Функціональна несумісність автономних генетичних елементів у Erwinia carotovora.

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Черватюк Ніна Володимирівна

УДК 578.26:579.842.1/.2

ФУНКЦІОНАЛЬНА НЕСУМІСНІСТЬ АВТОНОМНИХ ГЕНЕТИЧНИХ ЕЛЕМЕНТІВ У ERWINIA CAROTOVORA

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Товкач Федір Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділом молекулярної біології вірусів.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України, Малюта Станіслав Станіславович Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідуючий відділом молекулярної генетики;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Семчук Лідія Іванівна, Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка старший старший науковий співробітник кафедри вірусології.

Захист відбудеться 19 вересня 2007 року о 12 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Д03680, м. Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий “15” серпня 2007 року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, с.н.с Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

генетичний елемент клітина фаговий

Актуальність теми. Автономні генетичні елементи (АГЕ) бактерій включають острови патогенності, бактеріофаги, плазміди, транспозони, IS-елементи та RM-системи, які являють собою сегменти ДНК, здатні до внутрішньо- та міжгеномного розповсюдження. Вони проявляють паразитизм на молекулярному рівні та здатні формувати імунітет. Крім того, для них характерна ієрархія (прості АГЕ входять до складу більш складних). АГЕ широко розповсюджені і на сьогодні виключенням являються ті бактерії із природних джерел, які б не містили позахромосомної ДНК та не були б лізогенними. За даними профагової геноміки всі бактерії, геном яких просіквеновано, є лізогенними (Canchaya et al, 2003).

Несумісність автономних генетичних елементів відображає їх індивідуальність та егоїстичність і в багатьох випадках лежить в основі класифікації деяких із них (Novick, 1987). Дослідження несумісності АГЕ дозволять наблизитись до розуміння загальнобіологічної проблеми індивідуальності кожного окремого виду бактерій в цілому та генетичних елементів зокрема.

На даний час АГЕ Escherichia coli безумовно є найбільш дослідженими і навряд чи їх буде замінено іншими аналогами при використанні в біотехнології. Все ж фаги, плазміди і транспозони E. coli не вичерпують всього різноманіття АГЕ і тому їх вивчення в інших бактеріях є актуальним. Erwinia carotovora відноситься до важливих фітопатогенних бактерій родини Enterobacteriaceae, а також є продуцентом бактеріоцинів та таких ферментів як L-аспарагіназа, пектинази і целюлази. Вивчення її АГЕ та їх причетності до патогенності тільки розпочато.

В зв'язку з цим дисертаційна робота була спрямована на дослідження АГЕ та їх несумісності в клітинах штамів E. carotovora subsp. carotovora (Есс).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідних тем відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології НАН України: “Молекулярно-генетична організація та біотехнологічне застосування лізогенних систем Erwinia carotovora” (державний реєстраційний номер теми 0105U000788), “Одержання антилейкемічної L-аспарагінази з Erwinia carotovora” (державний реєстраційний номер теми 0104V003200 0102V003706) і “Отримання і використання макромолекулярних бактеріоцинів (каротоворіцинів) Erwinia carotovora для біоконтролю в оточуючому середовищі” (державний реєстраційний номер теми 0102V003706).

Мета і завдання дослідження. Основною метою роботи було встановлення особливостей функціональної несумісності автономних генетичних елементів в клітинах E. carotovora. Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити обмеження розвитку помірного бактеріофага ZF40 з боку бактерії-хазяїна.

2. Запропонувати модель для ідентифікації внутрішньоклітинних систем рестрикції-модифікації у E. carotovora.

3. Вивчити взаємодію між фагом ZF40 та екзогенними плазмідами RP4 та R68.45 на рівні його продуктивного та лізогенного розвитку.

4. Здійснити плазмідну трансформацію клітин E. carotovora.

Об'єкт дослідження - лізогенний та літичний шлях розвитку помірного бактеріофага ZF40 в плазмідних штамах Есс, системи рестрикції-модифікації E. carotovora та екзогенні плазміди RP4, R68.45 і pECL18.

Предмет дослідження - функціональна несумісність автономних генетичних елементів у фітопатогенної бактерії E. carotovora subsp. carotovora.

Методи дослідження - вірусологічні, мікробіологічні, молекулярно-біологічні, генетичні, біохімічні, комп'ютерна обробка даних.

Наукова новизна роботи. Робота виконувалась в рамках сучасної концепції несумісності автономних генетичних елементів: фагів, плазмід, RM-систем (Hatfull, 2000; Novick, 1987; Kobayashi, 2001).

Вперше встановлено, що клітини штамів, які підтримують продуктивний розвиток фага ZF40, містять унікальний ферментний комплекс з ендо- та екзонуклеазною активністю. Їх прояв залежить від температури: температурний діапазон виявлення ендонуклеазної активності становить 8 - 14 єС, екзонуклеазної - 28 - 37 єС. Встановлено, що обмеження продуктивного розвитку фага ZF40 відбувається за участю ендонуклеаз. Ефективність висіву фага корелює з температурним оптимумом дії цих ферментів.

Показано, що продукт гена ard екзогенної плазміди рКМ101, який послаблює рестрикцію I типу E. coli, не впливає на ефективність висіву фага ZF40. Система рестрикції-модифікації екзогенної плазміди pECL18 і хазяйська RM-система штаму Есс RC5297 ведуть себе автономно, тобто обмежують розвиток фагів незалежно одна від одної.

Вперше на основі вірулентних полівалентних бактеріофагів FE44 та T7, специфічних щодо ентеробактерій, запропоновано оригінальну систему для виявлення та типової ідентифікації систем рестрикції-модифікації Есс. Обидва фага містять рецептори в коровій частині ліпополісахариду ентеробактерій, що можна використовувати для збільшення кола чутливих хазяїв даних фагів за рахунок отримання R-форм бактерій. Фаг FE44, на відміну від фага Т7, не має гена антирестрикції типу ocr та не реагує на обмеження з боку F-плазміди.

Вперше встановлено, що на трансформацію клітин Е. carotovora впливає ферментний комплекс, нуклеазна активність якого залежить від стадії росту культури бактерій. Трансформацію клітин Есс RC5297 плазмідою pECL18 здійснено за умов, коли нуклеазна активність штаму мінімальна.

Вперше вивчено особливості фаго-плазмідної взаємодії в клітинах ервіній. Встановлено, що екзогенна плазміда R68.45 підвищує стабільність лізогенії за участю фага ZF40 та дестабілізує дефектну лізогенію E. carotovora.

Розроблено метод трансформації клітин E. carotovora, який є підґрунтям створення біотехнологічної системи для клонування та експресії генів на основі фітопатогенних бактерій роду Erwinia.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження функціональної несумісності фагів, плазмід та RM-систем можуть бути використані при розробці наукових підходів для вивчення адаптаційних властивостей бактерій та відкривають перспективу встановлення причетності АГЕ до патогенності бактерій.

Запропонована в роботі фагова система для виявлення та типової ідентифікації систем рестрикції-модифікації може бути використана для скринінгу бактерій родини Enterobacteriaceae на присутність RM-систем.

Встановлена наявність температурозалежних нуклеаз у Е. carotovora дає змогу використовувати такі ферменти в галузі молекулярної біології та генетики.

Результати досліджень несумісності автономних генетичних елементів та ролі нуклеаз в обмеженні фагової репродукції дозволили здійснити трансформацію клітин ервіній. Представлена робота є підґрунтям для створення оригінальної біотехнологічної системи на основі фагів та плазмід E. carotovora subsp. carotovotra.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи, обробку і аналіз результатів досліджень здійснено безпосередньо здобувачем. Автором проведено адаптацію помірного бактеріофага ZF40 до нового хазяїна. Досліджено механізми обмеження продуктивного розвитку фага з боку бактерії-хазяїна. Проаналізовано нуклеазну активність деяких штамів E. carotovora. Здійснено транкон'югаційний перенос екзогенних плазмідних ДНК в клітини фітопатогенної бактерії Есс. Досліджено фаго-плазмідну взаємодію в клітинах транкон'югантів E. carotovora на рівні продуктивного та лізогенного розвитку фага ZF40. Розроблено фагову систему для виявлення та типової ідентифікації внутрішньоклітинних систем рестрикції-модифікації. Модифіковано стандартний протокол одержання компетентних клітин E. carotovora та їх трансформації.

Виділення периплазматичних та екстрацелюлярних фракцій клітин E. carotovora subsp. carotovotra проведено в співробітництві з Т.Ю. Горб (ІМВ НАН України).

Планування напрямку роботи, формулювання основних положень і висновків дисертації проведено під керівництвом д.б.н. Ф.І. Товкача.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи доповідались на міжнародних конференціях: „Біоресурси та віруси” (Київ, Україна, 2004), 9-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених „Биология - наука XXI века” (Пущино, Россия, 2005), „Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Аллелопатія” (Київ, Україна, 2005), 10-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених „Биология - наука XXI века” (Пущино, Россия, 2006), „Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006), “Modern problem of microbiology and biotechnology” (Одеса, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, з них 3 статті в фахових виданнях і 6 тезисів доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка має 5 розділів, аналізу та узагальнення результатів досліджень і списку використаних літературних джерел, що охоплює 165 найменувань. Дисертацію викладено на 137 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 25 рисунків і 13 таблиць.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури, який складається з двох підрозділів, проаналізовано та узагальнено сучасні дані щодо різноманітності АГЕ бактерій, особливостей їх взаємодії та механізмів формування автономності. Розглянуто несумісність бактеріофагів, плазмід, систем рестрикції-модифікації. Особливу увагу приділено класифікації систем рестрикції-модифікації різних бактерій і механізмам їх функціонування в бактеріальних клітинах.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

В роботі використано 14 штамів E. carotovora subsp. carotovora, 4 з яких одержано методом трансформації та транскон'югації, 15 штамів E. coli, з яких 2 отримано при трансформації плазмідною ДНК, один штам Salmonella typhimurium; фаги ZF40 Е. carotovora, T7, л E. coli, полівалентний фаг FE44 та плазміди RP4, R68.45, pKM101, pECL18, pSACII, pUC19 і ColEI.

Бактерії вирощували в рідких та на агаризованих живильних середовищах такого складу: повноцінні (LB та NBY), мінімальні з глюкозою або лактозою (М9, 0,2%), пектином (РМ, 0,5 - 1%) і поліпектатом натрію (РРМ, 0,5 - 1%).

Фаголізати одержували методом зливного лізису. Концентрування фагових часток здійснювали шляхом освітлення лізатів (Дэвис и др., 1984).

Вивчення динаміки росту культур бактерій проводили в повноцінному рідкому поживному середовищі LB.

Лізогенізацію індикаторних штамів Eсс та визначення її частоти здійснювали на твердому живильному середовищі (Кушкіна, Товкач, 2004).

Дослідження спонтанної індукції лізогенів проводили в рідкому мінімальному середовищі М9 з лактозою. Після культивування при 25 єС з інтенсивною аерацією протягом 40 - 46 год клітини обробляли хлороформом та центрифугували на мікроцентрифузі ELMI (11000 об/хв, 5 хв).

Для дослідження лізогенної індукції профага ZF40 використовували мітоміцин С, який додавали наприкінці логарифмічної фази росту, в культуральне середовище до кінцевої концентрації 1 мкг/мл. Одержані лізати після спонтанної та лізогенної індукції наносили на газони індикаторних штамів: E. coli С600 та E. carotovora 66А для перевірки індукції бактеріоцинів та E. carotovora RC5297 - для перевірки індукції фага.

Адаптацію фага до нового хазяїна проводили на агаризованому повноцінному середовищі. Для цього фаголізат з титром не менше 1Ч1010 БУО/мл, одержаний на одному хазяїні, наносили на газон іншого штаму. Окремі негативні колонії фага вирізали та переносили в рідке мінімальне середовище М9 для елюції фага. Отриману суспензію обробляли хлороформом та центрифугуванням позбавлялись від клітин і агару. Очистку та концентрування фаголізату здійснювали стандартними методами.

Виділення плазмідної ДНК проводили лужним методом (Kado, Liu, 1981). Фагову ДНК виділяли детергент-фенольним методом (Товкач и др., 1988). Рестрикційний аналіз фагової ДНК проводили за допомогою ендонуклеаз EcoRI, SalI, PstI, BglII, HpaI, EcoRV, MboI, BamHI, BsaI та HpaII.

Трансформацію клітин E. coli здійснювали за (Стикланд, 1999). Отримання компетентних клітин Е. carotovora та їх трансформацію проводили аналогічним методом з модифікаціями (Черватюк и др., 2007).

Транскон'югаційне схрещування культур E. carotovora та S. typhimurium ТА38(pKM101) в титрі 1-2•109 кл/мл кожного здійснювали в рідкому LB-середовищі. Клони транскон'югантів відбирали на мінімальному середовищі з пектином та ампиціліном (50 мкг/мл).

Виділення рестриктаз із колоній мікроорганізмів проводили згідно (Белавин и др., 1988). Для цього бактеріальні клітини обробляли лізуючим буфером з 0,1 % трітону Х-100 і 0,1 % лізоциму та інкубували при кімнатній температурі. Лізат освітлювали на мікроцентрифузі при 11000 об/хв 10 хв. Рестриктазну активність супернатанту виявляли використовуючи плазмідну або фагову ДНК. Визначали рестриктазну активність периплазматичних фракцій клітин, які одержували за (Hu et al, 1992).

Для рестрикції фагової ДНК in vivo культуру Eсс M2-4/50RI в середині логарифмічної фази росту інфікували фагом ZF40/RC5297. Множинність зараження становила 50, 75, 100, 200, 300, 500, 1000 часток на клітину. Після інкубації суміші при 28 єС протягом 30, 40, 50, 60, 70, 90 хвилин клітини осаджували центрифугуванням. Лізис інфікованих фагом клітин проводили за (Sano Y., 1993) з використанням SDS при 95 єС. Лізати аналізували в 0,9 % агарозних гелях.

Для дослідження обмежень продуктивного фагового розвитку обрали два штами Есс - RC5297 та М2-4/50RI (Товкач, 2002) - з різними системами рестрикції-модифікації та два вірулентних мутанта фага ZF40 - с5/5 та 421.

Продуктивний розвиток фагів ZF40с5/5 та 421, одержаних на штамі Есс RC5297, обмежується на штамі М2-4/50RI (табл. 1).

Таблиця 1. Ефективність висіву фагів ZF40с5/5 та 421 на різних штамах Е. сarotovora subsp. carotovora

Фаг Штам	ZF40с5/5/RC5297*	ZF40с5/5/М2-4*	421/RC5297*
RC5297	1,0	0,310-6	1,0
М2-4/50RI	0,910-5	1,0	біля 3Ч10-8

Примітка: * - через косу лінію позначено штам Есс, на якому було отримано даний аг

Однією із можливих причин обмеження продуктивного розвитку фага може бути функціонування систем рестрикції-модифікації бактерії-хазяїна. При цьому фаги можна адаптувати до нового штаму (Krьger, Bickle, 1983). Нами було проведено адаптацію фагового мутанта ZF40с5/5/RC5297 до штаму Есс М2-4/50RI. Отриманий фаг ZF40с5/5/М2-4 відновлював ефективність висіву на Есс М2-4/50RI і обмежувався RM-системою Есс RC5297 (табл. 1).

Фаговий мутант 421/RC5297 адаптувати до штаму Есс М2-4/50RI не вдалось.

Ідентичний характер рестрикції ДНК фагів ZF40с5/5/RC5297 та ZF40с5/5/М2-4 ендонуклеазами HindIII, EcoRI, SalI, PstI, BglII, HpaI, EcoRV та MboI свідчить про відсутність модифікації сайтів для цих рестриктаз на ДНК фага ZF40с5/5/М2-4. Характер рестрикції ДНК фага ZF40с5/5/М2-4 нуклеазами BamHI та Bsa29I відрізняється від такого ДНК фага ZF40с5/5/RC5297 присутністю додаткових субмолярних фрагментів.

Відомо, що ДНК фага ZF40 пермутована (Панщина, Товкач, 2007). При перенесенні фагового мутанта ZF40с5/5/RC5297 на штам М2-4/50RI відбувається зміна характеру кільцевої пермутації ДНК в напрямку дискретності.

Таким чином, рестрикційний аналіз не виявив модифікованих сайтів на ДНК ZF40с5/5/М2-4.

Для виявлення фрагментів рестрикції фагової ДНК безпосередньо в клітинах ми застосовували оригінальний метод рестрикції фагової ДНК in vivo. Проте при множинності зараження від 50 до 1000 фагових часток на клітину і за різному часі адсорбції (30 - 70 хв) не вдалось виявити характерних дискретних фрагментів ДНК.

Виділення ферментів рестрикції із бактерій штамів М2-4/50RI, RC5297 та RC5297(pECL18) показало, що, на відміну від нуклеаз E. сoli, виділених із штамів JM109(pECL18) та JM109(pSACI1), ферментні препарати Eсс майже повністю гідролізують ДНК фага л без утворення дискретних фрагментів (рис. 2А та 2Б відповідно).

Лізат штаму E. coli JM109(pECL18), що містить плазміду з геном рестриктази Ecl18kI, гідролізує ДНК фага л на характерні дискретні фрагменти. Відсутність таких же фрагментів після гідролізу лізатами штаму Есс RC5297(pECL18), який також містить плазміду pECL18, не зрозуміла. Можливо, це пов'язано із наявністю в даному штамі E. carotovora інших нуклеаз, які „маскують” прояв активності рестриктази Ecl18kI.

За характером рестрикції ДНК фага л ферментами із Есс можна припустити, що в даних лізатах переважає екзонуклеазна активність. Це підтверджується при гідролізі ДНК фага л лізатом штаму М2-4/50RI.

Відомо, що у E. carotovora температурний оптимум дії рестриктази Pca17AI складає 25 °С (Waleron K. et al, 2006), а синтез деяких бактеріоцинів підвищується при 23 °С (Nguyen H.A et al, 2002). Тому нами було визначено температурний діапазон дії виділених ферментних препаратів.

Було встановлено, що при 8 єС та 14 єС виявляються ендонуклеази, які гідролізують кільцеву ковалентно замкнену плазмідну ДНК. Із збільшенням температури гідролізу розпочинають діяти екзонуклеази (рис. 4). Відсутність дискретних фрагментів ДНК після рестрикції плазмідної ДНК при 28 та 37 єС свідчить про наявність екзонуклеазної активності в лізатах досліджуваних штамів.

Таким чином, ферментні препарати Е. сarotovora характеризуються як ендо-, так і екзонуклеазною активностями, які залежать від температури. Цей факт можна використовувати для детального дослідження нуклеаз Есс. Так, при 8 єС екзонуклеазна активність препаратів повністю відсутня. По співвідношенню рефлексів та їх інтенсивності, які відповідають різним формам плазмідної ДНК, можна зробити висновок, що лізати досліджуваних штамів Е. сarotovora призводять до утворення дволанцюгових розривів надспіральної ковалентно замкненої ДНК. Димерна форма плазмідної ДНК повністю гідролізується ендонуклеазами штаму RC5297(pECL18) і в меншій мірі такими штамів М2-4/50RI та RC5297. Крім того, ферментні препарати із Есс RC5297(pECL18) частково гідролізують також релаксовану форму плазміди pUC18, яка містить одноланцюговий розрив. Скоріш за все, нуклеази даного штаму здатні переважно утворювати односпіральні розриви (ніки). Цей факт було підтверджено при взаємодії лізатів з плазмідою ColEI, яка гідролізується з утворенням не лінійної ДНК, а релаксованої (відкритої кільцевої) форми плазмідної ДНК.

За таких умов рестрикції підтверджується факт щодо гідролізу лише надспіральної ковалентно замкненої ДНК, а не її димерної форми. Особливо чітко це виражено для лізатів штаму М2-4/50RI, в менший мірі - для RC5297. Рестрикційна картина ДНК плазміди pUC18, гідролізовананої препаратами штаму Есс RC5297(pECL18), відрізняється від такої двох інших штамів. Це можна пояснити наявністю в згаданому штамі, крім власної системи рестрикції-модифікації, привнесену з плазмідою pECL18 RM-систему II типу.

Таким чином, температурний діапазон прояву ендонуклеазної активності ферментними препаратами E. carotovora становить 8 - 14 єС, а екзонуклеазної - 28 - 37 єС.

Враховуючи те, що нуклеазна активність залежить від температури, для визначення ролі нуклеаз в обмеженні продуктивного розвитку фагів, досліджували вплив температури на ефективність висіву фагів ZF40с5/5/М2-4 та ZF40с5/5/RC5297 на штамі Есс RC5297. Температурні режими обирали зважаючи на температурний діапазон нуклеазної активності препаратів, тобто титрування фагів проводили при 28, 20 і 8 єС.

Було виявлено, що температура культивування суттєво не впливає на титр фага, який одержано на даному штамі (табл. 2).

Таблиця 2

Залежність продуктивного розвитку фага ZF40 від температури

Фаг	Температура, єС
	8	20	28
	Т, БУО/мл	ЕВ	Т, БУО/мл	ЕВ	Т, БУО/мл	ЕВ
ZF40с5/5/ RC5297	4Ч1010	0,95	4,2Ч1010	1,0	1,6Ч1010	0,38
ZF40с5/5/ М2-4/50RI	2Ч103	1,6Ч10-2	1,6Ч104	0,13	1,2Ч105	1,0

Примітка: Т - титр фага; ЕВ - ефективність висіву фага

При адаптації титр фага, одержаного на штамі Есс М2-4/50RI, виявився на один порядок нижчий при 8 єС, ніж при 20 єС та 28 єС. Тобто ефективність висіву фага ZF40с5/5/М2-4 на RC5297 суттєво залежить від температури: чим менша температура культивування, тим більш вираженим є обмеження продуктивного розвитку.

Таким чином, обмеження продуктивного розвитку фага ZF40 відбувається за участю ендонуклеаз, які активізуються при зниженні температури.

В подальшій роботі нами було зроблено спробу віднести RM-системи E. carotovora до певного типу.

Так як продукт гена ard (Завильгельский и др., 1984) плазміди рКМ101 знижує ефективність рестрикції I типу E. coli, ми використали дану плазміду для тестування RM-систем E. carotovora.

Як було показано вище, розмноження немодифікованого фага ZF40с5/5/RC5297 в клітинах Есс M2-4/50RI обмежується системою рестрикції-модифікації даного штаму.

Така ж ситуація спостерігається при репродукції модифікованого фага ZF40с5/5/М2-4 в клітинах Есс RC5297. Якщо припустити, що причиною обмеження репродукції фага є RM-система I типу, то ефективність дії рестриктаз штаму Есс RC5297 буде послаблена при введені в його клітини плазміди pKM101. Оскільки ефективність висіву двох clear-мутантів як на штамі RC5297, та і на RC5297(рКМ101) приблизно однакова (табл. 3), то наявність плазміди pKM101 в клітинах Есс RC5297(рКМ101) не впливає на обмеження продуктивного розвитку фагів: ефективність висіву як на плазмідному штамі, так і на безплазмідному приблизно однакова.

Таблиця 3. Ефективність висіву фагів на різних штамах E. carotovora subsp. carotovora

Фаг штам	ZF40c6/M2-4	ZF40с5/5/М2-4
M2-4/50RI	1,0	1,0
RC5297	6,0Ч10-5	0,3Ч10-6
RC5297(pKM101)	1,0Ч10-5	0,4Ч10-6

Отже, так як плазміда pKM101 не знижує ефективність висіву фагів, система рестрикції-модифікації штаму Есс RC5297 не має аналогії з RM-системою I типу E. coli.

Для більш детального вивчення RM-систем Есс було запропоновано оригінальну фагову систему. Вивчення рестрикції-модифікації з використанням різних фагів E. carotovora раніше не застосовувалось, за виключенням ервініофага ZF40, коло бактерій-хазяїв для якого обмежено (Товкач, 2002). Для створення даної фагової системи в роботі було використано полівалентний вірулентний бактеріофаг FE44 ентеробактерій та Т7 E. coli. Коло чутливих хазяїв для фага FE44 включає різні штами E. coli, в тому числі і клінічні ізоляти (Корнейчук Е.П. и др., 2004).

Крім того, FE44 здатен до репродукції в клітинах інших ентеробактерій та Pseudomonas spp. (Товкач, 2002). Рецептори для даних фагів містяться в коровій частині ліпополісахариду ентеробактерій. Тому цю властивість можна використовувати для збільшення кола чутливих хазяїв за рахунок отримання R-форм E. carotovora, які стають стійкими до макромолекулярних каротоворицинів, але фагочутливими.

При перевірці різних штамів бактерій на фагочутливість виявилось, що обмеження розвитку фагів FE44 та Т7 системами рестрикції-модифікації відображається на морфології зон лізису. Так, у випадку штамів E. coli С600, К12 та JM109 морфологія зон лізису, які утворюють ці фаги, практично однакова. Це свідчить про їх нормальну репродукцію на вказаних штамах. Даний факт підтверджується відсутністю рестриктазної активності у штамів E. coli С600, К12 та JM109 (гени hsd r-m+). На E. coli С600(Р1) розвиток двох фагів обмежується. Причина такого обмеження - наявність в даному штамі системи рестрикції-модифікації III типу, яка властива плазміді Р1.

Зважаючи на морфологію зон лізису, утворених на E. coli С600(Р1) можна припустити, що фагова інфекція у випадку цього штаму носить абортивний характер. Крім того, про обмеження продуктивного розвитку фагів Т7 та FE44 RM-системами свідчить зміна ефективності висіву фагів на різних штамах E. coli (табл. 4).

Таблиця 4

Ефективність висіву фагів FE44 та Т7 на деяких штамах E. coli

Фаг Штам	FE44/60	FE44/НВ101	Т7/ВЕ	Т7/НВ101
TG1	0,8 (p)	0,1	10-5	аbi
CR63	0,1	-	abi	-
Hfr3000	0,1	4Ч10-2	1,0	0,4
C600	1,0	0,3	1,0	0,4
DH1	0,2	-	1,0	-
J53	7Ч10-4	-	1,0	-
BE	2Ч10-4	3Ч10-3	0,5	0,2
HB101	0,1	1,0	1,0	1,0

Примітка: „-” - ефективність висіву не визначали; „abi” - абортивна інфекція, або abi-фенотип; „р” - утворення дрібних бляшок

Виявилось, що розвиток фага FE44 обмежується RM-системами штамів HB101, J53 та BE (табл. 4). Проте фаг Т7 не реагує на рестрикцію цими штамами. Даний факт можна пояснити присутністю у фага Т7 гена антирестрикції ocr, який діє на ефективність рестрикції I типу. Фаг FE44 в свою чергу не реагує на обмеження з боку F-плазміди, що дає додаткову можливість використовувати запропонований підхід для вивчення внутрішньоклітинного обмеження фагів, минаючи обмеження з боку плазмід груп несумісності IncFI (Bickle T.A., 1993).

Системи рестрикції-модифікації ІІ та ІІІ типів обмежують продуктивний розвиток зазначених фагів із різною ефективністю. Низький показник ефективності висіву фага FE44/С600 на штамі E. coli JM109 (pECL18) свідчить про обмеження розвитку фага системою рестрикції-модифікації ІІ типу (табл. 5). Більш високий показник ефективності висіву на штамі E. coli JM109 (pSACII1) можна пояснити тим, що рестриктаза плазміди pSACII1 впізнає гексануклеотидні послідовності (5/-CCGCGG-3/), які рідко зустрічаються в геномах етеробактерільних вірусів, на відміну від такої плазміди pECL18, рестрикційним сайтом якої є пентануклеотидна послідовність 5/-ССNGG-3/ (Zakharova M.V. et al, 1998).

Таблиця 5. Обмеження розвитку фагів Т7, FE44 та л на штамах E. coli з II та III типами RM-систем

Штам	Тип RM-системи	Фаг
		FE44/С600	Т7/ВЕ	л/С600
JM109	-	1,0	1,0	л-r
JM109(pECL18)	II	2,9Ч10-6	0	л-r
JM109(pSАCII)	II	0,6	0,7	л-r
C600	-	1,0	1,0	1,0
C600(P1)	III	0,4	0,05	2,4Ч10-4

Примітка: „-” - відсутність RM-системи; л-r - стійкість до фага л

Для виявлення причин обмеження фагового розвитку в клітинах E. carotovora використовували кілька ізогенних варіантів штамів 66А і 62А, чутливих до дії різних макромолекулярних каротоворіцинів (MCTV), та бактеріофаги Т7 і FE44. У випадку штаму Есс RC5191 фаг Т7 нормально адсорбується та здатний до внутрішньоклітинного розмноження. В той же час показники ефективності висіву фагів ZF40c5/5/M2-4 та ZF40c5/5/RC5297 на даному штамі дорівнюють нулю (табл. 6). При цьому ступінь обмеження розвитку фагів Т7/ВЕ і ZF40c5/5/M2-4 на Есс 62А приблизно однакова. Отже, вони дійсно обмежуються системою рестрикції-модифікації, яка не реагує на продукт гена ocr фага Т7.

Таблиця 6. Ефективність висіву фагів Т7 та FE44 на штамах E. carotovora subsp. carotovora

ФагШтам	FE44/НВ101	Т7/ВЕ	ZF40c5/5/ M2-4	ZF40c5/5/ RC5297
E. carotovora subsp. carotovora 66А
RC18061	2,0Ч10-5	-	-	-
RC18215	1,3Ч10-2	-	-	-
RC18121	1,0Ч10-2	4,0Ч10-2	-	-
E. carotovora subsp. carotovora 62А
RC5297	-	-	4,3Ч10-6	1
RC5191	-	1,0Ч10-5	0	0
M2-4/50RI	-	-	1,0	1,0Ч10-5
E. coli HB101	1,0	1,0	Ч	Ч

Таким чином, запропонована система фагів Т7 та FE44 дозволяє ідентифікувати системи рестрикції-модифікації та інші механізми обмеження репродукції фагів в клітинах ентеробактерій.

Для дослідження несумісності автономних генетичних елементів в клітинах Есс використовували екзогенні плазміди R68.45 та RP4.

Встановлено, що зменшення ефективності висіву фага ZF40wt на транскон'югантах коливається в межах 30 - 84% (рис.7). Найменший показник (30 - 56%) характерний для окремих транскон'югантів, що несуть плазміду R68.45 (рис. 7, колонки 4 - 8).



Рис. 1. Відносна ефективність висіву (ЕВ) фага ZF40wt на транскон'югантах E. carotovora subsp. carotovora : 1 - RC5297; 2, 3 - RC5297(RP4); 4 - 8 - RC5297(R68.45); 9 - 10 - RC5297y(RP4); 11 - 14 - RC5297y(R68.45)

Тобто наявність плазмід R68.45 та RP4 в клітинах індикаторних штамів RC5297 та RC5297y суттєво не впливає на репродукцію бактеріофага ZF40wt.

Незначне зменшення показника ефективності висіву даного фага на окремих транскон'югантах по відношенню до безплазмідного штаму можна пояснити різною швидкістю росту штаму Есс RC5297 та плазмідних транскон'югантів (рис. 2).

Рис. 2. Криві росту штамів E. carotovora subsp. carotovora: 1 - RC5297; 2 - RC5297(R68.45); В - концентрація клітин

Не дивлячись на те, що плазміда R68.45 не впливає на продуктивний розвиток фага ZF40wt, вона суттєво змінює показники лізогенного розвитку clear-мутантів даного фага (табл. 7).

Таблиця 7. Ефективність лізогенізації індикаторних штамів E. carotovora subsp. carotovora фагом дикого типу та його c-мутантами

Фаг	Частота відносної лізогенізації штамів	Кількість псевдолізогенів, %
	RC5297	RC5297(R68.45)	RC5297	RC5297(R68.45)
ZF40wt	1,00	1,00	33	13
c10 (n)	1,00	1,88	13	6
c9 (m)	0,86	2,70	40	2
c3 (l)	0,31	1,36	0,4	0
c6 (k)	0,28	0,73	11	0

Як видно з табл. 7, на плазмідному транскон'юганті збільшується відносна частота лізогенізації фаговими мутантами груп n, m, та l в порівнянні із фагом дикого типу. Представник групи l (мутант с6) при взаємодії з клітинами лізогенізував їх з меншою частотою, ніж фаг дикого типу. Лізогени плазмідного варіанту Есс RC5297(R68.45) виявились значно більш стабільними, ніж лізогени безплазмідного штаму Есс RC5297 (табл. 7). Характерне зниження стабільності лізогенів свідчить про переважання фагоносійства (псевдолізогенії) над справжньою лізогенією при первинному заражені клітин. Ймовірно, що плазміда R68.45 сприяє встановленню справжньої лізогенії.

При інфікуванні фагом ZF40wt та його clear-мутантами плазмідного штаму Есс RC5297(R68.45) кардинально змінюється характер лізогенії, незалежно від того, відбувається виключення фагом плазміди чи ні. Це виявляється в зміні співвідношення між індукованим виходом фага та MCTV у лізогенів (табл. 8). Найбільший вплив на стабільність дефектної лізогенії зумовлює мутант с9. Ці результати узгоджуються із даними щодо частоти відносної лізогенізації фагом ZF40wt та його clear-мутантами: інфікування клітин мутантом с9 збільшує даний показник в два рази в порівнянні з таким фага дикого типу (табл. 7).

Таблиця 8. Лізогенна індукція мітоміцином С штаму Есс RC5297(R68.45) після інфекції фагом ZF40wt та його с-мутантами

Фаг	pla-, imm+*	pla+, imm+*
	Титр	Співвідношення титрів	Титр	Співвідношення титрів
	Фаг	MCTV		Фаг	MCTV
ZF40wt	3Ч104	3Ч105	0,1	6Ч104	3Ч104	2,0
c10(n)	2Ч106	3Ч103	800,0	3Ч105	3Ч103	100,0
c9(m)	-	3Ч105	-	-	3Ч105	-
c3(l)	2Ч105	3Ч104	7,0	2Ч105	3Ч104	7,0
c6(k)	2Ч105	3Ч104	7,0	1Ч105	3Ч104	4,0

Примітка: *pla+ та pla- - наявність та відсутність плазміди відповідно; imm+ - імунність до повторного зараження фагом; титр MCTV, одержаних із клітин RC5297(R68.45), незараженних фагом (контроль), становив 3104; „-” - відсутність показника, пов'язана з відсутністю індукції фага

Для оцінки впливу фагової інфекції на екзогенну плазміду R68.45 визначали наявність позахромосомної ДНК в клітинах. Виявилось, що при цьому плазміда R68.45 елімінується з частотою 25% у випадку фага дикого типу та 43% - у випадку мутантів с9 та с6. Мутанти с3 та с10 займають проміжне положення і інфікування ними призводить до втрати плазміди з частотою 33%.

Таким чином, присутність плазміди R68.45 в клітинах E. carotovora, з одного боку, сприяє підвищенню лізогенізації фагом ZF40 та її стабільності, а з іншого - дестабілізує дефектну лізогенію E. carotovora RC5297. Фагова інфекція транскон'юганта може призводити до елімінації плазміди.

Розробка простого та зручного методу трансформації клітин E. carotovora є одним із важливих етапів в створенні векторів на основі екзогенних та її власних плазмід. Більшість описаних протоколів створення компетентності E. coli за допомогою хлориду кальцію передбачає використання клітин в активній логарифмічній фазі росту. В випадку різних штамів E. carotovora виявилось, що протягом 12 год культивування ервіній при 25 °С в периплазматичній фракції клітин відбувається накопичення нуклеаз, які повністю гідролізують ДНК фага л. На 24 год пул цих ферментів в периплазмі знижується.

Проведення трансформації в логарифмічній фазі росту не буде достатньо ефективним за рахунок гідролізу плазміди клітинними нуклеазами. Тому для отримання компетентних клітин використовували культуру, яка досягала стаціонарної фази росту, коли нуклеазна активність периплазматичної фракції клітин зменшувалась. Інша модифікація стандартного протоколу трансформації клітин E. carotovora полягала в підвищенні концентрації CaCl2 до 0,1М на 5108 кл/мл для одержання компетентних клітин.

За допомогою даних модифікацій вдалось провести трансформацію клітин Есс RC5297 плазмідою pECL18. Колонії трансформантів виростали на LB-чашках з 50 мкг/мл ампіциліну при 25 єС протягом 20 год.

Для підтвердження нормальної експресії генів плазміди pECL18 в клітинах E. carotovora RC5297(pECL18) крім росту на середовищі з ампіциліном було перевірено здатність даної плазміди обмежувати розвиток фагів за рахунок ендонуклеази рестрикції II типу Ecl18kI.

Незначне зменшення ефективності висіву (в межах одного порядку) фага ZF40с5/5 на штамі Есс RC5297(pECL18) скоріш за все свідчить про наявність для рестриктази Ecl18kI частково модифікованих сайтів на ДНК фага ZF40. Проте в випадку модифікованого фагового мутанта спостерігається значне зменшення ефективності висіву (табл. 9). Одержані результати свідчать про нормальну експресію генів плазміди pECL18 в клітинах трансформантів RC5297(pECL18), що призводить до синтезу рестриктази та обмеженню розвитку фагів за рахунок гідролізу їхньої ДНК. Значне зниження титру модифікованого фага ZF40с5/5/М2-4/50RI на штамі Есс RC5297(pECL18) свідчить про те, що і привнесена з плазмідою pECL18, і хазяйська RM-система штаму E. carotovora RC5297, ведуть себе автономно, тобто обмежують розвиток фагів незалежно одна від одної (табл. 9).

Талиця 9. Ефективність висіву clear-мутантів фага ZF40 на різних штамах E. carotovora

Фаг Штам	ZF40с5/5	ZF40с5/5/М2-4
RC5297	1,0	0,310-6
RC5297(pECL18)	0,35	менше 110-7
М2-4/50RI	0,910-5	1,0

Таким чином, за допомогою розробленого методу трансформації вдалось не тільки одержати трансформанти E. carotovora, але і встановити незалежну поведінку власних систем рестрикції-модифікації штаму Есс RC5297 та таких, привнесених з плазмідою pECL18.

ВИСНОВКИ

1. Фагочутливі штами E. carotovora subsp. carotovora характеризуються наявністю систем рестрикції-модифікації, які обмежують продуктивний розвиток фага ZF40 на 5 - 6 порядків. Ці системи є унікальними для ентеробактерій і на їх функціонування не впливають екзогенна RM-система плазміди pECL18 і продукт гена ard екзогенної плазміди рКМ101.

2. E. сarotovora subsp. carotovora синтезує унікальну ферментативну систему, для якої характерна ендо- та екзонуклеазна активність. Температурний діапазон прояву ендонуклеазної активності ферментів E. carotovora становить 8 - 14 єС, екзонуклеазної - 28 - 37 єС. Обмеження продуктивного розвитку фага ZF40 відбувається за участю ендонуклеаз.

3. На основі коліфага Т7 і полівалентного фага FE44 запропоновано систему для виявлення та типової ідентифікації рестрикції-модифікації E. carotovora та E. сoli. На відміну від фага Т7, FE44 не має гена антирестрикції типу ocr та не реагує на обмеження з боку F-плазміди.

4. Екзогенна плазміда R68.45 позитивно впливає на стабільність лізогенії за участю помірного бактеріофага ZF40wt і його clear-мутантів та одночасно дестабілізує дефектну лізогенію E. carotovora. Інфікування клітин фагом ZF40 може призводити до втрати плазміди R68.45 з частотою 25 - 43%.

5. На основі екзогенної плазміди pECL18 та дисоціанта Есс RC5297 розроблено метод трансформації клітин, який є підґрунтям для клонування та експресії чужорідних генів в клітинах E. carotovora.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Черватюк Н.В., Товкач Ф.И. Влияние экзогенной плазмиды R68.45 на продуктивное и лизогенное развитие умеренного бактериофага ZF40 Erwinia carotovora // Мікробіол. журн. - 2006. - т. 68, № 2. - С. 48-57.

2. Товкач Ф.И., Черватюк Н.В. Экспериментальная фаговая система для изучения рестрикции-модификации Erwinia carotovora // Мікробіол. журн. - 2006. - T. 68, № 62. - С. 27 - 35.

3. Черватюк Н.В., Товкач Ф.И. Горб Т.Е. Особенности трансформации клеток Erwinia carotovora плазмидой pECL18 // Доп. НАНУ. - 2007. - № 1. - С. 165 - 170. (Здобувач безпосередньо розробила метод трансформації клітин Erwinia carotovora, встановила незалежну поведінку систем рестрикції-модифікації та приймала участь у плануванні експерименту, аналізі і обговоренні отриманих даних).

4. Товкач Ф.И., Маковецкая О.А., Горб Т.Е., Черватюк Н.В. Характеристика трансконъюгантов Erwinia carotovora, несущих экзогенные плазмиды RP4 и R68.45 // IV Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”. - К.: Видавничо-поліграфічний центр “Київський університет”. - 2004. - С. 25. (Здобувач приймала участь в проведенні конюгаційного схрещування E. carotovora і E. coli та в аналізі і обговоренні одержаних результатів).

5. Черватюк Н.В. Влияние плазмиды R68.45 на лизогению Erwinia carotovora // Биология - наука XXI века: 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 18 - 22 апреля 2005 года). Сборник тезисов. - Пущино. - 2005. - С. 60 - 61.

6. Черватюк Н.В., Товкач Ф.И. Лизогенизация плазмидного штамма Erwinia carotovora умеренным бактериофагом ZF40 // Тези доповідей міжнародної конференції “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидилогія. Алелопатія”. - Київ. - 2005. - С. 55.

7. Черватюк Н.В. Создание модели для изучения рестрикции-модификации Erwinia carotovora // Биология - наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН (Пущино, 17 - 21 апреля 2006 года). Сборник тезисов. - Пущино. - 2006. - С. 219.

8. Товкач Ф.И., Черватюк Н.В., Кушкина А.И., Бурова Л.М., Панщина А.И., Иваница Т.В., Сергеева Ж.Ю., Горб Т.Е., Романюк Л.В. Перспектива создания биотехнологической системы на основе Erwinia carotovora, ее бактериофагов и плазмид // Тези доповідей міжнародної наукової конференції “Мікробні біотехнології” (Одесса, 11 - 15 вересня, 2006). - Одеса: Астропринт. - 2006. - С. 30.(Здобувачем особисто показано можливість отримання трансформантів Erwinia carotovora).

9. Chervatyuk N. Restriction enzymes of the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovora // Modern problem of microbiology and virology: book of abstracts (Odessa, 28 - 31, May 2007). - Odessa: Astroprint. - 2007. - P. 166.

АНОТАЦІЯ

Черватюк Н.В. Функціональна несумісність автономних генетичних елементів у Erwinia carotovora. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Вперше показано, що клітини E. carotovora subsp. carotovora RC5297 та M2-4/50RI синтезують унікальний ферментний комплекс з ендо- та екзонуклеазною активністю. Ендонуклеазна активність лізатів клітин виявляється при 8 - 14 єС, а екзонуклеазна - при 28 - 37 єС. Встановлено, що обмеження продуктивного розвитку фага ZF40 відбувається за участю ендонуклеаз.

Показано, екзогенна плазміда рКМ101, яка містить ген ard, що послаблює рестрикцію I типу E. coli, не впливає на ефективність висіву фага ZF40. Встановлено незалежне обмеження продуктивного розвитку фага ZF40 системою рестрикції-модифікації екзогенної плазміди pECL18 і хазяйською RM-системою штаму RC5297.

Для дослідження рестрикції-модифікації Е. carotovora запропоновано оригінальну систему на основі вірулентних полівалентних бактеріофагів FE44 та T7, специфічних щодо ентеробактерій. Фаг FE44, на відміну від фага Т7, не має гена антирестрикції типу ocr та не реагує на обмеження з боку F-плазміди.

Вперше досліджено особливості фаго-плазмідної взаємодії в клітинах ервіній. Показано, що екзогенна плазміда R68.45 підвищує стабільність лізогенії за участю фага ZF40 та його clear-мутантів та дестабілізує дефектну лізогенію E. carotovora. Найбільший вплив на стабільність дефектної лізогенії зумовлює clear-мутант с9 групи комплементації m.

Вперше показано, що на трансформацію клітин E. carotovora впливає ферментний комплекс, нуклеазна активність якого залежить від стадії росту культури бактерій. Трансформацію клітин E. carotovora RC5297 плазмідою pECL18 здійснено в стаціонарній фаза росту культури, коли знижується нуклеазна активність штаму.

Ключові слова: Erwinia carotovora, помірний бактеріофаг ZF40, автономні генетичні елементи, системи рестрикції-модифікації, плазміди, нуклеази, трансформація.

АННОТАЦИЯ

Черватюк Н.В. Функциональная несовместимость автономных генетических элементов у Erwinia carotovora. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Работа выполнена в рамках теоретической концепции несовместимости автономных генетических элементов: бактериофагов, плазмид, систем рестрикции-модификации.

Впервые показано, что клетки E. carotovora subsp. carotovora RC5297 и M2-4/50RI синтезируют уникальный ферментный комплекс с эндо- и екзонуклеазной активностями. Эндонуклеазная активность лизатов клеток выявляется при 8 - 14 єС, а экзонуклеазная - при 28 - 37 єС. Установлено, что ограничение продуктивного развития фага ZF40 происходит при участии эндонуклеаз. Эффективность посева фага коррелирует с температурным диапазоном действия этих ферментов.

Показано, что экзогенная плазмида рКМ101, которая содержит ген ard, ослабляющий рестрикцию I типа E. coli, не влияет на эффективность посева фага ZF40. Установлено независимое ограничение продуктивного развития фага ZF40 системой рестрикции-модификации экзогенной плазмиды pECL18 и хозяйской RM-системой штама RC5297.

Для исследования рестрикции-модификации Е. carotovora предложена оригинальная система на основе вирулентных поливалентных бактериофагов FE44 и T7, специфичных в отношении энтеробактерий. Оба фага содержат рецепторы в коровой части липополисахарида энтеробактерий, что можно использовать для увеличения круга чувствительных хозяев данных фагов за счет получения R-форм бактерий. Фаг FE44, в отличие от фага Т7, не содержит гена антирестрикции типа ocr и не реагирует на ограничения со стороны F-плазмиды.

Впервые исследованы особенности фаго-плазмидного взаимодействия в клетках эрвиний. Показано, что екзогенная плазмида R68.45 повышает стабильность лизогении при участии фага ZF40 и его clear-мутантов и дестабилизирует дефектную лизогению E. carotovora. Наибольшее влияние на стабильность дефектной лизогении оказывает фаговый clear-мутант с9 группы комплементации m.

Результаты исследований несовместимости автономных генетических элементов и роли нуклеаз в ограничении фаговой репродукции позволили осуществить трансформацию клеток E. carotovora. Впервые установлено, что на трансформацию клеток E. carotovora влияет ферментный комплекс, нуклеазная активность которого зависит от стадии роста бактерий. Трансформация клеток E. carotovora RC5297 плазмидой pECL18 возможна при условиях, когда нуклеазная активность штамма минимальна.

Ключевые слова: Erwinia carotovora, умеренный бактериофаг ZF40, автономные генетические элементы, системы рестрикции-модификации, плазмиды, нуклеазы, трансформация.

RESUME

Chervatyuk N.V. Functional incompatibility of autonomous genetic elements in Erwinia carotovora. - Manuscript.

Thesis for Candidate`s degree in specialty 03.00.06 - Virology. - Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

The work realized by the theoretic conception of the incompatibility of autonomous genetic elements: bacteriophages, plasmids, restriction-modification systems.

First, it was described that cells of E. carotovora subsp. carotovora RC5297 and M2-4/50RI produce the unique enzyme complex with the endo- and exonuclease activity. The endonuclease activity of cells lysates becomes apparent at 8 - 14 єС, and exonuclease activity becomes apparent at 28 - 37 єС. The productive growth of the ZF40 phage limits by endonucleases.

It was described that exogenous pKM101 plasmid that contains ard gene which overcomes I type restriction E. coli doesn't influence on the ZF40 plating efficient. Independent limitation of ZF40 phage productive growth by the restriction-modification system of exogenous plasmid pECL18 and homing RM-system of strain RC5297 was shown.

For research modification restriction Е. carotovora the original system on the basis of virulent polyvalent bacteriophages FE44 and T7, specific rather enterobacteria were offered to updating. Phage FE44, unlike phage T7, has no gene type ocr and does not react to restriction from F-plasmid.

For the first time it was investigated features phage-plasmid interactions in erwinia's cells. It was shown, that exogenous plasmid R68.45 raises lysogeny stability at participation of phage ZF40 and its clear-mutants and destabilizes defective lysogeny of E. carotovora. The greatest influence on defective lysogeny stability determines clear-mutant с9 of m complementation group.

For the first time it was shown, that transformation of E. carotovora cells was influenced with an enzyme complex, which nuclease activity depends on a stage of bacteria growth. Transformation of cells E. carotovora RC5297 by plasmid pECL18 was carried out in a stationary growth phase of bacteria when decreases nuclease activity of strain.

Key words: autonomous genetics elements, temperate bacteriophage ZF40, Erwinia carotovora, restriction-modification systems, plasmids, nucleases, transformation.

Размещено на Allbest.ur

...