Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення закономірностей впливу проникних кріопротекторів і низьких температур на фазовий та структурний стан компонентів кордової крові, а також динаміки насичення плаценти кріопротекторами.

Завдання дослідження:

1. Дослідити вплив 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), гліцерину (Гл) і ДМСО на температуру фазових переходів і склування в еритроцитах, в плазмі КК і в плаценті. Визначити ентальпії кристалізації і плавлення евтектик в системах, що містять ДМСО.

2. Вивчити динаміку процесу насичення плаценти 1,2-ПД, Гл і ДМСО.

3. Провести порівняльний аналіз впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на морфологічний стан еритроцитів КК у залежності від концентрації кріопротектора, температури і часу еквілібрації.

4. Дослідити вплив 1,2-ПД, Гл, ДМСО і низьких температур на стан цитоплазми і бар'єрні властивості мембран еритроцитів КК.

5. Дослідити кріозахисну ефективність 1,2-ПД, Гл і ДМСО в процесі заморожування-відтавання еритроцитів КК.

Об'єкти дослідження - низькотемпературні фазові переходи і склування в компонентах фетоплацентарного комплексу, морфологічний стан еритроцитів, бар'єрні властивості мембран еритроцитів, гемоліз еритроцитів.

Предмет дослідження - еритроцити і плазма КК, плацента.

Методи дослідження. Методом ДСК досліджували низькотемпературні фазові переходи і склування. Характер кристалізації в суспензіях клітин вивчали методом кріомікроскопії. Визначення концентрації кріопротекторів у біологічних зразках проводили методом ядерного магнітного резонансу (ЯМР). Вплив кріопротекторів і низьких температур на морфологічний стан еритроцитів вивчали за допомогою методів світлової і растрової електронної мікроскопії (РЕМ). Методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) досліджували стан цитоплазми і бар'єрні властивості мембран еритроцитів. Метод спектрофотометрії використовували для вимірювання гемолізу еритроцитів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне дослідження метастабільних станів при температурах нижче 0С компонентів фетоплацентарного комплексу в присутності Гл, 1,2-ПД і ДМСО. Показано, що системи, які містять біологічні компоненти і кріопротектори, більш схильні до утворення аморфних фаз при охолодженні і до розвитку кристалізації води з аморфної фази при нагріванні, ніж водні розчини кріопротекторів відповідних концентрацій. Встановлено також, що як у плаценті, так і в еритроцитах і плазмі КК гальмується розвиток кристалізації і плавлення евтектик вода-ДМСО. Після еквілібрації фрагментів плаценти в розчинах, що містять 60 мас. % Гл і 1,2-ПД до 60 хв. і наступного охолодження до -196С не спостерігається розвитку процесів кристалізації з аморфної фази при нагріванні, що свідчить про те, що концентрація зазначених кріопротекторів у плаценті не досягає 40 мас %. Більш тривала еквілібрація сприяє затвердінню зразка в склоподібному стані і формуванню дрібнодисперсного льоду при нагріванні. Вивчення динаміки насичення плаценти кріопротекторами показало, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер - швидке проникнення кріопротектора у міжклітинний простір і повільне проникнення його всередину клітин .

Методами растрової електронної і оптичної мікроскопії встановлені закономірності впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на співвідношення різних форм еритроцитів КК до і після низькотемпературного впливу в залежності від концентрації кріопротекторів, температури і часу еквілібрації.

Методом ЕПР спінових зондів виявлене збільшення проникності мембран еритроцитів кордової крові для іонів ферриціаніду в присутності кріопротекторів високих концентрацій (Гл, 1,2 - ПД - більш 40 мас. % і ДМСО - більш 30 мас. %), що пов'язано з порушенням бар'єрної функції мембран еритроцитів. Виявлено пошкоджуючу дію низькотемпературних фазових переходів розчинника на бар'єрні функції мембран еритроцитів. Результати аналізу змін структурного стану клітин під впливом кріозахисних речовин і низьких температур сприяють розширенню уявлень про механізми кріоушкодження і кріозахисту клітинних суспензій, що є однією з фундаментальних задач кріобіології.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених в дисертаційній роботі комплексних досліджень низькотемпературних фазових переходів і склування в плазмі, суспензіях еритроцитів кордової крові і в плаценті в присутності ряду проникних кріопротекторів можуть бути використані при розробці нових способів консервування різних біологічних об'єктів. Отримані результати з насичення плаценти кріопротекторами дозволяють оптимізувати існуючі методи її кріоконсервування. Результати аналізу впливу проникних кріопротекторів і низьких температур на морфологічний стан еритроцитів КК, а також на стан цитоплазми і бар'єрні функції мембран мають практичне значення при виборі кріопротектора і умов еквілібрації в процесі розробки методів кріоконсервування еритроцитів КК.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором проведені аналіз і узагальнення даних літератури, виконані експериментальні дослідження, здійснено узагальнення і статистична обробка отриманих експериментальних результатів. Дисертантом спільно з науковим керівником були інтерпретовані отримані результати і зроблени остаточні висновки. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

Фазові переходи позаклітинних і внутрішньоклітинних розчинів є істотною причиною кріопошкодження клітин, оскільки, наприклад, повільне заморожування сприяє дегідратації клітин внаслідок осмотичних ефектів, що виникають при заморожуванні позаклітинних розчинів, а швидке - кристалізації внутрішньоклітинного розчину. У зв'язку з цим у роботі методом ДСК досліджувались умови розвитку склування, кристалізації льоду з аморфної фази, кристалізації і плавлення евтектичних складів, а також плавлення всієї системи в суспензіях еритроцитів з добавками кріопротектіров: 1,2-ПД, Гл і ДМСО різних концентрацій на етапі їх нагрівання після охолодження до -196°С.

На рис. 1 наведені типові термограми ДСК суспензій еритроцитів, щільної еритроцитарної маси і надосадової рідини, що містять 1,2-ПД і Гл, а також суспензій еритроцитів з розчинами ДМСО. Стрілками показані характерні стрибки теплопоглинання, ендо - і екзотермічні ефекти, що класифіковані в такий спосіб: 1 - стрибок теплопоглинання, що відповідає процесу переходу речовини з твердоаморфного стану в стан переохолодженої рідини (розсклування); 2 - інтенсивний ізотермічний пік кристалізації льоду з переохолодженої рідини; 3 - розмитий екзотермічний пік завершення кристалізації льоду при нагріванні; 4 - плавлення льоду в системі, 5 - евтектична кристалізація і 6 - евтектичне плавлення. На підставі термограмм визначені температури фазових переходів і склування для всіх досліджуваних систем.

При змішуванні эритроцитарної маси з 70 - 80% розчинами 1,2 - ПД спостерігається більш інтенсивний стрибок теплопоглинання 1 у порівнянні з таким же стрибком теплопоглинання у розчинах Гл тих же концентрацій. Це відповідає утворенню при тих самих умовах заморожування більшої кількості склоподібної маси. З термограмм також видно, що процес кристалізації льоду з аморфної фази розвивається при більш низьких концентраціях 1.2-ПД, ніж Гл, що вказує на більш високу стабільність аморфного стану в присутності 1,2-ПД у порівнянні з Гл тих же концентрацій.

Кристалізація льоду з аморфної фази реєструється в зразках, отриманих після змішування щільного осаду еритроцитів з кріозахисними розчинами, що містять 75 мас % Гл або 70 мас % 1,2-ПД, а також при більш високих концентраціях кріопротекторів. У той же час розбавлення тих же кріозахисних розчинів рівними об'ємами води при відсутності еритроцитів дає розчин, у якому кристалізація води з аморфної фази не реєструється. Ще більш інтенсивно і при більш низьких концентраціях кріопротекторів, ніж у суспензіях еритроцитів, виникає кристалізація льоду з аморфної фази в надосадовій рідині або в щільному осаді еритроцитів. Піки кристалізації льоду з аморфної фази реєструються в зразках надосадової рідини і у зразках щільної еритроцитарної маси, отриманих після центрифугування суспензій еритроцитів з розчинами 70 мас % Гл і 60 мас % 1.2-ПД. Однак у вихідній суміші еритроцитів при таких концентраціях кріопротекторів це явище не спостерігається. Відмінності, що спостерігаються, пояснюються особливостями розподілу кріозахисних речовин між внутрішньо- і позаклітинним середовищем еритроцитів. У щільному осаді еритроцитів знижується імовірність позаклітинної кристалізації, а висока концентрація кріопротектора усередині клітини сприяє склуванню внутрішньоклітинної рідини. У розбавленій суспензії клітин такий ефект склування потребує більш високих концентрацій кріопротектора.

Інтенсивність піка кристалізації евтектики 5 у вихідному зразку за характером свого прояву являє собою суперпозицію відповідних піків кристалізації евтектик у міжклітинній і внутрішньоклітинній рідині. Процес кристалізації льоду з аморфної фази реєструється в зразках еритроцитів, отриманих змішуванням суспензії еритроцитів з 70% розчином ДМСО, а при більш низьких концентраціях ДМСО процес кристалізації льоду з аморфної фази не розвивається.

На підставі отриманих термограм водних розчинів ДМСО і розчинів, приготовлених на фізіологічному розчині, побудована частина діаграми фізичних станів даної системи у діапазоні концентрацій від 0 до 60 мас. % ДМСО. На відміну від водних розчинів таких неелектролітів, як гліцерин і особливо 1,2-ПД, у системі вода - ДМСО кристалізація може відбуватися у всьому досліджуваному діапазоні концентрацій.

У роботі проведений порівняльний аналіз теплових ефектів, що супроводжують кристалізацію і плавлення евтектичних складів у розчинах ДМСО і у зразках клітин, що містять ДМСО (рис. 2). Видно, що інтенсивність розвитку процесів кристалізації і плавлення евтектичних складів зменшується в присутності еритроцитів і сильно залежить від щільності клітин у зразках. Крім того, тепловий ефект при плавленні евтектичних складів більший, ніж при кристалізації. Цей факт свідчить про те, що частина евтектичного складу закристалізувалася ще на етапі охолодження.

Методом ЯМР на ядрах ¹Н визначали концентрацію кріопротекторів у вихідній суміші еритроцитів, у надосаді і у щільній масі еритроцитів, отриманих після центрифугування еритроцитів з кріопротекторами. Показано, що у всіх досліджених зразках концентрація кріопротекторів у надосадовій рідині більш висока, у порівнянні зі зразками осаду еритроцитів.

Морфологічні зміни є важливими характеристиками реакції клітин на зміну властивостей навколишнього середовища, що дозволяє робити висновки про стан еритроцитів у присутності того чи іншого кріопротектора. У роботі проведений аналіз впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на морфологічний стан еритроцитів КК у залежності від концентрації кріопротекторів, часу і температури еквілібрації.

У присутності Гл і 1,2-ПД переважають дискоїдні форми еритроцитів, однак ці кріопротектори вже в 10% концентрації призводять до деякого набрякання дискоцитів, що підсилюється при підвищенні концентрації (рис. 3 a-b). Зростання концентрації Гл у суспензії до 30-40% приводить також до зростання кількості стоматоцитів, а 1,2-ПД - кренованих клітин. Вже в присутності 10 % ДМСО кількість дискоцитів у суспензії зменшується в кілька разів у порівнянні з контролем, а при підвищенні концентрації ДМСО в клітинній суспензії до 20-30% спостерігаються лише одиничні клітини правильної дисковидної форми (рис. 3c). Після відмивання всіх трьох досліджених кріопротекторів спостерігається відновлення вихідної форми еритроцитів.

У випадку Гл оптимальною температурою еквілібрації можна вважати 20С, оскільки при цій температурі спостерігається максимальна кількість дискоцитів, у той час як при 0С и 37С зростає частка кренованих форм еритроцитів і сфероцитів. У випадку 1,2-ПД і ДМСО оптимальною можна вважати температуру еквілібрації 0С, оскільки при підвищенні температури спостерігається активізація морфологічних змін.

При збільшенні часу еквілібрації еритроцитів у розчинах кріопротекторів з 15 хв до 30 хв не було виявлено значних морфологічних змін у популяції еритроцитів при температурах 0 і 20С, однак при 37С зростала частка сфероцитів і сфероехіноцитів (рис. 3d, f) у присутності всіх досліджених кріопротекторів. Цей факт можна пояснити зміною фізіологічного розподілу внутрішньо- і позаклітинних іонів, зв'язаною з порушенням бар'єрних властивостей мембран еритроцитів.

Методом кріомікроскопії показано, що при швидкостях охолодження - нагрівання 7-9 °С/хв всі три досліджених кріопротектори в концентраціях до 10% не спричинюють значної кріозахисної дії на еритроцити і в відтанутій суспензії спостерігаються лише одиничні цілі клітини. Кріозхисний ефект проникних кріопротекторів істотно підсилюється при підвищенні їх концентрації в суспензії. Однак зростання концентрації гліцерину в суспензії до 30 - 40% і ДМСО до 40% призводить до руйнування значної кількості клітин ще на етапі експозиції з кріопротектором. Максимальна кількість збережених клітин спостерігається після заморожування еритроцитів у присутності 20% Гл і 30% ДМСО і 1,2-ПД.

Плазматичні мембрани є первинною ланкою, що сприймає зміни фізико-хімічних умов середовища при впливі факторів кріоконсервування, а фундаментальною властивістю мембран, чуттєвою до цих факторів, є їх бар'єрна функція. У даній роботі методом ЕПР спінових зондів з додатковим уширенням досліджена дія проникних кріопротекторів і заморожування-відтавання на бар'єрні функції мембран і стан цитоплазми еритроцитів.

Додавання в суспензію еритроцитів Гл і 1,2-ПД у концентраціях 10-30%, а ДМСО - 10-20% не призводить до значної трансформації вигляду спектрів ЕПР. Однак при підвищенні концентрації Гл і 1,2-ПД до 40%, а ДМСО до 30% спостерігається поява незначного широкого сигналу, а в присутності 40% ДМСО спостерігається істотне зростання інтенсивності широкого сигналу і зменшення вузького. Ці факти свідчать про збільшення проникності мембран для іонів ферріціаніду, що говорить про порушення бар'єрної функції частини клітин.

Заморожування суспензії еритроцитів у присутності 10-40% Гл, 10-20% 1,2-ПД і ДМСО не призводить до появи помітної суперпозиції сигналів, причому ширина вузького сигналу в межах похибки не змінюється. Ці дані свідчать про збереження бар'єрних властивостей мембран переважної кількості клітин. Заморожування-відтавання клітин у присутності 30-40% ДМСО супроводжується не лише різким зменшенням інтенсивності вузького сигналу, але і збільшенням інтенсивності широкого сигналу у порівнянні з їх значеннями до заморожування, указуючи на ушкодження мембран значної частини клітин. Виявлено зменшення мікров'язкості цитоплазми еритроцитів після заморожування-відтавання в присутності Гл досліджуваних концентрацій, що може бути наслідком показаного вище набрякання еритроцитів у присутності даного кріопротектора.

При дослідженні впливу розсклування на бар'єрні функції мембран еритроцитів істотних змін у вигляді спектру не було виявлено, однак було зареєстровано істотне зростання інтенсивності широкого сигналу при дослідженні впливу кристалізації і плавлення евтектичних складів, що свідчить про збільшення кількості клітин з ушкодженими мембранами.

Для оцінки кількості ушкоджених кліток, після додавання кріопротекторів і після заморожування-відтавання в роботі також контролювали рівень гемолізу еритроцитів. Показано, що після еквілібрації еритроцитів при 0С у присутності 10-20 % кріопротекторів протягом 15 хв гемоліз складає менше 2%. Підвищення концентрації кріопротекторів до 30% викликає незначне зростання гемолізу, а до 40% - різкий стрибок цього показника. За рівнем гемолізу в присутності високих концентрацій кріопротектори можна розташувати в ряд: 1,2-ПД<Гл<ДМСО. Заморожування зануренням у рідкий азот призводить до різкого зростання рівня гемолізу у всіх досліджуваних зразках, однак для кожного кріопротектора можна виділити оптимальний концентраційний діапазон, що дозволяє зберегти максимальну кількість клітин: для ДМСО - 10 - 20%, для Гл і 1,2-ПД - 20 - 30%.

Ступінь насичення тканини кріопротектором і однорідність розподілу кріопротекторів у тканині визначають стійкість тканини до руйнування при низькотемпературному консервуванні, особливо до механічних руйнувань. У роботі за допомогою методів ДСК і ЯМР досліджена динаміка проникнення кріопротекторів у тканину плаценти з часом. Проведений аналіз термограм ДСК показав, що в плаценті, витриманій у 10%-х розчинах Гл і 1,2-ПД не реєструється ніяких особливостей крім стрибка теплопоглинання (рис. 4а, б) у температурному діапазоні склування. На термограмах плаценти, витриманої в 40%-х розчинах вказаних кріопротекторів спостерігається також розмитий пік завершення кристалізації при нагріванні. На термограммах ДСК плаценти, витриманої в 60%-х розчинах 1,2-ПД і гліцерину протягом доби, поряд із зазначеними вище особливостями, реєструється інтенсивний пік кристалізації льоду з аморфної фази, причому цей пік реєструється відразу після завершення процесу розсклування. У даному випадку насичення тканини плаценти досягло такого рівня, при якому стали можливими процеси утворення аморфних фаз при охолодженні і зародження кристалів льоду і їх подальшого росту при нагріванні. Аналогічне явище кристалізації льоду з аморфної фази реєструються у водних розчинах гліцерину, починаючи з концентрації 41% і вище і у водних розчинах 1,2-ПД - 31,9% і вище. Таким чином, у тканинах плаценти після 24 годин еквілібрації концентрація гліцерину складає не менше 41%, а 1,2-ПД - не менш 31,9%. Збільшення як концентрації кріопротектора в суміші, так і часу експозиції зразків плаценти призводить до збільшення стрибка теплопоглинання 1, отже, до збільшення відносної кількості склоподібної фази у зразку. При цьому ефект більш виражений у присутності 1,2-ПД. Методом ЯМР показано, що протягом перших 20 хвилин експозиції відбувається значне насичення тканини плаценти 1,2-ПД, а збільшення часу еквилибрації призводить до поступового подальшого насичення (табл.). Нерівномірність процесу насичення зв'язана, імовірно, з неодночасністю насичення поза- і внутрішньоклітинного простору. Той факт, що навіть протягом доби в плаценті не досягається концентрація кріопротектора, яка є у середовищі еквілібрації, пояснюється, на нашу думку, існуванням у тканині води, зв'язаної біологічними компонентами, яка не бере участь у процесі розчинення.

гліцерин кордова кров еритроцит

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню впливу 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), гліцерину (Гл) і диметилсульфоксиду (ДМСО) на фазові переходи і склування в компонентах фетоплацентарного комплексу нижче 0С, динаміки насичення плаценти кріопротекторами, а також впливу режимів еквілібрації з кріопротекторами і заморожування-відтавання на структурний стан еритроцитів кордової крові.

Отримані методом ДСК результати свідчать про те, що в присутності 1,2-ПД, Гл і ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці, при цьому стабільність аморфного стану найбільш висока в присутності 1,2-ПД; висока щільність клітин сприяє утворенню склоподібних фаз при охолодженні, призводить до процесу кристалізації з аморфної фази при нагріванні і пригнічує процес кристалізації евтектичних складів. Виявлено, що зростання концентрації Гл і 1,2-ПД викликає набрякання еритроцитів, а ДМСО - кренування. Встановлено оптимальні температури еквілібрації еритроцитів КК у розчинах кріопротекторів: Гл - 20С; 1,2-ПД і ДМСО - 0С. Методом ЕПР показано порушення бар'єрних функцій мембран еритроцитів кордової крові в присутності 30% ДМСО і 40% Гл та 1,2-ПД. Вивчення динаміки насичення плаценти кріопротекторами показало, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер.

Ключові слова: кордова кров, еритроцити, плазма, плацента, кріопротектори, низькі температури, фазові переходи, склування, форма еритроцитів, бар'єрні функції, мікров'язкість, гемоліз

Боброва Е.Н. Влияние криопротекторов и низких температур на термодинамические параметры и структурное состояние компонентов кордовой крови и плаценты человека. - Рукопись.

Диссертационная работа посвящена исследованию влияния 1,2-пропандиола (1,2-ПД), глицерина (Гл) и диметилсульфоксида (ДМСО) на фазовые переходы и стеклование в компонентах фетоплацентарного комплекса ниже 0С, динамики насыщения плаценты криопротекторами, а также влияния режимов эквилибрации с криопротекторами и замораживания-оттаивания на структурное состояние эритроцитов кордовой крови.

В работе использованы методы ДСК - для исследования низкотемпературных фазовых переходов и стеклования, ЯМР - для определения концентрации криопротекторов в биологических образцах, ЭПР - для исследования состояния цитоплазмы и барьерных функций мембран эритроцитов, метод спектрофотометрии - для измерения уровня гемолиза, растровая электронная и световая микроскопия - для исследования морфологического состояния эритроцитов, криомикроскопия - для изучения процессов кристаллизации в клеточных суспензиях.

Анализ термограмм ДСК позволил определить температуры фазовых переходов и стеклования в плазме крови, суспензиях эритроцитов, смешанных с растворами проникающих криопротекторов (1:1), а также надосадочной жидкости и плотной эритроцитарной массе, выявить закономерности развития в них стеклообразных и кристаллических фаз. Методом ЯМР определены концентрации криопротекторов в исследуемых образцах. Показано, что во всех исследованных системах в присутствии 1,2-ПД, Гл и ДМСО одинаковых концентраций стеклуются разные кинетические единицы, при этом стабильность аморфного состояния наиболее высока в присутствии 1,2-ПД. Исследовано влияние компонентов фетоплацентарного комплекса на процесс низкотемпературной кристаллизации из аморфной фазы в присутствии Гл и 1,2-ПД, кристаллизации и плавления эвтектических составов в присутствии ДМСО при нагреве. Установлено, что высокая плотность клеток способствует развитию процесса кристаллизации из аморфной фазы и препятствует процессам кристаллизации и плавления эвтектических составов.

В работе проведен сравнительный анализ влияния 1,2-ПД, Гл и ДМСО на морфологическое состояние эритроцитов кордовой крови в зависимости от концентрации криопротектора, температуры и времени эквилибрации. Показано, что в присутствии Гл и 1,2-ПД преобладают дискоидные формы эритроцитов, однако рост концентрации криопротекторов приводит к набуханию дискоцитов. В присутствии Гл в суспензии наблюдаются также стоматоцитарные формы клеток, а 1,2-ПД - кренированные. В присутствии ДМСО преобладают кренированные формы клеток. В случае Гл максимальное количество дискоцитов наблюдается при температуре 20С, в то время как при 0С и 37С возрастает доля кренированных форм и сфероцитов. В случае 1,2-ПД и ДМСО оптимальной температурой эквилибрации с точки зрения сохранения интактной формы эритроцитов является температура 0С.

При замораживании эритроцитов со средней скоростью 200 єС/мин в присутствии Гл и 1,2-ПД минимальный гемолиз регистрируется в диапазоне концентраций 20 ч 30 масс. %, а с ДМСО - 10 ч 20 масс. %.

Исследование влияния 1,2-ПД, Гл, ДМСО и низкотемпературного воздействия на барьерные функции мембран эритроцитов методом ЭПР спиновых зондов с добавочным уширением показало, что увеличение проницаемости мембран эритроцитов кордовой крови для ионов феррицианида наблюдается в присутствии Гл, 1,2-ПД в концентрациях более 40 масс. % и ДМСО более 30 масс.%. Обнаружено уменьшение микровязкости цитоплазмы эритроцитов после замораживания-оттаивания в присутствии Гл во всем диапазоне исследуемых концентраций, что может быть следствием набухания эритроцитов.

Изучение динамики насыщения плаценты криопротекторами показало, что процесс насыщения ткани криопротектором имеет двухфазный характер, обусловленный неодновременным насыщением вне- и внутриклеточного пространства. Показано, что эквилибрация фрагментов плаценты в растворах, содержащих 60 масс. % Гл и 1,2-ПД до 60 мин не приводит к развитию процессов кристаллизации из аморфной фазы при нагреве, что свидетельствует о том, что концентрация указанных криопротекторов в плаценте не достигает 40 масс.%. Более длительная эквилибрация способствует затвердеванию образца в стеклообразном состоянии и формированию мелкодисперсного льда при нагреве.

Ключевые слова: кордовая кровь, эритроциты, плазма, плацента, криопротекторы, низкие температуры, фазовые переходы, стеклование, форма эритроцитов, барьерные функции, микровязкость, гемолиз

Thesis for the candidate of biological science degree in speciality 03.00.19 - Cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine, National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2007.

The thesis is devoted to the investigation of the influence 1,2-propanediol (1,2-PD), glycerol (Gl) and dimethyl sulfoxide (Me₂SO) on phase and glass transitions of fetoplacental complex components below 0С, the dynamics of the placenta saturation by cryoprotectants, as well as the influence of equalibration conditions with cryoprotectants and freeze-thawing on structural states of cord blood erythrocytes.

The results received by DSC method indicate that the different kinetic units vitrify in the presence of the equal concentrations 1,2-PD, Gl and Me₂SO. At the same time stability of the amorphous state is the highest with 1,2-PD. A high cell density promotes the development of glass-like phases while cooling, results in crystallization from the amorphous phase while heating and prevents crystallization of eutiectic compositions. It has been discovered that a rise in Gl and 1,2-PD concentrations causes an erythrocyte swelling, but high concentrations of Me₂SO causes crenation. Optimal temperatures for cord blood erythrocyte ecvilibration in cryoprotectant solutions have been determined: Gl - 20С; 1,2-PD and Me₂SO - 0 С. EPR method showed a damage of barrier functions of cord blood erythrocyte membranes in the presence of 30% Me₂SO, 40% Gl and 1,2-PD. The investigation of saturation dynamics of placenta by cryoprotectants demonstrated that the process of tissue saturation by cryoprotectants had a two-phase nature.

Key words: cord blood, erythrocytes, plasma, placenta, cryoprotectants, low temperatures, phase transitions, glass transition, erythrocyte shape, barrier functions, microviscosity, hemolysis

Размещено на Allbest.ru