Асоціація змін транскрипційної активності генів із виникненням і прогресією гліальних пухлин головного мозку

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

АСОЦІАЦІЯ ЗМІН ТРАНСКРИПЦІЙНОЇ АКТИВНОСТІ ГЕНІВ ІЗ ВИНИКНЕННЯМ І ПРОГРЕСІЄЮ ГЛІАЛЬНИХ ПУХЛИН ГОЛОВНОГО МОЗКУ

03.00.03 - молекулярна біологія

ДМИТРЕНКО ВОЛОДИМИР ВОЛОДИМИРОВИЧ

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі біосинтезу нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Кавсан Вадим Мусійович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу біосинтезу нуклеїнових кислот.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Філоненко Валерій Вікторович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу сигнальних систем клітини;

доктор біологічних наук, с.н.с. Сидоренко Світлана Павлівна, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач лабораторії сигнальних каскадів клітини;

доктор біологічних наук, професор Дробот Людмила Борисівна, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини.

Захист дисертації відбудеться 24 грудня 2007 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розіслано 22 листопада 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Підпала

АНОТАЦІЯ

Дмитренко В.В. Асоціація змін транскрипційної активності генів із виникненням і прогресією гліальних пухлин головного мозку. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2007.

Серійним аналізом генної експресії (SAGE) і диференційною гібридизацією охарактеризовано зміни експресії генів в астроцитарних гліомах, які асоційовані з певними властивостями пухлинних клітин. За допомогою SAGE ідентифіковано 129 генів, експресія яких істотно змінюється в гліобластомах і які придатні для молекулярної характеристики пухлин головного мозку. Гени віднесено до обмеженої кількості функціональних груп. Диференційна експресія деяких генів показана вперше в пухлинах головного мозку.

В гліобластомі, найбільш злоякісній формі гліом, знайдено акумуляцію гетерогенних Alu-вмісних нуклеотидних послідовностей, а також генералізовану інактивацію транскрипції мітохондріального геному, асоційовану з деструкцією мітохондрій в пухлинних клітинах.

Виявлені співставленням результатів SAGE і мікроарейного аналізу 117 диференційно експресованих генів можна віднести до переліку генів, продукти яких є потенційними молекулярними маркерами гліальних пухлин.

Ключові слова: гліальні пухлини, гліобластома, серійний аналіз генної експресії, диференційна гібридизація, диференційна експресія генів, Alu-вмісні нуклеотидні послідовності, мітохондріальний геном, молекулярні маркери.

АННОТАЦИЯ

Дмитренко В.В. Ассоциация изменений транскрипционной активности генов с возникновением и прогрессией глиальных опухолей головного мозга. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертационная работа посвящена идентификации и характеристике генов, изменения транскрипцийной активности которых ассоциированы с образованием и развитием глиальных опухолей головного мозга человека.

С использованием двух современных методов экспрессионной генетики - серийного анализа генной экспрессии (SAGE) и дифференциальной гибриди-зации - обнаружены и охарактеризованы основные изменения экспрессии генов на разных стадиях злокачественной прогрессии астроцитарных глиом, ассоциированные с определенными свойствами опухолевых клеток.

Дифференциальная гибридизация библиотек кДНК эмбрионального и постнатального головного мозга человека выявила в глиобластоме изменения экспрессии для генов, которые кодируются как ядерным, так и митохондриальным геномами, а также для повторяющихся элементов генома человека, которые относятся к классу коротких рассеянных по геному элементов (SINE, short interspersed nuclear element). Использование Alu-содержащих кДНК в качестве зондов для Нозерн-гибридизации не обнаружило дискретных транскриптов ни в РНК нормального головного мозга, ни в РНК астроцитарних опухолей. Вместо этого, были получены гетерогенные гибридизационные сигналы размером от 0,3 т.н. до более чем 7,0 т.н. Для РНК глиобластомы гибридизация с этими зондами была намного интенсивнее по сравнению с РНК менее злокачественных астроцитом и нормального головного мозга. При использовании в качестве гибридизационных зондов уникальных последовательностей, прилежащих к Alu-повторам, не было найдено повышения содержания соответствующих транскриптов в опухолях. Аккумуляция высокомолекулярных гетерогенных Alu-содержащих нуклеотид-ных последовательностей, очевидно, является следствием аномалий синтеза, деградации или процессинга РНК в опухолевых клетках.

Нозерн-анализ астроцитарных глиом разной степени злокачественности обнаружил существенно сниженное содержание митохондриальных мРНК ATP6, COXIII, COXII, COXI, ND1 и ND4 в глиобластоме сравнительно с нормальным головным мозгом, а SAGE показал снижение уровня транскрипции всех митохондриальных генов в глиобластоме. Эти результаты вместе указывают на генерализованную инактивацию транскрипции митохондриального генома, ассоциированную с деструкцией митохондрий.

Исследования, проведенные с использованием SAGE, показали увеличение количества дифференциально экспрессирующихся генов со злокачественной прогрессией астроцитарных глиом, а также увеличение амплитуды изменений их экспрессии. Идентифицировано 129 генов, уровень экспрессии которых существенно изменяется в глибластоме и которые могут быть пригодными для молекулярной характеристики опухолей головного мозга. 44 из 129 генов оверэкспрессированы в опухолях. Большую часть генов с более чем 5-кратно повышенной активностью в глиобластомах можно условно разделить на небольшое количество групп: гены, вовлеченные в ангиогенез и фибрилогенез; гены, кодирующие белки внеклеточного матрикса; гены стойкости к лекарственным препаратам; гены системы IGF (IGF-axis); гены иммунного ответа и гены передачи сигнала.

Нозерн-анализ и обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция подтвердили результаты SAGE для двух десятков дифференциально экспрессирующихся генов с наиболее выразительным повышением уровня экспрессии в глиобластоме на независимых образцах опухолей и нормального головного мозга.

Обнаружено, что около 10 генов с повышенной больше чем в 5 раз активностью в глиобластоме имеют отношение к МАП-киназам - (МАПК)-каскадам. Более детальное исследование этих генов может позволить использование их продуктов в качестве мишеней для химио-, иммуно-, и генной терапии. Показано, что ген YKL-40/HC gp-39, который имеет функцию, синергичную IGF-I и принадлежит к МАПК-каскаду имеет экстремально высокую экспрессию в глиобластоме - наиболее агрессивной форме глиальных опухолей. Увеличение содержания YKL-40/HC gp-39 как в опухолях так и в сыворотке позволяет использовать его как молекулярный маркер злокачественной прогрессии глиом. Уровень экспрессии гена SPARC, который играет важную роль в ангиогенезе и инвазии глиом, повышен на всех этапах злокачественной прогрессии астроцитом и может быть специфическим маркером инвазии.

85 генов со сниженной активностью на последних стадиях злокачественной прогрессии астроцитарных глиом могут относиться к опухоль-супрессорних генам. Обнаруженное на уровне РНК и белка существенное снижение экспрессии гена TSC-22 в глиальных опухолях вместе с показанной другими авторами негативной ролью TSC-22 в процессе пролиферации клеток свидетельствует о его потенциальной опухоль-супрессорной роли. 117 дифференциально экспрессирующихся генов, общих для методов SAGE и анализа микрочипов, можно включить в список кандидатов для молекулярной характеристики глиальных опухолей.

Ключевые слова: глиальные опухоли, глиобластома, серийный анализ генной экспрессии, дифференциальная гибридизация, дифференциальная экспрессия генов, Alu-содержащие нуклеотидные последовательности, митохондриальный геном, молекулярные маркеры.

SUMMARY

Dmitrenko V.V. Association of transcriptional activity of the genes with the initiation and progression of human brain glial tumors. - Manuscript.

Thesis for Doctors' degree in Biology, speciality 03.00.03 - molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

Gene expression changes in astrocytic gliomas, associated with definite properties of tumor cells, were characterized by Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) and by differential hybridization. 129 genes with changed expression in glioblastoma and useful for the molecular characteristic of brain tumors were identified by SAGE. The genes are attributed to the limited number of functional groups. Differential expression of some genes was demonstrated first in brain tumors.

Accumulation of the heterogeneous Alu-containing nucleotide sequences and generalized inactivation of mitochondrial genome, associated with mitochondria destruction in tumor cells, were revealed in glioblastoma, the most malignant form of the glioma.

117 differentially expressed genes, revealed by the comparison of the results of SAGE and microarray analysis, can be included in the list of genes, whose protein products are candidates into molecular markers of glial tumors.

Keywords: glial tumors, glioblastoma, Serial Analysis of Gene Expression, differential hybridization, differential gene expression, Alu-containing nucleotide sequences, mitochondrial genome, molecular markers.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Злоякісні пухлини гліального походження є найбільш розповсюдженими первинними пухлинами головного мозку людини, що характеризуються значною агресивністю, високою інвазивністю і нейрологічною деструктивністю. Діагностику цих пухлин, прогностичну оцінку індивідуальних захворювань та їхню терапію здійснюють переважно на основі патоморфологічного аналізу. Класифікація ВООЗ гліальних пухлин (Louis et al., 2007) базується на певних гістологічних відмінностях пухлинних та нормальних клітин. Водночас, ці пухлини характеризуються значною морфологічною гетерогенністю. Тому гістологічні ознаки не відображають складних молекулярних подій, що керують процесом трансформації, і не завжди дозволяють однозначно визначити тип і ступінь злоякісності пухлини. Пухлини з однаковими гістологічними характеристиками можуть значною мірою відрізнятися щодо подальшого прогнозу та відповіді на терапію, що є наслідком множинних генетичних шляхів їхнього формування.

Відмінності біологічних властивостей злоякісних новоуворень від нормальних тканин, зокрема, специфічні генетичні зміни в пухлинних клітинах, є об'єктом досліджень для створення нових терапевтичних підходів. Виявлення змін у рівні експресіi генів у пухлинах і подальша характеристика пухлино-асоційованих генів вносить суттєвий вклад у розуміння фундаментальних властивостей новоутворень, механізмів їх виникнення і злоякісної прогресії. З'ясування цих механізмів важливе для визначення біологічних мішеней і створення терапевтичних засобів скерованої дії для лікування злоякісних новоутворень.

Дослідження генетичних аномалій злоякісних пухлин виявили обмежену кількість генів, мутації в яких ініціюють неопластичну трансформацію (протоонкогени) або інактивують блокування цього процесу (антионкогени). Вивчення онкогенного ефекту окремих генів призвело до уявлення про мультигенний характер формування пухлинного фенотипу клітини. З'являється все більше фактичних даних про участь в канцерогенезі сотень генів, рівень експресії яких змінюється в пухлинних клітинах, причому лише в поодиноких випадках за рахунок мутацій. Такі гени залучені до реалізації основних генетичних подій ініціації неопластичної трансформації у множинні фенотипічні зміни, які виявляються в злоякісних клітинах. Методологія “зворотної генетики” дозволяє виділяти гени із зміненою в пухлинних клітинах експресією, не концентруючись на структурних перебудовах (Киселёв, 1991; Sager, 1997).

Більшість гліом (до половини всіх внутрішньочерепних пухлин) становлять астроцитарні гліоми - новоутворення астроцитарної глії головного мозку. Пухлини можуть прогресувати через серію гістопатологічних стадій, асоційованих з акумуляцією генетичних аномалій на різних хромосомах та змінами експресії генів. Олігодендрогліоми складають інший, менш поширений тип гліальних пухлин. Гістологічна діагностика і розпізнавання астроцитом та олігодендрогліом ускладнені і в багатьох випадках суб'єктивні, що призводить іноді до помилкового діагнозу, зокрема у випадках, в яких немає типової картини. Спроби встановити кореляцію між генотипом та фенотипом гліальних пухлин також не дали однозначних результатів. Так, мутації гена ТР53 (характерна ознака дифузних астроцитом, стійких до хіміотерапії) і втрату гетерозиготності (LOH) на хромосомах 1р та 19q (характерні ознаки олігодендрогліом, які пов'язують із їхньою чутливістю до хіміотерапії і кращим прогнозом), було виявлено як в астроцитомах, так і в олігодендрогліомах (Watanabe et al., 2002; Okamoto et al., 2004).

З появою кДНК-мікроареїв та олігонуклеотидних чипів, секвенування кДНК-бібліотек, цифрового диференційного дисплею (Digital Differential Display, DDD) та серійного аналізу генної експресії (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) стала можливою ідентифікація генів, експресія яких змінюється при тому чи іншому захворюванні. Використання цих технологій дозволяє ідентифікувати не поодинокі гени, а генні кластери, які характеризують профілі експресії генів у нормальних клітинах та при захворюванні. Геномні підходи є ефективними для детекції хромосомних аберацій та генів, які пошкоджуються в пухлинах, а профілювання генної експресії дозволяє визначити молекулярні підтипи пухлин і може бути корисним для більш точної їхньої класифікації. Відмінності рівнів експресії генів можуть бути використані не тільки для діагностики пухлин та прогнозу відповіді на лікування, але й для ідентифікації множинних біомаркерів для направленої терапії (Negm et al., 2002; Mischel et al., 2006).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі біосинтезу нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, і виконувалась в рамках бюджетних тем “Механізми тканино-специфічної експресії генів” (номер державної реєстрації - 0193U026688, 1993-1997 рр.), “Вивчення регуляції вираження генів у вищих еукаріотів” (номер державної реєстрації - 0198U000673, 1998-2002 рр.), “Дослідження молекулярно-генетичних змін в пухлинах головного мозку” (номер державної реєстрації - 0103U000072, 2003-2007 рр.) та спільних науково-дослідних робіт з Інститутом нейрохірургії імені А.П. Ромоданова АМН України в рамках тем “Дослідити спектр біомолекулярних і генетичних змін гліальних та сполучно-тканинних внутрішньочерепних пухлин та визначити їх діагностичне та прогностичне значення (номер державної реєстрації В/1.К.26.02.01.04, 2004-2006 pp.), “Дослідити особливості генетичних порушень в нейроектодермальних і сполучно-тканинних пухлинах головного мозку та провести клініко-морфологічні кореляції” (номер державної реєстрації В/1.К.26.02.01.07, 2007-2009 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою цієї роботи була ідентифікація і характеристика генів, зміни транскрипційної активності яких можуть бути асоційованими з утворенням і злоякісною прогресією гліальних пухлин головного мозку людини. Для досягнення мети вирішували такі завдання:

Диференційною гібридизацією кДНК-бібліотек виявити нуклеотидні послідовності, рівень експресії яких змінюється в гліобластомі порівняно з нормальним головним мозком.

Секвенуванням клонів кДНК ідентифікувати гени, що були знайдені диференційною гібридизацією.

Порівняти рівні експресії генів в астроцитарних гліомах ІІ-IV ступенів злоякісності і нормальному головному мозку з використанням SAGE і виявити набори генів, які диференційно експресовані в астроцитомах різного ступеня злоякісності.

Дослідити особливості експресії генів, виявлених диференційною гібридизацією і SAGE, в гліальних пухлинах різного ступеня злоякісності методами Нозерн-блот гібридизації та зворотної транскрипції-полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР).

Провести класифікацію диференційно експресованих генів на основі аналізу біологічних функцій білкових продуктів, які вони кодують.

Гени з найвиразнішими змінами експресії клонувати у векторі для експресії в бактеріальній системі, отримати специфічні поліклональні антитіла проти їхніх білкових продуктів і проаналізувати експресію в гліальних пухлинах на рівні білка.

Співставити результати сучасних методів експресійної генетики - SAGE і гібридизації на мікрочипах - з метою визначення потенційних маркерів для молекулярного типування гліальних пухлин головного мозку.

Виявити молекулярні варіанти астроцитарних гліом та кореляцію цих молекулярних варіантів із клінічним перебігом пухлинного процесу.

Об'єкт дослідженя - молекулярні механізми виникнення і злоякісної прогресії гліальних пухлин головного мозку.

Предмет дослідження - зміни транскрипційної активності генів у гліальних пухлинах головного мозку людини різного ступеня злоякісності.

Методи дослідження: диференційна гібридизація бібліотек кДНК, SAGE, Нозерн-блот аналіз, аналіз експресії генів із використанням ЗТ-ПЛР, Вестерн-блот аналіз, створення плазмідних конструкцій для експресії генів у прокаріотних клітинах, очищення рекомбінантних білків із лізатів клітин, імуногістохімічний аналіз білків на парафінових зрізах тканин, виділення і Саузерн-блот аналіз геномної ДНК, визначення нуклеотидної послідовності ДНК.

Наукова новизна одержаних результатів. З використанням сучасних методів експресійної генетики, SAGE і диференційної гібридизації, виявлено і охарактеризовано основні зміни експресії генів в астроцитарних гліомах різного ступеня злоякісності, які асоційовані з певними властивостями пухлинних клітин.

Ідентифіковано 129 генів, рівень експресії яких істотно змінюється в астроцитарних гліомах, що може бути основою для молекулярної характеристики гліальних пухлин головного мозку. Диференційну експресію деяких із цих генів в пухлинах та нормальному головному мозку показано вперше.

Вперше виявлено в гліобластомах акумуляцію високомолекулярних гетерогенних Alu-вмісних нуклеотидних послідовностей, що, можливо, є наслідком аномалій синтезу, деградації чи процесингу РНК в пухлинних клітинах. Надекспресія Alu-вмісних нуклеотидних послідовностей асоційована з найбільш злоякісною стадією прогресії астроцитом, а варіабельність рівнів експресії цих послідовностей в гліобластомах може відображати різні механізми утворення пухлин.

Вперше показано генералізовану інактивацію транскрипції мітохондріального геному в гліобластомі, що корелює з деструкцією мітохондрій в пухлинах цього типу.

Вперше встановлене в пухлинах головного мозку суттєве зниження експресії гена TSC-22 на рівні мРНК і білка, що разом з показаним раніше іншими авторами зниженням його експресії в пухлинах слинної залози, гепатокарциномі і аденокарциномах простати, а також негативною регуляторною роллю білка TSC-22 в контролі проліферації клітин свідчать про потенційну пухлиносупресорну функцію TSC-22.

На додаток до описаної раніше мРНК HC gp-39 розміром 1,7 т.н. виявлено новий транскрипт більшого розміру (біля 3,0 т.н.), а також білок HC gp-39 більшого розміру переважно в зразках гліобластом і анапластичних астроцитом. Можливо, довша мРНК є наслідком альтернативного процесингу первинного транскрипту гена HC gp-39 і кодує білок, більший за розміром ніж 39 кДа. Можливо також, що внесок до зміни молекулярної маси може вносити і пост-трансляційна модифікація білка HC gp-39.

Вперше виявлено в пухлинах головного мозку, зокрема в менінгіомах, надзвичайно високий рівень мРНК, яка кодує гіпотетичний IGF-ІІ-асоційований білок і утворюється внаслідок незвичного ендонуклеотичного розщеплення довгих мРНК IGF-ІІ. Можливо, цей механізм є активованим в пухлинних клітинах.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень свідчать, що знайдені за допомогою SAGE та диференційної гібридизації гени із зміненим рівнем експресії відіграють важливу роль у формуванні гліальних пухлин і дають підставу для створення панелі потенційних молекулярних маркерів, придатних для молекулярної класифікації гліальних пухлин, їхньої діагностики і прогностичної оцінки.

Найвищий рівень експресії гена HC gp-39, одного з найбільш надекспресованих в гліальних пухлинах генів, знайдено переважно у гліобластомах, тому продукт цього гена придатний для використання як молекулярного маркера для аналізу стадії злоякісної прогресії астроцитарних гліом, або для діагностики гліобластом.

Декілька надекспресованих в гліобластомі генів - В2М, IGF-ІІ, IGFB5, IGFBP7, LGALS3, CHI3L1 (YKL-40), CHI3L2 (YKL-39), SERPINA3, SPARC/osteonectin і SSP1/osteopontin - кодують позаклітинні білки, що забезпечує можливість їхнього клінічного застосування як мішеней для терапії. Генно-інженерні конструкції з потенційним пухлиносупресорним геном TSC-22 можуть мати перспективи практичного використання в хіміотерапії і для генної терапії пухлин.

Ознаки зміни структури мітохондрій і експресії мітохондріальних генів можуть бути використані як маркери при аналізі стадій злоякісної прогресії гліом.

Матеріали дисертаційної роботи можуть бути використані в навчальних курсах вузів біологічного та медичного профілю.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто обгрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, здійснено пошук та аналіз даних літератури, запропоновано робочі гіпотези, проаналізовано весь отриманий матеріал, підготовлено до друку публікації. Основні положення і висновки дисертаційної роботи, сформульовані автором, обговорено разом із науковим консультантом - д.б.н., професором, член-кор. НАН України В.М. Кавсаном.

Усі дослідження виконувались за беспосередньої участі або під керівництвом здобувача. Дисертант особисто брав участь у виявленні та ідентифікації генів, що диференційно експресовані в гліальних пухлинах і нормальному головному мозку, за допомогою диференційної гібридизації бібліотек кДНК головного мозку та визначенні профілів експресії генів у гліальних пухлинах за допомогою SAGE. Секвенування клонів кДНК виконувалось разом з к.б.н. О.М. Гарифуліним, та к.б.н. К.О. Шостак. Роботи із дослідження експресії виявлених генів у пухлинах головного мозку за допомогою Нозерн-блот гібридизації і ЗТ-ПЛР проводились спільно з к.б.н. К.О. Шостак, О.І. Бойко, Т.В. Букреєвою та Н.Я. Вітаком. Створення плазмідних конструкцій для експресії рекомбінантних білків, їх отримання і очистка проводились разом із к.б.н. В.Г. Найдьоновим, к.б.н. М.І. Вудмаскою та к.б.н. К.О. Шостак. Аналіз експресії генів за допомогою методів імуногістохімії і Вестерн-блот аналізу виконувався разом із к.б.н. К.О. Шостак і О.Є. Симиренко. Результати досліджень опубліковано в спільних публікаціях.

Автор висловлює щиру подяку співробітникам відділу структури та функції нуклеїнових кислот ІМБіГ НАНУ за допомогу в отриманні поліклональних антитіл проти TSC-22, співробітникам Інституту нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова за хірургічні зразки пухлинних тканин голового мозку, особливу подяку академікові АМН України Ю.П. Зозулі, д.мед.н., професору М.І. Шамаєву, д.мед.н., професору В.Д. Розуменко і к.мед.н. Т.А. Малишевій за допомогу в обговоренні результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було апробовано на семінарах відділів біосинтезу нуклеїнових кислот і молекулярної онкогенетики та наукових конференціях ІМБіГ НАН України і представлено у вигляді доповідей на 15-му Конгресі Європейської асоціації ракових досліджень, EACR (Стокгольм, Швеція, 1998), Міжнародній конференції Європейської федерації ракових товариств, ЕССО-10 (Відень, Австрія, 1999), 16-му конгресі EACR (Халкідікі, Греція, 2000), ІІ-му З'їзді онкологів країн СНД “Онкологія 2000” (Київ, 2000), ІІІ-му Конгресі Українських медичних генетиків (Львів, 2002), 17-му Конгресі EACR (Гранада, Іспанія, 2002), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), 5-й Парнасівській конференції (Київ, 2005), Конференції ЕССО-13 (Париж, Франція, 2005), Міжнародній конференції “Нейронаука для медицини і психології” (Судак, 2006), 20-му Міжнародному конгресі молекулярних біологів і біохіміків - IUBMB (Кіото, Японія, 2006), Конференції ЕССО-14 (Барселона, Іспанія, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 статей у провідних закордонних та вітчизняних фахових виданнях та тези 12 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методологічної частини, матеріалів і методів дослідження, результатів, аналізу і узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 325 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 46 рисунків і 21 таблицю. Список використаної літератури охоплює 567 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. В роботі використовували хімічні реактиви компаній “Calbiochem” (Швейцарія), “Sigma” (США), “Bio Rad” (США), “Serva” (Німеччина), “Amersham Pharmacia Biotech” (Швеція/Великобританія), “Difco” (США) або вітчизняні реактиви кваліфікації “хч” і “осч”. Для рестрикції і модифікації ДНК, а також для синтезу кДНК використовували рестриктази, ДНК-полімерази, лігазу, зворотну транскриптазу компаній “Fermentas” (Литва), “Roche” (Німеччина), “USB” (США). Введення радіоактивної мітки до складу ДНК здійснювали за допомогою мічених сполук [-³²S]dATP або [-³²P]dCTP виробництва “Amersham Pharmacia Biotech”.

Біологічний матеріал. В роботі були використані хірургічні зразки пухлин головного мозку, умовно нормального головного мозку (прилегла до пухлини гістологічно нормальна тканина головного мозку, що видаляється вимушено разом з пухлиною під час операції), а також парафінові зрізи пухлин, отримані з Інституту нейрохірургії імені акад. А.П. Ромоданова АМН України. Одразу після резекції хірургічні зразки заморожували в рідкому азоті, потім зберігали до використання в низькотемпературному холодильнику при -70 ^оС. Загалом, було проаналізовано біля 600 зразків тканин. Пацієнти були поінформовані та дали згоду на використання хірургічного матеріалу для наукових досліджень. Для ідентифікації даних і збереження анонімності кожному зразку тканини було привласнено номер, який використовували при описанні результатів.

Диференційна гібридизація бібліотек кДНК. Так звані “гриди”, тобто нейлонові фільтри з кДНК-клонами організованих бібліотек кДНК головного мозку ембріона людини і постнатального головного мозку людини, нанесеними у вигляді сітки з високою щільністю (близько 20000 клонів на площі 22 Ч 22 см), а також клони, визначені диференційною гібридизацією, були отримані з Центру ресурсів геномних досліджень Німеччини (RZPD, Deutsches Ressourcenzentrum fьr Genomforschung GmbH).

Гібридизацію “грид” із зондами тотальних кДНК гліальних пухлин і нормального головного мозку людини проводили протягом 10-16 год при 42 ^оС у приладі Autoblot (BellcoGlass, США) в розчині: 5 Ч SSC, 5 Ч Denhardt, 50 % деіонізований формамід, 100 мкг/мл денатурованої ДНК лосося, ³²P-мічена кДНК (питома активність - 10⁸ імп/хв на 1 мкг) в кількості 10⁷-10⁸ імп/хв на 1 мл гібридизаційного розчину. Синтез зондів кДНК проводили з використанням зворотної транскриптази Mu-MLV згідно стандартної методики (Sambrook et al., 1989), однак концентрацію dCTP знижували до 0,025 мМ і додавали 50 ?Ci [?-³²P]dCTP. Суміш інкубували протягом 1 год при 37 єС. Для гідролізу РНК в складі гібриду РНК:кДНК реакційну суміш обробляли 50 мМ NaOH протягом 1 год при 65 ^оС.

Фільтри відмивали 2 рази протягом 15 хв розчином 2 Ч SSC/0,1 % SDS при кімнатній температурі, потім 2 рази протягом 15 хв розчином 2 Ч SSC/0,1 % SDS при 65 ^оС і насамкінець протягом 15 хв розчином 0,2 Ч SSC/0,1 % SDS. Фільтри підсушували і проводили радіоавтографування на рентгенівську плівку з використанням підсилюючого екрану при -70 ^оС протягом 16 год або 1-3 діб, в разі необхідності.

Виділення тотальної РНК. Тотальну РНК із заморожених тканин виділяли екстракцією кислим гуанідинізотіоціанат-фенол-хлороформним розчином (Chomczynski et al., 1987). Наважку тканини, заморожену в рідкому азоті, гомогенізували в фармацевтичній ступці і заливали десятьма об'ємами розчину такого складу: 4 М гуанідинізотіоціанат; 5 мМ цитрат натрію, рН 7,0; 0,1 М 2-меркаптоетанол; 0,5 % саркозилат натрію. Отриману суспензію обробляли ультразвуком із використанням гомогенізатору Ultrasonic Homogenizer - 4710 Series, (Cole-Parmer Instrument Co, США), додавали рівний об'єм фенолу (pH 4,0) та Ѕ об'єму хлороформу, перемішували, витримували на льодяній бані протягом 10 хв і центрифугували при 12000g і 4 єС протягом 15 хв, відбирали водну фазу і екстрагували її Ѕ об'єму хлороформу. РНК осаджували одним об'ємом ізопропанолу або двома об'ємами 96 %-го етанолу при -20 єС протягом 1-2 год, центрифугували протягом 20 хв при 12000 g і 4 єС. Осад РНК розчиняли в стерильній воді, обробленій 0,01 % DEPC і зберігали при -70 С.

Нозерн-блот гібридизація. РНК фракціонували в горизонтальному 1,5 % агарозному гелі у присутності 2,2 М формальдегіду в боратному буфері (0,2 мM EDTA, pH 8,0; 30 мM борна кислота; 3,3 мM тетраборат натрію, pH 7,5). До розчину РНК (10 мкг сумарної РНК) додавали деіонізований формамід до кінцевої концентрації 25 %, формальдегід до кінцевої концентрації 2,2 М і відповідну кількість 20-кратного боратного буферного розчину, а також вносили 1 мкл бромистого етидію (концентрація 1 мг/мл). Перед нанесенням на гель пробу прогрівали 5 хв при 65С, охолоджували на льоду. Електрофорез проводили в однократному боратному буферному розчині протягом 3-4 год при 100 V (10 V/см). РНК переносили на нейлонові фільтри Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech, Швеція) в 20 Ч SSC протягом ночі з використанням паперо-вих рушників згідно загальноприйнятої методики (Sambrook et al., 1989). Закріплення РНК на фільтрах проводили за допомогою УФ-опромінення в приладі Spectrolinker (Spectronics Corporation, США) при 1200 мJ/см².

Зонди для Нозерн-гібридизації синтезували методом “мічення з розсіяною затравкою” або з використанням набору Rediprime (Amersham Pharmacia Biotech, Швеція) згідно рекомендації фірми-виробника.

РНК на фільтрах гібридизували в приладі Autoblot (BellcoGlass, США) в розчині: 50 % формамід; 5 Ч Denhart; 5 Ч SSPE; 100 мкг/мл ДНК лосося; 0,5 % SDS; ³²P-мічений зонд (питома активність - 10⁸ імп/хв на 1 мкг) в кількості 10⁷-10⁸ імп/хв на 1 мл гібридизаційного розчину. Гібридизацію проводили протягом 10-16 год при 42 ^оС. Фільтри відмивали 2 рази протягом 15 хв розчином 2 Ч SSC/0,1% SDS при кімнатній температурі, потім 2 рази протягом 15 хв розчином 2 Ч SSC/0,1% SDS при 65 ^оС, 1 раз протягом 15 хв розчином 0,2 Ч SSC/0,1 % SDS при 65 ^оС. Фільтри підсушували і проводили радіоавтогра-фування на рентгенівську плівку з використанням посилюючого екрану при -70 ^оС.

Зворотна транскрипція-полімеразна ланцюгова реакція. Напівкількісну ЗТ-ПЛР із специфічними для кожного гена праймерами проводили як описано (Rae et al., 2000). Однакова кількість тотальної РНК (10 мкг кожного зразка) була транскрибована в кДНК із використанням оліго(dT)-праймера. ПЛР проводили в 20 мкл реакційної суміші, яка містила кДНК, синтезовану на 0,5 мкг тотальної РНК, 2 од. Taq-полімерази, 1 Ч ПЛР буфер, 0,2 мМ dNTPs та 1 мкМ праймери для відповідного гена. Параметри ПЛР: денатурація 30 сек при 94 ^оC; відпалювання 1 хв при відповідній температурі для кожної пари праймерів; синтез 1 хв при 72 ^оC, впродовж 30 циклів і на закінчення синтез протягом 7 хв при 72 ^оC. Кількість циклів надалі зменшували до тих пір, поки ампліфікація продукту ПЛР залишалася на лінійному відрізку (27 циклів). Продукти ПЛР візуалізували фарбуванням бромистим етидієм після електрофорезу в 2 % агарозному гелі.

Вестерн-блот аналіз. Для отримання сумарного екстракту білків заморожену тканину розтирали в керамічній ступці на порошок з подальшою гомогенізацією на льоду в гомогенізаторі Даунса в буфері для лізису: 100 mM трис-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 % дезоксихолату натрія з додаванням готової суміші інгібіторів протеаз (Boehringer Mannheim, Німеччина). Після центрифугування гомогенату відбирали супернатант та визначали концентрацію білків у розчині за допомогою методу Бредфорда (Bradford, 1976). Електрофоретичне розділення білків проводили в денатуруючому 12% ДСН-ПААГ. Білки переносили на PVDF-мембрану за допомогою апарату для електропереносу при 250 мА протягом 75 хв.

Вільні центри зв'язування на мембрані блокували 5% розчином сухого знежиреного молока в PBST, після чого проводили інкубацію з первинними антитілами, розведеними в 5% розчині сухого молока/PBST (1:5000-1:10000), протягом 1 год при кімнатній температурі. Після відмивки мембрани від надлишку первинних антитіл, зв'язування з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону, проводили протягом 1 год при кімнатній температурі. Мембрану відмивали від надлишку вторинних антитіл і проявляли у розчині з люмінолом і пероксидом водню. Флуоресценцію комплексу досліджуваних білків з антитілами фіксували радіоавтографією на рентгенівську плівку.

Отримання рекомбінантного білка TSC-22. Продукт ПЛР, який кодує білок TSC-22, синтезовано за допомогою специфічних праймерів на плазмідній ДНК з клону ICRFp507J1041, яка містить повнорозмірну кДНК TSC-22, і клоновано у векторі pET-23d. Зконструйованою рекомбінантною плазмідою трансформували клітини E. coli BL21(DE). Бактеріальну культуру нарощували при 37 ^оС до оптичної густини 0,5-0,7 (? = 600 нм), і синтез рекомбінантного білка індукували впродовж 3 год у присутності 1мМ IPTG. Рекомбінантний білок, який має на С-кінці шість амінокислотних залишків гістидину, (His)₆, очищували з клітинного лізату афінною хроматографією на Ni-NTA-агарозі при нативних умовах згідно інструкції фірми-виробника (Qiagen, США). Аналіз білкових продуктів здійснювали електрофорезом в 12 %-му ДСН-ПААГ.

Імуногістохімічний аналіз. Поліклональні антитіла проти рекомбінантного TSC-22 отримували імунізацією кролів-самців вагою 2-3 кг, яким вводили антиген в PBS з 50% повним ад'ювантом Фрейнда - 10 підшкірних ін'єкцій вздовж хребта по 30 мкг на ін'єкцію. Дві повторні імунізації здійснювали такою ж кількістю антигену, але в неповному ад'юванті Фрейнда. Титр антитіл проти TSC-22 у сироватці кролів визначали за допомогою ELISA.

Імуноцитохімічний аналіз TSC-22 здійснювали на фіксованих формаліном зрізах, отриманих із заплавлених в парафіні хірургічних зразків астроцитом. Подвійне імуногістохімічне забарвлення зрізів пухлин антитілами проти TSC-22 та гліального кислого фібрілярного білка (GFAP) проводили як описано (Cuny et al., 2002). Неспецифічне забарвлення блокували 3 %-м розчином BSA в 1 x TBS (20 mM трис-HCl, pH 7,5; 0,25 M NaCl), який містив 0,2 % желатини. Потім скельця витримували з кролячими поліклональними антитілами проти TSC-22 (первинні антитіла) протягом ночі і відмивали від надлишку антитіл 0,1 % Tween 20 в 1 Ч TBS. Після цього скельця обробляли міченими флуоресцеїном вторинними анти-кролячими антитілами (Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (anti-rabbit FITC 488, Invitrogen A-11008)) протягом 2 год при кімнатній температурі, а потім послідовно інкубували з первинними моноклональними антитілами проти GFAP (Sigma G3893) і міченими родаміном вторинними анти-мишачими антитілами (Alexa Fluor®594 goat anti-mouse IgG (Invitrogen A-11005)). Скельця аналізували на флуоресцентному мікроскопі (Carl Zeiss, Німеччина) з використанням зеленого (для флуоресцеїну) та червоного (для родаміну) фільтрів і накладали картини флуоресценції одна на одну в програмі Photoshop (Microsoft, США) для порівняння локалізації експресії генів TSC-22 та GFAP.

Виділення і Саузерн-блот аналіз геномної ДНК. Геномну ДНК із заморожених тканин виділяли згідно стандартних методів (Sambrook et al., 1989). Заморожену тканину розтирали в керамічній ступці до порошку з періодичним додаванням рідкого азоту. Переносили порошок до розчину 10 мМ трис·HCl, pH 8,0; 0,1 M NaCl; 25 мМ EDTA; 0,5 % SDS; 100 мкг/мл протеїнази K із розрахунку 10 мл на 1г тканини. Інкубували протягом 3 год при 55С. Суспензію екстрагували рівним об'ємом фенолу (рН 8,0) при м'якому перемішуванні протягом 1 год. Після центрифугування відбирали водну фазу і повторювали екстракцію рівним об'ємом суміші фенол:хлороформ (1:1), а потім хлороформом. Вносили 1/10 об'єму ацетату натрію (рН 5,0) і осаджували ДНК додаванням 2 об'ємів 96 %-го етанолу. Згусток ДНК намотували на скляну паличку і промивали в 70 %-му етанолі, потім підсушували ДНК на повітрі і розчиняли у 0,5-1,0 мл деіонізованої води.

Геномну ДНК, гідролізовану рестриктазою HindIII, фракціонували електрофорезом в 0,6% агарозному гелі в трис-боратному буфері і переносили на нейлонові фільтри Hybond N або Hybond N⁺ (Amersham Pharmacia Biotech) в 10 Ч SSC протягом ночі з використанням паперових рушників. Після переносу ДНК закріплювали на фільтрах за допомогою УФ-опромінення в приладі Spectrolinker (Spectronics Corporation, США) при, 1200 мJ/см². ДНК на фільтрах гібридизували в приладі Autoblot (BellcoGlass, США) в розчині: 50% формамід, 5 Ч Denhart, 5 Ч SSPE, 100 мкг/мл ДНК лосося, 0,5 % SDS та ³²P-мічений зонд ДНК з питомою активністю 10⁸ імп/хв на 1мкг в кількості 10⁶-10⁷ імп/хв на 1мл гібридизаційного розчину. Гібридизацію проводили протягом 10-16 год при

42 С і після відмивання фільтри радіоавтографували на рентгенівську плівку.

Визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Нуклеотидну послідовність ДНК визначали за методом Сенгера за допомогою Sequenase™ Version 2.0 DNA Sequencing Kit (USB, США) згідно протоколу фірми-виробника. Пошук гомологічних послідовностей в GenBank і інших базах даних нуклеотидних та амінокислотних послідовностей здійснювали за допомогою програми Blast (http://ncbi.nih.hlm.gov/BLAST).

Результати досліджень та обговорення. Ідентифікація генів із зміненою експресією в астроцитарних гліомах з використанням диференційної гібридизації кДНК-бібліотек. Дві бібліотеки кДНК ембріонального головного мозку людини і одну бібліотеку кДНК постнатального головного мозку було проаналізовано диференційною гібридизацією. Було знайдено, що 0,25-0,5% клонів цих бібліотек містять нуклеотидні послідовності, що диференційно експресуються в гліобластомі порівняно з нормальним головним мозком. Приблизно такий же відсоток клонів кДНК, що диференційно гібридизувалися, був показаний іншими авторами в подібних дослідженнях щодо аналізу бібліотек кДНК. Повторна гібридизація індивідуальних клонів підтвердила результати первинного скринінгу приблизно для 25 % відібраних клонів, а секвенування вставок кДНК в цих клонах дозволило ідентифікувати гени, що диференційно експресуються в астроцитарних гліомах. Нозерн-блот гібридизація підтвердила зміни експресії виявлених генів в гліальних пухлинах.

Серед нуклеотидних послідовностей, що були ідентифіковані диференційною гібридизацією, можна виділити три групи - повторювані елементи геному людини, які відносять до класу коротких розсіяних по геному елементів (SINE, short interspersed nuclear element), гени мітохондріального геному, а також структурні гени, що кодують білки з різною функцією.

Використання Alu-вмісних кДНК як зондів для Нозерн-гібридизації не виявило дискретних транскриптів ні в РНК нормального головного мозку, ні в РНК астроцитарних пухлин. Замість цього, були отримані гетерогенні гібридизаційні сигнали розміром від 0,3 т.н. до більш ніж 7,0 т.н. Для РНК гліобластоми гібридизація з цими зондами була набагато інтенсивнішою порівняно з РНК астроцитом і нормального головного мозку. При використанні як гібридизаційних зондів унікальних послідовностей, що межують із Alu-повторами, не було знайдено підвищення вмісту відповідних транскриптів в РНК пухлин, і це свідчить про те, що саме Alu-повтор є головною мішенню аномалій транскрипційної “машинерії” в пухлинних клітинах. Подальші дослідження показали варіабельність рівнів експресії Alu-вмісних нуклеотидних послідовностей. Якщо в РНК деяких зразків гліобластом було виявлено підвищений вміст Alu-повторів, то в РНК інших зразків цього виявлено не було. Відмінності рівнів експресії послідовностей, що містять повторювані елементи, в різних зразках гліобластом свідчать про неоднозначність молекулярних варіантів цих пухлин.

Очевидно, акумуляція високих рівнів гетеродисперсних РНК, які містять Alu-повтори, є наслідком аномалій синтезу, деградації чи процесінгу РНК в пухлинних клітинах. Дерегуляція цих процесів, можливо, залучена до прогресії астроцитом в гліобластому. На користь цього може свідчити підвищення транскрипційної активності і ретротранспозиції SINEs, до яких належать Alu-повтори, виявлені при обробці культивованих клітин ДНК-ушкоджуючими агентами, такими як цисплатин, етопозид або гама-радіація, а також іншими генотоксичними агентами (Rudin et al., 2001; Hagan et al., 2007). При цьому в клітинах паралельно відбувається збільшення продукції зворотної транскриптази. Пухлиносупресорний ген ТР53 відіграє інгібіторну роль в ослабленні генотоксичної індукції SINEs. Ці результати показують, що початкове пошкодження геномної ДНК може запускати геномну нестабільність через активацію SINEs і ця відповідь може ампліфікуватись в пухлинних клітинах, в яких відсутній функціональний ТР53 (Hagan et al., 2007). Інактивація ТР53 є частою аномалію в гліомах.

З іншого боку, повторювані елементи можуть впливати на рівень експресії генів в пухлинних клітинах. Було показано in vitro, що нуклеотидні послідовності (Alu-повтор та ген tRNA^Pro), які транскрибуються РНК-полімеразою ІІІ, виявляють цис-діючий посилюючий ефект на транскрипцію РНК-полімеразою ІІ розташованого нижче гена (Oliviero et al., 1988). При аналізі впливу транспозонів на рівень транскрипції сусідніх генів в нормальних і відповідних пухлинних клітинах, найбільше підвищення транскрипції в пухлинних клітинах було знайдено для генів, які межували із SINEs (Alu-повторами), рівень якого зростав з числом сусідніх повторюваних елементів (Lerat et al., 2007). Гіперметильовані транспозони, які мовчать в нормальних клітинах, активуються внаслідок гіпометилювання в пухлинних клітинах. Ці результати свідчать, що Alu-повтори причетні до каскаду дерегуляції генів у трансформованих клітинах.

Нозерн-блот аналіз астроцитарних гліом різного ступеня злоякісності виявив суттєве зниження вмісту мітохондріальних мРНК ATP6, COXIII, COXII та ND1 в гліобластомах порівняно з нормальним головним мозком. Це наглядно видно для пари зразків від одного й того ж пацієнта - зразки 182 та 181. Саме вони були використані для первинного скринінгу кДНК-бібліотеки ембріонального головного мозку. Середня кількість мРНК ATP6, COXIII, COXII чи ND1 в гліобластомах вдвічі-втричі менша ніж в нормальному головному мозку.

Порівняння астроцитарних пухлин і відповідних прилеглих тканин нормального головного мозку виявило різницю рівнів мітохондріальних мРНК для анапластичної астроцитоми і навіть для астроцитоми II ступеня злоякісності. Нозерн-блот гібридизація із зондами кДНК COXI та ND4 виявила в астроцитарних пухлинах та нормальному головному мозку подібні картини експресії цих генів. Можна бачити зменшений вміст мРНК в гліобластомах порівняно із зразками нормального головного мозку.

З метою підтвердження факту зниження рівня транскрипції мітохондріальних генів у гліобластомі, було проаналізовано кількість ярликів для всіх мітохондріальних генів у гліобластомах і нормальному головному мозку за допомогою програми SAGEmap. Аналіз показав, що рівні транскріпції всіх мітохондріальних генів у гліобластомі є нижчими порівняно з нормальним головним мозком людини.

Причина зниження рівня експресії мітохондріальних генів у гліобластомі поки що невідома. Це може бути наслідком зниження транскрипційної активності мітохондріального геному через збільшення кількості великих мутацій в мтДНК та/або зменшення кількості мітохондрій в гліобластомах. Морфометричні дослідження (Oudard et al., 1997; Шамаєв та ін., 2006) показали зменшення площі, яку займають мітохондрії в цитоплазмі клітин астроцитарних гліом, розмірів мітохондрій та/або зміни їхньої тонкої ультраструктури, що безпосередньо пов'язані зі зростанням анаплазії цих пухлин. Отже, зниження експресії мітохондріальних генів у гліобластомі корелює із зменшенням кількості і розмірів мітохондрій та зменшенням площі їхньої функціональної поверхні. Іншими авторами виявлено як підвищення, так і зниження рівня експресії мітохондріальних генів у пухлинах людини різного походження (Glaichennhaus et al., 1986; Corral et al., 1989; Yamamoto et al., 1989; Heerdt et al., 1990; Faure-Vigny et al., 1996 Haugen et al., 2003).

Таким чином, результати, отримані з використанням диференційної гібридизації кДНК-бібліотек, подальшим визначенням нуклеотидної послідовності вставок кДНК, що диференційно гібридизувалися, і Нозерн-блот гібридизацією пухлинних зразків, а також результати SAGE вказують на генералізовану інактивацію експресії мітохондріальних генів у гліобластомі порівняно з нормальним головним мозком. Зниження вмісту всіх мітохондріальних мРНК в гліобластомах, можливо, є відображенням особливостей останньої стадії злоякісної прогресії гліальних пухлин.

Інші клони, відібрані диференційною гібридизацією, містили кДНК-вставки, що відповідали добре охарактеризованим генам. Нозерн-блот аналіз із використанням деяких із цих кДНК-вставок підтвердив зміни експресії цих генів в астроцитарних гліомах. Аналіз даних літератури показав залучення цих генів до процесів, що відбуваються в пухлинних клітинах. Зокрема, активація експресії гена YB-1 асоційована з несприятливим прогнозом для пацієнтів з раком молочної залози, корелюючи зі стійкістю до хіміотерапії і високим ризиком рецидивів (Janz et al., 2002; Huang. et al., 2005). Крім того, надекспресію YB-1 знайдено в гліобластомах у дітей при профілюванні експресії генів у цих пухлинах (Faury et al., 2007). Аполіпопротєїн Е може бути маркером, специфічним для астроцитарних пухлин. Імуногістохімічний аналіз показав його придатність для розпізнавання астроцитом і олігодендрогліом разом з маркерами астроцитарних клітин GFAP і YKL-40 та маркерами олігодендрогліальних клітин ASCL1 і NKX2-2 (Rousseau et al., 2006).

Найбільшу увагу серед генів із зниженою експресією, що виявлені диференційною гібридизацією, привертає TSC-22. Аналіз експресії гена TSC-22, проведений Нозерн-блот гібридизацією (Шостак та ін., 2001), показав, що він інактивується в більшій частині астроцитарних пухлин, а також в інших типах пухлин головного мозку. Для підтвердження диференційної експресії гена TSC-22 в астроцитомах і нормальному головному мозку нами було використано також напівкількісну ЗТ-ПЛР, яка підтвердила результати, отримані Нозерн-блот гібридизацією, і показала зниження рівня його експресії в астроцитомах II-III ступенів злоякісності і відсутність його експресії в усіх восьми проаналізованих зразках гліобластом.

Експресію TSC-22 було проаналізовано в астроцитарних гліомах на рівні білка за допомогою імуногістохімічного аналізу. З цією метою за допомогою специфічних праймерів на плазмідній ДНК ICRFp507J1041, що включала кДНК TSC-22, було отримано продукт ПЛР, який кодує білок TSC-22, і клоновано в експресувальному плазмідному векторі pET-23d. Рекомбінантний білок TSC-22 було виділено з клітин E. coli, трансформованих сконструйованою плазмідою. Розмір рекомбінантного білка TSC-22 після очищення на колонці з Ni-NTA-агарозою відповідав очікуваному - близько 20 кДа.

Поліклональні антитіла проти TSC-22 були отримані після імунізації кролів рекомбінантним білком і використані разом з моноклональними антитілами проти людського GFAP (специфічний гліальний білок) для подвійного забарвлення парафінових зрізів пухлинних тканин з метою визначення клітинної локалізації (гліальні клітини або мікроглія/макрофаги) та рівня експресії TSC-22 в астроцитомах різного ступеня злоякісності. Накладання двох флуоресцентних картин забарвлення виявило їхню схожість. Таким чином, можна зробити висновок, що білок TSC-22 продукується або накопичується в астроцитах, як і білок GFAP, що є добре відомим маркером астроцитів. Аналіз астроцитом різного ступеня злоякісності показав, що кількість клітин, забарвлених антитілами проти TSC-22, в гліобластомі суттєво менша ніж в дифузній астроцитомі. Ці результати вказують на кореляцію між зниженням рівня мРНК TSC-22 і зниженням вмісту білка TSC-22 в астроцитомах більшого ступеня злоякісності.

Аналіз геномної ДНК не виявив делецій в локусі гена TSC-22 (Shostak et al., 2003) в астроцитомах. Аналізом нуклеотидної послідовності 5'-фланкуючої ділянки гена TSC-22 було знайдено декілька сайтів для рестриктази HpaII (CCGG) і високу щільність CрG-динуклеотидів в промоторній ділянці TSC-22, що є ознакою так званих CрG-острівців (Gardiner-Garden et al., 1987), які часто гіперметильовані в пухлинах (Esteller et al., 2005). Можливо, інактивація TSC-22 в гліальних пухлинах відбувається внаслідок метилювання його промоторної ділянки.