Особливості взаємодії помірного бактеріофага Р1 Escherichia coli з фітопатогенними бактеріями

Размещено на http://allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.06 - вірусологія

ОСОБЛИВОСТІ ВЗАЄМОДІЇ ПОМІРНОГО БАКТЕРІОФАГА Р1 ESCHERICHIA COLI З ФІТОПАТОГЕННИМИ БАКТЕРІЯМИ

Виконала Бурова Лариса Михайлівна

Київ - 2007

АНОТАЦІЯ

Бурова Л.М. Особливості взаємодії помірного бактеріофага Р1 Escherichia coli з фітопатогенними бактеріями. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

В роботі досліджено особливості взаємодії фага Р1 Escherichia coli з фітопатогенними бактеріями на рівні його літичного, трансдукційного, лізогенного і рекомбінаційного розвитку.

Показано, що фаг Р1 проявляє кілерну активність по відношенню до бактерій роду Erwinia, групи “carotovora”, “amylovora” і “herbicola” (Pantoea agglomerans), провокуючи фаг-фагову індукцію. Фаг-фагова індукція тісно пов'язана з псевдолізогенним станом і поширюється не тільки на ервінії, але й на лабораторні штами E. coli.

В лізогенних клітинах E. horticola Р1-профаг експресує ген хлорамфеніколацетилтрансферази і гени рестрикції-модифікації ЕсоР1І.

Вперше проведено порівняння двох гетерологічних систем коліфаг Р1-Erwinia і каротоворіцини типу фагових хвостових відростків-E. coli та показано фізіологічну спорідненість між ними.

Встановлено, що фаг Р1 ефективно здійснює трансдукцію маркера хлорамфеніколстійкості до клітин Е. carotovora subsp. atroseptica. В клітинах трансдуктантів плазмідна кільцева ДНК являє собою аутентичний профаг Р1. Лізогенна конверсія, яку здійснює Р1 профаг, має відношення до виживання бактерій при підвищеній температурі оточуючого середовища.

У роботі вперше запроваджено метод інкорпорації транспозона Tn9 в ендогенні плазміди Е. carotovora. Особливістю плазміди рСА25 E. carotovora subsp. carotovora 48А є стабільність наслідування, специфічність транспозиції Tn9 при її рекомбінації з фагом Р1 E. сolі.

Результати досліджень гетерологічної системи з участю коліфага Р1 створюють передумови для цілеспрямованого транспозонного мутагенезу і вивчення патогенності бактерій роду Erwinia.

лізогенний бактерія еrwinia трансдукція



1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасний стан молекулярної мікробіології та бактеріофагії характеризується лавиноподібним потоком інформації про автономні генетичні елементи бактерій (AГE) Frost et al., 2005. Для складних AГE, таких як помірні бактеріофаги, коньюгативні транспозони, плазміди та інсерційні послідовності, при їх поєднанні, наприклад, в складі генних островів, властива строга мозаїчність і генетична пластичність Крылов, 2003. За рахунок мобільності AГE значно розширюються можливості бактеріальної популяції при адаптації. У випадку мікроорганізмів, патогенних для людини і тварин, горизонтальне перенесення генів, обумовлене AГE, призводить до виникнення нових форм і/або нових штамів. Останні характеризуються підвищеною або множинною стійкістю до антибіотиків і, як правило, посиленим патогенним потенціалом Mazel, 2006.

На відміну від бактерій, патогенних для людини, ступінь вивчення АГЕ фітопатогенних бактерій знаходиться на більш низькому рівні, хоча їхня роль у взаємодії рослина-мікроорганізм не викликає сумнівів Toth et al., 2006. Бактерії роду Erwinia є практично важливими фітопатогенами, які характеризуються великою генною різноманітністю Yap et al., 2004, характеризуються розвинутою системою патогенних факторів, включаючи екзогенний ферментативний комплекс пектиназ, целюлаз, протеаз і системи секреції типів ІІ та ІІІ.

Нещодавно показано, що до патогенності Erwinia carotovora має відношення помірний бактеріофаг ZF40 Кушкина и др., 2006, а також встановлено, що близько 30% її штамів несуть криптичні плазміди різного розміру Товкач, 2001.

Однак, причетність АГЕ до патогенезу та їх значення в екології фітопатогенних ервіній однозначно не встановлено. Причина цього, багато в чому, пов'язана з відсутністю зручних молекулярно-генетичних підходів та інструментів, на пошук яких і скерована дана робота.

В силу полівалентної природи і плазмідного стану профага, помірний коліфаг Р1 на даний момент є найбільш розвинутим інструментом для вивчення молекулярної генетики представників родини Enterobacteriaceae [Westwater et al., 2002]. Тим не менш, у випадку бактерій роду Erwinia він використовувався лише спорадично [Белясова и др., 1990], що не дозволило скласти більш-менш точного уявлення про особливості даної фагової гетерологічної системи. Отже, розвиток цих досліджень, а також застосування фага Р1 як ефективного молекулярно-генетичного інструменту є актуальними для вивчення екології фітопатогенних ервіній та для оцінки їх вірулентного потенціалу.

Мета і завдання дослідження. Робота розвиває наукове положення щодо гетерологічних фагових систем, або взаємодії фага з неспорідненою бактерією, що супроводжується такими явищами як фаг-фагова індукція [Товкач, 2002], лізис клітин без репродукції фага [Товкач, 1998], транспозиція [Сергеева и др., 2006] і т.ін.

Основною метою досліджень було вивчення особливостей взаємодії помірного бактеріофага Р1 з клітинами різних фітопатогенних бактерій роду Erwinia на рівні адсорбційних рецепторів, лізису, лізогенії, трансдукції міжплазмідної рекомбінації і транспозиції.

Згідно з метою вирішували наступні завдання:

· здійснити загальний аналіз гетерологічних систем з участю коліфагів Р1, Т2, Т4 та Т7 і різних штамів ервіній та лабораторних штамів E.coli;

· вивчити адаптацію фага Р1 до літичного і лізогенного розвитку в клітинах аміловороподібної бактерії E.horticola;

· встановити наявність фізіологічної спорідненості між фагом Р1 і макромолекулярними каротоворіцинами;

· здійснити трансдукцію генетичних маркерів в клітини Erwinia carotovora і охарактеризувати трансдуктанти;

· запровадити метод інкорпорації транспозона в ендогенні плазміди E. carotovora;

· використати гетерологічну Р1-систему для вивчення криптичної плазміди рСА25 E. carotovora 48А.

Об'єкт дослідження: гетерологічна фагова система з участю помірного фага Р1 Escherichia coli і різних штамів трьох груп роду Erwinia: “amylovora”, “carotovora” і “herbicola”(Pantoea agglomerans).

Предмет дослідження: літичний, лізогенний і рекомбінаційний розвиток фага Р1 в клітинах неспоріднених бактерій; процеси трансдукції, транспозиції та рестрикції і модифікації.

Методи дослідження: вірусологічні, мікробіологічні, молекулярно- генетичні, комп'ютерна обробка даних.

Наукова новизна роботи. Вперше показано, що фаг Р1 проявляє кілерну активність щодо широкого спектру бактерій роду Erwinia груп “carotovora”, “amylovora” і “herbicola” (Pantoea agglomerans). Він також провокує фаг-фагову індукцію. При цьому виявляється новий бактеріофаг, здатний до продуктивної інфекції. Фаг-фагова індукція тісно пов'язана з псевдолізогенним станом і поширюється не тільки на ервінії, але й на лабораторні штами E. coli. Виявлено, що сам по собі фаг Р1 не репродукується в жодному штамі ервіній.

Вперше встановлено, що коліфаг Р1 формує лізогенний стан у аміловороподібної бактерії E. horticola. В лізогенних клітинах профаг експресує ген хлорамфеніколацетилтрансферазу (САТ) і гени рестрикції-модифікації ЕсоР1І, але він не ідентифікується як внутрішньоклітинна кільцева ДНК.

Вперше проведено порівняння гетерологічних систем коліфаг Р1-Erwinia і каротоворіцини типу фагових хвостових відростків-E. coli і показано фізіологічну спорідненість між ними.

Вперше виявлено здатність фага Р1 ефективно здійснювати трансдукцію хлорамфеніколстійкості до клітин Е. carotovora subsp. atroseptica. В таких трансдуктантах плазмідна кільцева ДНК представляє собою аутентичний профаг Р1. Лізогенна конверсія, яку здійснює Р1 профаг, проявляється в збільшенні показників виживання бактеріальних клітин при підвищенні температури оточуючого середовища.

В роботі вперше показано можливість перенесення транспозона Tn9 з генома фага Р1 до криптичної плазміди рСА25, а також запроваджено метод його інкорпорації в ендогенні плазміди Е. carotovora. Факт спрямованої інкорпорації Tn9 в строго визначений сайт рСА25 дозволив зробити припущення про профагову природу даного генетичного елемента Е. carotovora.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень гетерологічної фагової системи з участю помірного бактеріофага Р1 E. coli є фундаментальною основою для грунтовного вивчення детермінант патогенності бактерій роду Erwinia. Вони створюють передумови для цілеспрямованого транспозонного мутагенезу не тільки плазмід, але й бактеріальної хромосоми Е. carotovorа.

Міжродове трансдукційне перенесення генів від E. coli до Е. carotovorа з допомогою фага Р1 може бути використане при генетичному картуванні останньої.

Розроблені в роботі методики і підходи прискорюють створення векторних систем для клонування і експресії генів у ервіній.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури, який складається з двох підрозділів охарактеризовані молекулярно-генетичні властивості бактеріофагів Р1, Р2 та сателітного бактеріофага Р4. Описано системи регуляції їх генів при літичному і лізогенному розвитку.

Матеріали і методи досліджень

В роботі використано наступні фітопатогенні бактерії: 5 штамів E. carotovora subsp. atroseptica (Eca), 11 штамів E. carotovora subsp. carotovora (Ecc), 6 штамів E. horticola (Eho), 6 штамів E. herbicola (Pantoea agglomerans), 6 штамів Pseudomonas spp., а також мутанти Есс, стійкі до кілерної дії макромолекулярних каротоворіцинів (MCTV) [Товкач, 1998] і дисоціанти P. agglomerans, що не синтезують каротиноїдів [Товкач, Товкач, 2004]. В допоміжних дослідженнях застосовували лабораторні штами ешеріхій, похідні від E. coli K12 i B - всього 13 штамів. Список фагів включав: коліфаги Р1Cmcts100, T2L, Т4D, T7M, полівалентні бактеріофаги FE44, Gi7, N60, та ервініофаги 49, 59, 69(49), ZF40.

Для вирощування бактерій і бактеріофагів використовували як повноцінні, так і мінімальні середовища [Миллер, 1976].

Всі дослідження з бактеріями, бактеріоцинами, фагами і плазмідами проводили згідно стандартних протоколів [Миллер, 1976; Товкач, 1998; Товкач, 2002; Маниатис и др., 1984; Kado, Liu, 1981; Девис и др., 1984].

Препарати фага Р1 отримували двома методами. В першому випадку лізогени, що несли профаг Р1, вирощували до титру 210⁸кл/мл при 30 °С, після чого різко підвищували температуру до 44 ^°С і культивували до їх повного лізису. В другому випадку, фаг Р1 наробляли стандартним методом злитного лізису на E. coli С600. Частки фага концентрували і очищали з допомогою ультрацентрифугування в роторі SW-28 Spinco L7-70, 90 хв при 26000 об/хв та температурі 10 ^оС. Після цього суспензію фага додатково очищували на мікроцентрифузі ELMI при 11000 об/хв, протягом 5 хв. В роботі використовували фагові суспензії в концентраціях 110⁹ - 210¹⁰ БУО/мл. Розчини стерилізували фільтруванням через нітроцелюлозні фільтри фірми “Millipore” з розміром пор 0,45. Фагові препарати зберігали в буфері STMG при 4 ⁰С.

Мутанти E. coli, стійкі до дії MCTV отримували наступним шляхом. Бактерії, які пережили дію бактеріоцинів, переносили безпосередньо із зон лізису в рідке середовище LB. Потім підрощували до 1-2 10⁸ кл/мл формували газон і вдруге обробляли селективним бактеріоцином. При відсутності зон лізису на бактеріальному газоні або зменшенні їх прозорості бактерії розсівали до окремих колоній. Близько 15 індивідуальних клонів перевіряли на чутливість до відповідних бактеріоцинів.

Фагостійкі мутанти (RPh) E. coli отримували у такий оригінальний спосіб. Після злитного лізису клітин з одним із фагів (Т2, Т4 і Р1) чашки продовжували інкубувати 2-3 доби при 37 °С. Колонії, що росли на цих чашках переносили в рідке середовище LB, інкубували при 37 °С з інтенсивною аерацією протягом 18 год. В подальшому клітини розводили в 100 раз свіжим LB-бульйоном і знову вирощували при вказаних умовах. Після чотирьох пасажів, бактерії розсівали до окремих колоній на чашках LB та окремі з них перевіряли на чутливість до селективного бактеріофага і на здатність його адсорбції в порівнянні з диким типом E. coli. Час адсорбції складав 10 хв при 37 °С.

Для проведення трансдукції концентровану суспензію фага об'ємом 5 мкл, наносили на верхній шар напіврідкого агару з клітинами відповідного реципієнта. Після формування газону і утворення негативних зон клітини відбирали з місць нанесення фагової суспензії, переносили в рідке середовище LB і інкубували 8-10 год при 28 ^оС. Далі їх розсівали до окремих колоній на селективних пектинових або LB-чашках з хлорамфеніколом в концентрації 20 мкг/мл. Окремі клони трансдуктантів в подальшому були перевірені на спонтанний вихід фага Р1 і здатність утворювати життєздатні фагові частки при термоіндукції.

В зв'язку з вивченням гетерологічних систем з участю коліфага Р1 і бактерій роду Erwinia ми спробували ретельно оцінити їх особливості. При цьому виходили з того, що чутливість ервіній до неспорідненого бактеріофага Р1 може бути незначною. На цьому фоні можуть проявляти свою активність контамінантні фаги. Титруванням Р1-штоків на E. horticola 60 виявили два типи негативних колоній. Перший із них мав середній розмір - фаги P_sl. Колонії другого типу були прозорими, тобто не лізогенізували клітин і досягали 5мм в діаметрі. Із них ізольовано фаги Gi1, Gi2, Gi3 i Gi4, віріонна ДНК яких була стійка до дії багатьох ендонуклеаз рестрикції. Всі фаги P_sl виявились спорідненими до фага 59 E. horticola.

Очевидно, що у випадку появи аналогів помірного фага 59 при титруванні фага Р1 на сприйнятливих клітинах має місце фаг-фагова індукція, яка активує псевдолізогенний стан E. horticola 60 [Товкач, 2002].

При дослідженні фага Gi1, поряд з фагами Т7 і FE44, виявили, що чутливими до нього є всі досліджувані штами E. coli (C600, DH1, TG1, CR63, Hfr 3000, L1⁺, BE). Розвиток фага ефективно обмежувався зі зниженням ефективності висіву на 2-4 порядки в штамах BE i L1⁺. Крім того, на штамі L1⁺ спостерігалося зменшення розміру його бляшок. Повторне вирощування фага Gi1 збільшувало ефективність висіву і за 2-3 пасажи вона досягала одиниці. Перехресне культивування фага FE44 на штамах BE і L1⁺ призводило спершу до падіння титру, а потім до його відновлення. Ці результати свідчать про наявність рестрикції-модифікації. Показано, що фаги Gi1 і FE не обмежуються в розвитку з боку плазміди F E. coli К12. В той же час фаг Т7 не здатний репродукуватися на штамах E. coli TG1(F) і CR63(F).

На основі рестрикційного аналізу фаг Gi1 можна вважати представником нової групи споріднених FE-фагів, так як узор НраІ-рестрикції його геному повністю співпадає з такими фагів FE44, N60 і Gi 7 . FE-фаги мають полівалентну природу і репродукуються в клітинах двох родів - Escherichia і Erwinia. Зазначені бактерії несуть бактеріофаги, які не проявляють себе в звичайних лабораторних умовах і тільки при дії на клітини інших фагів відбувається їх активація і розвиток. Таке явище розглядається як фаг-фагова індукція в системі псевдолізогенних бактерій [Товкач, 2002]. Формування стійкості до видалення плазмідами ипу F у фагів Gi1 і FE44, а також часткова модифікація і контрселекція сайтів рестрикції дозволяє їм швидко адаптуватися до різних хазяїв.

В послідуючих дослідженнях псевдолізогенії популяцій Erwinia і Escherichia ми ідентифікували фаг N450, який активувався до літичного розвитку при титруванні фага Т4 на E. horticola 450. Фаг N450 розмножували на штамах E. coli C600, HB101 i BE.

Віріонна ДНК фага N450 лише частково гідролізується ендонуклеазою EcoRV. При цьому характер рестрикції його ДНК не співпадає з таким ДНК фага-індуктора Т4D. Висловлено припущення, що фаги Т4D і N450 неідентичні, хоча їх хвостові відростки однакові за будовою і розміром. Фаг N450 може бути рекомбінаційним похідним від фага Т4D і іншого спорідненого бактеріофага. Можливо, що він є компонентом псевдолізогенної популяції E. horticola і впродовж багатьох поколінь співіснує з клітинами цієї бактерії.

Для доказу того, що відповідні фаги наявні також в популяціях лабораторних штамів E. coli, в якості їх індуктора використовували фаг ZF40. Були виявлені Т4-подібні бактеріофаги (PhiC600, Phij53, PhiP1, PhiBE), які відрізнялись від фага Т4 за структурою геному.

Отже, бактеріофаг Р1, як і інші коліфаги при взаємодії з бактеріями роду Erwinia може активувати їх псевдолізогенний стан до виходу нових бактеріофагів. Серед останніх вперше виявлено фаг Gi1, який є полівалентним і спорідненим до фагів FE-групи. Часткова модифікація сайтів та їх контрселекція, а також висока ефективність репродукції дозволяють фагу Gi1 надійно адаптуватись до нового хазяїна.

Виявлено, що багато штоків фага P1Cmcts100, одержаних шляхом термоіндукції, контаміновані невідомими бактеріофагами. Ймовірно, вони мають відношення до псевдолізогенії лабораторних ешеріхій.

Для вирішення даної проблеми на основі штамів E. coli С600 було отримано кілька лізогенів, які аналізували на наявність виходу фага Р1 і контамінуючих бактеріофагів за допомогою термоіндукції (табл.1). Всі клони E. coli С600, які несли профаг Р1 не продукували сторонніх фагів, в тому числі фагів Рi3 та Рi5. Лізогени E. coli gA120(Р1) та gA112(Р1) утворювали фаги Рi3 і Рi5, відповідно. В подальших експериментах використовували бактеріофаг Р1, отриманий шляхом термоіндукції із лізогенів E. coli С600(Р1)FT та С600(Р1)АК.

Таблиця 1. Сторонні фагові контамінації бактерій, лізогенізованих фагом Р1

Лізоген E. coli	Кількість клонів	Середній титр фага після індукції (БУО/5мкл)	Відсоток стороннього фага
		Р1	Рі
С600(Р1)АК	3	6·103-2·105	0	0
С600 (Р1)FT	3	3·106	0	0
gA120 (Р1)	2	3.9·105	8,6·103	2,2
gA112 (Р1)	2	1,3·106	2,7·104	2.1

Результати пошуку чутливих хазяїв для фага Р1 серед широкого набору штамів Е. carotovora, E. herbicola (P. agglоmerans) і аміловороподібної бактерії E. horticola дозволили зробити наступні висновки.

Серед Е. carotovora subsp. carotovora коло бактерій-хазяїв для фага Р1 є доволі обмеженим, тоді як ця ж бактерія підвиду “atroseptica”, а також P. agglоmerans є досить чутливою до кілерної дії Р1. Це стосується і аміловороподібних ервіній, половина із яких вбивається коліфагом ззовні.

Було здійснено спробу розвинути гетерологічну клітинно-фагову систему таким чином, щоб адаптувати фаг Р1 до репродукції і лізогенії в клітинах E. horticola. Система на основі E. horticola є зручною для виконання поставленого завдання в зв'язку з тим, що ця бактерія здатна підтримувати нормальний розвиток помірних фагів 59, 49 і Е105 [Товкач и др., 2002].

Виявлення лізогенного розвитку фага Р1 в клітинах E. horticola (Eho) 450 аналізували за функціями, показовими для профага Р1. Вони включають імунітет, індукцію, експресію генів рестрикції-модифікації ІІІ типу (ЕсоР1І) і гена хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ), а також наявність плазмідного профага в лізогенній клітині. Для цього ми здійснили загальну Р1-трансдукцію маркера Cm^r в клітини Eho 450. В результаті було отримано шість клонів Eho 450 і 3 контрольні клони E. сoli С600(Р1), які були стійкі до хлорамфеніколу (10-14мкг/мл). На відміну від вихідного штаму Eho 450, фаг Р1 не утворював прозорих зон лізису на всіх шести трансдуктантах. При первинному висіві фага 59 в великих титрах (10⁸ - 10⁹ БУО на чашку) був відсутній вторинний ріст бактерій, характерний для лізогенів Eho 450(59) в нормальних умовах. І нарешті, фаги 59 і 49 не втрачали здатності до репродукції на трансдуктантах, хоча їх первинна ефективність висіву (ЕВ) значно зменшувалась.

На 3-х трансдуктантах розвиток фагів 59 і 69 обмежується приблизно на три порядки (табл.2). У випадку трансдуктантів Eho 450(Р1) - 5 і 1 показник ЕВ досягає рівня 5·10^-4. Це свідчить про існування не менше двох різних варіантів лізогенів E. horticola, які несуть профаг Р1, а також про активну експресію профагових генів рестрикції. Для другого варіанта лізогенів (представники Eho 450(Р1) - 5 і 1) характерне також швидке відновлення фагового фенотипу, оскільки кількість великих бляшок (нормальний фенотип) в загальному пулі з малими складає 33%. Це в 6-7 разів вище, ніж у чотирьох інших лізогенів.

Таблиця 2. Зниження ефективності висіву фагів 59 і 69 на трансдуктантах E. horticola 450(Р1)

Штам/ трансдуктант	Кількість великих бляшок фага 59 (%) після першого пасажу	Ефективність висіву фага
		59	69
Eho 450	100	1	1
Eho 450(Р1)-2	4,5	3,6·10-3	-
Eho 450(Р1)-3	5,3	3,0·10-3	3,0·10-3
Eho 450(Р1)-5	33	4,8·10-4	5,0·10-4

На трансдуктанті Eho 450(Р1)-1 були отримані модифіковані варіанти фагів 49mod і 59mod. Обидва фаги висівалися з рівною ефективністю на Eho 450 і на всіх шести лізогенах Eho 450(Р1). Цей факт дозволяє припустити, що R/M системи ЕсоР1І і Eho 450 функціонують незалежно.

У всіх шести лізогенів E. horticola 450, на відміну від E.coli С600(Р1), кільцеву позахромосомну ДНК виявити не вдалось. Допускається, що профагова ДНК в клітинах E. horticola знаходиться або в лінійній формі, або в стані лабільного ДНК-білкового комплексу.

Отже, адаптація коліфага Р1 на рівні його репродуктивного циклу в клітинах фітопатогенної аміловороподібної бактерії E. horticola не є можливою. Тим не менше, в лізогенах профаг Р1 явно експресує ген САТ в складі транспозона Tn9 та гени рестрикції-модифікації ЕсоРІ. В лізогенних клітинах він створює певний імунітет до повторного зараження (вбивства) лізогенів гомологічним фагом Р1.

Наступні дослідження стосувались фізіологічної спорідненості між фагом Р1 і макромолекулярними каротоворіцинами типу фагових хвостових відростків (MCTV) на рівні їх прикріпних рецепторів. Для цього використовували набір бактеріальних мутантів E.coli стійких до MCTV (RB-мутанти) і набір мутантів, стійких до власних фагів, в тому числі і до фага Р1 (RPh - мутанти).

Як видно з результатів табл.3, всі мутанти типу Е. соli ВЕ/12 є однотипними щодо чутливості до різних коліфагів і каротоворіцинів; на відміну від вихідного штаму вони стійкі до селективного MCTV Еса35А (12). Мутанти Е. соli ВЕ/12 набувають підвищеної чутливості до MCTV ЕсаЕс153(29) і Еса24А(38). В той же час показник ефективності висіву для фагів Т2, Т4 і Р1 вони не змінюють і по іншому інфікуються фагом Т7, ніж вихідна бактерія. В останньому випадку ефективність висіву знижується до 25%. Коліфаг Т7 не здатний викликати нормальну інфекцію при репродукції в клітинах всіх трьох мутантів EсоВЕ/12 (табл. 3). Його негативні колонії мають невеликий розмір (petit-морфологія) і не містять периферичної „лізоцимної” зони. Їх поява, ймовірно, є наслідком абортивної інфекції.

Для представника RB-мутантів штама E. coli НВ101 першого типу (табл. 3), які отримані спонтанно і відібрані з допомогою МСТV Еса62А (05), характерна повна втрата чутливості до шести МСТV. Представник другого типу, мутант НВ/05-5, частково стійкий до селективного каротоворіцину, а також залишається чутливим до МСТV Еса48А (25), ЕсаЕс153 (29) і Еса35А (12). І, нарешті, мутант НВ/05-6 був абсолютно стійкий до МСТV, не інфікувався фагами Т4 і Р1, зберігаючи при цьому нормальну сприйнятливість до фагів Т2 і Т7. У мутанта НВ/05-2 виявлені найбільш суттєві зміни: крім повної втрати бактеріоциночутливості і сприйнятливості до фагів Т4 і Р1, ефективність висіву на ньому фагів Т2 і Т7 знижується на 2 порядки.

Таблиця 3. Чутливість мутантів E. coli ВЕ/12 i E. coli НВ/05 до коліфагів і бактеріоцинів

Мутантний штам E.coli	Ефективність висіву фага	Чутливість до МCTV
	Т2	Т4	Т7	Р1	5	25	44	29	38	12
ВЕ	1,0	1,0	1,0	1,0	+	+	+	-	-	+
ВЕ/12-1	1,0	1,0	0,25*	1,0	+	+	+	+	+	-
ВЕ/12-2	0,5	1,0	0,25*	1,0	+	+	+	+	+	-
ВЕ/12-3	1,0	1,0	0,25*	1,0	+	+	+	+	+	-
НВ101	1,0	1,0	1,0	1,0	+	+	+	+	+	+
НВ/05-2	0,01	0	0,01	0	-	-	-	-	-	-
НВ/05-5	1,0	1,0	1,0	1,0		+	-	+	-	+
НВ/05-6	1,0*	0	1,0	0	-	-	-	-	-	-

Отже, RB-мутанти штаму E. coli ВЕ, окрім повної стійкості до селективного МСТV Еса35А(12), толерантні до інфікування фагом Т7. Мутанти RB-типу E.coli НВ101 характеризуються широкою різноманітністю щодо наслідків інфікування бактеріофагами і бактеріоцинами (табл.3). Повна втрата чутливості до фагів Р1 і Т4 свідчить про мутації в області рецепторів, які локалізовані в коровій частині ліпополісахариду.

Для того, щоб виявити співпадіння фагових- і МСТV-рецепторів в зовнішній оболонці, було одержано мутанти E.coli ВЕ, стійкі до інфікування коліфагами Т2, Т4 і Р1 (RPh-мутанти). Виявлено, що жоден із коліспецифічних МСТV не проявляє повноцінної кілерної активності на фагостійких мутантах E.coli ВЕ. Цікаво, що майже всі каротоворіцини здатні викликати індукцію невідомих фагів, негативні колонії яких проявляються замість зон МCTV.

Вище ми показали наявність фаг-фагової індукції в гетерологічній системі фаг Р1 - E. herbicola 60 з виходом фагів P_sl і Gi1. Обидва явища, очевидно, аналогічні і відображають особливість взаємодії гетерологічних систем: коліфаг Р1 - бактерії рода Erwinia; каротоворіцини типу фагових хвостових відростків (МCTV) - E.coli.

Отже, доказ фізіологічної спорідненості між фагом Р1 і каротоворіцинами типу фагових хвостових відростків є підставою для вивчення гетерологічної системи Е. carotovora-фаг Р1 на молекулярно-генетичному рівні.

В наявній літературі не описано ні умов для здійснення трансдукції, ні частотних характеристик процесу перенесення генетичних маркерів фагом Р1 в клітини Е. carotovora [Белясова и др., 1990]. Для трансдукції ми використали три різні штами Е. carotovora subsp. atroseptica (Еса).

Аутентичний плазмідний профаг Р1 був виявлений в клітинах двох штамів Еса - 39А та g125. Але він був відсутній в клітинах трансдуктантів g217. Параметри трансдукції маркера хлорамфеніколстійкості (Cm^r) коліфагом Р1 для штама Еса g217 разом з основними показниками інфекції наведено в табл 4. Встановлено, що доля трансдуктантів мало залежить від множинності інфекції і досягає максимуму 9Ч10^-5 або 0,009%. Але частота трансдукційного переносу найбільша при невеликих множинностях.

На відміну від трансдуктантів Еса g217 наявність кільцевого профага в клітинах Cm^r -клонів штаму Еса g125 корелювала з набуттям даним штамом стійкості до хлорамфеніколу. Для визначення стабільного успадкування профагової ДНК в клітинах трансдуктантів Еса g125, один із них, Р1-4, вирощували протягом двох діб в середовищі LB і потім розсівали до окремих колоній, які в подальшому переколювали на матричну LB-чашку і на паралельні чашки з хлорамфеніколом - LB+Cm і пектин +Cm. Для збільшення точності було проведено дві серії аналогічних досліджень. В першій із них встановлено, що із 48 клонів Еса g125 (Р1-4) на чашці PN+Cm після переколювання не виросло 7 клонів. Їх перевірка на наявність плазміди Р1, виявила повну відсутність відповідної кільцевої ДНК. В другій серії досліджень частота втрати маркера склала 6/32. Отже, спонтанна втрата профага Р1 за відсутності селективного пресу в клітинах Еса g125 коливається від 14 до 19% і строго пов'язана із втратою маркеру Cm^r.

Таблиця 4. Параметри трансдукційного переносу маркера Cm^r в клітини Е. carotovora subsp. atroseptica g217 коліфагом Р1

Розведення фага	Інфекція	Трансдукція
	Множинність інфекції (БУО/кл)	Виживання клітин	Доля трансдуктантів	Частота трансдукції (на 1 частку)
10-1	100	0,1	4,0Ч10-5	2Ч10-5
10-2	10	0,38	9,0Ч10-5	1Ч10-4
10-3	1	0,30	3,0Ч10-5	7,5Ч10-4
10-4	0,1	0,80	2,5Ч10-6	1,3Ч10-4

Це дозволяє припустити, що реципієнтні клітини сприймають і успадковують профаг Р1 у вигляді аутентичної геномної одиниці. Враховуючи те, що він містить термолабільний ген репресора с1 (мутація ts100), ми спробували отримати експресію пізніх фагових генів в гетерологічній системі, використовуючи зсув температури від 28 ^°С до 37 ^°С. Як контроль використовували лізогени E. coli С600(Р1)FT і АК.

В супернатантах штамів Еса g125/Р1-3 та Еса g125/Р1-4 не вдалось виявити життєздатного бактеріофага Р1, тоді як в контрольних експериментах його вихід склав 0,4-210⁸ БУО/мл. На основі цих результатів можна зробити висновок про те, що функції, які відповідають за літичний розвиток фага Р1 не проявляються.

Далі встановлювали вплив температури як на виліковування від плазмідного профага, так і на стимуляцію транспозицій з участю Tn9. Для цього трансдуктанти Еса g125, які несли профаг Р1, спершу інкубували при температурі 37 ^°С 18 год, пізніше - при 28 ^°С протягом 24 год. Було встановлено, що така поперемінна інкубація клітин призводить до утворення колоній двох видів - мілких і нормального розміру. Серед мілких колоній число тих, які несли Р1-плазміду досягло 9 %, тоді як серед бактерій, що утворюють колонії нормального розміру воно склало 5 %. Узагальнені дані, цих досліджень подані в табл. 5. По-перше, звертає на себе увагу те, що за відсутності селективного пресу елімінація профага Р1 після попередньої інкубації клітин трансдуктанта Р1-3 при 37 ^°С збільшується приблизно в 6 разів порівняно з умовами оптимального росту. По-друге, супрооптимальна температура, на відміну від оптимальної температури росту, призводить до появи бактерій, у яких стійкість до хлорамфеніколу не пов'язана з наявністю вільного плазмідного профага в клітинах. Кількість таких клонів може досягти 66 % від загальної кількості Cm^r -клонів (табл.5).

Таблиця 5. Вплив температури на втрату профага Р1 клітинами Е. carotovora subsp. atroseptica g125/Р1-3 Cm^r

Показник	28 °С	37 °С
	І*	ІІ	ІІІ	IV
Загальна кількість колоній	48	32	70	80
Доля колоній: Cms	0,15	0,29	0,81	0,95
Cmr	0,85	0,81	0,19	0,05
Р1	0,85	0,81	0,14	0,02
Відсоток безплазмідних Cmr-клонів	0	0	26	66

Наявність безплазмідних Cm^r -клонів може свідчити про те, що транспозон Tn9 переноситься до бактеріальної хромосоми.

Як видно наявність плазміди-профага Р1 в клітинах трансдуктантів Еса g125 не впливає на стан криптичної плазміди рАТ58. Очевидно, що обидві плазміди відносяться до різних груп несумісності.

Дослідження показали, що вихідний штам Еса g125 дуже чутливий до впливу підвищеної температури - 37 °С. Через добу його виживання знижувалось на 4 порядки, тоді як для трансдуктантів - Р1-1 та Р1-2 це зниження складало 3 порядки. Отже, наявність профагів може суттєво впливати на життєздатність фітопатогенних ервіній в природних умовах.

В наступних дослідах використовували два штами Е. carotovora subsp. carotovora 52А і 48А і два штами Е. carotovora subsp. atroseptica 8912 і g125. Всі вони несуть позахромосомні ДНК невеликого розміру (3,8; 9,8; 16,7 і 18,5 т.п.н.), а також чутливі до кілерної дії фага Р1 [Товкач, 1998; Товкач, 2001].

На їх основі одержували трансдуктанти, які аналізували на наявність позахромосомних ДНК. Виявилось, що трансдуктанти штамів Есс 52А і 48А, а також штаму Еса 8912 не несли плазмідного профага Р1. Серед 11 трансдуктантів Есс 48А Cm^r було знайдено один клон, 7/4b, клітини якого мали позахромосомну кільцеву ДНК більшого розміру ніж вихідна плазміда рСА25. ЇЇ розмір складає близько 12,1 т.п.н., що на 2,3 т.п.н. більше розміру плазміди рСА25. Ці дані дозволили припустити, що виявлена плазміда штаму 48А-7/4b Cm^r є транспозонним похідним резидентної плазміди рСА25. Для перевірки цього припущення використовували рестрикційний аналіз ДНК обох плазмід.

У всіх варіантах гідролізу не було виявлено сайтів для рестриктази HindIII ні для нативної, ні для плазміди з інкорпорованою вставкою ДНК. ДНК вихідної плазміди рСА25 не містила сайтів для рестриктази EcoRI, але мала не менше двох сайтів для HpaI і EcoRV. Збільшення розміру позахромосомної ДНК в клітинах штама Есс 48А Cm^r-7/4b дійсно пов'язане із вставкою додаткової ДНК в плазміду рСА25.

На прикладі позахромосомної ДНК штаму Есс 48А ми розробили простий метод інкорпорації транспозону Tn9 в криптичні плазміди E. carotovora. Його суть така. Клітини чутливого плазмідовмістного штаму інфікуються фагом Р1::Tn9 (Р1Cmcts100), далі проводиться відбір великих колоній, що виростали на фоні дрібних трансдуктантів, на чашках з 20 мкг/мл хлорамфеніколу. Великі колонії перевіряються на здатність росту на чашках LB з хлорамфеніколом в концентрації 100 мкг/мл. І, нарешті, кінцева селекція включає їх перевірку на чашках з пектином, які містять 100 мкг/мл хлорамфеніколу. Так як плазміда рСА25 є багатокопійною [Товкач, 2001], можна допустити, що доза САТ значно збільшиться порівняно з такою звичайних транстуктантів, якщо Tn9 ввійде до її складу.

Таким чином, описаний вище підхід є дуже зручним для транспозонного мутагенезу криптичних плазмід Е. carotovora.

В наступній серії дослідів ми одержали і проаналізували 13 стабільних клонів з підвищеною стійкістю до хлорамфеніколу - 100 мкг/мл. Незважаючи на строгий відбір клонів, лише 6 з них містили плазміду із вставкою Tn9; інша половина несла нативну плазміду pCA25.

Ми не спостерігали інших варіантів pCA25::Tn9, окрім представлених (доріжки 3-7, 10 та 11), що свідчить про унікальний спосіб транспозиції. Очевидно, включення Tn9 в плазміду відбувається шляхом сайт-специфічної рекомбінації між ДНК фага Р1 і рСА25.

Однією з причин підвищеної стійкості без ампліфікації гена САТ в складі плазміди може бути множинна лізогенізація фагом Р1Cmcts100 штама Есс 48А.

Для визначення локалізації Tn9 в межах плазміди рСА25 проводили неповний гідроліз ДНК семи різних плазмід pCA25::Tn9 ендонуклеазою EcoRV. Як видно із електрофореграми, всі плазміди утворюють 4 фрагменти, В+Tn, , А та С, розміри яких в середньому складають 6,9; 6,1; 4,7 і 1,4 т.п.н. відповідно.

Так як ні один з фрагментів , А та С в жодній із плазмід не містить не лише цілісної, але й часткової транспозонної послідовності, можна вважати, що Tn9 розташовується виключно в межах фрагмента В EcoRV. Оскільки отримані дані можуть мати важливе значення для визначення ролі автономних генетичних елементів в екології фітопатогенних ервіній, наші подальші дослідження були скеровані на підтвердження профагової природи рСА25. Висока стабільність є однією з важливих особливостей лізогенних систем. В порівнянні зі звичайними плазмідами інтегративні і позахромосомні (кільцеві та лінійні) профаги дуже рідко втрачаються лізогенною клітиною. Неодноразові спроби вилікувати штам Есс 48А від криптичної плазміди рСА25 завжди закінчувались безуспішно [Товкач, 2001].

Після культивування Есс 48А-7/4b в LB-бульоні з 1% SDS було отримано 3 клони (частота появи яких складає 0,6%), чутливих до антибіотика в концентрації 20 мкг/мл і нижче. Електрофоретичне розділення показало, що клітини цих клонів містять позахромосомні ДНК однакового розміру, який більше такого для нативної рСА25, але менше pCA25::Tn9. Було зроблено припущення, що ці плазміди є делеційними варіантами pCA25::Tn9.

Виявлено, що делеція безпосередньо торкається фрагмента B+Tn EcoRV плазміди pCA25::Tn9. В порівнянні з pCA25::Tn9 - 7/4b і її делеційних варіантів визначено, що в останніх відсутній також другий PstI-фрагмент розміром близько 1,7 т.п.н.. Не виключено, що крім більшої частини гена САТ делеція також впливає й на правий IS1-елемент, який, є нестабільним в складі транспозона Tn9 [Данилевич и др., 1990]. За нашими попередніми підрахунками розмір спонтанних делецій транспозонної вставки в складі позахромосомної ДНК рСА25 може досягати 50% від її повного розміру [Cергеева и др., 2006].

Таким чином, факт стабільності успадкування, поруч із специфічністю транспозиції і делеції транспозону Tn9, підтверджує припущення про профагове походження позахромосомного кільцевого елементу (плазміди) рСА25 E. carotovora subsp. carotovora 48А. Крім того, плазміди pCA25::Tn9 можуть бути використані при створенні векторних конструкцій для вивчення експресії генів в E. carotovora.



ВИСНОВКИ

1. Помірний бактеріофаг Р1 Escherichia colі проявляє кілерну активність щодо широкого спектру фітопатогенних бактерій, таких як Erwinia horticola, E. carotovora, Pantoea agglomerans.

2. Поряд з коліфагами Т2, Т4 і Т7, фаг Р1 провокує “фаг-фагову” індукцію, і запускає інфекцію з участю нового бактеріофага. Фаг-фагова індукція пов'язана з псевдолізогенним станом бактерій, який поширюється не тільки на природні штами ервіній, але й на лабораторні штами E. coli.

3. Взаємодія E. horticola з коліфагом Р1 призводить до формування лізогенів, які експресують не тільки профаговий ген хлорамфеніколацетилтрансферази, але й гени системи рестрикції-модифікації ЕсоР1І. В цих лізогенах профаг Р1 не виявляється як кільцева ДНК.

4. Каротоворіцини типу фагових хвостових відростків E. carotovora subsp. carotovora 62А проявляють спорідненість з фагом Р1 на рівні адсорбційних рецепторів. Вони зумовлюють фаг-фагову індукцію у фагостійких мутантів E. colі В/Р1.

5. Частота трансдукції маркера хлорамфеніколстійкості фагом Р1 до клітин E. carotovora subsp. atroseptica g125 досягає 3·10^-7. Трансдуктанти цієї бактерії стабільно успадковують аутентичний плазмідний профаг Р1.

6. Під час процесу трансдукції-лізогенізації, а також при виліковуванні клітин E. carotovora subsp. carotovora 48А від профага Р1 спостерігається інкорпорація транспозона Tn9 в плазмідну ДНК або в хромосому реципієнтної бактерії.

7. Особливістю плазміди рСА25 E. carotovora subsp. carotovora 48А є стабільність наслідування і специфічність транспозиції Tn9 при її рекомбінації з фагом Р1 E. сolі.



СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Бурова Л.М., Товкач Ф.И. Экспрессия генов профага Р1 Escherichia coli в клетках фитопатогенных эрвиний// Мікробіол. журн. - 2006. - т. 68, № 2. - С. 39-47.

2. Сергеева Ж.Ю., Бурова Л.М., Товкач Ф.И. Внесение транспозона Tn9 в эндогенные плазмиды Erwinia carotovora при лизогенизации клеток колифагом Р1// Мікробіол. журн. - 2006. - т. 68, № 4. - С. 34 - 39. (Здобувачем безпосередньо отримано трансдуктанти, які охарактеризовано на наявність нових фенотипових ознак, на зміну плазмідних спектрів; приймала участь у плануванні експерименту, аналізі даних та в обговоренні результатів).

3. Бурова Л.М., Горб Т.Е., Товкач Ф.И. Природа криптической плазмиды рСА25 Erwinia carotovora subsp. carotovora 48A// Мікробіол. журн. - 2007. - т. 69, № 2. - С. 23 - 28. (Здобувач здійснювала транспозонний мутагенез, проводила виліковування від плазміди, виділяла, очищувала та проводила електрофорез плазмідних ДНК; приймала участь у плануванні експерименту, аналізі даних та в обговоренні результатів).

4.Степанов А.А., Бурова Л.М., Товкач Ф.И. Фаг-фаговая индукция и псевдолизогения энтеробактерий // Материалы IV Международной конференции “Биоресурсы и вирусы”. - К.: Издательско-полиграфический центр “Київський університет”, 2004. - С.22.

5.Бурова Л.М., Товкач Ф.И. Явление фаг-фаговой индукции с участием колифага Р1 и псевдолизогенов Erwinia carotovora // Материалы международной конференции “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии”. - Минск. - 2004. - С. 163 - 164.

6.Бурова Л.М., Товкач Ф.И. Структурно-функциональное состояние профага Р1 в клетках фитопатогенных эрвиний//Тези доповідей міжнародної наукової конференції “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія”. - Київ. - 2005. - С. 57.

7.Товкач Ф.И., Черватюк Н.В., Кушкина А.И., Бурова Л.М., Панщина А.И., Иваница Т.В., Сергеева Ж.Ю., Горб Т.Е., Романюк Л.В. Перспективы создания биотехнологической системы на основе Erwinia carotovora, ее бактериофагов и плазмид // Тези доповідей міжнародної наукової конференції “Мікробні біотехнології” (Одесса, 11 - 15 вересня, 2006). - Одеса: Астропринт. - 2006. - С. 30.

8.Товкач Ф.И., Горб Т.Е., Бурова Л.М., Черватюк Н.В., Сергеева Ж.Ю.

Использование транспозона Тn9 для изучения криптической плазмиды рСА25 Erwinia carotovora// Российская школа-конференция “Генетика микроорганизмов и биотехнология”. - Москва-Пущино-на-Оке. - 2006.-С.37.

9.Горб Т.Е., Бурова Л.М., Черватюк Н.В., Товкач Ф.И. Причастность плазмидных детерминант к адсорбции колифага Р1 на клетках Erwinia carotovora// Материалы V Международной конференции “Биоресурсы и вирусы”. - К.: Фитосоциоцентр. - 2007.- С.153.

Размещено на Allbest.ru

...