Мутації cn і vg, локус Adh и пристосованість генотипів Drosophila melanogaster Мeig

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Селекційно-генетичний інститут - Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.15 - генетика

Мутації cn і vg, локус Adh і пристосованість генотипів Drosophila melanogaster Мeig.

Білоконь Світлана Василівна

Одеса-2007

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Запропоновано чимало концепцій і гіпотез щодо генетичних механізмів становлення ознаки пристосованості генотипів і популяцій до несприятливих чинників зовнішнього середовища. Серед них - уявлення про коадаптованість генів з подальшим їх зчепленням і утворенням блоків коадаптованих генів в процесі філогенетичної адаптації, про існування компенсаційних і адаптаційних комплексів генів у особин популяції і т. ін. На жаль, ці теорії недостатньо обґрунтовані експериментальним вивченням динаміки структури і функцій, а також взаємодії різних локусів хромосом за онтогенетичної та філогенетичної адаптації.

Встановлено важливу роль генів локусу Adh в адаптації D. melanogaster, причому тиск різних за характером дії чинників зовнішнього середовища на популяцію призводить до спрямованого добору або F-, або S- алелів гена Adh. Що стосується досліджуваних морфологічних мутацій (cn, vg), то коадаптованість мутантних генів cn і vg з алелями гена Adh за онтогенетичної та філогенетичної адаптації дрозофіли до теперішнього часу не досліджувалася, хоча дослідження в цьому напрямі можуть сприяти глибшому розумінню механізмів впливу маркерних морфологічних мутацій на функції інших структурних генів, що кодують ферменти метаболізму. При цьому дуже важливо з'ясувати, як здійснюється цей вплив за різних умов зовнішнього середовища, а також за структурних перебудов генотипів. Вирішення цих проблем могло б сприяти з'ясуванню механізмів взаємодії мутаційної і комбінаційної мінливості за адаптації генотипів та популяцій.

Представлена дисертаційна робота присвячена вивченню компонентів пристосованості та функціонального стану локусу Adh у мутантів дрозофіли cn і vg за умов вільних і насичувальних схрещувань (тобто при частковому і повному заміщенні генотипів), видається актуальною і науково значущою. Не менш актуальним є питання про взаємодію мутантних генів cn і vg з конкретними алелями локусу Adh за адаптації мух до умов зовнішнього середовища.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. В 1994-1997 р.р. робота виконувалася згідно плану держбюджетної теми “Вікові особливості життєздатності і мейотичної рекомбінації у дрозофіли в залежності від генотипу, штучного заміщення хромосом і умов утримання” № 760, реєстраційний номер 0197 V 017690, яка входила до координаційного плану № 15 за фаховим напрямом “Біологія” Міністерства освіти і науки України. В 2004-2006 р.р робота була розширена та доповнена в межах теми “З'ясувати шляхи генетичної коадаптації за гібридизації та штучних перетворень генотипу”, номер реєстрації ОНУ 274, номер державної реєстрації 0103U004773.

Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи було вивчення ступеня коадаптованості мутантних генів cn і vg з алелями гена Adh і з'ясування впливу мутацій cn і vg в умовах різного генотипового середовища на компоненти пристосованості і функціональний стан гена Adh у D. mеlanogaster.

Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:

- вивчити пристосованість і стан ген-ензимної системи алкогольдегідрогенази (АДГ) у мутантів cn, vg та у лінійних мух дикого типу C-S і D;

- провести насичення генотипів мутантів cn і vg генами ліній дикого типу для отримання форм cn (C-S), cn (D), vg(C-S), vg (D);

- дослідити показники пристосованості і стан локусу Adh в динаміці заміщення генотипів мутантів cn і vg за насичувальних схрещувань з мухами дикого типу C-S і D;

- визначити ступінь залежності показників пристосованості мух від генотипового оточення мутацій cn і vg;

- на підставі власних і наявних літературних даних провести порівняльну оцінку ефективності впливу на пристосованість і функцію Adh часткового і повного заміщення генотипів мутантів;

- одержати інформацію про шляхи взаємодії маркерних генів cn, vg і окремих алелів Adh при формуванні пристосованості ліній, гібридів та експериментальних популяцій Drosophila melanogaster;

- вивчити ступінь коадаптованості маркерних генів cn і vg з алелями гена Adh у досліджуваних мух.

Об'єкт дослідження - взаємодія генів і пристосованість при структурних змінах генотипів Drosophila melanogaster.

Предмет дослідження - ефекти мутацій cn і vg на компоненти пристосованості і стан локусу Adh у мух чистих ліній та їх гібридів.

Методи дослідження. Застосовано традиційні і добре апробовані в генетиці методи визначення основних компонентів пристосованості D. melanogaster, а саме: плодючості, виживаності в екстремальних умовах (гіпертермія, голодування), тривалості життя та ін. Крім зазначених фізіологічних компонентів пристосованості, використовували також генетико-біохімічний (визначення функціонального стану ген-ензимної системи АДГ) показник адаптивності. Активність і термостабільність АДГ визначали загальноприйнятими методами і, керуючись даними літератури, використовували ці показники для оцінки життєздатності і загальної пристосованості D. melanogaster. Достовірність отриманих даних оцінювали за критерієм Стьюдента (Р<0,05) та методом ч² [Плохинский, 1980]. В окремих серіях дослідів розраховували коефіцієнт кореляції (r) показників за методом Сепетлієва [1968].

Наукова новизна одержаних результатів полягає в наступному:

- вперше проведено комплексне вивчення пристосованості у ліній, міжлінійних гібридів і у мутантних форм cn і vg з генотипами, заміщеними в результаті насичувальних схрещувань;

- одержані нові для науки форми мух із заміщеними генотипами, марковані морфологічними мутаціями (cn і vg) і алелями гена Adh. На цих модельних об'єктах показано, що тривалі бекроси з одночасним відбором за маркерною морфологічною мутацією vg призводять до істотних змін пристосованості особин. При заміщенні генотипу низькопристосованої лінії мутанта vg генами ліній дикого типу C-S і D спостерігається достовірне збільшення всіх досліджуваних показників пристосованості - реальної плодючості, тривалості життя, теплостійкості особин;

- на формах мутантів із заміщеними генотипами одержані нові дані, які свідчать про те, що мутантам сn (гомозиготам Adh^SAdh^S) і vg (гомозиготам Adh^FAdh^F) притаманні різні механізми модифікації АДГ;

- встановлено, що плейотропна дія мутантного гена cn, і особливо гена vg, призводить до зміни пристосованості мутантів у порівнянні з мухами дикого типу C-S і D, і що умови утримання мух можуть визначати характер плейотропної дії генів мутантів;

- з'ясовано, що одним із механізмів плейотропної дії гена vg і виразного впливу його на пристосованість особин є взаємодія цього гена з алелями гена Adh;

- вперше одержано дані, що свідчать про коадаптованість маркерних генів cn і vg з алелями гена Adh.

Практичне значення одержаних результатів. Матеріали дисертації поглиблюють існуючі уявлення про вплив різних змін структури генотипу (створення гібридних форм, виникнення мутантних генів, гетерозиготності і т. ін.) на показники пристосованості і функціональний стан ген-ензимної системи АДГ D. melanogaster. Ці дані сприяють розумінню механізмів тонкої взаємодії генів в процесах онтогенетичної та філогенетичної адаптації і, отже, шляхів регуляції метаболізму тварин на генетичному і епігенетичному рівнях. Автором вперше отримано дані про коадаптацію генів cn і vg з генами локусу Adh, які поглиблюють і розвивають існуючі в літературі концепції про утворення в філогенезі адаптаційних комплексів генів, блоків коадаптованих генів і т.п., наповнюючи ці концепції реальним змістом. Не менш важливе наукове значення мають вперше встановлені автором дані про механізми плейотропного впливу мутацій cn і vg, а саме про можливу модифікацію у мутантів cn і vg продуктів генів локусу Adh.

Одержано мух із заміщеними генотипами, які можуть бути модельними об'єктами в генетичних дослідженнях по з'ясуванню взаємодії генів, особливостей розвитку синтезованих генотипів та ін. Ці лінії мух використовують співробітники і студенти кафедри генетики і молекулярної біології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова для проведення наукових досліджень, виконання курсових і дипломних робіт.

Матеріали дисертації, що свідчать про вплив перебудов генотипів на показники пристосованості і властивості продуктів структурних генів, слід враховувати в селекційній роботі по створенню нових форм, за здійснення трансгенезу і інших генно-інженерних перетворень біологічних об'єктів. У зв'язку з цим матеріали дисертації можуть зацікавити наукові установи, які здійснюють генетичні, генно-інженерні і селекційні дослідження.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провела інформаційний пошук та огляд літератури. Експерименти по заміщенню генотипів у D. melano-gaster, популяційні дослідження та вивчення показників пристосованості у вихідних ліній та гібридів автором проведені самостійно. Електрофоретичний розподіл АДГ і визначення фізико-хімічних властивостей алозимів у лабораторних ліній і гібридів дрозофіли автор здійснювала разом з

Н. Д. Хаустовою та Л. В. Левчук. Аналіз ступеня коадаптованості генів мутантів cn і vg з алельними генами локусу Adh та інтерпретацію результатів провадили разом із науковим керівником. Статистичну обробку цифрового матеріалу, написання тексту дисертації та її оформлення автор здійснювала самостійно.

Апробацiя результатiв дисертацiї. По темі дисертації були зроблені доповіді на звітних конференціях професорсько-викладацького складу і наукових співробітників Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова (1998-2006); на міжнародних симпозіумах “Біологічні механізми старіння” (м. Харків 15-17 травня 1996 р., 19-21 травня 1998 р. і 24-27 травня 2006 г.); результати досліджень були представлені в матеріалах всеукраїнської науково-практичної конференції “Довкілля і здоров'я” (27-28 квітня 2006 р).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 16 праць: 10 журнальних статей у фахових виданнях ВАК України та 6 публікацій у матеріалах наукових конференцій та симпозіумів у вигляді тез.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів: огляду літератури, загальної методики і основних методів, результатів досліджень і їх обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку літератури. Текст викладено на 130 сторінках комп'ютерного тексту, він містить 13 таблиць и 15 рисунків.

Список літератури включає 239 найменувань, з них 113 на іноземних мовах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтована актуальність теми дисертації, вказано на її зв'язок з існуючими в Україні науковими програмами та планами, сформульовано загальну мету та завдання дослідження, підкреслено наукову новизну та практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача в її виконання.

У першому розділі (“Огляд літератури”) на підставі аналізу літературних джерел дано огляд сучасних уявлень щодо генетичної структури популяцій та пристосованості генотипів, викладено існуючу інформацію про взаємодію генів та складові відносної пристосованості генотипів. Один із підрозділів присвячено ролі локусу Adh в генетичних механізмах онтогенетичної та філогенетичної адаптації.

Загальна методика і основні методи. Дослідження провадили на ізогенних лінійних мухах дикого типу С-S (Canton-S), D (Домодедовская), мутантах cn (сinnabar), vg (vestigial), на експериментально одержаних формах Drosophila melanogaster із заміщеними генотипами, гібридах сn Ч vg; vg Ч cn, а також на мухах із штучно створених популяцій.

Насичення генотипів мутантів cn і vg генами мух С-S і D призводило до того, що маркерні гени мутантів cn і vg опинялися в генотиповому середовищі відповідних ліній дикого типу. Одержані таким чином синтезовані форми мух з модифікованими генотипами позначали як сn (D), vg (D), cn (С-S), vg (С-S). При цьому в дужках зазначено генотипове оточення маркерної мутації.

Пристосованість вихідних мутантів та мух з модифікованими генотипами оцінювали, визначаючи загальноприйнятими методами основні компоненти цієї ознаки: реальну плодючість (вихід імаго), тривалість життя, здатність виживати в екстремальних умовах.

Відносну пристосованість мутантів (w) і коефіцієнт добору (s = 1 - w) визначали методом [Айала, Кайгер, 1988]. За одиницю пристосованості (w=1) приймали ефективність розмноження генотипів, що залишають максимальну кількість нащадків.

Для визначення алелів гена Adh в процесі насичувальних схрещувань індивідуальному електрофоретичному розподілу піддавали АДГ всіх особин, що мають фенотипові прояви ознак cn і vg в різних поколіннях бекросів - F_B5, F_B10, F_B15, F_B20.

Вихід імаго з яйцекладок досліджуваних мух визначали по кількості нащадків однієї пари батьківських форм, що утримувалася в пробірці з кормом (20 мл) впродовж 3 діб. Цей показник позначений нами як реальна плодючість мух.

Тривалість життя особин визначали, утримуючи в пробірках по 10 мух кожної статі. Підрахунок живих особин вели щодня. Результати виражали кількістю діб, необхідних для загибелі 50% особин ( Lt₅₀ ) [Dorado, Barbancho, 1984].

Тривалість життя мух за умов голодування визначали, утримуючи по 10 особин кожної статі в пробірках без корму. Підрахунок живих мух протягом першої доби провадили через кожні 6 годин, а надалі - через кожних 3 години до повної загибелі особин в кожній пробірці і виражали в годинах загибелі 50% мух ( Lt₅₀ ).

Для визначення теплостійкості 3-денних особин досліджуваних генотипів піддавали дії сублетальної температури (Lt₅₀ для мух дикого типу). У пробірках утримували по 10 особин кожної статі і прогрівали їх у водяному термостаті 12 хв. при температурі 41,5 ± 0,10 °С. Враховували кількість мух, що залишилися живими через добу після впливу високої температури. Теплостійкість виражали відношенням живих мух до загальної кількості прогрітих у відсотках [Страшнюк, Воробьева, 1985].

Плейотропні ефекти генів cn і vg, показники пристосованості гомозиготних і гетерозиготних генотипів, а також конкурентоспроможність мутантів cn і vg при сумісному їх розмноженні вивчали в експериментальній панміктичній популяції, яка була одержана схрещуванням мутантних маркерних мух. При цьому вихідні популяції (F_o) створювали з 16 мух в пробірках об'ємом 50 мл, поміщаючи в них 4 мухи лінії cn (2 + і 2 >), 4 мухи лінії vg (2 + і 2 >) і 8 мух (4 + і 4 >), гетерозиготних по маркерних генах. У таких вихідних популяціях (F_o) лінійні і гібридні генотипи знаходилися у співвідношенні 1:2:1, а співвідношення мутантних генів cn і vg складало 1 : 1. Всіх нащадків (F₁) з кожної пробірки переносили у великі за розміром посудини (200 мл) для отримання F₂. Всіх мух з F₁ і F₂ кожної баночної популяції (повторність досліду десятиразова) аналізували за маркерними ознаками і визначали кількісний фенотиповий склад експериментальних популяцій. Частоти генів і генотипів у популяціях розраховували, використовуючи формулу Харді-Вайнберга: p² + 2pq +q² = 1.

Рівноважність по зчепленню генів локусів cn, vg і Adh визначали в окремій серії дослідів, в якій 5 + vg схрещували з 5 > лінії cn. Співвідношення алелів Adh^F і Adh^S було 1 : 1. Покоління F₁ цієї баночної популяції було представлено гетерозиготами і мало дикий фенотип. 10 + і 10 > цього покоління схрещували між собою для отримання нащадків F_2.. Серед останніх відбирали сегрегантів з фенотипами cn і vg (їх позначали як cn? і vg? ) і частину з них (20 сегрегантів cn? і 20 сегрегантів vg? - по 10 самок і самців) досліджували електрофоретично на алозимний склад АДГ. Решту мух популяції розмножували до досягнення ними покоління F₆. Серед нащадків F₆ відбирали 20 сегрегантів cn? і 20 сегрегантів vg? (самців і самок порівну) і електрофоретично визначали алельний склад локусу Adh. За наслідками электрофорезу у аналізованих мух поколінь F₂ і F₆ визначали кількість гомозигот і гетерозигот по локусу Adh, а також співвідношення частот алелів Adh^S і Adh^F у сегрегантів cn? і vg?. Повторність досліду - десятиразова. Ґрунтуючись на результатах цих дослідів, оцінювали частоту попадання в одну гамету генів cn і Adh^S, а також vg і Adh^F з метою визначення ступеня рівноважності по зчепленню цих генів.

Активність АДГ в екстрактах тканин дрозофіли визначали спектрофотометрично [Mc Kechnie, Geer, 1984], а термостабільність ферменту - за методом Chambers, Wilks, Gibson [1984].

Математичну обробку отриманих результатів провадили загальновизнаними методами варіаційної статистики [Сепетлиев, 1968; Плохинский, 1980].

Результати досліджень та їх обговорення

Компоненти пристосованості диких (C-S, D) і мутантних (cn, vg) ліній D. melanogaster. З'ясувалося, що максимальна ефективність розмноження притаманна мухам лінії D, коефіцієнт пристосованості яких був прийнятий за одиницю (w = 1). Дещо меншою була пристосованість мух C-S і cn (w відповідно складає 0,99 і 0,94 при p > 0,05). Таким чином, достовірних відмінностей у пристосованості мух D, C-S і cn не було встановлено, і в подальших дослідженнях цих мух оцінювали як однаково добре пристосованих. У протилежність цьому, здатність залишати потомство у мух vg була дуже низькою (w = 0,60), а коефіцієнт добору був досить значним (s = 0,40). Приведені факти підтверджують думку про низьку пристосованість мух vg у порівнянні з іншими дослідженими генотипами.

До такого ж висновку приводять дослідження по вивченню деяких основних компонентів пристосованості у досліджуваних лінійних мух. Результати цих досліджень свідчать, що в умовах проведених експериментів найбільш високі показники тривалості життя, реальної плодючості та теплостійкості виявлялися у мух дикого типу C-S і D. Мухи цих двох ліній по експресивності компонентів пристосованості практично не відрізнялися одна від одної, але значно перевищували мутантів vg. Що стосується мутантів cn, то за тривалістю життя вони не поступалися мухам дикого типу, а по плодючості і теплостійкості якщо й поступалися, то незначно (на 13% від C-S по плодючості і на 7% від D по теплостійкості). З'ясувалося, що теплостійкість мух лінії vg складає лише дещо більше 30%, реальна плодючість - 67%, 71% і 78%, а тривалість життя - 51%, 53% і 56% від відповідних показників ліній C-S, D і сn. На підставі всіх наведених даних мух, що несуть мутацію vg, ми віднесли до слабо пристосованих генотипів і використали в подальшій роботі для схрещувань і порівняльного аналізу.

Окрім вказаних відмінностей в пристосованості, мутанти cn і vg, як свідчать наші дані і дані літератури, відрізняються фізико-хімічними властивостями їх алозимів, а отже, алельним складом локусу Adh. При цьому мухи cn утримують в гомозиготному стані алель Adh^S, а мухи vg - Adh^F. Мухам лінії C-S властивий гомозиготний стан алеля Adh^S, а мухам D - Adh^F. Ці особливості будови генотипів мух C-S, D, cn і vg зумовили їх вибір для наступних досліджень.

Алелі локусу Adh і компоненти пристосованості мутантів cn і vg в динаміці насичувальних схрещувань.

Роботами окремих авторів [Касинская, 2000; Хаустова, 2004] було показано, що алелі гена Adh грають важливу роль в адаптації D. melanogaster, причому тиск різних чинників зовнішнього середовища на популяцію призводить до направленого відбору або F-, або S- алелів Adh. На жаль, коадаптованість та взаємодія мутантних генів cn і vg з алелями гена Adh за онтогенетичної та філогенетичної адаптації дрозофіли до теперішнього часу не досліджувалася.

З метою вивчення залежності ознаки пристосованості лінійних мух від алельного складу гена Adh досліджували алозимну належність алкогольдегідрогенази (АДГ) мух ліній C-S, D, cn і vg, які, як уже наголошувалося, відрізняються між собою рівнем пристосованості. Оскільки контрастним за ознакою пристосованості лініям, наприклад D і vg, притаманний ідентичний алельний склад локусу Adh, можна вважати, що сам по собі алельний контроль АДГ не має вирішального значення у визначенні рівня пристосованості лінійних мух. Проте, численні дослідження вказують на те, що гомозиготи Adh^F Adh^F і

Adh^SAdh^S мають різну селективну цінність і географічну розповсюдженість [Савченко, Касинская, 1985; Oakeshott, 1985]. На жаль, ці дослідження проведені на лініях мух з різними генотипами і однозначної відповіді на питання про питому роль алельних варіантів гена Adh в адаптивних реакціях дрозофіли не дають.

З урахуванням цього шляхом насичуючих схрещувань здійснювали заміщення генотипів мутантних мух cn і vg на генотипи мух дикого типу

(C-S, D). Серед гібридів F_B5, F_B10, F_B15, F_B20 відбирали мух з проявом мутаційної ознаки, у яких визначали алозимну належність АДГ і окремі показники пристосованості.

Дані таблиці 1 свідчать, що в результаті бекросів алельний склад локусу Adh поступово змінюється і у нащадків F_B20 не відрізняється від такого у мух дикого типу, які були материнською формою за насичувальних схрещувань.

Показники активності і термостабільності АДГ у нащадків вказаних насичувальних схрещувань (табл. 2) змінюються разом із змінами алельного контролю цього ферменту у гібридів, проте прямої залежності цих параметрів не спостерігається. У разі насичувальних схрещувань (D Ч cn) відбувалася заміна

S-алеля гена Adh мух cn на F-алель мух D. Хоч F - алозим АДГ мух D відрізняється найвищою активністю, видно, що активність АДГ у гібридних мух cn (D) зростала неадекватно ступеню заміщення F - і S - алелів Adh у гібридів.

Таблиця 1. Динаміка частоти генотипів по локусу Adh в процесі насичення мух мутантних ліній генами мух дикого типу

n=30-50

До десятого покоління бекросу рівень активності ферменту у мутантів cn (D) не відрізнявся від цього показника у вихідних мух cn, хоч не менше половини S - алелів мух сn в 10-му поколінні бекросів було замінено на F - алель мух D. Цей факт наводить на думку про існування у мутантів cn певної системи модифікації невластивих цим мутантам F - алозимів АДГ з метою збереження біохімічного гомеостазу. Лише на 15-20-му бекросі гібриди cn (D) по активності АДГ дещо перевищували відповідні показники мутантів cn, але все-таки поступалися мухам лінії D. Ймовірно, функція F - алозиму мух лінії D під впливом мутації cn у гібридів модифікується по типу S - алозиму, властивого мутантам cn. Схожа закономірність простежується у разі бекросів C-S Ч vg і D Ч vg. У першому варіанті насичувальних схрещувань алель Adh^F мух vg витісняється алелем Adh^S мух С-S, що призводить до зменшення активності АДГ у мух vg (C-S). Це зменшення максимальне в поколінні F_B20, коли відбувається повна заміна Adh F-алеля на Adh S-алель (див. табл. 1). У другому варіанті насичувальних схрещувань (D Ч vg) зміни алельного контролю ферменту не відбувається, і гібриди vg (D) у всіх поколіннях бекросів зберігають високий, властивий F-алозиму, рівень активності АДГ.

Що стосується термостабільності АДГ, то в умовах наших дослідів мухи C-S і cn, проявляли однаково високу стійкість до підвищеної температури. Несподіваним було те, що АДГ мух лінії D, що виявляла властиву F-алозиму високу електрофоретичну рухливість, своєю високою стійкістю до підвищеної температури уподібнювалася S - алозимам мух C-S і cn. Найменш термостабільним був F - алозим мух vg, який за даним параметром більш ніж в три рази поступався мухам C-S, D і cn. Можливо, саме тому у варіантах насичувальних схрещувань C-S Ч cn і D Ч cn істотних змін термостабільності АДГ у гібридів cn (C-S) і cn (D) не спостерігалося, в той час як за бекросів C-S Ч vg і D Ч vg термостабільність АДГ після 10-го бекросу достовірно зростала як у мутантів vg (C-S), так і у мутантів vg(D).

Таблиця 2. Активність і термостабільність АДГ у мутантів дрозофіли у динаміці насичення їх генотипів генами мух дикого типу

n=30-50

Примітка.*Відмінності достовірні у порівнянні з вихідною мутантною лінією (p<0,05)

Представлені результати насичувальних схрещувань однозначно свідчать про залежність фізико-хімічних властивостей АДГ від алельного складу локусу Adh у мух із заміщеними генотипами. За насичувальних схрещувань C-S Ч vg достовірні зрушення виявляються тільки після 15-20-го бекросу, коли алель Adh^F у гібридних мух практично повністю заміщений алелем Adh^S (r = 0,92). При цьому активність і термостабільність АДГ у нащадків F_B20 достовірно відрізняються як від мутантів vg, так і від мух лінії C-S. Таким чином, незважаючи на гомозиготність нащадків F_B20 по локусу Adh (Adh^S/Adh^S), їх АДГ за своїми властивостями займає проміжне положення між S- і F- алозимами. Цей факт можна пояснити модифікацією S - алозиму в процесі коадаптації генів vg і Adh^S за насичувальних схрещувань. Таким чином, в процесі гібридизації здійснюється взаємодія (коадаптація) генів хромосом різного походження.

У зв'язку із викладеним, важливо з'ясувати не тільки динаміку функціонального стану локусу Adh, але й компонентів пристосованості особин за насичувальних схрещувань.

Відповідні показники (реальну плодючість, тривалість життя особин, теплостійкість) досліджували у мух C-S, D, cn, vg до їх гібридизації і в ході насичувальних схрещувань C-S Ч cn, C-S Ч vg, D Ч cn, D Ч vg. Зазначені компоненти пристосованості досліджували у гібридів 5-го, 10-го, 15-го і 20-го поколінь F_B. Результати цих досліджень представлені у табл. 3, з якої видно, що насичення генотипу добре пристосованих мух лінії cn генами дикого типу (як C-S, так і D) не призводить до будь-яких вірогідних змін компонентів пристосованості.

Таблиця 3. Компоненти пристосованості мутантів дрозофіли в динаміці насичення їх генотипів генами мух дикого типу

n=200-300

Примітки: *- Відмінності достовірні у порівнянні з відповідними показниками мух дикого типу (p<0,05) **- Відмінності достовірні у порівнянні з відповідною мутантною лінією (p<0,05)

В протилежність цьому, при заміщенні генів низькопристосованої лінії vg генами ліній дикого типу (C-S і D) пристосованість особин значно зростає як за компонентом реальної плодючості, так і за тривалістю життя та теплостійкістю особин. Реальна плодючість гібридів vg (C-S) в поколінні F_B20 складає 135% її рівня у мух vg, практично не відрізняючись від реальної плодючості мух дикого типу. Вже після декількох схрещувань (F_B5) показники всіх компонент пристосованості зростають і продовжують поліпшуватися по мірі насичення мутанта генами мух дикого типу. У мух F_B20 тривалість життя, їх плодючість і теплостійкість значно перевищують аналогічні показники мух vg. Таким чином, заміщення генів мутанта (за винятком гена vg, на який вели добір) генами мух дикого типу усуває основний недолік мутантної лінії - її низьку пристосованість. Проте маркерна мутація (vg) в силу її плейотропного впливу зменшує адаптивний потенціал дикого генотипу: окремі показники пристосованості мутантних гібридів F_B20 з повністю заміщеними генотипами статистично достовірно поступаються тим же показникам мух C-S і D.

Пристосованість гібридних мух при вільному схрещуванні мутантів cn і vg. У випадку мутантів cn і vg за допомогою показника відносної пристосованості як інтегрального показника адаптивності можна оцінити, якою мірою плейотропна дія морфологічних мутацій може впливати на виживаність в популяціях гомозиготних і гетерозиготних носіїв цих мутацій, на частоту відповідних генотипів і алельних генів.

У зв'язку з цим виникла необхідність визначити відносну пристосованість і окремі її компоненти у вихідних лінійних мух і у мух різних фенотипових класів, що виникають у популяції, засновниками якої були мутанти cn, vg та їх гібриди. Дані табл. 4 переконливо свідчать про виражену негативну плейотропну дію мутації vg на її носіїв і на генетичну структуру популяції в цілому за стандартних умов.

Таблиця 4. Співвідношення фенотипових класів в F₁ і F₂ досліджуваних популяцій дрозофіли та їх відносна пристосованість

n = 10

Примітки: * Відхилення від теоретично очікуваного розщеплення вірогідні (р < 0,05) ** Відмінності в порівнянні з класом + vg достовірні

При вільному схрещуванні особин популяції дуже швидко відбувається зміна частот генотипів, а, отже, і окремих генів. Встановлено, що якщо в F₁ співвідношення фенотипових класів (+ vg, + + і cn +) не відхилялося від вихідного співвідношення 1 : 2 : 1, то вже в F₂ це співвідношення складало 0,70 : 2,17 : 1,13, тобто розщеплення змінювалося на користь класів сn + і ++, що свідчить про меншу конкурентоспроможність мух vg. Дійсно, відносна пристосованість (w) мух цього фенотипового класу (+ vg) складала менше половини (w = 0,42 ± 0,08) відносної пристосованості мутантів cn і гібридів ++, що містили мутантні гени в гетерозиготі В результаті цього змінюється співвідношення мутантних генотипів: у популяції з кожним поколінням зростає частота носіїв гена cn і зменшується частота генотипів, що несуть ген vg.

Плейотропна дія мутантних генів (cn, vg) і компоненти пристосованості відповідних ліній та їх гібридів. Досліджувані компоненти пристосованості лінійних мух (C-S, cn, vg) і їх реципрокних гібридів (cn Ч vg, vg Ч cn) представлені в табл. 5. У повній відповідності з низькою відносною пристосованістю, відміченою раніше у мух vg, ці мухи виявляли найнижчу реальну плодючість і найкоротшу тривалість життя за стандартних умов утримання. Цікаво зазначити, що якщо за стандартних умов утримання мух ген vg проявляє помітну негативну дію на пристосованість генотипів, то за умов голодування тривалість життя мух vg не поступається показникам мух C-S і вірогідно перевищує терміни життя мух лінії cn.

Таблиця 5. Компоненти пристосованості лінійних мух та їх гібридів

n= 150-200

Примітки:* Відмінності достовірні у порівнянні з мухами лінії C-S

** Відмінності достовірні у порівнянні з лінією vg

Оскільки пристосованість особин популяції залежить від ступеня гомозиготності і гетерозиготності генотипів [Зорина, Полетаева, 2002; Кулабухова, Медведєва, Воробйова, 2005], ми зіставили стан деяких компонент пристосованості у гомозигот і гетерозигот по генах cn і vg. В якості гомозигот використовували лінійних мух з відповідними маркерними мутаціями; гетерозигот одержували в реципрокних схрещуваннях cn Ч vg і vg Ч cn.

Дані табл. 5 свідчать, що гетерозиготність по локусах cn і vg сприяє кращій пристосованості. Показники реальної плодючості і тривалості життя за стандартних умов у гібридів досягають рівня кращого з батьків ? мутантів cn. Це особливо добре виявляється у варіанті схрещування cn Ч vg, за якого у гібридів спостерігається гетерозис по тривалості життя у стандартних умовах, а також по адаптивно важливій ознаці - виживаності в умовах голодування.

Таким чином, об'єднання в одному генотипі мутантних генів cn і vg, за умови їх гетерозиготності, може нівелювати їх негативні плейотропні впливи і сприяти поліпшенню окремих показників пристосованості. З'ясувалося, що плейотропна дія мутації vg, по-різному впливає на окремі компоненти пристосованості за мінливих умов навколишнього середовища та неоднакового генотипового оточення мутантного гена.

Значний інтерес викликає питання про механізми плейотропної дії морфологічних мутацій, зокрема мутацій cn і vg. Обидві мутації, особливо мутація vg, мають відношення до індивідуального розвитку дрозофіли, до процесів диференціювання клітин і органогенезу. Мутацію vg, що порушує розвиток крила, можна розглядати як мутацію одного з численних гомейозисних генів, що відповідають за морфогенез. Відомо, що гомейозисні гени кодують фактори транскрипції, необхідні для нормальної функції багатьох структурних генів, кодуючих ферменти метаболізму. Таким чином, плейотропну дію мутації vg можна розглядати як результат впливу даного мутантного гена на функцію структурних генів, що забезпечують метаболізм. В цьому випадку слід чекати певної взаємодії гена vg з алелями гена Adh, оскільки алкогольдегідрогеназа - найважливіший учасник енергетичного обміну у D. melanogaster.

Це припущення повністю підтверджується результатами досліджень. У разі штучної заміни в генотипі мутанта одного алеля Adh на інший шляхом насичувальних схрещувань спостерігається модифікація продукту Adh по типу F-алозиму або S-алозиму залежно від природи мутанта (vg або cn). Подібна взаємодія генів cn і vg з генами локусу Adh не може бути простою випадковістю і свідчить про коадаптацію функції цих генів в процесі онтогенетичної і філогенетичної адаптації.

Як відомо, коадаптовані гени можуть частіше потрапляти в одну гамету, ніж слід очікувати на підставі теорії вірогідності і законів незалежного або зчепленого успадковування. Вірогідність такого більш частого сумісного успадковування певних алелей локусів cn, vg і Adh демонструють результати досліджень, представлені в табл. 6. Вихідну популяцію F_o створювали з рівної кількості мух - засновників (самців і самок) cn і vg, що забезпечувало практично рівне співвідношення в F_o алелів Adh^F і Adh^S.

Таблиця 6. Успадковування алелів Adh^S і Adh^F при схрещуванні лінійних мух + vg Ч > cn

n=10

В протилежність цьому серед сегрегантів cn? і vg? подальших поколінь по локусу Adh зустрічалися генотипи різної будови - гомозиготи Adh^F Adh^F, гетерозиготи Adh^F Adh^S і гомозиготи Adh^S Adh^S. При цьому кількісне співвідношення різних в генетичному відношенні гомозигот по локусу Adh і співвідношення Adh^F/Adh^S у сегрегантів cn? і vg? було різним. У сегрегантів cn? співвідношення Adh^F/Adh^S з кожним подальшим поколінням зменшувалося, а у сегрегантів vg? - збільшувалося. Внаслідок цього у мух всіх поколінь з фенотипом cn кількісно переважав S - алель гена Adh, а у мух vg - аллель Adh^F. Серед сегрегантів F₆ з фенотипом cn переважна більшість гомозигот по локусу Adh - це гомозиготи Adh^S Adh^S, а у сегрегантів з фенотипом vg переважають гомозиготи Adh^F Adh^F.

Ці дані підтверджують припущення про те, що гени cn і Adh^S, а також vg і Adh^F краще коадаптовані, чим інші можливі варіанти алелів, і частіше разом потрапляють в одну гамету. Ця коадаптованість, мабуть, пояснює гомозиготність досліджуваних лінійних мух cn по гену Adh^S, а мух vg - по гену Adh^F.

Якщо алелі різних локусів хромосом в одних комбінаціях (гаплотипах) зустрічаються частіше, ніж в інших, то таке явище називається нерівноважністю по зчепленню. Ймовірно, це явище лежить в основі формування у особин популяції компенсаційних [Струнников, 1986] і адаптаційних [Тоцкий, 1995] комплексів генів, що грають важливу роль у підвищенні пристосованості.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень

Оцінка адаптивного потенціалу використаних у даній роботі лінійних мух показала їх істотні відмінності за показниками пристосованості - реальної плодючості, тривалості життєвого циклу, стійкості до гіпертермії і голоду. За стандартних умов утримання мух найбільш високі показники компонентів пристосованості виявилися у мух дикого типу C-S і D, а також у мутантів cn. У зв'язку з цим генотипи ліній С-S, D і cn були віднесені до добре пристосованих, на відміну від мух лінії vg, що мали низьку в порівнянні з мухами C-S тривалість життя (51%), меншу реальну плодючість (67%) і теплостійкість (30 %).

Було висловлено припущення, що плейотропний ефект гена vg і низька конкурентоспроможність його носіїв може призводити до того, що за певних (стандартних) умов утримання мух частота гена vg в популяціях з кожним поколінням може зменшуватися. Це припущення повністю підтвердилося в експериментах зі штучно створеними популяціями мух, родоначальниками яких були мутанти cn і vg. Як з?ясувалося, вільне схрещування цих мутантів призводить до вищеплення серед нащадків генетично гетерогенних гомозигот і гетерозигот по генах локусів cn і vg. Цікаво, що якщо родоначальники популяції (F_o) складалися з гомозигот і гетерозигот по генах cn і vg, узятих у фенотипових співвідношеннях 1vg+/ 2++ / 1 +cn, то вже в F₂ такої популяції співвідношення фенотипових класів зрушувалося на користь мутантів cn і гетерозигот (++). Розрахунки показують, що зменшення в популяції частоти носіїв гена vg відбувається в повній відповідності з відносною пристосованістю (w = 0,42 ± 0,08) і коефіцієнтом добору (s = 0,58) гомозиготних по гену vg мух.

Що стосується гетерозигот по локусах cn і vg, то їм властивий дикий фенотип і високі показники пристосованості. За схрещування cn Ч vg у гібридів F₁ спостерігається гетерозис за тривалістю життя в стандартних умовах, а також по виживаності в умовах голодування. Слід, проте, відзначити, що навіть у разі гетерозису по окремих конкретних складових пристосованості рівень мух дикого типу (C-S) не досягається. Сказане свідчить про те, що негативна плейотропна дія маркерних мутацій, що знаходяться в гетерозиготі, в умовах наших дослідів в значній мірі ослаблялася, але не зникала повністю.

Було зроблено припущення, що ген vg може модифікувати функцію окремих структурних генів, що відповідають за певні ланки метаболізму. Зміна функції останніх може виявлятися як плейотропна дія маркерної морфологічної мутації, що знижує пристосованість мутантних мух.

Для перевірки цього припущення досліджували взаємодію гена vg з алельними генами локусу Adh. При цьому враховували життєво важливе значення цього локусу для дрозофіли, його точну хромосомну локалізацію і відомі алельні різновиди гена Adh.

Результати досліджень показали, що за насичуючих схрещувань мутантів cn і vg з мухами дикого типу C-S і D розходження по різних гаметах генів cn і Adh^S, так само як і генів vg і Adh^F у мейозі здійснюється дуже повільно, незважаючи на досить значну відстань між цими локусами на генетичній карті (відомо, що відстань між локусами vg і Adh складає 16,9 сМ, а між локусами cn і Adh - 7,4 сМ). Про сповільнене розходження мутантних генів cn і vg у мейозі із “звичайними” для них алелями локусу Adh свідчить те, що повне заміщення алеля Adh^F на аллель Adh^S у мутантів vg і алеля Adh^S на Adh^F у мутанта cn спостерігається лише після 15-20 поколінь насичувальних схрещувань C-S Ч vg і D Ч cn.

На підставі цих дослідів ми дійшли висновку про коадаптованість генів cn і Adh^S, а також vg і Adh^F, тобто про оптимальну взаємодію цих неалельних генів при формуванні генотипом компонентів пристосованості. Мабуть, ця коадаптованість обумовлює оптимальний генний баланс і забезпечується частішим попаданням коадаптованних алелів різних локусів в одну гамету.

Про переважне сумісне успадковування неалельних генів cn і Adh^S, а також vg і Adh^F свідчать також результати дослідів з гібридними популяціями мух, одержаними в результаті схрещування лінійних мух vg і cn. У нащадків цих мух поколінь F₂ і F₆ відбирали сегрегантів vg? і cn? і визначали у них алельний склад локусу Adh. З'ясувалося, що в F₆ серед сегрегантів cn? гомозигот Adh^SAdh^S було значно більше, ніж гомозигот Adh^FAdh^F. Алельний ген Adh^S у них складав 70%, а Adh^F - 30% загальної кількості генів локусу Adh. У протилежність цьому, серед сегрегантів vg? було виявлено значно більше гомозигот Adh^FAdh^F, ніж гомозигот Adh^SAdh^S. Частота алеля Adh^F у цьому випадку складала 73%, а частота алеля Adh^S - 27%. Ці результати спільно з іншими даними підтверджують правильність припущення про коадаптованість зазначених пар неалельних генів і про нерівноважність їх по зчепленню.

В процесі онтогенетичної адаптації взаємодія локусів vg, cn і Adh може здійснюватися іншим шляхом, а саме - модифікацією функцій продуктів генів Adh^F і Adh^S під впливом маркерних мутацій. У наших дослідах у нащадків насичувальних схрещувань здійснювалася поступова зміна алельного складу локусу Adh при збереженні в хромосомі 2 маркерної мутації cn або vg. Було встановлено, що активність і термостабільність АДГ у цих мух не завжди відповідає очікуваним параметрам зміненої алозимної належності цього ферменту. Так, наприклад, в десятому поколінні нащадків cn (D) частота алелю Adh^F зростає майже в два рази, а активність ферменту не змінюється в порівнянні з такою у мух вихідної лінії cn. Навіть після повного заміщення алеля Adh^S на алель Adh^F (20 бекросів) рівня активності, відміченої у гомозиготної по гену Adh^F лінії D, не спостерігається.

Результати бекросу C-S Ч vg приводять до тих же висновків. Поступове заміщення алеля Adh^F на аллель Adh^S в другій хромосомі нащадків не призводить до істотних змін активності і термостійкості АДГ впродовж 15 бекросів, хоч S - алозим АДГ менш активний і більш термостабільний, ніж F- алозим.

Не менш важливим є питання про роль локусу Adh в становленні ознак пристосованості дрозофіли. Важливо відзначити, що в результаті насичувальних схрещувань C-S Ч vg і D Ч vg алельний склад локусу Adh мутантів поступово змінювався (перший варіант бекросу) або залишався тим самим (другий варіант схрещувань). Проте і в першому, і в другому варіанті після 20-го бекросу активність АДГ у мутантів максимально наближалася до показників мух дикого типу, а разом з цим зростав і рівень пристосованості гібридних мух. Це видно по їх збільшеній реальній плодючості, більшій тривалості життя і кращій виживаності при високій температурі. В наших дослідах стійкість мух до сублетальної температури добре корелювала з високою термостабільністю S - алозиму АДГ (r = 0,94). Введення методом насичувальних схрещувань теплочутливим мутантам vg алелів Adh^S від теплостійких мух C-S або алелів Adh^F від терморезистентних мух D призводить до значного збільшення теплостійкості мутантів (у 2 і 1,7 рази відповідно), хоч вказаний показник не досягає рівня, притаманного мухам дикого типу.