Вплив кріоконсервованого екстракту плаценти на серцево-судинну систему лабораторних тварин в умовах загального охолодження

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК:612.592:615.361.013.85.014.41:591.41.084

Вплив кріоконсервованого екстракту плаценти на серцево-судинну систему лабораторних тварин в умовах загального охолодження

03.00.19-кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Черемський Антон Костянтинович

Харків 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: кандидат медичних наук, старший науковий співробітник Прокопюк Ольга Степанівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу „Низькотемпературний банк біологічних об'єктів”, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, м. Харків

доктор медичних наук, Бачериков Андрій Миколайович, Український науково-дослідний інститут клінічної та експериментальної неврології і психіатрії, завідувач відділу невідкладної психіатрії та наркології, м. Харків.

Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, кафедра біохімії

Захист дисертації відбудеться „13” березня 2007р. о 13³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради D 64.242.01. в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України( 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою м. Харків, вул. Переяславська, 23

Автореферат розіслано „12” лютого 2007р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01, член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.

охолодження серцевий кріоконсервований плацента

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У сучасній кріобіології актуальними є дослідження впливу холоду на живі організми. На цей час відомості з морфології, біохімії й фізіології загального охолодження представлені досить повно, але способи підвищення стійкості теплокровних організмів до переохолодження вивчені недостатньо.

Загальне охолодження в природних умовах носить аварійний характер і тому набуває рис неспецифічної стресорної реакції.

Стан загального охолодження стосується практично всіх функціональних систем організму. При цьому реакції на охолодження можуть бути різні залежно від ряду умов: виду теплокровного організму, його віку, ступеня акліматизації до холоду, наявності тієї або іншої патології, а також особливостей охолодження (способу, швидкості й глибини зниження температури тіла тощо) [Акимов Г.А. и др., 1977]. Загальне охолодження в першу чергу впливає на центральну нервову систему, серцево-судинну систему й систему дихання. При цьому значно виснажуються енергетичні ресурси організму, розвивається гіпоксія. Дія низьких температур приводить до зміни ряду фізіологічних і біохімічних процесів у живому організмі, у тому числі реологічних характеристик крові, гормонального статусу й структурно-функціонального стану біомембран [Даценко Г.В. та ін., 2001; Jansky L., 2003].

Істотний інтерес мають роботи про дію загального охолодження на функцію кровообігу. Цей вплив проявляється в зміні ритму серцевих скорочень, скоротності міокарду, тонусу судинної системи, обсягу циркулюючої крові й ін. [Роздильская О.Н. и др., 1994; Heush G. et al., 1994; Жураківська О.Я., 2003].

Науковий інтерес мають дослідження, спрямовані на вивчення проникності гематоенцефалічного бар'єра (ГЕБ) при періодичній дії екстремально низьких температур, оскільки від ступеня його проникності залежать адаптивні реакції серцево-судинних і центральної нервової систем організму на стресори [Марченко В.С и др., 2001]. Було встановлено, що посилення протифазних коливань проникності ГЕБ для симпато- і парасимпатомиметиків при гіпотермії може відновити фізиологічну ритміку функціонування ГЕБ, оптимізувати прямі й зворотні зв'язки в центральній нервовій і серцево-судинній системах.

У цей час актуальним завданням кріобіології є пошук способів, що підвищують стійкість гомойотермних організмів до ушкоджуючої дії холоду. Одним з можливих шляхів вирішення даної проблеми може бути пошук біологічно активних сполук, що мають захисні властивості при холодовому стресі.

Використання кріоконсервованих біооб'єктів плацентарного походження виявилося ефективним у корекції різних патологічних порушень організму людини. Відомо, що плацента містить весь спектр гормонів, вітамінів, імунорегуляторів, ростових факторів і інших біологічно активних речовин, які забезпечують формування і розвиток організму плода. Експериментальні дані дозволяють констатувати, що при використанні плаценти виникає стимуляція ендокринних органів, тканини печінки, поліпшується трофіка серцево-судинної системи, підвищується репаративна здатність тканин. Застосування кріоконсервованих фрагментів плаценти впливає на органи-мішені, стимулюючи їх функцію, підвищує неспецифічну резистентність організму до несприятливих факторів зовнішнього середовища і стресових ситуацій [Грищенко В.І. та ін., 1996, 1999, 2003]. У зв'язку з цим препарати плаценти, на наш погляд, можуть позитивно впливати на стабілізацію основних показників гомеостазу, які порушуються при переохолодженні, і використовуватись для корекції або профілактики патологічних порушень, що виникають при впливі холоду на теплокровний організм.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами й темами. Робота виконана в рамках науково-дослідної теми Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України №2.2.6.16. “Проведення наукових досліджень, розробка та втілення інформаційних та технічних заходів, необхідних для збереження й використання наукового об'єкта - низькотемпературного банку біологічних об'єктів” № держ. реєстрації 0104U006441.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з'ясування характеру впливу на стан серцево-судинної системи теплокровного організму кріоконсервованого екстракту плаценти (КЕП) в умовах загального охолодження.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Провести аналіз динаміки вмісту катехоламінів у експериментальних тварин після введення КЕП в умовах загального охолодження.

2. Проаналізувати варіабільність ритму серця лабораторних тварин за даними ЕКГ після введення КЕП на фоні холодового стресу.

3. Вивчити морфофункціональні та мікрогемоциркуляторні особливості кровоносного русла різних органів лабораторних тварин після введення КЕП в умовах загального охолодження.

4. Дослідити реологічні властивості крові тварин, що охолоджувалися, після попереднього введення КЕП.

5. Оцінити особливості впливу КЕП на прооксидантно-антиоксидантну систему лабораторних тварин в умовах загального охолодження.

Об'єкт дослідження - стан серцево-судинної системи щурів в умовах загального охолодження після попереднього введення кріоконсервованого екстракту плаценти.

Предмет дослідження - дія кріоконсервованого екстракту плаценти на серцево-судинну систему тварин в умовах холодового стресу.

Методи дослідження. У роботі були використані морфологічні, біохімічні методи, методи оцінки реологічних показників крові, метод спектрального аналізу варіабільности ритму серця, методи імуноферментного аналізу і прижиттєвої біомікроскопії. Статистичну обробку отриманих експериментальних даних проводили за методом Стьюдента-Фішера.

Наукова новизна отриманих результатів. Отримані дані свідчать, що речовини, які містяться в кріоконсервованому екстракті плаценти, розширюють функціональні можливості теплокровного організму в умовах холодового стресу.

Встановлено, що кріоконсервований екстракт плаценти підвищує виживаність тварин, що піддавалися загальному охолодженню у воді при температурі +4єС на етапі самовідігрівання.

Уперше встановлено, що застосування кріоконсервованого екстракту плаценти приводить до перебудови роботи гуморальної ланки стресової реакції, що у свою чергу, дозволяє організму переносити холодовий стрес.

Також було показано, що введення кріоконсервованого екстракту плаценти приводить до активізації метаболічних процесів у різних органах. Це знаходить своє відбиття в збільшенні кількості й довжини мікросудин, накопиченні глікогену в якості енергетичного субстрату у клітинах, а це, в свою чергу, дозволяє тваринам ефективніше переносити холодовий стрес в умовах самовідігрівання.

Введення кріоконсервованого екстракту плаценти дозволяє знизити наростання в'язкості й гематокриту крові в процесі охолодження щурів, і тим самим попереджає виникнення гемореологічних розладів в організмі при холодовому стресі.

Отримано нові оригінальні дані, щодо нормалізації прооксидантно-антиоксидантного балансу у сироватці крові, серці й печінці піддослідних тварин після введення КЕП в умовах охолодження, що свідчить про активацію біохімічних механізмів, які сприяють компенсації порушень, викликаних дією холоду.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані дозволяють глибше зрозуміти механізми дії холодового стресу та КЕП на серцево-судинну систему ссавців. В цілому, отримані результати можуть бути застосовані в медичній практиці для профілактики і лікуванні патологічних порушень, які виникають при переохолодженні.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором сформульована мета і визначені задачі роботи, проведені і проаналізовані експерименти, статистично оброблені результати, сформульовані висновки роботи, які базуються на експериментальних даних. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

· у роботі [1] вивчено вплив загального охолодження та кріоконсервованого екстракту плаценти (КЕП) на мікроцикуляцію підшкірної клітковини та печінки;

· у роботі [2] вивчено вплив КЕП в нормі та в умовах загального охолодження на інтенсивність перекисного окислення ліпідів та вміст ТБК-активних продуктів в сироватці крові, серці та печінці;

· у роботі [3] досліджено вплив КЕП на морфофункціональні показники шкіри, кісткових м'язів, кори головного мозку, міокарду, печінки, наднирників та нирок в умовах загального охолодження;

· у роботі [4] вивчено вплив КЕП на варіабільность ритму серця та гемореологічні показники в умовах загального охолодження;

· у роботі [5] вивчено вплив КЕП на виживаність щурів при переохолодженні;

· у роботі [6] досліджена позитивна дія КЕП при загальному охолодженні на гормональний статус щурів;

· у роботі [7] показана позитивна дія КЕП на загальні фізіологічні показники організму щурів в умовах дії холодового стресу.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи повідомлені й обговорені на науково-практичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (Харків, 2004р.), науково-практичній конференції “Актуальні питання функціональної морфології” (Полтава, 2005р.), міжнародній науково-практичній конференції “Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології” (Четверті Данилевські читання) (Харків, 2005р.), на 1 з'їзді фізіологов СНД “Физиология и здоровье человека” (Сочи, 2005р.), конференції з міжнародною участю „Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2005р.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, з яких 4- у фахових наукових журналах, 3- у збірниках матеріалів конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 123 сторінках друкованого тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, заключення, висновків і переліку використаних джерел (13 сторінок), що включає 132 джерело. Дисертація ілюстрована 13 таблицями та 39 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали й методи досліджень

Експерименти проведені на статевозрілих (6 міс.) безпородних щурах-самцях масою 180 - 220г (197 тварин), що втримувались в стандартних умовах віварію ІПКіК НАН України.

В роботі застосувався дозволений Міністерством охорони здоров'я України препарат Кріоцел-кріоекстракт плаценти (сертифікат ДР №604/06-300200000). У складі КЭП є такі біологічно активні речовини: б-фетопротеїн; хоріонічний гонадотропін; естрадіол; прогестерон; пролактін; б-мікроглобулін фертильности; СТГ; лютеїнізуючий гормон; фоликулостимулюючий гормон; ТТГ; фактор некрозу пухлини; тестостерон; кортизол.

Тварини були розділені на 4 групи. Контролем служила 1-а група інтактних тварин. Щурів 2-ї і 4-ї груп піддавали загальному охолодженню. Тваринам 3-ї і 4-ї груп внутрішньочеревинно вводили кріоконсервований екстракт плаценти (КЕП) одноразово протягом 5-ти днів. Доза КЕП дорівнювала 0,1мл/100г маси тварини. Тварин 4-ї групи охолоджували через добу після курсу введення екстракту.

Всі маніпуляції з тваринами проводили, дотримуючись положення Європейської конвенції по охороні хребетних тварин і національного законодавства по гуманному поводженню із тваринами (Страсбург, 1986р.).

Загальне охолодження лабораторних тварин здійснювалося у водяній бані при температурі +4єС, де тварина плавала, не маючи можливості опиратися на стінки й дно резервуару. Тварин витягали в момент, коли вони втрачали здатність триматися на поверхні води. Щури поміщалися у водяну баню без попередньої адаптаційної підготовки до впливу холодового стресу. У силу значних рухових артефактів електричну активність серця реєстрували після витягу тварин з води. У процесі проведення методики здійснювався контроль ректальної температури за допомогою термометра, а також реєструвався час плавання щурів.

Дослідження рівня гормонів у сироватці крові. Визначення рівня норадреналіну, тестостерону та естрадіолу у сироватці крові проводили за допомогою модифікованого методу твердофазного конкурентного імуноферментного аналізу із застосуванням моноклональних антитіл. Концентрацію гормонів у пробі обчислювали по каліброваній кривій. Величину оптичної щільності розчинів вимірювали на планшетному спектрофотометрі Statfax 2100 (USA) вертикального сканування при довжині хвилі 490 нм протягом 60 хв. Для визначення рівня норадреналіну використовувався набір реагентів "NORADRENALІ ELІSA" (Germany), а для визначення вмісту эстрадіолу та тестостерону використався набору "Хема-медика" (Росія).

Варіабільність ритму серця (ВСР). Електрокардіограми реєструвалися на електрокардіографі серії “Полі-Спектр” в 6 стандартних відведеннях. При спектральному аналізі ВСР нами були визначені та проаналізовані такі показники:

ТР, (мс²) - загальна потужність спектру коливань кардіоритму ( 0,003-0,4 Гц);

HF, (мс²) - високочастотні коливання (0,15-0,4 Гц);

LF, (мс²) - низькочастотні коливання (0,04-0,15Гц).

VLF, (мс²) - потужність спектру кардіоритму в області понад низьких частот (0,003-0,04Гц).

LF/HF - баланс симпатичних та парасимпатических впливів на серцевий ритм.

Аналіз показників варіабільності серцевого ритму (ВСР) проводили за допомогою програми “Полі-Спектр-Ритм” [Михайлов В.М., 2002].

Динаміку мікрогемоциркуляторних процесів вивчали методом контактної біомікроскопії за допомогою мікроскопа ЛЮМАМ К-1, оснащеного засобами фото- і відеореєстрації в режимі on line. Температуру тканин протягом експериментальних досліджень вимірювали мідь-константановими термопарами, підключеними до вольтметра універсального В7-21А.

Морфологічне вивчення судинного русла. Проводили морфологічний аналіз судинного русла кори головного мозку, міокарду, печінки наднирників, нирок, шкіри та скелетних м'язів тварин за допомогою гістологічних і гістохімічних методів. Ділянки органів фіксували в 10%-му нейтральному формаліні з наступним заливанням у парафін, а ділянки шкіри _ у целоїдин. Отримані з парафінових і целоїдинових блоків зрізи товщиною 6-8 мк фарбувалися гематоксиліном і еозіном для одержання оглядових гістологічних препаратів і пікрофуксіном по Ван Гізону для виявлення колагенових волокон. Вміст глікозаміногліканів, мукопротеїнів і глікогену встановлювався за допомогою комбінованого методу з альціановим синім [Mowry R.W., 1963].

Вивчення реологічних властивостей крові. Динамічну в'язкість крові визначали на капілярно-рамковому віскозиметрі типу Копли [99] у модифікації при напругах зсуву 2,85; 3,80; 5,70; 7,60; 9,50 дин/см², які характерні для різних відділів мікроциркуляторного русла. Калібрування приладу проводили 40%-ным розчином сахарози.

Величину динамічної в'язкості визначали по формулі:

з= 100gr⁴/ 8RІlz Pt (сП),

де r- радіус капіляра у вузькій частині (см), l- довжина вузької частини капіляра (см), R- радіус капіляра в широкій частині (см), z- відстань, прохідна меніском по широкій частині капіляра (див), t- час (с), Р - тиск у системі, з - в'язкість (сП)

Для визначення гематокритного числа використовувався мікрометод із застосуванням капіляра Панченкова. Капіляр з кров'ю центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хв. Потім відзначали кількість розподілів, займаних стовпчиком з еритроцитів, у результаті обчислювали гематокритне число у відсотках [Ронин В.С., Старобинец Г.М., 1989]

Вивчення процесів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ). При дослідженні інтенсивності ПОЛ середовище інкубації містило 100мМоль трис- HCl, рН 7,4 і 1,5-3,0мг білка в 1мл. При аскорбат-індукованому ПОЛ середовище додатково містило 0,5мМ аскорбату й 12мкМоль солі Мору. Реакцію проводили на водяній бані-качалці при температурі 37єС протягом 20хв. Визначення малонового діальдегіду (МДА) проводили, як описано в роботі Владимирова Ю.А. й Арчакова А.І. (1972).

Визначення ТБК-активних продуктів у гомогенатах печінки й серця щурів проводили за методом Ohkava Н. et.al.(1979), а в сироватці крові - за методом Asakova Т. et.al.(1980).

Антиокисну активність сироватки крові визначали по її здатності гальмувати залізо-індуковане окислювання жовточних ліпопротеїдів [Клебанов Г.І. та ін., 1988].

Активність церулоплазміну визначали, як описано в роботі Мжельскої Т.І. і ін. (1989).

Каталазну активність у гомогенатах печінки й серця вимірювали, як описано в роботі Marklund S. et al. (1981).

Супероксиддисмутазну активність у гомогенатах тканин і сироватці крові вимірювали, як описано в роботі Beavchamp C. et al. (1971).

Вміст білка в гомогенатах печінки й серця визначали за методом Lowry et al. у модифікації Miller (1959), використовуючи людський сироватковий альбумін як стандарт.

Статистична обробка результатів. Отримані результати обробляли за методом Ст'юдента-Фішера.

Результати власних досліджень і їх обговорення

Вплив КЕП на виживаність лабораторних тварин після загального охолодження. Виживаність гомойотермних тварин, які піддавалися загальному охолодженню, є кардинальним і інтегральним критерієм стійкості організму до холодового стресу. Загибель тварин може відбутися як безпосередньо при охолодженні, так і на етапі самовідігрівання.

Введення КЕП не зробило якого-небудь впливу на поведінкові реакції лабораторних тварин у процесі охолодження. Слід зазначити також, що не виявлено розходжень ректальної температури та часу плавання у тварин, які піддавалися охолодженню, і тварин, яким перед охолодженням уводили КЕП (табл.1). Водночас на етапі самовідігрівання у 2-й експериментальній групі (охолодження) загинуло більше 90% тварин, у той час щури, які одержували КЕП, виявилися більш стійкими до впливу переохолодження: в 4-й групі виживаність тварин дорівнювала 86,6 % (табл.1).

Таблиця 1

Вплив КЕП на виживаність тварин, які піддавалися загальному охолодженню (n=10, M±m)

Групи тварин	Маса(г)	t плав. (сек)	TR (єС)	Виживаність,%
2(охолодження)	150±25	476±30	17,5±1,4	6,7±0,3
4(КП+охол.)	150±25	504±33	18,0±1,6	86,6±3,4*

Примітка: *- р<0,005 порівняно з 2-ю групою тварин

Отримані дані свідчать, що кріоконсервований екстракт плаценти підвищує виживаність тварин, які піддавалися загальному охолодженню.

Вивчення рівня гормонів в сироватці крові після введення КЕП в умовах загального охолодження. Загальне охолодження організму є сильним стресом, при якому концентрація катехоламінів у крові й периферичних тканинах різко зростає [Хочачка С., Сомеро Д, 1988; Султанов Ф.Ф. и др., 1991]. Норадреналін здійснює найважливіший вплив на серцево-судинну систему і стимулює теплопродукцію в організмі через дію на енергетичні субстрати. Виходячи із цього, було доцільно визначити рівень цього гормону у лабораторних тварин в умовах експерименту.

Було показано, що при загальному охолодженні вміст норадреналіну в крові лабораторних тварин (2-а група) збільшився в 17-20 разів.

Попереднє введення кріоконсервованого екстракту плаценти (щури 3-ї групи) приводило до підвищення вмісту норадреналіну у крові близько 20% порівняно з нормою. За літературними даними такий рівень катехоламінів характерний для тварин, які пройшли аклімацію до переохолодження [Иванов К.П. и др., 1984].

У тварин 4-ї групи введення КЕП при загальному охолодженні нормалізувало рівень катехоламінів у крові. Імовірним поясненням даної реакції, на нашу думку, може бути загальне посилення метаболічних процесів в організмі експериментальних тварин після введення КЕП. Але для детальнішого пояснення отриманого результату необхідні подальші дослідження.

Зміна рівня норадреналіну представлена на рис. 1.

Рис. 1 Рівень норадреналіну в сироватці крові експериментальних тварин

Також вивчався рівень эстрадіолу та тестостерону. Необхідність визначення стероїдних полових гормонів у тварин у ході експерименту обумовлена, у першу чергу, тим, що застосовуваний у роботі КЕП містить у високій концентрації гонадотропіни та полові стероїдні гормони. Введення в організм цих з'єднань у вигляді монотерапії може викликати стимуляцію секреції полових стероїдних гормонів, або інгібіцію їх синтезу.

Було показано, що введення КЕП експериментальним тваринам не приводить до дисбалансу полових гормонів у сироватці крові.

На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що застосування екстракту плаценти експериментальним тваринам в умовах загального охолодження сприяє нормалізації рівня катехоламінів у крові. Також не зареєстровано достовірної зміни рівня эстрадіолу та тестостерону в сироватці крові лабораторних тварин як після введення КЭП, так і після загального охолодження, у порівнянні з інтактними тваринами.

Коливання рівня норадреналіну в крові експериментальних тварин знаходить своє відбиття в електрофізіологічних корелятах роботи серця.

Вплив КЕП на варіабільність ритму серця (ВРС) лабораторних тварин в умовах загального охолодження. Метод спектрального аналізу ВРС об'єктивно відбиває стан нейрогуморальної регуляції й дозволяє на цій основі оцінити загальний функціональний стан і адаптаційні резерви організму.

При дослідженні ВРС було показано, що стан нейрогуморальної регуляції тварин 4-й групи (КЕП +охолодження) (рис.2), у порівнянні із тваринами 3-ї групи (тільки КЕП), характеризується зниженням рівня як парасимпатичних (HF), так і симпатичних впливів (LF) на серцевий ритм, а так само знижується рівень гуморально-метаболічних впливів на ритм серця. Відповідно знижується загальна потужність спектра нейрогуморальної регуляції (ТР). Однак порівнюючи показники спектрального аналізу ВРС тварин 4-ї експериментальної групи з аналогічними показниками спектрального аналізу ВРС 2-ї групи тварин (охолодження), ми встановили, що загальний функціональний стан організму щурів значно змінився, що насамперед пояснюється підйомом загальної потужності спектра, активацією симпатичних і парасимпатичних впливів на ритм серця (рис.2).

Рис. 2 Показники спектрального аналізу ВРС 4-х груп експериментальних тварин

Отримані дані можуть свідчити про підвищення адаптаційних можливостей організму тварин до дії низьких температур. Однак в першій групі інтактних тварин величина показників спектрального аналізу (ТР, VLF, LF, HF), а відповідно й функціональні резерви організму залишалися вище ніж у щурів після введення екстракту плаценти в умовах загального охолодження.

Вивчення морфофункціональних змін кровоносного русла тварин, після введення КЕП та загального охолодження. Порушення функції серцево-судинної ситеми при охолодженні організму приводить до патологічних змін органів та тканин. При гістологічному дослідженні у тварин 2-ї групи (охолодження) виявлено характерну картину порушень, що виникають після загального охолодження. А саме були зафіксовані набряки, венозний стаз, крововиливи, спазмування судин тощо в міокарді, шкірі, скелетних м'язах, корі головного мозку, печінці, наднирниках і нирках (рис.3).

Після введення тваринам КЕП (3 група) практично в усіх вивчених органах виявлено збільшення кількості, довжини просвіту кровоносних судин, у порівнянні з інтактними тваринами (рис.4).

Патологічні зрушення морфофункціонального стану тканин та органів тварин 4-ї групи (КЕП+охол.) (рис.5) мали зворотній характер, у порівнянні з 2-ю групою тварин. В 4-й групі тварин спостерігався більш високий рівень адаптаційно-пристосувальних процесів, який знаходив відображення у гіперваскулярізації, і як наслідок, - активізація обмінних процесів після введення КЕП сприяє підвищенню процесів теплообміну між периферичними та внутрішніми органами, відновленню водно-сольвого балансу, редукції набряків та дистрофічних процесів, покращенню трофіки життєво важливих органів при загальному охолодженні на етапі самовідігрівання.

Вивчення мікрогемоциркуляції та реологічних показників крові після введенні КЕП на фоні загального охолодження. При оцінці ефективності функції серцево-судинної системи у забезпеченні трофіки, газообміну органів і тканин, а також гомеостазу організму в цілому важливу роль відіграє мікрогемоциркуляція. Висока мінливість морфофункціонального стану мікрогемоциркуляторного русла при стресорних реакціях може бути використаною для характеристики адаптації чи дезадаптації організму в умовах охолодження. Отримані дані про стан мікрогемоциркуляції підшкірної клітчатки, скелетних м'язів та печінки збігаються з результатами гістологічних досліджень. Комплексна дія КЕП та загального охолодження (4 група тварин) приводила до погіршення стану мікрогемоциркуляторного русла відносно 3-ї групи експериментальних тварин (КЕП). Проте у порівнянні з 2-ю групою тварин (охолодження) картина мірогемоциркуляції у 4-й групі була принципіально більш сприятливою відносно прогнозу виживаності тварин. Так, у мікросудинах підшкірної клітчатки зберігався кровообіг, хоча частина з них одразу після охолодження була звужена та заповнена плазмою без формених елементів. В судинах скелетних м'язів зберігався кровообіг. В печінці зберігався уповільнений кровобіг у всіх елементах мікрогемоциркуляторного русла. Виявлене збереження кровообігу у всіх досліджених органах та тканинах після попереднього введення КЕП при охолодженні захищало означені структури від гіпоксії, накопичення метаболітів, зберігало трофіку, що в результаті дозволило піддослідним тваринам перенести негативний вплив холоду та ефективно перебудуватися на етапі самовідігрівання.

Відомо, що істотна роль у порушенні кровообігу при охолодженні організму належить гемореологічним змінам [Кощєєв В.С. і ін., 1981, Ліпіна О.В. і ін., 1991].

В процесі експерименту було встановлено, що в міру охолодження організму відбувається збільшення в'язкості крові та гематокриту в порівнянні з інтактними тваринами (табл.2).

Таблиця 2

Зміна реологічних властивостей крові щурів в умовах експерименту

Групи тварин	В'язкість крові, сП	Гемато-крит,%
	Напруга зсуву, дин/смІ
	2,85	3,80	5,70	7,60	9,50
1 (інтактні)	10,0±1,5	9,6±1,1	8,1±0,7	5,5±0,5	4,6±0,3	34±0,6
2 (охол.)	44,5±3,7*	32,1±3,5	30,1±2,9	17,0±2,1	13,8±1,5	45±0,9
3 (КЕП)	14,2±2,3*	12,3±1,7	10,2±1,6	8,9±0,9	7,0±0,7	35±0,7
4( КЕП+охол.)	21,6±2,7**,***	15,4±1,8	14,7±1,7	12,1±1,0	9,5±0,5	38±0,8

Примітка: *- р<0,005 порівняно з 1-ю групою; **- р<0,005 порівняно з 2-ю групою; ***- р<0,005 порівняно з 3-ю групою.

Введення КЕП дозволяє знизити наростання в'язкості крові та гематокриту в процесі охолодження щурів і тим самим попереджає виникнення гемореологічних розладів в організмі при холодовому стресі.

Вивчення перекісного окислення ліпідів при комплексній дії КЕП та загального охолодження. Серед основних механізмів холодового ушкодження мембран останнім часом значну роль відводять вільнорадикальному ушкодженню біомолекул [Нікитченко Ю.В., Овсянніков С.Е., Мазалов В.К., Луговий В.Й., 1989].

Отримані в роботі дані дозволяють стверджувати, що загальне охолодження контрольних тварин збільшує вміст ТБК-активних продуктів (табл.3) і інтенсивність спонтанного й аскорбат-індукованого ПОЛ в гомогенатах серця (табл.4), печінки й сироватці крові. При цьому антиокисна активність сироватки крові та активність супероксиддисмутази в гомогенатах серця, печінки і сироватці крові знижувалася, а активність церулоплазміну і каталазна активність не змінювалась.

Таблиця 3

Вплив кріоконсервованого екстракту плаценти на вміст ТБК-активних продуктів у гомогенатах серця щурів у нормі й після загального охолодження

Групи тварин	ТБК-активні продукти, нМольМДА/мг білка
1 (інтактні)	0,235±0,011
2 (охолодження)	0,336±0,021*
3 (КЕП)	0,262±0,012**
4 (КЕП+охол.)	0,268±0,018***

Примітка: *- р<0,005 порівняно з нормою; **- р<0,005 порівняно з 2-ою групою ***- р<0,005 порівняно з 3-ою групою

Таблиця 4

Вплив КЕП на інтенсивність спонтанного и аскорбат-індукованого ПОЛ в гомогенатах серця щурів після загального охолодження (M±m; n=6-7)

Групи тварин	нмольМДА/мгбілка за 20хв. інкуб.
	Спонтанне ПОЛ	Аскорбат-індуковане ПОЛ
1 (інтактні)	0,350±0,012	0,74±0,17
2 (охолодження)	0,466±0,030*	2,14±0,58*
3 (КЕП)	0,384±0,025	2,12±0,35*
4 (КЕП+охол.)	0,363±0,028**	1,96±0,49*

Примітка *- р<0,005 порівняно з 1-ю групою; **- р<0,005 порівняно з 3-ю групою.

КЕП нормалізує антиокисну активність і активність супероксиддисмутази в сироватці крові, гомогенатах серця й печінки експериментальних тварин (табл.5), знижує накопичення ТБК- активних продуктів (на 30%) (табл.2) і інтенсивність спонтанного й аскорбат-індукованого ПОЛ (на 10%) (табл. 4) у вивчених тканинах.

Таблиця 5

Вплив КЕП на антиокисну активність, активність церулоплазміну та супероксиддисмутазную активність сироватки крові щурів в умовах загального охолодження (M±m; n=6-7)

Групи тварин	AOА,%	Активність церулоплазміну, од. о.щ. /мл за 60хв.	Активність, СОД ум.од./мл
1 (інтактні)	48,2±3,8	20,01±1,39	281,8±10,8
2 (охолодження)	35,4±4,0*	21,40±0,88	189,2±13,0
3 (КЕП)	45,0±4,6	19,15±1,44	240,1±15,4*,**
4 (КЕП+охол.)	44,9±1,2	19,68±2,01	255,6±20,5***

Примітка: *- р<0,005 порівняно з 1 групою; **- р<0,005 порівняно з 2-ю групою; ***- р<0,005 порівняно з 3-ю групою.

У результаті наших експериментальних досліджень встановлено, що кріоконсервований екстракт плаценти підвищує резистентність серцево-судинної системи теплокровних організмів до дії холоду, що зумовлює в значній мірі високу виживаність тварин на етапі самовідігріву.

ВИСНОВКИ

На теперішній час актуальною задачею кріобіології є пошук способів, що підвищують стійкість гомойотермних організмів до дії холоду. Дисертаційна робота присвячена вивченню дії кріоконсервованого екстракту плаценти на серцево-судинну систему лабораторних тварин в умовах холодового стресу. Введення кріоконсервованого екстракту плаценти розширює функціональні можливості різних систем теплокровного організму і компенсує патологічні порушення, що виникають у серцево-судинній системі при охолодженні, внаслідок чого підвищується виживаність лабораторних тварин на етапі самовідігрівання після холодового стресу.

1. Показано, що після введення КЕП спостерігається максимальна виживаність (86,6±3,4%) лабораторних тварин 4-ї групи (КЕП +охолодження) на етапі самовідігрівання, порівняно з 2-ю групою (охолодження)- 6,7 ±0,3%.

2. Попереднє введення КЕП лабораторним тваринам 3-ї групи (КЕП) приводить до збільшення змісту норадреналіну в крові щурів на 20% у порівнянні з інтактними тваринами. Це свідчить про активацію нейроендокринних механізмів, що спостерігається при аклімації тварин до переохолодження. При загальному охолодженні, в умовах попереднього введення КЕП, у крові тварин рівень норадреналіну наближається до норми.

3. Загальна спектральна потужність (ТР) ВРС в 4-й експериментальній групі тварин в 1,5 рази вища, ніж у тварин 2-ї групи, що свідчить про підвищення адаптаційних можливостей організму даної групи тварин до переохолодження.

4. Оцінка морфофункціонального стану вивчених тканин і органів свідчить, що у щурів, які одержували КЕП, спостерігається збільшення обсягу мікрогемоциркуляторного русла, що дозволяє організму лабораторних тварин ефективніше відновлювати свої функції на етапі самовідігрівання.

5. Попереднє введення КЕП в умовах охолодження не приводить до значного підвищення в'язкості крові та гематокриту, що сприяє нормалізації гемореологічних показників на етапі самовідігрівання.

6. Введення КЕП 4-й групі тварин (КЕП+охолодження) знижує накопичення ТБК-активних продуктів (на 30%) і інтенсивність спонтанного й аскорбат-індукованого ПОЛ (на 10%), у порівнянні з 2-ю групою тварин (охолодження), а також нормалізує антиокисну активність і активність супероксиддисмутази у вивчених тканинах лабораторних тварин.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Прокопюк О.С., Черемской А.К., Слета И.В., Луценко Д.Г., Чижевский В.В., Грищенко Н.Г. Микроциркуляция при остром общем охлажденни на фоне введения криоконсервированного экстракта плаценты// Проблемы криобиологии.-2005.-Т.15.-№3.-С.479-481.

2. Прокопюк О.С., Черемской А.К., Никитченко Ю.В., Чижевский В.В. Влияние криоконсервированного экстракта плаценты на интенсивность ПОЛ и содержание гидроперекисей липидов в тканях крыс в норме и после общего острого охлаждения// Проблемы криобиологии.-2005.-Т.15.- №4.-С.681-687.

3. Черемской А.К., Прокопюк О.С., Губина- Вакулик Г.И., Чижевский В.В., Фалько О.В. Влияние криоконсервированного экстракта плаценты на морфофункциональные показатели лабораторных животных при общем охлаждении// Вісник ХНУ.-2006.-Вип.3, №729.-С.232-235

4. Прокопюк О.С.,Черемской А.К., Липина О. В., Чижевский В.В., Марченко В. С. Электрические и гемореологические показатели состояния сердечно-сосудистой системы крыс после введения криоконсервированного экстракта плаценты на фоне общего охлаждения// Світ медицини та біології.- 2006.-№2.- С.41-45

5. Черемской А.К., Чижевский В.В., Фалько О.В. О криопротекторном действии криоконсервированного экстракта плаценты при остром общем охлаждении// Матеріали 5 науково-практичної конференції „Клінічна фармація в Україні”. - Харків, 2004р.- С.108.

6. Чижевский В.В., Черемской А.К., Мусатова И.Б., Фалько О.В. О возможности коррекции изменений гормонального статуса у лабораторных животных в условиях острого общего охлаждения// Матеріали науково-практичної конференції „Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології”: Четверті Данилевські читання. - Харків, 2005р.-С.210-212.

7. Чижевский В.В., Прокопюк О.С., Никитченко Ю.В., Черемской А.К. Новые подходы в коррекции холодового стресса// Материалы 1 съезда физиологов СНГ”Физиология и здоровье человека”.-Сочи, 2005г.-С.87.

АНОТАЦІЯ

Черемський А.К. Вплив кріоконсервованого екстракту плаценти на серцево-судинну систему лабораторних тварин в умовах загального охолодження. -Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19- кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей впливу кріоконсервованого екстракту плаценти (КЕП) на серцево-судинну систему гомойотермів в умовах загального охолодження. Встановлено, що введення КЕП позитивно впливає на резистентність тварин до дії холодового стресу, підвищує адаптаційні можливості теплокровного організму. Це відбивалося в максимальній виживаності тварин при загальному охолодженні на етапі самовідігрівання після попереднього введення КЕП, а також при дослідженні варіабільності ритму серця тварин. Доведено, що застосування екстракту приводить до стимуляції метаболізму та підвищення обсягу мікрогемоциркуляторного русла в різних тканинах і органах. Введення КЕП нормалізувало реологічні властивості крові тварин, які піддавалися дії охолодження. Попереднє введення кріоконсервованого екстракту плаценти приводило до підвищення вмісту норадреналіну у крові щурів 3-ї групи. За літературними даними, такий рівень катехоламінів характерний для тварин, які пройшли аклімацію до переохолодження.

При вивченні перекисного окислювання ліпідів (ПОЛ) при загальному охолодженні в умовах введення КЕП було показано, що КЕП нормалізує антиокисну активність і активність супероксиддисмутази в сироватці крові, серце й печінки експериментальних тварин і знижує накопичення ТБК-активних продуктів і інтенсивність спонтанного й аскорбат-індукованого ПОЛ у вивчених тканинах.

Дані, отримані в процесі роботи свідчать, що КЕП розширює функціональні можливості теплокровного організму, позитивно впливає на стабілізацію гомеостазу гомойотермів під час відігріву.

Ключові слова: загальне охолодження, кріоконсервований екстракт плаценти, серцево-судинна система

Черемской А.К. Влияние криоконсервированного экстракта плаценты на сердечно-сосудистую систему лабораторных животных в условиях общего охлаждения. - Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19- криобиология.- Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков, 2007.

Диссертационная работа посвящена изучению особенностей влияния криоконсервированного экстракта плаценты (КЭП) на сердечно-сосудистую систему лабораторных животных в условиях общего охлаждения. Установлено, что введение КЭП положительно влияет на устойчивость организма животных к воздействию холодового стресса. В частности, это выражалось в максимальной выживаемости животных при общем охлаждении на этапе самоотогрева после предварительного введения КЭП.

Оценка нейрогуморальной регуляции ритма сердца у животных 4-й группы с аналогичными показателями спектрального анализа у 2-й группы животных показывает, что общее функциональное состояние крыс значительно изменилось за счет активации симпатических и парасимпатических влияний. Полученные данные могут свидетельствовать, что введение криоконсервированного экстракта плаценты в условиях общего охлаждения повышает адаптационные возможности организма животных к действию низких температур. Доказано, что применение криоконсервированного экстракта плаценты приводит к повышению объема микрогемоциркуляторного русла в разных тканях и органах за счет увеличения количества, длины и диаметра микрососудов и капилляров, что, с одной стороны, приводит к активизации обменных процессов, с другой стороны - к усилению процессов теплообмена между периферическими и внутренними органами. Исходя из этого, логично предположить, что внутрибрюшинное введение КЭП нормализует реологические свойства крови. Это подтверждается результатами, полученными при изучении вязкости крови и гематокрита у лабораторных животных.

В 3-й группе животных введение КЭП приводит к увеличению продукции норадреналина. Согласно литературными источникам, такой уровень катехоламинов характерен для животных, которые прошли акклимацию к переохлаждению. Введение КЭП также позволило нормализовать уровень катехоламинов в крови крыс при холодовом стрессе (4-я группа). При изучении перекисного окисления липидов при общем охлаждении на фоне введения КЭП было показано, что КЭП нормализует антиокислительную активность и активность супероксиддисмутазы в сыворотке крови, сердце и печени подопытных животных и снижает накопление ТБК-активных продуктов и интенсивность спонтанного и аскорбат-индуцированного ПОЛ в изученных тканях.

В связи с этим данные, полученные в процессе работы, показали, что КЭП позитивно влияет на стабилизацию гомеостаза теплокровного организма, который нарушается при холодовом стрессе. Поэтому эти результаты могут быть использованы в медицинской практике для профилактики переохлаждения.

Ключевые слова: общее охлаждение, криоконсервированный экстракт плаценты, сердечно-сосудистая система

Cheremskoy A.K. Influence of cryopreserved placenta extract on cardiovascular system of laboratory animals under general cooling conditions.- A manuscript. Dissertation for the candidate of biological sciences degree in specialty 03.00.19 - cryobiology.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2007.

Dissertation covers the study of peculiarities of cryopreserved placenta extract (CPE) influence on cardiovascular system of laboratory animals under general cooling conditions. CPE introduction was established to positively affect an animal organism resistance to cold stress, by increasing its adaptation possibilities. It was manifested in maximum survival of animals under general cooling at the stage of self-warming after preliminary CPE introduction, as well as it was seen when interpreting the method for cardiac rhythm variability study. Under morphological analysis the CPE introduction to animals was shown to result in metabolic process activation, thereby strengthening the heat exchange processes between peripheric and internal organs due to an increase in a microhemocirculatory channel volume in different tissues and organs. This also results in normalisation of rheologic blood properties, being impaired under general cooling.

CPE introduction positively affects the neuroendocrine thermoregulation mechanisms of animal organism under cold stress, proceeding from the data obtained when studying the rat hormonal status under general cooling.

When studying the lipid peroxidation (LPO) processes the CPE application was demonstrated to prevent the LPO processes activation under animal overcooling.

In this respect the data obtained during research have demonstrated, that CPE positively affects the homeostasis stabilisation in homoiothermal organism, impairing under cold stress.

Key-words: general cooling, cryopreserved placenta extract, cardiovascular system

Размещено на Allbest.ru

...