Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Антибактеріальна активність синтетичних порфіринів

ЗІНЧЕНКО ОКСАНА ЮРІЇВНА

КИЇВ-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Філіпова Тетяна Олегівна, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, професор кафедри мікробіології і вірусології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

доктор біологічних наук, професор Федоровська Олена Олексіївна, Інститут гематології та трансфузіології НАН України, завідуюча лабораторії мікробіології та імунних препаратів.

Провідна установа: Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова Академії медичних наук України, м. Харків.

Захист відбудеться "20" вересня 2006 р. о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна,

Д 03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано "14" cерпня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У останні роки велике занепокоєння викликає швидке зростання антибіотикорезистентності мікроорганізмів, обумовлене широким і часто безконтрольним застосуванням антибіотиків. У такій ситуації є бажаним винайдення принципово нових засобів антимікробної терапії, активних щодо збудників інфекційних захворювань людини. Перспективною групою сполук вважають синтетичні порфірини, що вже протягом тривалого часу застосовуються як фотосенсибілізатори (ФС) у фотодинамічній терапії пухлинних захворювань. Фотосенсибілізатори - це молекули, здатні поглинати світло з певною довжиною хвилі і генерувати активні форми кисню, які є цитотоксичними для клітини-мішені (Красновский, 1990). Останні дослідження вказують на можливість істотного розширення області застосування такої терапії за рахунок використання цього підходу для лікування інфекційних захворювань, викликаних бактеріальними, вірусними та грибковими збудниками (Allen, 1995). Експериментальні дані свідчать про те, що порфірини і їх металокомплекси здатні викликати фотоіндуковану загибель бактеріальних клітин. Важливо, що ці ефекти виявляються і на антибіотикостійких штамах мікроорганізмів (Bertoloni, 1993).

Разом з тим, дані про темнову активність тетрапірролів, яка не потребує активації світлом, у доступній нам літературі відсутні. На жаль, і в Україні не проводяться такі дослідження. Тому актуальним є дослідження чутливості мікроорганізмів до вітчизняних ФС з антимікробною дією і вивчення темнових ефектів цих сполук.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обрана тема дослідження розвиває держбюджетну тему Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова "Комплексне вивчення механізмів дії природних та синтетичних порфіринів на клітини" № держреєстрації 0101U001594. Дисертант є співвиконавцем теми.

Мета та задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є визначення чутливості умовно-патогенних бактерій до хімічної та фотосенсибілізуючої дії синтетичних порфіринів.

Виходячи з мети дослідження виявилося необхідним вирішення наступних задач:

1. Дослідити особливості росту умовно-патогенних бактерій при додаванні до поживного середовища нових катіонних та аніонних синтетичних порфіринів.

2. Вивчити чутливість клітин тест-мікроорганізмів до фотосенсибілізуючої дії нових тетрапірролів.

3. Порівняти закономірності антимікробної дії вільних основ порфіринів та їх комплексів з металами за умов фотоактивації та без неї.

4. Порівняти чутливість антибіотикорезистентних та чутливих до антибіотиків штамів до темнової та фотосенсибілізуючої дії порфіринів.

5. Порівняти чутливість грампозитивних та грамнегативних бактерій до темнової та фотосенсибілізуючої дії вивчених сполук.

6. Визначити здатність бактеріальних клітин до зв'язування синтетичних тетрапірролів та дослідити залежність антимікробних ефектів від кількості зв'язаної речовини.

7. Дослідити характер темнової антимікробної дії синтетичних порфіринів та вивчити їх вплив на чутливість мікроорганізмів до антибіотиків.

Об'єкт дослідження. Особливості росту умовно-патогенних мікроорганізмів за темнової та фотосенсибілізуючої дії нових синтетичних порфіринів.

Предмет дослідження. Визначення чутливості умовно-патогенних бактерій до дії катіонних та аніонних мезо-заміщених порфіринів і хлоринів та їх металокомплексів.

Методи дослідження. Для досягнення вказаної мети та вирішення перелічених задач в дисертаційній роботі використовували мікробіологічні та математичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів

1. Уперше досліджено чутливість бактерій до темнової та фотодинамічної дії двадцяти нових синтетичних порфіринів, що не мають світових аналогів, та встановлено залежність ефекту від структури цих сполук.

2. Уперше встановлено, що ріст культур Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa пригнічується при додаванні до поживного середовища синтетичних порфіринів в концентраціях 10-40 мкМ.

3. Показано, що фотоіндукована і темнова дія порфіринів не залежить від антибіотикочутливості тест-мікроорганізмів: однакові ефекти спостерігаються при дослідженні дії порфіринів на чутливі штами S. aureus АТСС 25923, E. coli АТСС 25922, P. vulgaris АТСС 6896, P. aeruginosa АТСС 27853, полірезистентні штами S. aureus ОГУ 223, E. coli ОГУ 206, P. vulgaris ОГУ 205, P. aeruginosa ОГУ 211 та клінічні ізоляти S. aureus, E. coli, P. vulgaris та P. aeruginosa.

4. Уперше встановлено, що порфірини з високою фотоіндукованою активністю практично не виявляють темнової дії і навпаки, сполуки зі значною темновою дією не здатні викликати фотосенсибілізацію бактеріальних клітин. Також показано, що найбільш високу фотосенсибілізуючу дію серед аналогів порфіринів мають їх вільні основи, а серед похідних хлоринів - металокомплекси.

5. Встановлено, що ріст S. aureus, E. сoli і P. aeruginosa пригнічується відразу після додавання асиметрично заміщених порфіринів з бактерицидним типом дії.

Практичне значення отриманих результатів.

Проведене дослідження дає підстави для розробки на основі нових синтетичних тетрапірролів антимікробних засобів з оригінальними механізмами дії на клітини Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris та Pseudomonas aeruginosa.

За результатами дослідження розроблено методичні рекомендації щодо модифікації структури (функціоналізації) синтетичних порфіринів з метою одержання сполук з переважно фотосенсибілізуючою або темновою активністю щодо умовно-патогенних бактерій. Ці рекомендації впроваджені у роботу лабораторії синтезу лікарських засобів ОНУ ім. І. І. Мечникова. На основі асиметрично заміщених порфіринів рекомендовано створення антимікробних засобів з бактерицидним типом дії.

Експериментально доведена можливість включення асиметрично заміщених порфіринів до матеріалів, з яких виготовляють внутрішньовенні катетери тривалого використання. Розроблено рекомендації щодо включення порфіринів до складу матеріалів медичного призначення з метою запобігання їх інфікуванню шпитальними штамами.

Результати дослідження впроваджено у лабораторні заняття з великого спецпрактикуму на кафедрі мікробіології і вірусології ОНУ. Розроблені методичні підходи використовуються при виконанні курсових та дипломних робіт.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь дисертанта полягала в критичному аналізі літературних даних, розробці та удосконаленні методичних підходів щодо виконання поставленої мети, експериментальному її обґрунтуванні, узагальненні одержаних результатів, статистичній обробці цифрового матеріалу.

Автором самостійно проведено відбір полірезистентних до антибіотиків штамів умовно-патогенних бактерій для використання їх як тест-об'єктів, здійснено оцінку чутливості відібраних штамів до темнової та фотодинамічної дії 20 нових синтетичних мезо-заміщених порфіринів, визначено характер антибактеріальної дії досліджених сполук, вивчено особливості зв'язування бактеріальними клітинами природних та синтетичних порфіринів, виявлено вплив досліджених сполук на чутливість тест-штамів до антибіотиків та визначено характер взаємодії між порфіринами та антибіотиками.

Досліджені сполуки синтезовані групою хіміків у складі проф. З. І. Жиліної, к.х.н. С. В. Водзінського та к.х.н. Ю. В. Ішкова, які є співавторами відповідних публікацій.

Постановка завдань, обговорення одержаних результатів та підготовка публікацій за результатами досліджень проводились спільно з науковим керівником д.б.н, проф. Філіповою Т. О.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень за темою дисертації представлені на ІІ національному з'їзді фармакологів України "Фармакологія 2001 - крок у майбутнє" (Дніпропетровськ, 2001), VI Пущинській школі - конференції молодих вчених "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2002), науково-практичній конференції "Динаміка наукових досліджень." (Дніпропетровськ, 2002), ІХ Міжнародній конференції з хімії порфіринів і їх аналогів (Суздаль, 2003), International Weigl conference "Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance" (Львів, 2003), IV - й українській науково-практичній конференції з клінічної фармакології "Актуальні питання фармакології" (Вінниця, 2004) та X з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових робіт, серед них 6 - наукові статті (4 у фахових виданнях), 7 - тези доповідей на наукових конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 200 сторінках, ілюстровано 54 рисунками, 43 таблицями. Робота складається з розділів: "Вступ" "Огляд літератури", "Матеріали та методи", 4 розділів власне експериментальних досліджень, "Аналіз та узагальнення результатів", "Висновки", "Список літератури". Бібліографія включає 247 джерел, в тому числі 217 іноземних.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури дано хімічну характеристику синтетичних тетрапірролів (будова та основні властивості), описано їх поширення в природі та біологічні функції. Проаналізовано сучасний стан досліджень в області використання синтетичних порфіринів як антимікробних агентів. Розглянуто взаємодію між мікроорганізмами та порфіринами та механізми пошкодження бактеріальних клітин. Зроблено акцент на відсутність у літературі даних про темнову активність даної групи сполук. Розглянуто перспективи використання синтетичних порфіринів та споріднених сполук як антибактеріальних і антивірусних агентів.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі як тест-мікроорганізми використовували штами бактерій Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Proteus vulgaris ATCC 6896, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 та Bacillus subtilis АТСС 6633 з відомою чутливістю до антибіотиків, отримані з музею культур кафедри мікробіології і вірусології ОНУ ім. І. І. Мечникова, полірезистентні до антибіотиків музейні штами S. aureus ОГУ 223, E. coli ОГУ 206, Salmonella enteritidis var. Isatchenko ВНИИСХМ 18/1, P. vulgaris ОГУ 205, P. aeruginosa ОГУ 211, отримані там же, та полірезистентні до антибіотиків клінічні штами S. aureus, E. coli, P. vulgaris та P. aeruginosa, виділені співробітниками діагностичної лабораторії Одеської обласної дитячої клінічної лікарні. Усього в роботі було використано 24 штами: 7 штамів виду S. аureus, 5 штамів E. сoli, 5 штамів P. vulgaris, 5 - P. aeruginosa та по 1 штаму S. enteritidis та B. subtilis.

Зберігання тест-штамів проводили на поверхні скошеного м'ясо-пептонного агару (МПА) при температурі 4 ⁰С. Для експерименту використовували добові культури, що вирощувались у пробірках на скошеному МПА при 37 ⁰С.

Досліджували активність 20 сполук - 6 вільних основ: мезо-тетра(N-метил-6-хінолініл)порфірин (І), мезо-тетра(N-метил-4-піридил)порфірин (ІІ), мезо-тетра(N-мeтил-6-хінолініл)хлорин (ІІІ), 5,10,15-три(N-метил-4-піридил)-20-(н-ноніл)порфірин (IV), 5,10, 15-три(N-метил-4-піридил)-20-(н-гексадецил)порфірин (V), мезо-тетра(п-карбоксифеніл)порфірин (VI) та комплекси сполуки І з германієм (VII), оловом (VIII), марганцем (ІХ); сполуки ІІ з цинком (Х), нікелем (ХІ), германієм (ХІІ); сполуки ІІІ з оловом (ХІІІ); сполук IV, V, VI з цинком (XIV, XV, XVI, відповідно).

Морфологічні та культуральні властивості тест-штамів вивчали стандартними методами.

Чутливість тест-штамів бактерій до антибіотиків визначали за стандартним тестом Кірбі-Бауера з використанням паперових дисків.

Визначення здатності бактеріальних клітин до зв'язування порфіринів. При визначенні зв'язування досліджуваних порфіринів з клітинами мікроорганізмів готували суспензії бактеріальних клітин у середовищі, яке містило різні концентрації досліджуваних сполук. Після певного часу інкубації клітини відмивали фізіологічним розчином та екстрагували зв'язані мікроорганізмами сполуки метиловим спиртом. Вимірювали оптичну густину на спектрофотометрі "Spekol-10" та визначали кількість порфіринів за калібрувальною кривою. Визначення екстинкції розчинів кожного з порфіринів проводили при довжині хвилі, яка відповідає максимуму поглинання даної речовини (смуга Соре) (Malik аt al., 1990).

Визначення чутливості мікроорганізмів до темнової дії порфіринів.

При вивченні темнового впливу досліджуваних речовин користувалися стандартною методикою визначення антимікробної активності сполук (Біргер, 1973). Дію сполук оцінювали за накопиченням біомаси в контрольних і дослідних варіантах, вимірюючи оптичну густину зразків на спектрофотометрі "Spekol-10" (Німеччина) при довжині хвилі 540 нм.

Кількість накопиченої біомаси тест-штамів визначали за калібрувальними кривими, для побудови яких клітини із зразків з певною оптичною густиною відмивали від поживного середовища та висушували до постійної маси. Зважування зразків провадили на електронних вагах Adventurer (США).

За контроль правили культури мікроорганізмів, паралельно вирощені в середовищі Гісса без додавання досліджуваних речовин.

Визначення фотосенсибілізації бактеріальних клітин у присутності порфіринів. Для визначення фотоіндукованої дії досліджуваних сполук суспензії тест-мікроорганізмів інкубували з порфіринами для зв'язування сполук з клітинами, після чого проводили активацію досліджуваних речовин за допомогою лампи розжарювання денного світла потужністю 500 Вт. Інтенсивність опромінення складала 40 J/cм². З опромінених суспензій робили висіви у стерильне середовище Гісса з глюкозою та спостерігали за ростом культур (Черняева, 1990).

Кількість повторів, умови інкубації та оцінка результатів аналогічні попередній методиці.

Визначення характеру дії порфіринів на бактеріальні клітини. Культури тест-штамів інкубували у рідкому середовищі на термостатованій гойдалці до початку логарифмічної фази, після чого додавали досліджувані сполуки та через рівні проміжки часу проводили вимірювання оптичної густини і висіви на поверхню м'ясо-пептонного агару для визначення кількості життєздатних клітин. Для даної серії дослідів використовували сполуки, які виявили значну темнову антимікробну дію.

Вивчення чутливості мікроорганізмів до комбінованої дії порфіринів та антибіотиків. На першому етапі визначали мінімальну інгібуючу концентрацію антибіотиків та порфіринів у рідкому середовищі Гісса за кольоровою реакцією (Біргер, 1973). Далі вивчали сумісну дію антибіотиків та порфіринів. Для цього тест-мікроорганізми вирощували у середовищі Гісса з індикатором Андреде, до якого одночасно додавали антибіотики та порфірини у концентраціях, менших за МІК. Для оцінки характеру сумісної дії антибіотиків та порфіринів обчислювали фракційну інгібуючу концентрацію (ФІК) за наступною формулою:

ФІК=МІК А у присутності В/МІК А+МІК В у присутності А/МІК В,

де А - антибіотик, В - порфірин.

При ФІК?0,5 взаємодію досліджуваних сполук оцінювали як сінергізм, 0,5<ФІК<2,0 - як адитивний ефект, ФІК?2,0 - антагонізм (Hallander, 1982).

Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням методів варіаційного та кореляційного аналізу. Математичні розрахунки проводили за допомогою комп'ютерної програми Excel (Лапач та ін., 2001).

РОЗДІЛ 3. ЧУТЛИВІСТЬ ТЕСТ-ШТАМІВ ДО АНТИБІОТИКІВ, ПРИРОДНИХ ПОРФІРИНІВ ТА СОЛЕЙ МЕТАЛІВ

Антибактеріальна активність синтетичних порфіринів досліджена нами на 24 штамах умовно-патогенних бактерій 6 видів. Серед них 4 еталонні колекційні штами з відомою чутливістю до антибіотиків, та 20 полірезистентних штамів (6 колекційних та 14 клінічних ізолятів). Встановлено, що усі відібрані штами, крім еталонних, є резистентними до поліміксинів, макролідів, тетрацикліну, лінкозамідів та пеніцилінів. Використання чутливих та стійких до антибіотиків штамів було необхідним для встановлення зв'язку між антибіотикорезистентністю та чутливістю до дії порфіринів.

При вивченні особливостей росту тест-штамів за присутності природних порфіринів не виявлено будь-якого впливу цих сполук на накопичення бактеріальної біомаси як у темнових умовах, так і при опроміненні.

Оскільки в експериментальних дослідженнях використовувалися комплекси порфіринів з металами, а саме, з Ni, Mn, Zn та Sn, було проведено визначення впливу солей відповідних металів на ріст мікроорганізмів. Установлено, що кількість накопиченої біомаси усіх штамів, за винятком P. vulgaris ОГУ 205 та P. aeruginosa ОГУ 211, за присутності зазначених сполук не відрізняється від контрольного значення. Ріст P. vulgaris усі досліджені солі дещо стимулювали, а у P. aeruginosa стимулюючий ефект спостерігався за присутності NiSO₄.

РОЗДІЛ 4. РІСТ БАКТЕРІЙ ЗА ПРИСУТНОСТІ КАТІОННИХ ТЕТРАПІРРОЛІВ

Серед досліджених сполук високу антибактеріальну активність щодо усіх тест-штамів виявлено у асиметрично заміщених порфіринів. Вони були здатні повністю пригнічувати ріст як чутливих до антибіотиків, так і полірезистентних штамів. На рисунку 1 показано вплив різних концентрацій асиметрично заміщених порфіринів на ріст S. аureus та E. сoli. Приблизно однакова з клітинами E. сoli чутливість була зареєстрована для більшості штамів грамнегативних бактерій. У сполук цієї групи також виявлено високу здатність до фотосенсибілізації клітин бактерій. Особливо чутливими виявилися штами P. vulgaris: після опромінення у присутності сполуки VI росту бактерій не спостерігали.

Крім зазначених сполук високою темновою активністю щодо ентеробактерій характеризувався германієвий комплекс XII, різні концентрації якого спричиняли пригнічення росту різних штамів на 42-100 %. Впливу даної сполуки на ріст штамів S. aureus, B. subtilis та P. aeruginosa не зареєстровано.

Щодо решти досліджених сполук штами різних видів характеризувалися різною чутливістю. Так, ріст колекційних і клінічних штамів S. aureus, B. subtilis та P. vulgaris майже повністю пригнічувався у присутності максимальної концентрації сполуки IX, сполука VIII повністю припиняла ріст E. coli. Помітну інгібуючу дію щодо більшості тест-штамів також виявили хлорини.

З'ясовано, що найбільшою чутливістю до темнової дії порфіринів характеризуються штами грампозитивних видів S. aureus та B. subtilis.

У фотодинамічних дослідженнях високу здатність сенсибілізувати клітини бактерій до денного світла виявили порфірини, що містять у мезо-положеннях N-метилпіридил. Сполуки ІІ та Х значно підвищували чутливість усіх штамів до опромінення денним світлом. Винятком є лише клітини P. aeruginosa.

Фотодинамічні дослідження також продемонстрували більшу чутливість грампозитивних бактерій до фотосенсибілізації у присутності порфіринів.

Цікаво було прослідити залежність між активністю та будовою сполук. На рис. 4 показано активність вільної основи та олов'яного комплексу порфірину і хлорину схожої структури. З'ясовано, що олов'яні комплекси порфіринів мають більш високу темнову антимікробну активність щодо грамнегативнх бактерій, проте хлорини є більш активними їх фотосенсибілізаторами.

У грампозитивних темнова активність не залежала від структури, але фотодинамічний ефект був більш вираженим у присутності хлоринів.

РОЗДІЛ 5. РІСТ БАКТЕРІЙ У ПРИСУТНОСТІ АНІОННИХ ПОРФІРИНІВ

У роботі досліджено активність аніонних порфіринів (рис. 5, а, б), що є предметом особливої уваги, оскільки більшість дослідників повідомляє про відсутність у даних сполук антимікробних властивостей. Нами встановлено, що у присутності мезо-тетра(п-карбоксифеніл)порфірину максимальне пригнічення росту S. aureus та B. subtilis складало приблизно 88 % (рис. 5, а).

Причому, слід зазначити, що у випадку аніонних порфіринів, на відміну від катіонних, спостерігали зворотну залежність між активністю та концентрацією сполуки в середовищі. У випадку P. vulgaris спостерігався максимальний інгібуючий вплив на рівні 40 %. Активність цинкового комплексу була помітно нижчою (рис. 5, б), що також є особливістю аніонних порфіринів порівняно з катіонними, для яких показано зростання активності при утворенні металокомплексів. Фотодинамічну активність зареєстровано лише у сполуки VI, за присутності якої приблизно 25 % клітин P. vulgaris ставали чутливими до дії денного світла.

РОЗДІЛ 6. ДЕЯКІ ОСОБЛИВОСТІ АНТИБАКТЕРІАЛЬНОЇ ДІЇ СИНТЕТИЧНИХ ПОРФІРИНІВ

Установлено, що клітини тест-штамів здатні активно зв'язувати досліджені сполуки. Для більшості сполук було характерне максимальне зв'язування після 20 хвилин інкубації (рис. 6). У подальшому частина зв'язаних сполук вивільнювалася назад у середовище (рис. 7). Грамнегативні бактерії зв'язували порфірини більш активно.

Було з'ясовано, що не існує прямої залежності між активністю досліджених сполук та рівнем їх зв'язування з бактеріальними клітинами. Цей факт свідчить про здатність порфіринів викликати антибактеріальний ефект за рахунок пошкодження поверхневих структур мікробних клітин.

У більшості активних у темнових умовах сполук виявлено бактеріостатичний характер антибактеріальної дії. Бактерицидну активність встановлено лише у асиметрично заміщених сполук з н-нонілом в одному з мезо-положень. Додавання цих порфіринів у логарифмічній фазі затримувало подальше наростання біомаси (рис. 8). Після висіву на МПА у культурі S. aureus ОГУ 223 реєстрували зменшення кількості життєздатних клітин приблизно на 90 % у присутності металокомплексу (ХIV), сполука IV викликала загибель 100 % клітин. У культурі E. coli ОГУ 206 вільна основа також спричиняла втрату життєздатності 100 % клітин, металокомплекс - приблизно 80 % клітин. Однак, літичної дії, притаманної деяким порфіринам, яку можна зареєструвати за просвітленням культуральної рідини, не спостерігалося. Цей факт дає підставу припустити, що бактерицидна дія досліджених сполук викликана пошкодженням внутрішніх структур бактеріальної клітини або блокуванням важливих метаболічних процесів.



Рис. 8. Вплив 5,10,15-три(N-метил-4-піридил)-20-(н-ноніл)порфірин тритозилату на накопичення біомаси S. aureus та E. coli

Примітка: - контроль,

- оптична густина культури, до якої додавали сполуку І.

Заштриховані фігури - значення для E. coli, пусті фігури - значення для S. aureus, стрілкою позначено момент додавання порфірину.

У порфіринів, які спричинили значну інгібуючу дію у темнових умовах, виявлено здатність у невисоких концентраціях підвищувати чутливість тест-штамів до еритроміцину та тетрацикліну. Зокрема, асиметрично заміщені порфірини зменшували МІК еритроміцину для S. aureus ОГУ 223 у 8-16 разів, тетрацикліну - у 16 разів. У E. coli ОГУ 206 цей показник зменшувався у випадку еритроміцину у 16 разів, тетрацикліну - у 8 разів (табл.). У інших активних сполук також виявлено здатність впливати на чутливість тест-штамів до зазначених антибіотиків. Обчислення ФІК дозволило оцінити характер взаємодії досліджуваних порфіринів та антибіотиків. Для більшості комбінацій він був визначений як сінергізм.

Таблиця Вплив порфіринів на чутливість S. aureus ОГУ 223 і E. coli ОГУ 206 до еритроміцину та тетрацикліну

Мікроорганізм	Варіант	МІК еритроміцину, мкг/мл	МІК тетрацикліну, мкг/мл
S. aureus	Контроль*	60	240
	IV	3,75	3,75	15	15
	XIV	7,50	3,75	15	15
E. coli	Контроль*	120	240
	IV	7,50	7,50	240	240
	XІV	7,50	7,50	15	15

Примітка: * - МІК антибіотика без додавання порфіринів.

У дослідах показано, що відрізки катетеру, просочені розчином порфірину, здатні затримувати ріст S. aureus протягом 10 днів, ріст Е. сoli - протягом 5 днів (рис. 9). Щодо культури стафілокока інгібуюча дія була більш сильною, ніж по відношенню до E. coli.

Рис. 9. Інгібуюча дія відрізків катетерів, оброблених сполукою XVII на ріст S. aureus та E. coli

Отримані дані свідчать про можливість вирішення проблеми інфікування медичного інструментарію шпитальними штамами.

бактерія синтетичний порфірин тетрапіррол

ВИСНОВКИ

1. Вперше досліджено чутливість умовно-патогенних бактерій до 20 нових синтетичних мезо-заміщених порфіринів.

2. S. aureus, B. subtilis, E. coli, S. enteritidis, P. vulgaris та P. aeruginosa виявили високу чутливість до катіонних порфіринів. Найбільш активними були асиметрично заміщені сполуки, які пригнічували ріст даних мікроорганізмів у концентрації 10 мкМ.

3. При утворенні комплексів досліджуваних порфіринів з металами темнова активність щодо S. aureus, B. subtilis, E. coli, S. enteritidis, P. vulgaris та P. aeruginosa підвищується.

4. Чутливість бактерій до дії видимого світла найбільш суттєво зростає в присутності мезо-піридилзаміщених порфіринів та синтетичних хлоринів. Опромінення в присутності цих сполук призводить до втрати життєздатності 50-100 % клітин.

5. Вперше показано, що катіонні порфірини з високою фотодинамічною активністю щодо тест-мікроорганізмів не виявляють темнової активності і навпаки, сполуки з високою темновою активністю не здатні фотосенсибілізувати бактеріальні клітини.

6. Комплекси досліджених мезо-хінолініл- та мезо-піридилзаміщених порфіринів з металами виявляють більш низьку фотодинамічну активність щодо грампозитивних і грамнегативніих мікроорганізмів в той час, як для таких комплексів з хлоринами є характерним її підвищення.

7. Найбільшу чутливість до досліджених катіонних сполук як у темноті, так і при опроміненні виявляють клітини S. aureus та B. subtilis.

8. Ріст тест-мікроорганізмів пригнічується аніонним мезо-тетра(п-карбоксифеніл)порфірином та його цинковим комплексом у концентрації 20 мкМ. Але ці сполуки не виявили фотосенсибілізуючої дії.

9. Показано, що клітини S. aureus та E. сoli більш ефективно зв'язують синтетичні порфірини, ніж природні. Проте, антимікробна дія порфіринів не залежить безпосередньо від рівня зв'язування.

10. Встановлено, що асиметрично заміщені порфірини, які містять в одному з мезо-положень н-ноніл, справляють бактерицидну дію щодо S. aureus, E. сoli і P. aeruginosa та здатні у концентрації 1 мкМ знижувати мінімальні пригнічуючі дози антибіотиків. Цей ефект може бути використаний для підвищення ефективності антибіотикотерапії.

11. Не виявлено змін в морфологічних та культуральних властивостях тест-мікроорганізмів при визначенні темнової та фотоіндукованої активності досліджуваних сполук.

СПИСОК НАУКОВИХ, ПРАЦЬ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Філіпова Т. О., Галкін Б. М., Зінченко О. Ю., Русакова М. Ю., Жиліна З. І., Водзінський С. В., Ішков Ю. В. Взаємодія мікроорганізмів з природними і синтетичними порфіринами // Вісник ОНУ. Біологія. - 2001. - Т. 6, вип. 2. - С. 317-322. (Здобувачем проведено експериментальні дослідження темнової та фотодинамічної дії природних та мезо-хінолінілзаміщених синтетичних порфіринів на клітини бактерій ).

2. Зінченко О. Ю. Вплив порфіринів на ріст грампозитивних і грамнегативних бактерій // Вісник ОНУ. Біологія. - 2003. - Т. 8, вип. 2. - С. 157 - 160. (Здобувачем проведено експериментальні дослідження, статистичну та математичну обробку результатів, інтерпретацію результатів та оформлення статті).

3. Т. О. Філіпова, О. Ю. Зінченко, Б. М. Галкін, З. І. Жиліна. Темнова та фотоіндукована дія синтетичних порфіринів на клітини Pseudomonas aeruginosa // Одеський медичний журнал. - 2004. - Т. 81, № 1. - С. 29 - 32. (Здобувачем проведено дослідження чутливості P. аeruginosa до темнової та фотоіндукованої дії катіонних та аніонних синтетичних порфіринів, статистичну та математичну обробку результатів та оформлення статті).

4. Зінченко О. Ю., Філіпова Т. О., Галкін Б. М., Жиліна З. І. Антимікробні властивості асиметрично мезо-заміщених порфіринів // Вісник ОНУ. Біологія. - 2005. - Т. 10, вип. 7. - С. 110 - 117. (Здобувачем проведене дослідження впливу асиметрично заміщених порфіринів на ріст умовно-патогенних бактерій).

5. Зінченко О.Ю., Русакова М.Ю., Філіпова Т.О., Галкін Б.М., Жиліна З.І. Антимікробні властивості марганецьвмісних синтетичних порфіринів // Biomedical and Biosocial Antropology. - 2004. - № 3. - С. 40-42. (Здобувачем проведено дослідження чутливості умовно-патогенних бактерій до темнової та фотоіндукованої дії марганцевих комплексів синтетичних порфіринів, статистичну та математичну обробку результатів та оформлення статті).

6. Philippova T. O., Galkin B. N., Zinchenko O.Yu., Rusakova M. Yu., Ivanitsa V. A., Zhilina Z. I., Vodzinskij S. V., Ishkov Yu. V. The antimicrobial properties of new synthetic porphyrins // Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. - 2003. - V. 7, № 11-12. - Р. 737-742. (Здобувачем проведено дослідження впливу олов'яних комплексів синтетичних порфіринів та хлоринів на ріст прокаріотичних та еукаріотичних мікроорганізмів, статистичну та математичну обробку результатів та переклад статті).

7. Філіпова Т. О., Галкін Б. М., Жиліна З. І., Зінченко О. Ю. Підходи до створення на основі синтетичних порфіринів антимікробних і фотосенсибілізуючих лікарських засобів // Матеріали ІІ національного з'їзду фармакологів України "Фармакологія 2001 - крок у майбутнє". - Дніпропетровськ. - 2001. - С. 20-24. (У тезах обгрунтовано необхідність вивчення синтетичних порфіринів як потенційних антимікробних агентів).

8. Зінченко О. Ю. Вплив синтетичних порфіринів на ріст золотистого стафілокока // Матеріали наукової Internet-конференції "Динаміка наукових досліджень". - Дніпропетровськ. - 2002. - С. 47-48. (Здобувачем проведено вивчення чутливості клітин S. aureus АТСС 25923 до дії синтетичних порфіринів).

9. Зінченко О. Ю., Русакова М. Ю., Храпенко Л. І. Антимікробна активність синтетичних порфіринів // Материалы VI Пущинской школы - конференции молодых ученых "Биология - наука 21 века". - Пущино. - 2002. - Т. 3. - С. 23-24. (Здобувачем проведений аналіз та інтерпретація результатів, отриманих при виченні взаємодії природних та синтетичних порфіринів з клітинами бактерій).

10. Zinchenko O., Rusakova М., Galkin B., Zhilina Z. Antimicrobial activity of meso-quinolinyl substituted synthetic tetrapyrrols // Materials of International Weigl conference "Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance". - Львів. - 2003. - С. 122. (Здобувачем проведено дослідження впливу синтетичних порфіринів та хлоринів на ріст умовно-патогенних бактерій, аналіз та інтерпретація результатів, переклад тез).

11. Зинченко О. Ю., Филиппова Т. О., Лищишина Е. В. Антибактериальная активность синтетических хлоринов // Материалы ІХ Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. - Суздаль. - 2003. - С. 312. (Здобувачем проведено аналіз та інтерпретацію результатів дослідження темнової та фотоіндукованої дії синтетичних хлоринів та їх металокомплексів на ріст S. аureus).

12. Русакова М. Ю., Зінченко О. Ю., Водзінська Н. С. та ін. Протимікробні властивості олов'яних комплексів синтетичних порфіринів // Матеріали X з'їзду Товариства мікробіологів України. - Одеса. - 2004. - С. 235. (Здобувачем проведено оцінку впливу комплексоутворення на антибактеріальну активність порфіринів).

13. Філіпова Т.О., Галкін Б.М., Русакова М.Ю. та ін. Синтетические мезо-тетразамещенные порфирины: профиль антимикробной активности // Матеріали IV української науково-практичної конференції з клінічної фармакології "Актуальні питання фармакології". - Вінниця. - 2004. - С.151. (У тезах наведено закономірності антимікробної дії синтетичних мезо-заміщених порфіринів).

АНОТАЦІЯ

Зінченко О. Ю. "Антибактеріальна активність синтетичних порфіринів". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного, Київ, 2006.

Дисертація присвячена дослідженню чутливості умовно-патогенних бактерій до темнової та фотоіндукованої дії ряду синтетичних порфіринів і споріднених сполук, а також особливостей їх зв'язування з клітинами мікроорганізмів.

Досліджено особливості росту 24 тест-штамів за дії сполук з позитивним і з негативним зарядом молекули, порфіринів з асиметричною будовою молекули, вільних основ порфіринів та їх металокомплексів. Клітини мікроорганізмів активно зв'язують природні та синтетичні порфірини при кімнатній температурі. Природні порфірини поглинаються повністю в перші хвилини інкубації, синтетичні - частково і більш повільно. В темноті грампозитивні і грамнегативні бактерії мають різну чутливість до вивчених сполук. При дослідженні фотоіндукованої дії значних відмінностей не виявлено. Антибактеріальна дія порфіринів посилюється при утворенні металокомплексів. Серед досліджених сполук найбільш активні порфірини з асиметричною будовою. Активні сполуки у низьких концентраціях підвищують чутливість тест-мікроорганізмів до антибіотиків.

Отримані дані свідчать про перспективність створення на основі досліджених речовин нових засобів антисептики та протимікробної терапії.

Ключові слова: умовно-патогенні бактерії, порфірини, темнова протимікробна дія, фотосенсибілізуюча активність.

АННОТАЦИЯ

Зинченко О. Ю. "Антибактериальная активность синтетических порфиринов". - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного, Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию чувствительности условно-патогенных бактерий к темновому и фотоиндуцированному антимикробному действию ряда синтетических порфиринов и родственных соединений, а также особенностей их связывания с клетками микроорганизмов.

Исследовано действие соединений как с положительным, так и с отрицательным зарядом молекулы, порфиринов с асимметричным строением молекулы, в которой один из мезо-заместителей отличается по строению от трех других, а также активность свободных оснований порфиринов и их металлокомплексов.

Показано, что клетки микроорганизмов способны активно связывать природные и синтетические порфирины при комнатной температуре. Природные порфирины поглощаются практически полностью в первые минуты инкубации. Синтетические порфирины поглощаются частично и медленнее, причем часть поглощенного из среды вещества остается необратимо связанной с клеточными структурами, а другая часть через некоторое время выбрасывается обратно в среду, что может свидетельствовать о наличии у тест-штаммов бактерий систем активного выброса ксенобиотиков. Связывание синтетических порфиринов грамотрицательными бактериями характеризуется большей скоростью, чем у грамположительных, что отражает особенности строения клеточной стенки этих групп микроорганизмов.

Установлено, что в условиях темнового эксперимента грамположительные и грамотрицательные бактерии имеют разную чувствительность к исследованным соединениям. При изучении фотоиндуцированного действия значительных отличий не выявлено. Показано, что в присутствии большинства исследованных катионных соединений клетки тест-микроорганизмов становятся чувствительными к повреждающему действию дневного света, что не всегда совпадает с темновыми эффектами этих веществ. Отрицательно заряженные молекулы порфиринов, наоборот, вызывают более выраженную задержку роста тест-штаммов в темновых условиях, чем после облучения. В целом у мезо-хинолинилзамещенных порфиринов отмечено более значительное темновое действие на тест-штаммы, чем у соединений, содержащих в мезо-положении N-метил-4-пиридил. Фотодинамическая активность веществ с разными заместителями практически одинаковя. При сравнении активности свободных оснований порфиринов и их комплексов с цинком, никелем, германием, оловом и марганцем показано, что металлокомплексы в большинстве случаев демонстрируют более выраженное антимикробное действие, чем свободные основания, как в темновых условиях, так и после облучения. Использованные в работе тест-штаммы проявили наиболее высокую чувствительность к действию порфиринов с асимметричным строением, причем в данном случае наличие или отсутствие атома металла в структуре молекулы не имеет решающего значения. Показано, что большинство соединений, активных в темновых условиях, вызывают бактериостатический эффект в культурах микроорганизмов. Асимметрично замещенные порфирины характеризуются высоким уровнем бактерицидной активности.

Установлено также, что в присутствии соединений, активных в темновых условиях, чувствительность тест-микроорганизмов к антибиотикам значительно возрастает.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности создания на основе исследованных соединений новых средств антисептики и антимикробной терапии.

Ключевые слова: условно-патогенные бактерии, порфирины, темновое антимикробное действие, фотосенсибилизирующая активность.

SUMMARY

Zinchenko O. Yu. "Antibacterial activity of synthetic porphyrins". - Manuscript.

Thesis for scientific degree of the kandidat of biological sciences in speciality 03.00.07 - microbiology. The Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, Kiyv, 2006.

The dark and photoinduced antimicrobial activity of synthetic porphyrins and their analogs towards opportunistic bacteria and particularities of their connection to bacterial cells are studied.

The research object is the opportunistic bacteria sensitivity to new porphyrins and chlorins containing in meso-position N-methyl-4-pyridyl and N-methyl-6-quinolinyl. The activity of compounds with positive and negative molecule charge, asymmetric substituted compounds, free bases and metal-complexes of porphyrins is studied.

It is shown, that bacterial cells are able to active connection of natural and synthetic porphyrins under room temperature. Natural porphyrins are completely absorbed in first minutes of incubation. Synthetic porphyrins are absorbed partly and more slowly. Іn the dark Gram-positive and Gram-negative bacteria have different sensitivity to studied compounds. There was no significant differences in photoinduced action. The metal-complexes of studied compounds are more active than free bases. Asimmetric substituted porphyrins are the most active among all studied compounds. Active compounds increase the test-microorganism antibiotic sensitivity in low concentrations.

The received data show the perspective of new antiseptic and antimicrobial agents creation on the basis of studied compounds.

Кey words: opportunistic bacteria, porphyrins, dark antimicrobial activity, photosensitizing activity.

Размещено на Allbest.ru

...