різної щільності культури.

3. Виявити особливості гомологічної і негомологічної кон'югації політенних хромосом у інбредних ліній і гібридів F₁ дрозофіли.

4. Вивчити прояв адаптивно важливих ознак дрозофіли та експресивності ознаки Bar за умов ізогенізації хромосом 2 і 3.

5. Визначити вплив ізогенізації на ступінь політенії і пуфову активність гігантських хромосом у дрозофіли.

6. Дослідити показники мутаційного процесу в умовах різної щільності культури, а також при ізогенізації хромосом: частоту виникнення нерівного кросинговеру в локусі Bar, частоту домінантних летальних мутацій (ДЛМ).

Об'єкт дослідження - структурна організація і функціональна активність хромосом дрозофіли в залежності від генотипу та щільності культури;

Предмет дослідження - пуфова активність, ступінь політенії (СПХ), ектопічна кон'югація, спонтанний асинапсис політенних хромосом, нерівна гомологічна рекомбінація, домінантні летальні мутації, теплостійкість імаго, вихід імаго, маса тіла імаго, яйцепродукція, експресивність ознаки Bar у D. melanogaster;

Методи дослідження - генетичний аналіз, метод давлених ацетоорсеїнових препаратів політенних хромосом, цитоморфометричний метод, методи визначення пристосованості ліній і гібридів F₁, математичний аналіз отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Результати дослідження впливу перенаселення культури, ефекту гетерозису та ізогенізації хромосом на ступінь політенії, пуфову активність, гомологічну і негомологічну кон'югацію політенних хромосом, частоту домінантних летальних мутацій та частоту нерівної гомологічної рекомбінації є новими і важливими для розуміння генетичних механізмів дії наведених чинників на хромосомному рівні.

Вперше встановлено зниження ендореплікативної й пуфової активності політенних хромосом у інбредних ліній і гібридів F₁ дрозофіли за умов перенаселення культури. Показана залежність виявлених ефектів від генотипу мух. Встановлено позитивну кореляцію показників СПХ та пуфової активності в ряді локусів з виходом імаго, масою тіла імаго, теплостійкістю особин (r = 0,71 - 0,78) і негативну кореляцію між СПХ і частотою пізніх домінантних летальних мутацій (r = - 0,82).

Для лінії Oregon-R виявлено цитологічний маркер - ектопічний контакт між районами 100F і 92EF хромосоми 3R. Показано генотипічні розходження за показниками ектопічного спарювання і частотою асинапсису в районі ектопічного спарювання в інбредних ліній і гібридів F₁ дрозофіли. Встановлено наявність позитивної кореляції між частотою ектопічних контактів у досліджуваному районі хромосоми 3R і активністю пуфінгу в локусі 93D (r = 1), а також збільшення частоти асинапсису гомологів хромосоми 3R за наявності ектопічного контакту. Отримані дані свідчать про розходження просторової організації хромосом інтерфазного ядра інбредних ліній і гібридів F₁ дрозофіли, що може бути однією з причин гетерозису.

Вперше досліджено вплив ізогенізації на ендореплікативну та пуфову активність політенних хромосом дрозофіли. Показано негативний ефект даного чинника на показник ступеня політенії. Активність пуфіювання за умов ізогенізації переважно знижувалася, однак в ряді локусів виявлено відсутність зміни пуфової реакції та її посилення в одному з локусів.

У роботі вперше отримано дані про зміну показників мутаційного процесу за умов личинкового перенаселення і при ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли, таких як частота нерівної гомологічної рекомбінації в локусі Bar і частота ДЛМ.

Практичне значення одержаних результатів. Інбридинг і гетерозисна гібридизація - надзвичайно ефективні генетичні засоби зміни пристосованості і продуктивності організмів, які широко застосовуються у практичній селекції. Отримані в дисертаційній роботі дані свідчать про залежність проявів гетерозисного ефекту від щільності культури, що вказує на необхідність урахування цього фактора в селекції з використанням ефекту гетерозису.

Мутація Bar є зручною моделлю для дослідження нерівної гомологічної рекомбінації і може бути використана для розробки нового методу оцінки мутагенної дії екзогенних та ендогенних чинників.

Результати проведених досліджень використовуються у навчальному процесі кафедри генетики і цитології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину і статистичну обробку отриманих результатів. Аналіз отриманих даних проведено разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, наявні в дисертації, доповідалися на конференції молодих учених, аспірантів і студентів з молекулярної біології і генетики (Київ, 2003), на VI з'їзді українського ентомологічного товариства (Біла Церква, 2003), на конференції молодих учених «Актуальні проблеми біології в дослідженнях молодих учених Харківського національного університету» (Харків, 2003), на третьому з'їзді генетиків і селекціонерів Росії «Генетика в ХХІ веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на установчому з'їзді українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), VIII міжнародній науковій екологічній конференції «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Бєлгород, 2004), на науковій ентомологічній конференції «Загальна і прикладна ентомологія в Україні» (Львів, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 друкованих праць: 5 статей у наукових фахових журналах і 7 тез.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота містить такі розділи: вступ, огляд літератури, об'єкти та методи дослідження, результати досліджень і їх обговорення, узагальнення, висновки, список цитованої літератури та додатки. Дисертацію викладено на 165 сторінках і проілюстровано 10 рисунками, 10 таблицями та 35 мікрофотографіями. Бібліографічний список складає 230 ждерел, з яких 86 іншомовних.

Зміст роботи

хромосома дрозофіла полінетія генотип

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на класичному об'єкті генетичних досліджень - плодовій мушці Drosophila melanogaster Meig. Матеріалом служили інбредні лінії дикого типу різного географічного походження: Oregon-R (Or) (інбридинг 56-116 поколінь), Canton-S (C-S) (інбридинг 58-118 поколінь) та міжлінійні гібриди F₁: Or Ч C-S, C-S Ч Or. У роботі також використовували неселектовану аутбредну мутантну лінію Bar (B) (локалізація мутації 1 - 57.0; дуплікація; гомозиготи життєздатні; мутація фенотипово проявляється у редукції очей до вузької вертикальної смуги з кількістю фасеток біля 90 у самців і 70 у самок), линію Bar_C-S, отриману шляхом насичувальних схрещувань мух лінії Bar з мухами лінії Canton-S (C-S), а також лінію iso^II; iso^III Bar_C-S, ізогенну за хромосомами 2 і 3. Дослідження проводили на стадії личинки, 0-годинні передлялечки й імаго дрозофіли.

Культури дрозофіли вирощували на стандартному цукрово-дріжджовому середовищі при температурі 240,5°C в термостаті. Щільність культури задавали кількістю пар батьківських особин на один стаканчик, при об'ємі живильного середовища 5 мл: 1 пара (контроль) і 3, 5, 7 пар (дослід). Ізогенізацію хромосом проводили за класичною схемою із використанням лінії-балансера Cy/Pm; D/Sb [Тихомирова M.M., 1990].

Політенні хромосоми досліджували при збільшенні мікроскопа Ч 600 на давлених ацетоорсеїнових препаратах слинних залоз, виготовлених згідно до стандартної методики [Полуэктова Е.В., Евгеньев М.Б., 1974]. Відмінності за ступенем політенії хромосом (СПХ) визначали цитоморфометричним методом [Страшнюк В.Ю. и др., 1995]: хромосоми з різним ступенем політенії відрізняються за шириною й інтенсивністю забарвлення ацетоорсеїном. Відомо, що до кінця третьої личинкової стадії в клітинах слинних залоз D. melanogaster проходить від шести до дев?яти циклів ендоредуплікації і хромосоми досягають ступеня політенії 256C, 512C, 1024C і 2048C [Rodman T.C., 1967]. У районі диска 22А хромосоми 2L, що приблизно відповідає середній ширині хромосом, поперечні розміри хромосом із різним ступенем політенії складають відповідно 1,6; 2,3; 3,2; 4,5 мкм. Визначали відсотковий вміст ядер із різним ступенем політенії на тотальних препаратах слинних залоз. За результатами цих даних розраховували середні значення політенії в кожному варіанті експерименту. Для виготовлення препаратів використовували самок і самців наприкінці третього личинкового віку.

Активність пуфів онтогенезу досліджували в локусах 2EF (хромосома Х), 21F, 22C, 23E (хромосома 2L), 50CD (хромосома 2R), 63F, 71CE, 72CD (хромосома 3L), 82EF, 83E, 93D (хромосома 3R) на хромосомах з однаковим ступенем політенії (1024С). Локалізацію пуфів проводили за уточненими картами Бриджеса [Lindsley D.E., Grell E.H., 1968]. Відношення розміру пуфа до розміру прилеглого диска, не залученного у процес пуфіювання, слугувало мірою пуфової активності: 2EF/2D, 21F/22B, 22C/22B, 23E/24C, 50CD/51В, 63F/64B, 71CE/73A, 72CD/73A, 82EF/84A, 83E/84A і 93D/93F. Виміри проводили за допомогою окуляр-мікрометра. За даними авторадіографічних досліджень, розміри пуфів позитивно корелюють з рівнем транскрипційної активності локусів [Pelling G., 1959]. З огляду на стадієспецифічність картини пуфінгу, досліджували самок на стадії 0-годинної передлялечки, яка триває протягом декількох секунд, що є важливим фактором створення синхронізованих вибірок особин дрозофіли.

Частоту ектопічних контактів між районами хромосоми 3R 100 F і 92 EF, а також процент асинапсису в хромосомі 3R за наявності й відсутності ектопічного контакту розраховували за відношенням кількості хромосом 3R із аналізованою ознакою до загальної кількості досліджуваних хромосом 3R з розрахунку на препарат. Досліджували самок на стадії 0-годинної передлялечки.

Частоту нерівного кросинговеру в локусі Bar визначали за відношенням кількості мутантних особин +/Y, B/+, BB/Y, BB/B до загальної кількості проаналізованих особин ліній Bar, Bar_C-S, iso^II; iso^III Bar_C-S. Наявність мутації в локусі Bar підтверджували цитологічним контролем.

Експресивність ознаки Bar оцінювали за часткою мух із максимальним проявом ознаки від загальної кількості досліджених імаго. Вихід імаго визначали, підраховуючи кількість дорослих мух у період від початку і до кінця виходу імаго. Імаго зважували у віці від 6 годин до однієї доби на торсійній вазі. Використовували показник маси 100 особин. Теплостійкість імаго дрозофіли досліджували методом термотесту [Шахбазов В.Г., 1966]. Яйцепродукцію оцінювали за середньою кількістю яєць, відкладених самкою протягом 8 годин у період максимальної плідності (5 доба після вильоту імаго). Частоту ДЛМ, як відсоток ембріональної смертності, визначали за стандартною методикою [Тихомирова М.М., 1990].

Результати експериментів піддавали статистичному аналізу. Визначали середнє арифметичне значення ознаки і помилку середнього значення. Вірогідність розходжень середніх оцінювали за критерієм Ст?юдента. Статистичні зв'язки оцінювали за допомогою коефіцієнта кореляції. Дисперсійний аналіз одно- і двофакторних комплексів здійснювали за методом Плохінського.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив щільності культури на прояв адаптивно важливих ознак у інбредних ліній і гібридів F₁ дрозофіли. Питання про вплив щільності культури на показники пристосованості у дрозофіли в зв'язку з генотипічними розходженнями є актуальним як у теоретичному, так і в практичному плані. В табл. 1 наведені результати дослідження прояву низки адаптивно важливих ознак у інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S дрозофіли за умов різної щільності культури.

За умов підвищеної личинкової щільності (3 - 7 пар особин батьківського покоління) виявлено достовірне зниження виходу імаго, маси тіла імаго, яйцепродукції, а також збільшення частоти ДЛМ порівняно з контролем (1 пара особин батьківського покоління). Зниження теплостійкості в досліді (7 пар батьків) відзначене у гібрида F₁ Or Ч C-S, тоді як для самців гібрида F₁ С-S Ч Оr показано збільшення даного показника при щільності культури 5 пар у батьківському поколінні.

Встановлено істотний вплив генотипу на прояв досліджуваних ознак у дрозофіли. У контролі (1 пара батьків) лінія C-S перевищувала лінію Or за виходом імаго, мала менші значення частоти ДЛМ, але поступалася лінії Or за теплостійкістю. За показниками маси імаго і яйцепродукції лінії достовірно не відрізнялися. Міжлінійні гібриди F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S виявляли значний гетерозисний ефект за виходом імаго, теплостійкістю та яйцепродукцією. Маса імаго у гібридів не відрізнялася від кращої з батьківських форм. За умов перенаселення (3 - 7 пар батьків) гібриди зберігали перевагу над інбредними лініями за адаптивно важливими ознаками, однак фактор щільності культури значно модифікував прояв ефекту гетерозису у дрозофіли. За показником виходу імаго максимальний прояв гетерозису спостерігався при щільності культури 1 та 3 пари батьківських особин. За умов максимального перенаселення (7 пар батьківських особин) величина гетерозису зменшувалася за показником яйцепродукції. За показником теплостійкості імаго, як правило, прояв ефекту гетерозису збільшувався за умов високої щільності культури (3 - 7 пар батьківських особин). Ефект гетерозису за сумарною частотою ДЛМ і частотою пізніх ДЛМ, оцінений за зниженням цих показників у гібридів порівняно з кращою батьківською формою, в контролі перевищував дослідний варіант у гібрида F₁ C-S Ч Or, у гібрида F₁ Or Ч C-S спостерігалася зворотня тенденція.

Показники адаптивної цінності інбредних ліній і гібридів D. melanogaster за умов різної щільності культури (М±m)

Отримані дані свідчать про те, що прояв адаптивно важливих ознак дрозофіли залежить як від щільності культури, так і від генотипу, встановлено значний модифікуючий вплив щільності культури на прояв інбредної депресії і гетерозису у D. melanogaster.

Вплив щільності культури на експресивність ознаки Bar у дрозофіли. Відомо, що зовнішні чинники істотно впливають на експресивність морфологічних ознак дрозофіли. Комплексні генетичні і морфофізіологічні зміни, що виникають при цьому, можуть мати складний системний плейотропний ефект на процеси індивідуального розвитку організму. Ознака Bar D. melanogaster характеризується варіюючою експресивністю і є зручною моделлю для вивчення успадкування кількісних ознак.

У контролі (1 пара батьківських особин) експресивність досліджуваної ознаки, яку оцінювали за часткою мух з максимальним проявом ознаки Bar від загальної кількості імаго, в неселектованій лінії Bar складала 33,336,42% у самок і 7,413,56% у самців. За умов стресу, зумовленого личинковим перенаселенням (7 пар батьківських особин), експресивність досліджуваної ознаки знижувалася відносно контролю у самок на 46,77% (P  0,999). Істотного впливу досліджуваного фактора на експресивність ознаки Bar у самців не встановлено. Силу впливу щільності культури на експресивність ознаки Bar у самок встановлено на підставі однофакторного дисперсійного аналізу, і вона складала 6,27% (Р 0,99).

Вплив щільності культури на ендоредуплікацію політенних хромосом інбредних ліній і гібридів дрозофіли. Для з'ясування генетичних механізмів ефекту гетерозису й адаптації до дії факторів навколишнього середовища велике значення мають дослідження на хромосомному рівні. У даний час мало відомо про вплив щільності культури на ступінь політенії гігантських хромосом дрозофіли у зв'язку з генотипічними розходженнями.

На підставі дослідження змін ступеня політенії хромосом у інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S в умовах різної щільності культури встановлено, що личинкове перенаселення знижує ендореплікативну активність політенних хромосом D. melanogaster.

При підвищенні щільності культури до 7 пар батьківських особин збільшується кількість ядер з нижчим ступенем політенії - 256С і 512С, і зменшується вміст ядер зі ступенем політенії 1024С і 2048С. Зниження середнього ступеня політенії хромосом у особин інбредних ліній і гібридів F₁ складало 11,84 - 19,27% (Р 0,999) у самок і 6,76 - 17,87% (Р 0,95) у самців, за винятком самок гібрида F₁ C-S Ч Or, для яких розходження з контролем недостовірні.

Генетично обумовлені відмінності за показником середнього ступеня політенії хромосом в контролі встановлені тільки для самців: самці інбредної лінії C-S і гібридів F₁ C-S Ч Or, Or Ч C-S перевищували лінію Or у середньому на 11,70 - 12,93% (Р 0,99). Вплив фактора щільності культури призводив до посилення прояву генетичних розходжень за СПХ: перевага самців лінії C-S і гібридів F₁ C-S Ч Or, Or Ч C-S над лінією Or за умов досліду, в середньому, складала 19,58 - 27,39% (Р  0,99 - 0,999). Самки гібрида F₁ C-S Ч Or за досліджуваним показником перевищували обидві інбредні лінії на 14,84 - 25,14% (Р 0,999). Достовірних розходжень між самками інбредних ліній і гібрида F₁ Or Ч C-S у досліді не виявлено.

Сила впливу щільності культури і генотипу на показник ступеня політенії хромосом у самців складала 17,16% (Р  0,999) і 27,50% (Р  0,999), відповідно. У самок встановлено вплив сполучення градацій досліджуваних факторів (8,34%, Р  0,999), що свідчить про істотну залежність впливу щільності культури від генотипу.

Встановлено кореляцію між показником ступеня політенії хромосом та виходом імаго (r = 0,74, Р  0,95), масою тіла імаго (r = 0,71, Р 0,95), теплостійкістю особин (r = 0,71, Р 0,95) у самок; а також між СПХ та виходом імаго (r = 0,75, Р 0,95), масою тіла імаго (r = 0,73, Р 0,95), частотою пізніх ДЛМ (r = - 0,82, Р 0,95) у самців.

Показник ступеня політенії характеризує рівень помноження геному і пов'язаний із реплікативною активністю хромосом. Отримані дані про вплив щільності культури, інбредної депресії й гібридизації на показник СПХ свідчать про те, що механізми гетерозису, підвищеного гомеостазу гібридів F₁, адаптації до високої щільності культури пов'язані з регуляцією функції ендоредуплікації політенних хромосом дрозофіли.

Вплив щільності культури на пуфову активність політенних хромосом інбредних ліній і гібридів дрозофіли. Результати дослідження впливу щільності культури на активність пуфів онтогенезу політенних хромосом у інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S дрозофіли представлені в табл. 2. Для аналізу було взято 6 пізніх екдизонових пуфів - 63F, 71CE, 72CD, 82EF, 83E, 93D. За умов перенаселення відзначено зниження розмірів пуфів відносно контролю в лінії C-S (локуси 63F, 71CE, 72CD, 82EF), Or (локуси 63F, 82EF, 83E) і у гібрида F₁ C-S Ч Or (локуси 71CE, 82EF) у середньому на 9,82 - 20,10% (Р 0,95 - 0,999). Достовірного впливу личинкового перенаселення на пуфову активність у гібрида F₁ Or Ч C-S не встановлено. Отримані дані свідчать про підвищену стійкість гібридів F₁ до дії стресового фактора щільності культури.

Слід зазначити, що є певні труднощі в оцінці генетичних розходжень за показником пуфової активності політенних хромосом з огляду на встановлений вплив щільності культури на даний показник і різну плідність ліній і гібридів F₁ дрозофіли. У зв'язку з цим виконано аналіз генетичних розходжень за показником пуфової активності політенних хромосом за умови однакової щільності культури в поколінні F₁. За показником виходу імаго достовірних відмінностей в досліді (7 пар батьківських особин) між інбредною лінією C-S і гібридом F₁ C-S Ч Or, а також реципрокними гібридами F₁ не встановлено. При цьому розмір пуфа 63F у гібрида F₁ C-S Ч Or на 22,67% більший, ніж у лінії C-S. Різниця за розмірами пуфів між гібридами достовірно виявлялася в районі 93D і складала 11,84% (Р > 0,99). За іншими пуфами достовірних генетичних розходжень не виявлено.

Статистична обробка результатів експерименту із використанням двофакторного дисперсійного аналізу показала достовірний вплив генотипу і щільності культури на пуфову активність політенних хромосом у локусах 63F, 71CE, 72CD, 82EF і 63F, 72CD, 82EF. Сила впливу генотипу складала, у середньому, 3,91 - 8,05% (Р 0,95 - 0,999), щільності культури - 1,61 - 9,53% (Р 0,95 - 0,999).

Розміри пуфів політенних хромосом у D. melanogaster за умов різної щільності культури (M±m)

Встановлено тісну і середню позитивну кореляцію показника пуфової активності в локусах 63F, 82EF, 83E із виходом імаго (r = 0,71 - 0,73, Р 0,95), масою тіла імаго (r = 0,75 - 0,78, Р  0,95), теплостійкістю особин (r = 0,75, Р 0,95), а також зі ступенем політенії хромосом (r = 0,75 - 0,96, Р 0,95 - 0,99).

Отримані дані свідчать про те, що механізми гетерозису, адаптації до перенаселення культури, а також підвищеного гомеостазу гетерозисних гібридів F₁ пов'язані з регуляцією пуфової активності хромосом, яка відібражає транскрипційну активність клітинного ядра.

Особливості гомологічної і негомологічної кон'югації хромосом у інбредних ліній і гетерозисних гібридів дрозофіли. Відповідно до сучасних даних, архітектоніка клітинного ядра має велике значення щодо здійснення його генетичних функцій. З метою вивчення особливостей просторової організації хромосом інтерфазного ядра в інбредних ліній C-S, Or і міжлінійних гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S дрозофіли досліджували гомологічну і негомологічну кон'югацію політенних хромосом. Для інбредної лінії Or виявлено цитологічний маркер - ектопічний контакт між районами 100F і 92EF хромосоми 3R (рис. 2. В.), присутній у 100,00±0,00% проаналізованих препаратів та не характерний для лінії C-S (рис. 2. А.). У гібрида F₁ C-S Ч Or наявність контакту виявлено в 60,00±15,49% препаратів, а у гібрида F₁ Or Ч C-S - в 77,78±13,86%. Сила впливу генотипу на частоту виникнення ектопічного контакту між ділянками 100 F і 92 EF хромосоми 3R у досліджуваних інбредних ліній і гетерозисних гібридів F₁ складала 56,13% (Р  0,999).

Встановлено генотипічні розходження за частотою асинапсису в досліджуваному районі ектопічного спарювання (рис. 3, рис. 2. Г.). Для лінії Or цей показник становив 21,65±2,71%. Перевага гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S відносно лінії Or за досліджуваною ознакою складала 85,64% (Р > 0,999) і 79,82% (Р > 0,999), відповідно. Для лінії C-S, що не має ектопічного контакту, досліджуваний показник мав значення 1,67±1,17% (рис. 2. Б.). Результати однофакторного дисперсійного аналізу свідчать про достовірний вплив генотипу (3,75%, Р  0,999) на частоту асинапсису в досліджуваному районі ектопічного спарювання.

Порівняльний аналіз частот асинапсису в хромосомі 3R при наявності (рис. 2. Г.) і відсутності ектопічного спарювання ділянок 100 F і 92 EF (рис. 2. Б.) у гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S виявив достовірний вплив (Р > 0,999) асоціації районів 100 F і 92 EF на частоту асинапсису гомологів у хромосомі 3R (рис. 3.). Сумарна частота асинапсису в гібридів F₁ C-S Ч Or і Or Ч C-S за наявності ектопічного контакту складала 68,12±3,97%, тоді як за його відсутності досліджуваний показник знижувався до 5,71±1,75%. Сила впливу ектопічного спарювання ділянок 100 F і 92 EF на частоту асинапсису гомологів складала 14,85%, Р  0,999.

Показано наявність тісної позитивної кореляції (r = 1, Р 0,999) між частотою ектопічних контактів у досліджуваному районі хромосоми 3R у інбредних ліній Or, C-S і реципрокних гібридів F₁ C-S Ч Or, Or Ч C-S і активністю пуфінга в локусі 93D, розташованому на незначній відстані від місця контакту (рис. 2 В.).

Таким чином, отримано нові дані про наявність впливу генотипу на просторову організацію хромосом інтерфазного ядра, що є важливим доповненням до існуючих гіпотез про механізми гетерозису.

Зміни адаптивно важливих ознак при ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли. Відомо, що використання ізогенних ліній дозволяє вирішити цілий ряд теоретичних і практичних задач селекції. Однак вплив ізогенізації на пристосування організмів вивчено недостатньо. Проведені дослідження свідчать, що за умов ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли спостерігається достовірне зниження виходу імаго (на 32,27% у самок і 34,03% у самців, Р > 0,999), а також яйцепродукції (на 56,10%, Р > 0,999) (табл. 3). Сила впливу ізогенізації на вихід імаго складала 31,81% (Р  0,95) у самок і 40,68% у самців (Р 0,95), на яйцепродукцію - 48,94% (Р  0,999).

Показники адаптивної цінності у ліній Bar_C-S і iso^II; iso^III Bar_C-S D. melanogaster (М±m)

Вплив ізогенізації другої і третьої пар хромосом дрозофіли на експресивність ознаки Bar. Відомо, що фенотипічний прояв окремих генів залежить від зовнішнього середовища та їхнього генетичного оточення, зокрема генетичного фону. Так, за результатами наших досліджень, у лінії Bar_C-S експресивність ознаки Bar достовірно відрізнялася від неселектованої лінії і складала 65,31±6,80% і 25,00±6,25% у самок і самців, відповідно.

Аналіз експресивності ознаки Bar в лінії iso^II; iso^III Bar_C-S, ізогенної за хромосомами 2 і 3, показав залежність фенотипічного прояву досліджуваної ознаки від процесу ізогенізації хромосом. Гомозиготизація генів за хромосомами 2 і 3 призводила до зниження експресивності мутантної ознаки у самок на 36,95% (P  0,95) відносно лінії Bar_C-S та істотно не впливала на експресивність ознаки Bar у самців. Сила впливу ізогенізації хромосом на експресивність ознаки Bar у самок складала 6,10% (Р  0,99).

Вплив ізогенізації на ендореплікативну і пуфову активність політенних хромосом дрозофіли. У даний час вплив ізогенізації на генетичний апарат клітини не викликає сумнівів. Однак мало дослідженим залишається питання щодо зміни функціональної активності хромосом за умов ізогенізації.

На підставі дослідження ліній Bar_C-S і iso^II; iso^III Bar_C-S показано, що процес ізогенізації хромосом негативно впливає на ендореплікативну активність політенних хромосом у самок D. melanogaster та істотно не змінює її у самців (рис. 4). Зниження середнього ступеня політенії хромосом складало 8,16% (Р > 0,999). Аналіз співвідношення відсотка ядер із різним ступенем політенії хромосом показав значне зростання у досліді частки ядер зі ступенем політенії 512С - на 48,10% (Р > 0,99). При цьому мала місце тенденція до зниження кількості ядер із рівнем політенії 1024С, 2048С і зростання відсотка ядер із найменшим ступенем політенії - 256С. Сила впливу ізогенізації на рівень політенії гігантських хромосом у самок складала 44,92% (Р 0,999).

Результати дослідження ефекту ізогенізації на активність пуфінгу в локусах 2EF (хромосома Х), 21F, 22C, 23E (хромосома 2L), 50CD (хромосома 2R), 63F, 71CE, 72CD (хромосома 3L), 82EF, 83E, 93D (хромосома 3R) представлені на рис. 5. У лінії iso^II; iso^III Bar_C-S встановлено зниження розмірів пуфів порівняно з лінією Bar_C-S у локусах 2EF, 50CD, 71CE, 72CD, 83E на 11,72% (Р > 0,99), 10,65% (Р > 0,95), 22,41% (Р > 0,999), 16,80% (Р > 0,99) і 16,04% (Р > 0,95), відповідно. Одночасно показано посилення пуфової активності в локусі 21F на 11,06% (Р > 0,95). У локусах 22C, 23E, 63F, 82EF, 93D розміри пуфів істотно не змінювалися. Сила впливу ізогенізації хромосом 2, 3 D. melanogaster на активність пуфінгу політенних хромосом в локусах 2EF, 21F, 50CD, 71CE, 72CD, 83E, встановлена на підставі однофакторного дисперсійного аналізу, складала, в середньому, 6,90 - 25,00% (Р  0,95 - 0,999).

Отримані дані свідчать про зниження функціональної активності політенних хромосом дрозофіли за умов ізогенізації. Пригнічення ендореплікативної та пуфової активності гігантських хромосом слинних залоз корелює зі зниженням плідності й життєздатності особин ізогенної лінії, що збігається з результатами літературних даних [Страшнюк В.Ю. и др., 1995; 1997; 2001], в яких показано зв'язок проявів функцій політенних хромосом із адаптивно важливими ознаками.

Зміна частоти нерівного кросинговеру в локусі Bar і частоти ДЛМ за умов перенаселення культури і при ізогенізації другої та третьої пар хромосом дрозофіли. Серед великої кількості робіт щодо генетичних ефектів личинкового перенаселення та ізогенізації хромосом дані про вплив наведених факторів на мутаційний процес неповні та суперечливі.

Результати досліджень впливу щільності культури і процесу ізогенізації хромосом 2 і 3 D. melanogaster на частоту нерівної гомологічної рекомбінації в локусі Bar наведені в табл. 4. Наявність мутації в локусі Bar підтверджували цитологічним контролем (рис. 6). Показано зростання частоти нерівного кросинговеру в неселектованій лінії Bar за умов личинкового перенаселення на 296,04% (P 0,99) відносно контролю. Збільшення частоти нерівного кроссинговеру на 151,53% (P 0,95) встановлено також для лінії iso^II; iso^III Bar_C-S, ізогенної за хромосомами 2 і 3, відносно лінії Bar_C-S. Достовірних відмінностей між лініями Bar і Bar_C-S за досліджуваним показником не виявлено.

Частота нерівного кросинговеру в локусі Bar за умов різної щільності культури і при ізогенізації хромосом 2 і 3 у D. melanogaster (M±m)

У табл. 5 наведені результати дослідження впливу щільності культури і процесу ізогенізації хромосом 2 і 3 D. melanogaster на частоту ДЛМ. Встановлено достовірне зниження частоти ДЛМ на 10,02% (Р 0,99) при збільшенні щільності культури в лінії Bar до семи пар батьківських особин відносно контролю (одна пара батьківських особин). В лінії iso^II; iso^III Bar_C-S, ізогенної за хромосомами 2 і 3, показано збільшення даного показника на 18,52% (P 0,99), відносно лінії Bar_C-S. Слід зауважити, що мутантні лінії Bar, Bar_C-S, iso^II; iso^III Bar_C-S характеризуються високою частотою ДЛМ - 44,05 - 52,21%, перевищуючи лінію C-S в 2,95 - 3,49 рази, що погоджується з даними про генетичну нестабільність ознаки Bar.

Частота ДЛМ за умов різної щільності культури і при ізогенізації хромосом 2 і 3 у D. melanogaster (M±m)

• Таким чином, отримані дані свідчать про те, що дія екологічного стресового фактора щільності культури та генетичного чинника - ізогенізації хромосом - є важливим джерелом зміни спадкової мінливості. Враховуючи дані таблиці 1, слід зауважити, що вплив фактора щільності культури на частоту ДЛМ залежить від генотипу: показник збільшується у гібридних особин, не змінюється в інбредних лінях і зменшується в мутантної лінії Bar. З огляду на широку розповсюдженість процесу нерівного кросинговеру в природі та його важливе біологічне значення, виявлена висока чутливість нерівної гомологичної рекомбінації в локусі Bar до впливу чинників різного походження може бути використана для розробки тест-системи щодо оцінки мутагенного ефекту екзогенних та ендогенних чинників.

Висновки

У дисертації, відповідно до поставленої мети та задач, наведено нові дані щодо хромосомних механізмів впливу щільності культури, ізогенізації хромосом, диференційної стійкості генотипів та ефекту гетерозису у плодової мушки Drosophila melanogaster Meig. Встановлено, що вплив щільності культури та ізогенізації хромосом пов'язаний з регуляцією структурних та функціональних особливостей політенних хромосом дрозофіли. Відмінності за активністю пуфіювання, ступенем політенії, гомологічною і негомологічною кон'югацією гігантських хромосом у інбредних ліній і гетерозисних гібридів свідчать про те, що прояви гетерозису торкаються різних рівнів регуляції функцій генетичного апарату клітини.

1. Виявлено істотний вплив щільності культури на прояв кількісних ознак у дрозофіли: за умов личинкового перенаселення знижується вихід імаго (на 59,88 - 80,65%), маса тіла імаго (на 12,24 - 22,22%), теплостійкість імаго (на 11,91 - 29,74%), яйцепродукція (на 14,88%) та експресивність ознаки Bar (на 46,77%). Міжлінійні гібриди F₁ в умовах різної щільності культури виявляють значний гетерозисный ефект за показниками виходу імаго (18,52 - 69,41%), теплостійкості імаго (4,27 - 35,62%) і яйцепродукції (36,42 - 90,57%).

2. Ступінь політенії гігантських хромосом слинних залоз дрозофіли при збільшенні щільності культури зменшується на 6,76 - 19,27%. Гібридні особини характеризуються підвищеним гомеостазом до дії личинкового перенаселення і за даною ознакою перевищують інбредні лінії на 14,84 - 25,14%. Встановлено позитивну кореляцію показника СПХ із виходом імаго (r = 0,74 - 0,75), масою тіла імаго (r = 0,71 - 0,73), теплостійкістю особин (r = 0,71) і негативну кореляцію між СПХ і частотою пізніх домінантних летальних мутацій (r = - 0,82).

3. Перенаселення культури знижує активність пізніх екдизонових пуфів гігантських хромосом у локусах 63F, 71CE, 72CD, 82EF, 83E на 9,82 - 20,10%. Гібриди F₁ виявляють підвищений гомеостаз за даною ознакою порівняно з інбредними лініями. Показано, що розміри пуфів у ряді локусів у особин інбредних ліній і гібридів дрозофіли позитивно корелюють із виходом імаго (r = 0,71 - 0,73), теплостійкістю (r = 0,75), массою тіла імаго (r = 0,75 - 0,78).

4. Отримано нові дані про генотипічні розходження просторової організації хромосом інтерфазного ядра. Ектопічний контакт між районами 100F і 92EF хромосоми 3R постійно присутній в лінії Or, не виявлений в лінії C-S, у гібридів F₁ показано проміжну частоту даної ознаки (60,00 - 77,78%). Встановлено генотипічні відмінності за частотою асинапсису в районі ектопічного спарювання: гібриди F₁ за даним показником перевищують батьківську лінію Or на 79,82 - 85,64%. Виявлено стимулюючий вплив ектопічного контакту на частоту асинапсису гомологів хромосоми 3R, а також тісну позитивну кореляцію (r = 1) між частотою ектопічних контактів у досліджуваному районі хромосоми 3R і активністю пуфінгу в локусі 93D.

5. Показано негативний вплив ізогенізації хромосом 2 і 3 на прояв кількісних ознак у дрозофіли: вихід імаго знижувався на 32,27 - 34,03%, яйцепродукція - на 56,10%, експресивність ознаки Bar - на 36,95%.

6. Вперше встановлено пригнічення прояву генетичних функцій політенних хромосом дрозофіли за умов ізогенізації хромосом 2 і 3. Показано зменшення ступеня політенії на 8,16% і зниження пуфової активності гігантських хромосом дрозофіли в локусах 2EF, 50CD, 71CE, 72CD, 83E на 10,65 - 22,41%. Одночасно показано посилення пуфової активності в локусі 21F на 11,67%. У локусах 22C, 23E, 63F, 82EF, 93D розміри пуфів істотно не змінювалися.

7. Встановлено зростання частоти нерівних хромосомних обмінів в локусі Bar у 2,52 - 3,96 рази за умов личинкового перенаселення і при ізогенізації хромосом 2 і 3 дрозофіли, що свідчить про посилення мутаційної мінливості.

8. Ізогенізація хромосом 2 і 3 призводить до зростання частоти домінантних летальних мутацій у дрозофіли. Вплив фактора щільності культури на частоту ДЛМ залежить від генотипу: показник збільшується в гібридних особин, не змінюється в інбредних ліній і зменшується в мутантній лінії Bar. Мутантні лінії Bar, Bar_C-S, iso^II; iso^III Bar_C-S характеризуються високою частотою ДЛМ - 44,05 - 52,21%, перевищуючи лінію C-S в 2,95 - 3,49 рази, що погоджується з даними про генетичну нестабільність ознаки Bar.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Журавльова Л., Страшнюк В., Шахбазов В. Вплив щільності культури на прояв ефекту гетерозису у Drosophila melanogaster // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2004. - Вип. 35. - С. 102-109.