Молекулярні механізми структурної динаміки хроматину

По-друге, виникає питання, чи справді тетрамер гістонів (Н3-Н4)₂, який у складі нуклеосоми має вигляд лівозакрученої підкови, може змінювати свою хіральність. Адже вищезгадані спостереження стосуються тільки поведінки ДНК-компоненти тетрасомного комплексу. Модифікація двох SH-груп гістонів Н3 (два цистеїна різних молекул Н3 знаходяться поблизу від центральної частини тетрамера, приблизно у зоні осі симетрії другого порядку частинки) відомим ковалентним реагентом ДТНБ (5,5'-дітіобіс (2-нитробензойна кислота)) призводить до реверсії вільних енергій двох структурних форм тетрасоми: права форма стає менш енергетичною. Цей результат, що він є доказом залучення білкової частини тетрасоми в її структурне перетворення, було підтверджено у релаксаційних експериментах з ДТНБ-тетрасомами (Alilat et al., 1999).

Отже, результати флуоресцентного титрування тетрасом однозначно свідчать, що БЕ, індукуючи позитивну надспіралізацію, викликає у тетрасомі структурне перетворення зі зміною хіральності суперспіралі ДНК. При цьому змінюється також хіральність тетрамера гістонів (Н3-Н4)₂. Дестабілізація кінцевих невпорядкованих ділянок гістонів полегшує структурне перетворення.

Структурна динаміка нуклеосоми у взаємозв'язку з топологією циркулярної ДНК. Релаксація у присутності ДНК-топоізомерази І. Внаслідок високої жорсткості ДНК малого розміру серед продуктів релаксації вільних мініциклів, як правило, є присутнім лише один топоізомер. Коли розмір мініциклу є кратним спіральній періодичності ДНК плюс пів-періоди (близько 5 п.о.), два топоізомери можуть бути отримані у рівних кількостях, завдяки рівній імовірності недокручення або перекручення подвійної спіралі при її замиканні у кільце. В інших випадках формується лише один топоізомер, який відповідає найменшій зміні твісту відносно лінійної ДНК. Аналіз релаксаційних експериментів на вільних мініциклах дозволяє встановити спіральну періодичність ДНК, яка відповідає найбільш вигідному твістові в умовах релаксації, та K_sc для вільної ДНК. Ці значення виявилися незалежними від складу використаних буферів релаксації. Середнє значення K_sc = 4100300 для мініциклів обох використаних серій. Спіральна періодичність розрізняється для двох серій ДНК (тобто для різних послідовностей пар основ): 10,4940,003 п.о./виток для серії Taq та 10,5380,003 для серії Bam.

Структурна динаміка нуклеосоми. На відміну від вільних мініциклів, продукти релаксації реконструйованих нуклеосом містять не менше двох топоізомерів. Отже, мініцикл із нуклеосомою у своєму складі, у порівнянні з вільною ДНК, поводиться як менш жорстка система.

Відносні внески топоізомерів у їх розподілах (для мініциклів усіх досліджених розмірів) у залежності від ДLk цих топоізомерів представлено на рис. 4. Слід зауважити, що сума внесків (імовірностей) усіх топоізомерів у розподілі дорівнює 1 тільки в межах одного розміру (одного експерименту), тобто загальна залежність на рис. 4 не є нормалізованою для всіх ?Lk. На кривій виявляються три локальні максимуми, які наводять на думку про існування принаймні трьох структурних станів нуклеосоми з різними значеннями характеристичної різниці числа зачеплень, що вноситься нуклеосомою, ДLk_p.

Для опису залежності на рис. 4 було використано модель кількох станів нуклеосоми. Внесок певного стану на певному топоізомері в загальну релаксаційну рівновагу визначається вільною енергією G мініциклу, що містить нуклеосому в певному стані (за аналогією з рівн. 1):

G = (K_sc/N_l) (?Lk - ?Lk_p)² + ?G_p,

де перший доданок - енергія надспіралізації петлі, N_l - розмір петлі у п.о., ?Lk_p - специфічний для кожного стану внесок нуклеосоми у загальне значення ?Lk топоізомера, ?G_p - відносна конформаційна енергія нуклеосоми у певному стані (для одного зі станів приймається за 0). Коли ?Lk = ?Lk_p, петля є релаксованою, тобто реалізується мінімум енергії (максимум імовірності). Виявилося, що мінімальне число станів, використовуючи яке можна задовільно описати експериментальну залежність на рис. 4, дорівнює трьом. Знайдені значення параметрів моделі та конфігурації ДНК у трьох формах нуклеосоми наведені у табл. 2.

Таблиця 2. Топологічні та енергетичні параметри нуклеосом у складі мініциклів

Згідно розрахунків рівноважної конфігурації петлі, «канонічна» нуклеосома з 1,7 витками лівої суперспіралі дає Wr мініциклу, близький до ДLk_p першого, закритого негативного стану. Відкрита форма нуклеосоми, ~1,4 витка без перехрещення лінкерів, є наслідком руйнування найменш міцних контактів ДНК з октамером гістонів на вході-виході з нуклеосоми. Можливість реалізації цієї форми демонструє аналіз міжмолекулярних взаємодій у нуклеосомі (див. вище), електронна мікроскопія нуклеосом, реконструйованих на мініциклах із ДLk ~ -1 (Goulet et. al, 1988), та результати про доступність нуклеосомної ДНК до рестриктаз (Polach and Widom, 1995). Закрита позитивна форма нуклеосоми (1,7 витка з позитивним перехрещенням лінкерів) виявлена вперше. Наявність цієї форми підтверджується результатами щодо високої здатності нуклеосоми витримувати позитивні еластичні напруження, що індукуються БЕ (див. вище).

Надспіральний парадокс - досить давня проблема, що досі не була вирішена, яка полягає в розбіжності між даними про структуру нуклеосоми (1,7 витка лівої суперспіралі ДНК мають вносити величину приблизно -1,7 у рівень надспіралізації циркулярної ДНК) та топологічними вимірами на мініхромосомах (циркулярних ДНК з ~20 нуклеосомами), які свідчать, що середнє питоме значення <?Lk_p> ? -1 на одну нуклеосому. Факт існування нуклеосоми у різних структурних станах негайно дає очевидне рішення парадокса: у хроматині існує рівновага трьох конформаційних станів з різними значеннями ДLk_p, що у середньому дає питоме значення <ДLk_p> на нуклеосому, близьке до -1. Звичайно, у хроматині енергетика цієї рівноваги має дещо відрізнятися від такої, що має місце в мініциклах.

Роль ацетилування гістонів у динаміці нуклеосоми. Конформаційна рівновага нуклеосом може бути модифікована принаймні двома важливими способами. Один з них - дестабілізація невпорядкованих кінцевих ділянок гістонів за рахунок їх ацетилування. На аналогічній до наведеної на рис. 4 залежності, що була отримана для ацетильованих нуклеосом, пік, який відповідає відкритому станові нуклеосоми, стає домінуючим. Енергетичні параметри (табл. 2) вказують, що спостерігається зменшення внесків обох закритих станів нуклеосоми на користь відкритого.

Стає зрозумілою одна з фізіологічних ролей, що її відіграє ацетилування гістонів, яке завжди корелює з транскрипційною активністю. Значна частина кінцевих ділянок гістонів сконцентрована в структурі нуклеосоми у місці входу-виходу нуклеосомної ДНК. Дестабілізація взаємодії цих ділянок із ДНК унаслідок ацетилування повинна призвести до зростання електростатичного розштовхування кінцевих ділянок нуклеосомної ДНК, тобто до зростання енергетичної вартості закритих конформаційних станів нуклеосоми. Можна, таким чином, ідентифікувати відкритий конформаційний стан нуклеосоми як активований - такий, що має певний потенціал щодо підвищення транскрипційної активності за рахунок зростання доступності ДНК та, можливо, дестабілізації димерів гістонів Н2А-Н2В.

Структурно-динамічний поліморфізм нуклеосом. Інший фактор, який впливає на конформаційну рівновагу нуклеосом, - послідовність пар основ ДНК. Результати аналізу релаксацій нуклеосом, реконструйованих на мініциклах іншої послідовності (серія Bam), вказує, що внесок позитивного закритого стану є дуже низьким (табл. 2), тобто має місце динамічний поліморфізм нуклеосом.

Нуклеосоми, реконструйовані на двох досліджених послідовностях ДНК, відрізняються також за твістом нуклеосомної ДНК. Значення ДLk_p негативного закритого та відкритого станів для нуклеосом Bam і Taq відрізняються між собою приблизно на 0,3 (табл. 2). Якщо райзинг відкритих станів обох нуклеосом дорівнює -1,01, то нуклеосомна ДНК має дуже різні значення ДTw_p (різниця в твісті між нуклеосомною та вільною ДНК): ДTw_p ? 0 для нуклеосоми Taq, тоді як для нуклеосоми Bam ДTw_p = +0,29. Футпринтинг нуклеосомної ДНК за допомогою ДНКази І підтверджує, що нуклеосомна ДНК Taq є більш розкрученою по відношенню до такої Bam; ступінь розкручення узгоджується з даними релаксації. Отже, істинна спіральна періодичність нуклеосомної ДНК Taq приблизно дорівнює періодичності у розчині (10,49 п.о./виток), а для нуклеосом Bam становить 10,26 п.о./виток. Відповідні локальні періодичності h_loc (періодичності контактів ДНК із білковою поверхнею), які відрізняються від істинних завдяки хіральності нуклеосомної суперспіралі, можна оцінити як 10,37 та 10,14 п.о./виток для нуклеосом Taq і Bam відповідно.

Виявлений динамічний поліморфізм повинен відображати певні відмінності й у просторовій структурі нуклеосоми. Розрахована в межах теорії рівноважних конфігурацій залежність еластичної енергії петлі від ДLk для випадку 1,7 витка регулярної нуклеосомної суперспіралі (рис. 5) демонструє наявність двох локальних мінімумів (для обох петля не містить торсійних напружень), які й відповідають двом закритим структурним станам нуклеосоми (табл. 2). Оскільки застосована теорія не бере до уваги електростатичних взаємодій, другий мінімум повинен насправді зсуватися до більш негативних значень ДLk, як це спостерігається в експерименті.

Різниця в енергії між двома мінімумами дорівнює близько 4 одиниць k_BT, що наближається до значення ДG_p позитивного стану нуклеосоми Bam (табл. 2). Отже, регулярна нуклеосомна суперспіраль дозволяє задовільно описати динамічні властивості нуклеосоми Bam, але не нуклеосоми Taq. Для пояснення значної присутності позитивного стану у випадку нуклеосоми Taq необхідно знайти спосіб так змінити граничні умови на кінцях петлі, щоб вони сприяли більш легкому формуванню позитивного перехрещення лінкерних ділянок. Одна з можливостей полягає у вигині осі нуклеосомної суперспіралі, як це зображено у нижній частині рис. 5. Залежність вільної енергії мініциклу, що містить таку структуру (рис. 5), показує значне зниження різниці між двома мінімумами - приблизно до експериментальних значень для нуклеосоми Taq. Припущення щодо викривлення осі суперспіралі у нуклеосомі Taq не є цілком гіпотетичним. Аналогічна деформація нуклеосомної суперспіралі спостерігалася в кристалах нативних нуклеосом із низьким розділенням (Richmond et al., 1984), як можливість такої деформації можна інтерпретувати результати дослідження резонансного переносу енергії (Tomschik et al, 2005). Імовірно, вигин осі нуклеосомної суперспіралі є неможливим для деяких послідовностей ДНК, унаслідок чого нуклеосоми на таких послідовностях є більш конформаційно жорсткими.

Структурна динаміка тетрасоми. Тетрамер гістонів (Н3-Н4)₂ займає у нуклеосомі центральну позицію, є найбільш міцно зв'язаним з ДНК і, після звільнення димерів гістонів (Н2А-Н2В) у процесі активації хроматину, його комплекс з ДНК - тетрасома - тимчасово замінює нуклеосому у хроматині. Результати релаксаційних експериментів підтверджують дані флуоресцентного методу (див. вище) щодо вражаючої конформаційної рухливості тетрасоми.

Залежність від ДLk відносних внесків топоізомерів у їх розподілах є бімодальною (рис. 6), що негайно вказує на існування двох конформацій тетрасоми з негативним та позитивним значеннями ДLk_p, тобто з різною хіральністю. Перша з конформацій є лівою і більш вигідною енергетично, що природно, бо тетрамер має вигляд закрученої ліворуч підкови у складі нуклеосоми. Друга є закрученою праворуч конформацією. Аналіз даних на підставі моделі двох станів та теорії рівноважних конфігурацій дозволяє отримати топологічні, енергетичні та структурні параметри двох станів (табл. 3). Зокрема, експериментальні значення K_sc є, згідно до розрахунків, дуже чутливими до радіуса r тетрасомної суперспіралі. У правому стані радіус виявився значно більшим (табл. 3).

Таблиця 3. Топологічні, енергетичні та структурні параметри тетрасом у складі мініциклів

Знайдена для нуклеосом різниця між серіями ДНК у випадку тетрасом суттєво знижується. Але певний поліморфізм зберігається: тетрасома Bam характеризується дещо меншим радіусом суперспіралі у лівому стані та більш високою енергією конформаційного перетворення ДG_p (табл. 3). Тобто, тетрасома Bam, як і відповідна нуклеосома, є більш конформаційно жорсткою у порівнянні з Taq. Крім того, зберігається різниця у локальній спіральній періодичності h_loc, що вона спостерігалася для відповідних нуклеосом.

Загальними характеристиками тетрасом на обох досліджених серіях ДНК (табл. 3) є: 1) наявність структурного перетворення зі зміною хіральності, коли під впливом позитивної надспіралізації тетрасома перетворюється на більш енергетичну закручену праворуч форму; 2) вказана зміна хіральності супроводжується латеральним розкриттям тетрасоми (збільшенням радіусу тетрасомної суперспіралі); 3) тетрасомна ДНК, у порівнянні з нуклеосомною, характеризується більшим значенням твісту (зменшенням спіральної періодичності). Латеральне розкриття тетрасоми у її позитивному стані було підтверджено електронно-мікроскопічними спостереженнями (Alilat et al., 1999).

Виявляється, що гістонові хвости відіграють значну роль також у процесі структурного перетворення тетрасоми. Тетрасоми були реконструйовані з використанням трипсинизованих гістонів (обох або одного з двох). Аналіз релаксації свідчить, що усунення хвостів трипсином призводить до суттєвого полегшення структурного перетворення, а також до додаткового латерального розкриття (збільшення радіусу суперспіралі) у обох структурних формах (табл. 3). Головним чином за цей ефект відповідає хвіст гістона Н3. Релаксаційні експерименти з використанням ацетильованих тетрамерів демонструють менш значні зміни, але в тому ж напрямку. Таким чином, тетрасома може бути латерально розкритою у двох випадках: у ході перетворення у праву форму та після усунення кінцевих ділянок гістона Н3. Така кореляція наводить на думку, що кінцеві ділянки є дестабілізованими у складі правої форми тетрасоми, або, іншими словами, їхня дестабілізація є необхідною для структурного перетворення у праву форму з латеральним розкриттям тетрасоми. На підставі кристалічної структури нуклеосоми можна припустити «інтеркаляцію» хвостів у малий жолобок в структурі лівої тетрасоми. Малий жолобок при цьому збільшується на зовнішньому боці суперспіралі, що повинно блокувати ДНК у вигнутому стані.

Структурна динаміка та позиціювання тетрасоми. Модифікація тетрамера гістонів (Н3-Н4)₂ ковалентним реагентом SH-груп ДТНБ призводить до реверсії енергетичної вартості двох структурних форм тетрасоми: права форма стає переважною (див. вище). Таке «блокування» тетрасоми у правій формі відкриває можливість дослідити структуру цієї форми у складі лінійної ДНК (199 п.о., серія Bam) методом футпринтинга ДНК за допомогою вільних ОН* радикалів.

Футпринтинг не виявляє жодної різниці у доступності певних нуклеотидів для радикалів між контрольними та ДТНБ-нуклеосомами. Унікальна позиція нуклеосоми досить точно передбачається теорією позиціювання (див. вище). Фур'є-трансформація частоти розщеплення обох нуклеосом дає оцінку періодичністі контактів h_loc = 10,30,1. Періодичність контактів є однаковою для нативних та ДТНБ-тетрасом (h_loc = 10,10,1). Це підтверджує припущення, зроблене у ході аналізу релаксаційних експериментів тетрасом, про незалежність h_loc від конформаційних перетворень, а також висновок про збільшення твісту тетрасомної ДНК у порівнянні з нуклеосомною. Але нативний тетрамер займає на дослідженому фрагменті кілька позицій, що перекриваються (що теж узгоджується з теорією позиціювання), тоді як тетрамер-ДТНБ займає дві окремі позиції на протилежних кінцях фрагменту. Отже, одна з функцій, що її виконує in vivo виявлене структурне перетворення у тетрасомі зі зміною хіральності, може полягати у зміні переважних позицій, які займає тетрасома відносно послідовності ДНК.

Структурна динаміка нуклеосоми у присутності лінкерного гістону Н5. Лінкерні гістони (Н1 або його аналог з еритроцитів птахів Н5) зв'язуються з нуклеосомою в місці входу-виходу нуклеосомної ДНК. Специфічність зв'язування зумовлена глобулярним доменом (GH5). Але завдяки невпорядкованій С-кінцевій ділянці довжиною ~100 амінокислотних залишків, серед яких багато позитивно заряджених, лінкерні ділянки ДНК формують стеблоподібну структуру (Hamiche et al., 1996), яка зумовлює певний напрямок специфічної укладки ДНК у складі 30 нм фібрили.

У релаксаційних експериментах із комплексами нуклеосома-Н5 (рис. 7, табл. 4) спостерігаються наступні відміни у порівнянні з нуклеосомою: 1) у присутності Н5 відкритий стан нуклеосоми зникає, що й очікувалось, оскільки Н5 взаємодіє з нуклеосомною ДНК на вході-виході; 2) залишаються два закриті конформаційні стани, що їх було зафіксовано для нуклеосоми, і це, у свою чергу, підтверджує їх передіснування в нуклеосомі; 3) зростає присутність позитивного стану (також і для нуклеосоми Bam); 4) практично зникає динамічний поліморфізм для двох досліджених послідовностей ДНК - крива для серії Bam виглядає так само, як крива Taq на рис. 7, за винятком зсуву по осі абсцис, який відображає різницю у твісті нуклеосомної ДНК; 5) збільшується відстань по осі абсцис між двома конформаційними станами: негативний стає більш негативним, позитивний - більш позитивним.

Таблиця 4. Топологічні та енергетичні параметри комплексів нуклеосома-Н5 у складі мініциклів

Ще однією характерною відзнакою Н5-нуклеосом є дивовижно низька, навіть на тлі загально високої конформаційної рухливості інших досліджених комплексів, силова константа надспіралізації (табл. 4). Якщо розмір вільної петлі дорівнює приблизно 190 п.о., то величина K_sc/N_l відповідає, в середньому, K_sc ~ 800, що практично співпадає зі значенням, отриманим методом флуоресценції БЕ для ДНК нативних клітинних ядер.

Як показують розрахунки на підставі теорії рівноважних конфігурацій еластичного стержня, для досягнення такої низької константи K_sc/N_l необхідно, щоб два кінця петлі ДНК були у контакті, при цьому тангенти до осі ДНК у цих точках були паралельними, та розмір петлі N_l не перевищував 180 п.о. Тобто, отримане значення K_sc/N_l може розглядатися як доказ існування на кінцях петлі стеблоподібної структури, у якій дві ділянки ДНК є паралельними одна до одної. З іншого боку, зміщення ДLk_p приблизно на 0,2 у негативний (для негативного стану) чи у позитивний (для позитивного стану) бік у порівнянні з нуклеосомою (табл. 2, 4), вказує на відповідне закручення двох ділянок ДНК у складі стебла. Тобто паралелізм у стеблі досягається поступово: дві лінкерні ділянки, виходячи з нуклеосоми, формують перехрещення (негативне чи позитивне) під певним кутом та утворюють стебло у вигляді подвійної спіралі; далі крок такої спіралі поступово збільшується так, що дві ділянки стають паралельними на виході зі стебла. Відповідно до таких властивостей стебла була побудована модель мініциклу, що містить нуклеосому та гістон Н5. Галерея конфігурацій мініциклу (рис. 7) ілюструє легкість обертання петлі навкруг стебла. Дещо подібне повинно відбуватися й у хроматині, де нуклеосома може легко обертатися навкруг стебла у відповідь на зміну топологічного стану ДНК.

Як показують релаксаційні експерименти з комплексами нуклеосома-GH5 (табл. 4), присутність GH5 є достатньою для зникання відкритого стану нуклеосоми, що підтверджує взаємодію глобулярного домену з нуклеосомою у місці входу-виходу ДНК. GH5 полегшує формування позитивної форми нуклеосоми, але є недостатнім для повного зникнення динамічного поліморфізму нуклеосом. GH5 є також недостатнім для збільшення ступеня перехрещення лінкерних ділянок ДНК, що він спостерігається у випадку Н5, - для формування стебла є необхідним С-кінцевий невпорядкований домен.

Динамічна модель організації хроматину. Результати дисертаційної роботи дозволяють сформулювати загальну модель динаміки нуклеопротеїнових комплексів у складі хроматину (рис. 8). Висока загальна конформаційна рухливість хроматину в складі клітинних ядер знаходить своє пояснення у високій конформаційній рухливості нуклеогістонових комплексів різного складу. Зокрема, надзвичайно висока конформаційна рухливість наднуклеосомної частинки, яка містить гістон Н1/Н5 (верхня частина рис. 8), дозволяє нуклеосомі у складі хроматину легко обертатися навкруг стеблоподібної структури. Висока обертальна рухливість стебла має полегшувати компактизацію хроматину завдяки зміні, в разі потреби, обертальної орієнтації нуклеосоми з метою забезпечення ефек-тивних міжнуклеосомних взаємодій. Крім того, рухливість стебла дає змогу хроматину «витримувати» еластичні напруження, що виникають у складі хроматинової петлі. Одним з головних джерел таких напружень є процес елонгації транскрипції (нижня частина рис. 8): проходження РНК-полімерази викликає, як відомо, дві хвилі надспіралізації - позитивну попереду і негативну позаду полімеразного комплексу. Стебло виступає своєрідним буфером, здатним гасити такі хвилі на віддалених від зони елонгації ділянках хроматину.

Роль такого ж буферу виконують негативний та позитивний стани нуклеосоми після усунення лінкерних гістонів із потенційно активних ділянок хроматину (середня частина рис. 8). Проте, в цьому випадку в активних ділянках хроматину на певних послідовностях ДНК, а також завдяки ацетилуванню гістонів і/або репозиціюванню нуклеосом, конформаційна рухливість нуклеосоми зменшується, і превалює відкрита форма нуклеосоми. Часткове розгортання нуклеосомної ДНК у відкритій формі повинно забезпечувати більшу доступність регуляторних послідовностей до транскрипційних факторів та дестабілізувати димери гістонів Н2А-Н2В.

Унаслідок цього димери можуть (завдяки дії проміжних переносників) видалятися з хроматину, де залишається тетрасома (нижня частина рис. 8). Структурне перетворення тетрасоми зі зміною її хіральності знову ж таки дозволяє швидко гасити хвилі надспіралізації. Те ж саме послаблення взаємодії кінцевих ділянок гістонів з ДНК, яке викликало збільшення жорсткості нуклеосоми, у даному випадку полегшує структурне перетворення. Загальна рухливість тетрасоми (здатність її до латерального розкриття, трансляційна рухливість вздовж ДНК) значно полегшує процес елонгації транскрипції. Негативна надспіралізація позаду РНК-полімерази зумовлює швидке відновлення структури нуклеосоми.

Висновки

1. Головним загальним наслідком утворення нуклеопротеїнових комплексів хроматину є, поряд із компактизацією, значне підвищення конформаційної рухливості ДНК. Ця рухливість, що вона зумовлена змінами балансу різноманітних міжмолекулярних взаємодій та залежить від послідовності пар основ ДНК і посттрансляційних модифікацій гістонів, дає можливість вибірково активувати певні ділянки геному при збереженні загальної щільної упаковки ДНК у клітинному ядрі.

2. Запропонована теорія електростатичних взаємодій позитивно заряджених лігандів з ДНК, яка базується на використанні рівняння Пуассона-Больцмана для зарядженого циліндра та дозволяє оцінювати значення електростатичного внеску у вигин ДНК, загальну електростатичну енергію полііону, константи зв'язування позитивно заряджених білків з ДНК.

3. Теоретичний аналіз, проведений на підставі теорії електростатичних взаємодій, вказує, що конформаційна динаміка нуклеосоми зумовлена можливістю руйнування електростатичних контактів кінцевих ділянок ДНК із гістонами та (або) контактів димера гістонів Н2А-Н2В з тетрамером (Н3-Н4)₂.

4. В рамках теоретичної моделі ДНК як ізотропного еластичного стержня показано, що залежні від послідовності пар основ еластичні властивості ДНК є головним фактором позиціювання нуклеосом відносно послідовності. Розроблений теретичний алгоритм, що враховує пружні властивості динуклеотидних контактів у складі ДНК, у багатьох випадках дозволяє передбачити переважні нуклеосомні позиції з точністю до 10 пар основ.

5. Флуоресцентне титрування бромистим етидієм свідчить, що, незважаючи на щільну компактизацію, ДНК зберігає високу загальну конформаційну рухливість у складі нативних клітинних ядер. Результати флуоресцентних експериментів вказують також на високу конформаційну рухливість нуклеогістонових комплексів, реконструйованих на циркулярній ДНК малого розміру (мініциклах).

6. Аналіз релаксації мініциклів ДНК, які містять реконструйовану нуклеосому, ДНК-топоізомеразою І вказує, що нуклеосома здатна існувати у трьох структурних формах за фізіологічних умов, в залежності від топологічного стану ДНК: двох закритих, у яких нуклеосомна суперспіраль містить 1,7 витка, та у місці входу-виходу ДНК із нуклеосоми формується негативне або позитивне перехрещення, та відкритого - з 1,4 витка суперспіралі.

7. Рівновага між структурними формами нуклеосоми залежить від послідовності пар основ ДНК, на якій ця нуклеосома сформована. Існування закритого позитивного стану нуклеосоми зумовлено залежною від послідовності пар основ деформацією нуклеосомної суперспіралі зі зближенням та зміною орієнтації лінкерних ділянок ДНК.

8. У тетрасомі - комплексі ДНК із тетрамером гістонів (Н3-Н4)₂ - під впливом позитивної надспіралізації здійснюється структурне перетворення зі зміною хіральності суперспіралі та її латеральним розкриттям.

9. Дестабілізація кінцевих невпорядкованих ділянок гістонів унаслідок їх ацетилування призводить до зменшення конформаційної рухливості нуклеосоми та до збільшення рухливості тетрасоми: доступ до закритих форм нуклеосоми зменшується, структурне перетворення у тетрасомі значно полегшується після послаблення взаємодії кінцевих ділянок із ДНК.

10. У нуклеосомі, яка містить лінкерний гістон Н5, лінкерні ділянки ДНК формують стеблоподібну структуру. Стебло є правою чи лівою подвійною спіраллю, крок якої поступово змінюється так, що дві ділянки ДНК виходять із неї майже паралельними, що забезпечує високу обертальну рухливість стебла.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Теоретическое исследование структурного перехода в нуклеосоме при низкой ионной силе // Молек. биология. - 1987. - Т.21, №3. - С. 714-723. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

2. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Структура октамера гистонов в составе реконструированных полинуклеосом в присутствии гистона Н1 и двухвалентных катионов // Биополимеры и клетка. - 1987. - Т.3, №4. - С. 192-201. (Особистий внесок дисертанта: реконструкція нуклеосом, виміри тирозинової флуоресценції гістонів, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

3. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Связывание положительно-заряженных лигандов с ДНК. Влияние ионной силы, заряда и размера лиганда // Молек. биология. - 1988. - Т.22, №2. - С. 414-422. (Особистий внесок дисертанта: розробка теорії електростатичних взаємодій білків з ДНК, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

4. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Теоретическое рассмотрение механизмов компактизации ДНК поликатионами // Биофизика. - 1989. - Т.34, №1. - С. 28-33. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

5. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Влияние сверхспирализации ДНК на структуру нуклеосом // Молек.биология. - 1991. - Т.25, №1. - С. 144-152. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз можливих варіантів впливу надспіралізації на структуру нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

6. Бондарь Н.В., Безруков В.Ф., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Возможная роль эндогенных нуклеаз в структурной организации хроматина // Биологические науки. Научные доклады высшей школы. - 1992. - №2. - С. 58-64. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

7. Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Флюоресцентная спектроскопия в исследованиях белково-нуклеиновых взаимодействий в хроматине // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т.8, №1. - С. 89-100. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів флуоресцентної спектроскопії щодо структури хроматину, розробка флуоресцентних підходів до вивчення білково-нуклеїнових взаємодій, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

8. Sivolob A.V., Khrapunov S.N. Translational positioning of nucleosomes on DNA: the role of sequence-dependent isotropic DNA bending stiffness // J. Mol. Biol. - 1995. - Vol.247, N5. - P.918-931. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі та алгоритму, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

9. Khrapunov S.N., Dragan A.I., Sivolob A.V., Zagariya A.M. Mechanisms of stabilizing nucleosome structure. Study of dissociation of histone octamer from DNA // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - Vol.1351, N1-2. - P.213-222. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз дисоціації нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

10. Sivolob A., Khrapunov S.N. Electrostatic contribution to the bending of DNA // Biophys. Chemistry. - 1997. - Vol.67, N1-3. - P.85-96. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

11. Бондар Н.В, Сиволоб А.В., Демідов С.В. Використання методу титрування бромистим етидієм для дослідження топологічного стану ДНК у складі ядер // Вістник Київського університету. Біологія - 1998. - вип. 28. - С. 23-24. (Особистий внесок дисертанта: розробка методики визначення топологічного стану ДНК у складі клітинних ядер, виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

12. Sivolob A., De Lucia F., Rйvet B., Prunell A. Nucleosome dynamics II. High flexibility of nucleosome entering and exiting DNAs to positive crossing. An ethidium bromide fluorescence study of mononucleosomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. - 1999. - Vol.285, N3. - P.1081-1099. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

De Lucia F., Alilat M., Sivolob A., Prunell A. Nucleosome dynamics III. Histone tail-dependent fluctuation of nucleosomes between open and closed DNA conformations. Implication for chromatin dynamics and the linking number paradox. A relaxation study of mononucleosomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. - 1999. - Vol.285, N3. - P.1101-1119. (Особистий внесок дисертанта: розробка методики релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, теоретичний аналіз релаксації нуклеосом, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

13. Alilat M., Sivolob A., Rйvet B., Prunell A. Nucleosome dynamics IV. Protein and DNA contributions in the chiral transition of the tetrasome, the histone (H3-H4)₂ tetramer-DNA particle // J. Mol. Biol. - 1999. - Vol.291, N4. - P.815-841. (Особистий внесок дисертанта: визначення позицій нуклеогістонових комплексів методом футпринтинга ДНК, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

14. Sivolob A., Prunell A. Nucleosome dynamics V. Ethidium bromide versus histone tails in modulating ethidium bromide-driven tetrasome chiral transition. A fluorescence study of tetrasome on DNA minicircles // J. Mol. Biol. - 2000. - Vol.295, N1. - P.41-53. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, розробка моделі кількох структурних станів тетрасоми у присутності барвника, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

Sivolob A., De Lucia F., Alilat M., Prunell A. Nucleosome dynamics VI. Histone tail regulation of tetrasome chiral transition. A relaxation study of tetrasomes on DNA minicircles // J. Mol. Biol. - 2000. - Vol.295, N1. - P.55-70. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації тетрасом топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

15. Сиволоб А.В. Структурная динамика нуклеосомы и суперспиральный парадокс // Молек. биология. - 2002. - Т.36, №3. - С. 391-396.

16. Сиволоб А.В. Висока конформаційна рухливість ДНК в ядрах клітин // Вісник Київського університету. Біологія. - 2002. - вип. 36. - С. 17-19.

17. Сиволоб А.В. Енергетика та конформаційна рухливість циркулярної ДНК малого розміру // Вісник Київського університету. Біологія. - 2002. - вип. 38. С. 21-22.

18. Sivolob A., Lavelle C., Prunell A. Sequence-dependent nucleosome structural and dynamic polymorphism. Potential involvement of histone H2B N-terminal tail proximal domain // J. Mol. Biol. - 2003. - Vol.326, N1. - P.49-63. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації нуклеосом топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, розробка теоретичних моделей, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

19. Sivolob A., Prunell A. Linker histone-dependent organization and dynamics of nucleosome entry/exit DNAs // J. Mol. Biol. - 2003. - Vol.331, N5. - P.1025-1040. (Особистий внесок дисертанта: експерименти з релаксації топоізомеразою І, теоретичний аналіз результатів, розробка теоретичних моделей, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

20. Prunell A., Sivolob A. Paradox lost: nucleosome structure and dynamics by the DNA minicircle approach // Chromatin structure and dynamics: state-of-the-art. New Comprehensive Biochemistry. Vol. 39 (Eds. J. Zlatanova, S.H. Leuba). - Amsterdam: Elsevier, 2004. - P. 45-74. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, вирішення надспірального парадокса, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

21. Dragan A.I, Potekhin S.A., Sivolob A., Lu M., Privalov P.L. Kinetics and thermodynamics of the unfolding and refolding of the three-stranded б-helical coiled coil, Lpp-56 // Biochemistry. - 2004. - Vol.43, N47. - P.14891-14900. (Особистий внесок дисертанта: розробка методів підгонки теоретичних моделей під експериментальні дані, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

22. Sivolob A., Prunell A. Nucleosome conformational flexibility and implications for chromatin dynamics // Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. A. - 2004. - Vol.362, N1820. - P.1519-1547. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів релаксації нуклеогістонових комплексів топоізомеразою І, розробка моделі структурної динаміки хроматину, обговорення результатів зі співавтором, підготовка роботи до друку.)

23. Драган А.И., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Структурные перестройки нуклеосом в растворах с высокой ионной силой // Тезисы докладов IX Всесоюзного симп. «Структура и функции клеточного ядра». - Черноголовка. - 1987. - С. 52. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

24. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Механизмы стабилизации нуклеосомы при низкой ионной силе // Тезисы докладов IX Всесоюзного симп. «Структура и функции клеточного ядра». - Черноголовка. - 1987. - С. 86. (Особистий внесок дисертанта: розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

25. Драган А.И., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Механизмы диссоциации нуклеосомы при высокой ионной силе по данным флуоресцентной спектроскопии // Тезисы докладов VI конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С. 116-117. (Особистий внесок дисертанта: теоретичний аналіз дисоціації нуклеосом, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

26. Сиволоб А.В., Драган А.И., Храпунов С.Н. Структурный переход в нуклеосоме при низкой ионной силе. Флуоресцентная спектроскопия и теоретический анализ // Тезисы докладов VI конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С. 269-270. (Особистий внесок дисертанта: виміри тирозинової флуресценції нуклеогістонових комплексів, розробка теоретичної моделі, математичні розрахунки, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

27. Сиволоб А.В., Безруков В.Ф., Бондарь Н.В., Храпунов С.Н. Торсионные напряжения в ДНК клеточных ядер. Флуоресцентные исследования // Тезисы докладов VII конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1991. - С. 219. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

28. Безруков В.Ф., Бондарь Н.В., Сиволоб А.В., Храпунов С.Н. Зависимость активности Ca-Mg эндонуклеазы от структурного состояния хроматина // Тезисы докладов IX конференции межотраслевого проекта «Нуклеазы». - Казань. - 1991. - С. 18-20. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

29. Khrapunov S.N., Dragan A.I., Sivolob A.V. The topological complementarity of the charge groups controlling the interaction of DNA with core histones in nucleosome // Progr. Biophys. and Mol. Biol. (International Biophysical Congress, Amsterdam). - 1996. - Vol.65, N1 - Р.82. (Особистий внесок дисертанта: теоретичне узагальнення власних результатів щодо конформаційної рухливості нуклеосоми в залежності від іонної сили, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

30. De Lucia F., Sivolob A., Alilat M., Cohen-Solal J., Prunell A. Histone-tail dependent flexibility of nucleosome entering and exiting DNAs to positive crossing // EMBL Transcription meeting. - Heidelberg. - 1998. - P.256-257. (Особистий внесок дисертанта: виміри флуоресценції бромистого етидію, теоретичний аналіз результатів, обговорення результатів зі співавторами, підготовка роботи до друку.)

Размещено на Allbest.ru