Генетичний контроль утворення сахаридної частини ландоміцину А

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетичний контроль утворення сахаридної частини ландоміцину А

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Приблизно чверть кoрисних для людини прeпaрaтів, якi знайшли своє викoристання в медицині, вeтeринaрiї тa сiльськoму гoспoдaрствi належать до природних сполук або їх похідних [Newman et al., 2000]. Значна їх частина містить залишки цукрів у своєму складі, наявність яких у багатьох випадках є вирішальною для біологічної активності [Weymouth-Wilson et al., 1997]. Вiдпoвiднi цукри пeрeнoсяться дo aглiкoну глiкoзилтрaнсфeрaзaми.

Актиноміцети - прокаріотичні грампозитивні мікроорганізми, які продукують більше половини описаних та понад 90% промислово важливих антибіотиків [Hopwood et al., 1985]. Streptomyces сyanogenus S136 i Streptomyces fradiae Tu2717 синтезують ангуцикліни ландоміцин А і урдаміцин А, відповідно [Henkel et al., 1990 Drautz et al., 1986]. Saccharotrix espaniensis продукує гептадекоглікозид сахароміцин [Singh et al., 2000]. Ландоміцин А містить гексачленний дезоксисахаридний ланцюг, який є найдовшим серед описаних на сьогодні представників родини ангуциклінових та споріднених з ними антрациклінових антибіотиків. У порівнянні з іншими ландоміцинами він має найвищу протипухлинну активність, яка поступово зростає із збільшенням кількості цукрових залишків і втрачається при відсутності глікозильної частини. Отже, дослідження процесу біосинтезу гексасахариду ландоміцину А та вивчення специфічності глікозилтрансфераз в S. cyanogenus S136 набуває важливого значення. Кластер генів біосинтезу ландоміцину А секвеновано, однак донедавна їх вивчення було утруднене відсутністю ефективної методики внесення екзогенної ДНК в цей штам [Trefzer et al., 2001]. З розвитком техніки міжродової кон?югації E.coli - Streptomyces виникла можливість більш детально вивчати функціонування генів біосинтезу ландоміцину A в S. cyanogenus S136 [Luzhetskyy et al., 2002].

Штам S. fradiae Tu2717 ефективно досліджується групою професора Андреаса Бехтольда в Інституті фармацевтичної біології при університеті Фрайбурга (ФРН). Показано, що глікозилтрансферази, які беруть участь у процесі біосинтезу урдаміцину, володіють широкою субстратною специфічністю [Trefzer et al., 2000].

Синтез та модифікація різноманітних антрахінонових похідних є основним предметом інтенсивних досліджень кафедри ТБСФБ національного університету «Львівська Політехніка». У результаті попередніх досліджень на кафедрі було синтезовано ряд сполук антрахінонової природи. Складність будови звужує межі хімічних модифікацій; тому наявність мікроорганізмів, здатних здійснювати ефективну глікозиляцію, дає можливість значно розширити спектр активності речовин [Trefzer et al., 2002].

Зв'язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась дисертація. Робота виконувалась у науково-дослідній лабораторії при кафедрі технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету «Львівська політехніка» в рамках науково-дослідних тем ДБ «Хінон» (№ держреєстрації 0104V002315) та ДБ «Скринінг» (№ держреєстрації 0102V001199) у 2003-2006 рр. та у науково-дослідній лабораторії при кафедрі генетики та біотехнології Львівського Національного університету ім.І. Франка.

Ці дослідження також були підтримані індивідуальними грантами для молодих науковців DAAD (2003-2004 рр.) та FEBS (2006 р.).

Мета та завдання дослідження. Метою нашої роботи було: 1) встановлення особливостей генетичного контролю біосинтезу сахаридної частини ландоміцину А шляхом інактивування генів глікозилтрансфераз і 2) глікозилювання синтетичних біологічно активних сполук за допомогою біотрансформації штамами актиноміцетів. Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

- провести інактивування усіх чотирьох генів глікозилтрансфераз, які входять в кластер біосинтезу ландоміцину А;

- охарактеризувати вплив інактивування глікозилтрансфераз на структуру антибіотика;

- виявити вплив руйнування гена lanZ2 на спектр утворених ландоміцинів;

- показати можливість зміни сайту глікозилювання ландоміцинів шляхом гетерологічної експресії генів глікозилтрансфераз з інших штамів продуцентів;

- знайти штами актиноміцетів, які можуть здійснювати біотрансформацію антрахінонів шляхом їх глікозилювання;

- дослідити умови та ефективність утворення глікозильованих похідних різних біологічно активних антрахінонів;

Об'єкт дослідження - явище глікозилювання протипухлинних антибіотиків ангуциклінової природи.

Предмет дослідженя - сахаридна частина ландоміцину А і генетичний контроль іі утворення.

У якості головних методів дослідження використано: міжродову кон'югацію за методикою [Luzhetskyy A. et al., 2002]; біотрансформацію антрахінонів [Dьrr et al., 2004]; тонкошарову та високоефективну рідинну хроматографію метаболітів, спектральний аналіз ландоміцинів та урдаміцинів [Hoffmeister D. et al., 2000]; генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення ДНК, секвенування, конструювання та аналіз рекомбінантних молекул ДНК, ПЛР, ДНК-ДНК гібридизація) згідно cтандартних методик [Kieser et al., 2000, Sambrook et. al, 1989]; аналіз нуклеотидних та імовірних амінокислотних послідовностей за допомогою програм REFLECTION, BLAST 2.0, BOXSHADE, DNASIS, NEBCUTTER, CLUSTAL W [Altschul, S.F. et. al, 1997, Genetic Computer Croup, Wisconsin, USA].

Наукова новизна отриманих результатів. Завдяки нашій роботі вдолося отримати чітке уявлення про детальний механізм утворення гексасахаридного «хвоста» і показати послідовність реакцій глікозидного перенесення. Вперше для антибіотичних глікозилтрансфераз показано, що в процесі біосиинтезу ландоміцину А LanGT1 та LanGT4 працюють двічі на різних акцепторних субстратах. Дoскoнaле знaння спeцифiчнoстi глiкoзилтрaнсфeрaз lan-кластеру стосовно донора (цукру) і акцептора (аглікону) дозволить змінювати специфічність цих ферментів генно-інженерним шляхом.

У результаті виконаної роботи вперше показано функцію гену lanZ2 lan-кластеру і вплив його інактивації на спектр продуктів біосинтезу штаму S. cyanogenus S136. За результатами мас-спектральних аналізів видно, що LanZ2 сприяє утворенню ландоміцинів з довшою цукровою частиною.

Вперше показано можливість проведення гетерологічної експресії глікозилтрансферази UrdGT2 у мутантних штамах S. cyanogenus S136, внаслідок чого змінюється місцеположення і характер глікозилювання ангуциклінів. Якщо в нативній молекулі перший цукровий залишок приєднано через С-О глікозидний зв'язок, то у рекомбінантному ангуцикліні проходить зміна на С-С глікозиднй зв'язок, який є більш стабільним.

Вперше одержано похідні деяких біологічно активних антрахінонів шляхом біотрансформації у штамі Saccharotrix espaniensis.

Практичне значення отриманих результатів. S. cyanogenus S136 в нормі продукує три види ландоміцинів (ландоміцини А, В і D). Практичне значення наших результатів полягяє в можливості одержання нових ангуциклінів (ландоміцинів і С-глікозильованих тетрангулолів з одним, двома, трьома, чотирма та п'ятьма залишками цукрів), які можуть мати вищу протипухлинну активність або новий спектр цінних біологічних активностей. Створені мутанти S. cyanogenus S136 можуть бути використані для гетерологічної експресії генів глікозилтрансфераз штамів актиноміцетів - продуцентів біологічно активних сполук. В результаті гетерологічної експресії ГТ lan-кластеру можна отримувати нові глікозильовані сполуки із зміненими властивостями.

Штам Saccharotrix espaniensis, який здатний модифікувати сполуки шляхом глікозиляції може використовуватись для біотрансформації біологічно активних антрахінонів.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень. Для конструювання плазмід, що несуть гени біосинтезу ландоміцинів та урдаміцину, використані клони з бібліотек, які містять lan - та urd-кластери, клоновані і секвеновані співробітниками Львівського Національного університету ім.І. Франка та Фрайбурського університету, відповідно. Аналіз та інтерпретація отриманих результатів проведені за участю наукового керівника та співавторів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які включені до дисертації, оприлюднені на Міжнародній конференції з молекулярної біології та генетики для студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченій 100-річчю генетики (Львів, 20-22 квітня, 2000), Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів «Біологічні дослідження молодих вчених в Україні» (Київ, 1-3 жовтня, 2001), з'їзді німецького мікробіологічного товариства (VAAM) «Біологія природніх продуктів бактерійного походження» (Фрайбург, ФРН, 29 вересня - 1 жовтня 2002) та «Біологія бактерій, що продукують природні сполуки» (Йєна, ФРН, 26-28 вересня 2004), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Біотехнологія. Освіта. Наука» (Київ, 10-11 лютого, 2003), ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції «Біотехнологія. Освіта. Наука.» Львів, Україна 6-8 жовтня 2004).

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 7-и статтях у профільних наукових журналах, 8 тезах доповідей на конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експеримкнтальної частини (матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення), висновків, списку використаних джерел та трьох додатків. Дисертацію викладено на 169 сторінках машинописного тексту, з яких 12 займають ілюстрації (загальна кількість рисунків - 46), 7 сторінок - таблиці (загальнп кількість - 4) та 34 - додатки А, Б і В. Список використаних джерел охоплює 160 найменувань.

Основний зміст

глікозилювання ландоміцин ген

Матеріали і методи

Штами бактерій та плазміди. У роботі використані штами S.cyanogenus S136, S.espaniensis, та їхні ексконюганти, отримані автором у цій роботі, E.coli DH5б, E.coli ET12567 (pUB307), ET12567 (pUZ8001). Як вектори для клонування ДНК та перенесення в штами актиноміцетів використали плазміди pKC1132, pKC1218, pOJ260mel, pUWLoriT, pSET152, pIAGO; в E.coli - pUC18/19, pLitmus38, pMun2.

Середовища. Для отримання спор актиноміцетів та виконання міжродових схрещувань використовували вівсяне [Демидчук Ю.О., 1998] та MS середовища, рідкі середовища TSB, SG, NL111 використовували для продукції антибіотиків, отримання біомаси штамів та протопластів [Kieser et al., 2000].

Міжродову кон'югацію проводили за модифікованою методикою проф. Мазодієра [Flett et al., 1997]. Вирощували нічну культуру донорного штаму E. coli ET12567 (pUB307), що ніс відповідну плазміду, до середини логарифмічної фази росту, клітини осаджували при 12 тис. об/хв та ресуспендували в 100 мкл стерильної дистильованої води. Оскільки штам S.cyanogenus S136 не здатний формувати спори, його вирощували 12-годин в середовищі TSB, як описано [Luzhetskyy A. et al., 2002]. Міцеліальну культуру штама-рецепієнта та клітини E. coli ET12567 (pUB307) змішували у співвідношенні 1:10 та висівали на чашки з підсушеним МS середовищем. Інкубували 12-20 год та заливали розчином налідиксової кислоти і антибіотика, стійкість до якого визначається маркерним геном плазміди. Інкубували чашки 3-6 діб, після чого підраховували та аналізували екскон'югантів.

Біотрансформацію антрахінонів виконували як описано [Dьrr et al., 2004].

Тонкошарову та високофективну рідинну хроматографію метаболітів ландоміцинів та антрахінонів виконували згідно [Hoffmeister D. et al., 2000]. Похідні ландоміцину та хімічно синтезованих антрциклінів екстрагували з культуральної рідини рівним об'ємом етилацетату, випаровували до сухого стану у вакуумі і розчиняли у метанолі. ТШХ ландоміцинів проводили у системі розчинників дихлорметан: метанол (9:1) (довжина фронту хроматографічних пластинок -15 см). У вищенаведених умовах визначали R_f окремих сполук. Полікетиди виявляли візуально та за допомогою ультрафіолетового (УФ)опромінення хроматографічних пластинок. ВЕРХ проводили на апараті Waters PAD796 («Waters», Великобританія), використовуючи колонки із зворотньою фазою RP-С₁₈ Symmetry (250 Х 4,6 мм; («Waters», Великобританія). Як мобільну фазу використовували ацетонітрил з 0,1% трифтороцтовою кислотою у воді. Ландоміцини елюювали у лінійному градієнті ацетонітрилу (10%-100%), на протязі 30 хв із швидкістю потоку 1 мл/хв. В цих умовах визначали час виходу (R_t) ландоміцинів. Детекцію та спектральну характеристику сполук проводили з використанням фотодіодного детектора PAD796 та програми Millenium («Waters», Великобританія), отримуючи при цьому двомірні («час» - «одиниці абсорбції») хроматограми. Ландоміцини детектували при довжині хвилі 451 нм. Фракції, які за спектром поглинання відповідали ландоміцинам, у наведених вище умовах з'являлись між 15 та 30 хв.

Мас - спектральний аналіз проводили на апараті Agilent 1100 Series System («Agilent», ФРН), використовуючи підготовчу колонку Zorbax SB-C18; 4,6х12,5 мм, 5µм та основну колонку Zorbax SB-C18; 4,6х150 мм, 5µм або Zorbax Eclipse XDB-C8; 4,6х150 мм, 5µм. Інтенсивність потоку елюанта 0,7 мл/хв. Результати знімали при довжині хвилі 200-400 нм. або 200-600 нм. та фрагментуючій напрузі 70 вольт. Для визначенняя маси іони отримували за допомогою іонізації електронним ударом. У якості розчинника використовували різні градієнти води та ацетонітрилу. Вимивання фракцій і вимірювання проводилися при температурі 25С. Дані обробляли з використанням програми «ChemStations» («Agilent», США), отримуючи при цьому двомірні («маса» - «інтенсивність піку») мас-спектрограми.

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення ДНК, секвенування, конструювання та аналіз рекомбінантних молекул ДНК, ПЛР, ДНК-ДНК гібридизація) виконували згідно cтандартних методик [Kieser et al., 2000, Sambrook et. al, 1989].

Аналіз нуклеотидних та імовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою програм REFLECTION, BLAST 2.0, BOXSHADE, DNASIS, NEBCUTTER, CLUSTAL W [Altschul, S.F. et. al, 1997, Genetic Computer Croup, Wisconsin, USA].

Результати досліджень та їх обговорення

Функція гену lanGT2 в біосинтезі ландоміцину А S.cyanogenusS136.

Точне визначення функції lanGT2 гену проводилося шляхом його інактивації в геномі продуцента завдяки гомологічній рекомбінації між плазмідою pKC-lanGT2-aadA, яка містить касету спектиноміцин-резистентності (aadА) всередині lanGT2 гену, і хромосомним алелем цього гену в S.cyanogenus S136. Для створення інактиваційної конструкції 9.5 тпн BamHI фрагмент косміди H2-26, всередині якого знаходиться ген lanGT2, було субклоновано в аналогічний сайт pKC1132. Для конструювання мутантного алеля lanGT2 використали той факт, що всередині гену lanGT2 знаходиться унікальний сайт впізнавання для рестриктази SnaBI. В цей сайт ми клонували як SmaI-фрагмент генну касету стійкості до спектиноміцину aadA і таким чином отримали мутантний ген lanGT2:aadA. Плазміду pKC-lanGT2-aadA ми перенесли за допомогою кон'югації E.coli-Streptomyces в S.cyanogenus S136. Внаслідок проходження одиночного кросинговеру з хромосомою, плазміда pKC-lanGT2-aadA інтегрувалася в геном S.cyanogenus S136. В результаті послідовних пересівів культури екскон'юганта у середовищі TSB без апраміцину ми одержали 5 клонів, які є резистентними до спекиноміцину, але чутливими до апраміцину, що вказує на проходження вторинного кросинговеру і, відповідно, заміну дикого алелю lanGT2 на мутантний з геном lanGT2:aadA (Рис. 3.1).

Штами S. сyanogenus, стійкі до спектиноміцину і чутливі ло апраміцину, отримані в результаті подвійного кросинговеру, було названо S. cyanogenusДlanGT2. ДНК даних клонів аналізували за допомогою ПЛР, в результаті якої ампліфікували збільшений завдяки інтеграції aadA-касети (3.1 т. п.н.) алель гену lanGT. aadA-касета походить з плазміди pHP45omega. Вона з обох боків фланкована транскрипційними термінаторами фага T4. Тому інтеграція aadA у lanGT2 може спричиняти полярний ефект на два гени, lanX та lanGT1, які знаходяться нижче сайту інтеграції відносно напрямку транскрипції. Щоб створити одиночний мутант з порушеною експресією лише lanGT2-гена, отриманий рекомбінант S.cyanogenusДlanGT2 комплементували плазмідою pUWLoriT-lanGT1-lanX, у якій гени lanX і lanGT1 експресуються з конститутивного промотора гену ermE.

Плазміду pUWLoriT-lanGT1-lanX з допомогою кон'югації вводили в штам S. cyanogenusДlanGT2. Результати аналізів екстрактів одержаного мутанту методами ТШХ і ВЕРХ показали відсутність молекул ландоміцину. Натомість акумулюється речовина з R_T = 25 хв, яка не продукується диким типом (Рис. 3.2).

Подальший аналіз екстрактів штаму методом ВЕРХ МС показав, що пікові з R_T 25 хв відповідає сполука з масою 304 Да, яка є меншою за аглікон молекул ландоміцинів (М =338). Цей результат недвозначно вказує на те, що lanGT2 контролює приєднання першого цукру під час біосинтезу ландоміцину А. Треба зазначити, що ніякої різниці у спектрі продуктів S. cyanogenus ДlanGT2 і S. cyanogenus ДlanGT2 з pUWLoriT-lanGT1-lanX відзначено не було.

За результатами високороздільного мас-спектрального аналізу встановили, що якісний склад нової сполуки відповідає формулі C₁₉H₁₂O₄. За допомогою одно- і двохпросторового ЯМР аналізу її було ідентифіковано як тетрангулол, який є попередником ландоміцинового аглікону без гідроксильних груп біля атомів C-6 та C-11 та гексасахаридного ланцюга. Тобто продукт гену lanGT2 відповідає за приєднання першого цукру (D-олівози) до 8-O положення ландоміцинового аглікону під час біосинтезу ландоміцину А.

Для підтвердження функції LanGT2 проводили комплементацію мутанта S.cyanogenusДlanGT2 конструкцією pSET-lanGT2 (lanGT2 субклонований під сильний промотор транскрипції ermE). ВЕРХ МС аналізи отриманого екстракту показали, що основним продуктом комплементованого рекомбінанта є ландоміцин А з молекулярною масою 1086 Да.

Цікавим фактом є те, що у молекулі тетрангулолу, який продукується мутантом S. cyanogenus ДlanGT2, відсутні гідроксильні групи біля атомів C-6 та C-11 на противагу ландоміцинону. Це може свідчити про те, що гідроксилювання в положеннях C-6 та C-11 відбувається після приєднання першого цукру. Цікаво, що під час синтезу ландоміцину карбонільна група «ацетатного» походження в положенні C-6 елімінується, а потім вводиться de novo з допомогою оксигенази LanM [152]. Біологічне значення такого «обхідного маневру» в синтезі ландоміцинону було незрозуміле. Однак тепер, ми можемо припустити, що видалення карбонільної групи з положення C-6 необхідне для того, щоби відбулося глікозилювання аглікону, оскільки субстратом для LanGT2 ГТ може служити, очевидно, тільки аглікон у якого відсутній гідроксил в положенні C-6. Очевидно і те, що оксигенази, які вводять кисні в положення С-11 (LanZ5) і С-6 (LanM) є вузькоспецифічними, оскільки не можуть гідроксилювати тетрангулол.

Функція гену lanGT1 в S.cyаnogenus S136.

Для точного визначення функції глікозилтрансферази LanGT1 в штамі-господарі нами було вирішено використати отриманий перед тим мутант S.cyanogenus ДlanGT2lanXlanGT1. Як описувалося у попередньому розділі, інтеграція фланкованої з обох боків транскрипційними термінаторами aadA-касети у ген lanGT2 хромосоми S.cyanogenus спричинила полярний ефект на гени lanX та lanGT1, які знаходяться у 3' кінці від сайту інтеграції. У результаті комплементації мутанта S.cynogenusДlanGT2lanXlanGT1 плазмідою pSET-lanGT2 ми отримали мутант штаму S.cynogenus у якого відключені гени lanX та lanGT1.

Враховуючи те, що lanX не має гомології з генами глікозилтрансфераз, його інактивація не повинна впливати на формування сахаридної частини ландоміцину А. Результати аналізів екстракту штаму S.cynogenusДlanXlanGT1 методами ТШХ і ВЕРХ показали відсутність молекули ландоміцину А. Натомість на хроматограмі екстракту S.cynogenusДlanXlanGT1, за детекції сполук при довжині хвилі 451 нм, виявлено 2 основні сполуки, яким відповідають піки з часом виходу R_t 8,2 хв та 26,1 хв. Ми провели аналіз цих сполук методом мас-спектрометрії. Сполука з R_t 8,2 хв має молекулярну масу m/z 468 Да, а з R_t 26,1 хв - m/z 304 Да (рис. 3.3). УФ спектр поглинання сполуки з R_t 8,2 хв є характерним для ландоміцинів, а сполуки з R_t 26,1 хв - для тетрангулолу. Обидві сполуки були очищені з допомогою колоночної хроматографії та препаративної ВЕРХ і проаналізовані з допомогою ЯМР. Виявилося, що сполука з R_t 8,2 хв є моноглікозильованим ландоміциноном (ландоміцин І), а сполука з R_t 26,1 хв - тетрангулол. Очевидно, тетрангулол присутній в екстрактах штаму S.cyanogenus ДlanXllanGT1 тому, що експресія lanGT2 з промотора ermE^* є недостатньо ефективною для конверсїї всієї кількості сполуки. Оскільки, у ландоміцину І відсутній другий цукор - D-олівоза, це дозволяє стверджувати, що ген lanGT1 відповідає за приєднання другого цукру у молекулі ландоміцину А і кодує D-олівозилтрансферазу.

Для підтвердження того, що продукція моноглікозильованих ландоміцинів відбувається завдяки інактивації тільки lanGT1, ми комплементували штам S.cynogenusДlanXlanGT1 плазмідою pUWLoriTlanGT1, у якій ген lanGT1 експресується з сильного конститутивного промотора ermE. Після комплементації штам S.cynogenusДlanXlanGT1 (pUWLoriTlanGT1) продукував ландоміцин А, що підтверджує функцію LanGT1 як другої D-олівозилтрансферази під час біосинтезу гексасахариду у молекулі ландоміцинуА.

Інактивація гену lanGT3 в S.cynogenus S136.

Ген lanGT3 S.cynogenus S136 привернув нашу особливу увагу, оскільки його гомолог відсутній у lnd-кластері біосинтезу ландоміцину Е S.globisporus 1912, який на відміну від ландоміцину А містить лише три молекули цукрів у своєму складі. Отже, припускалося, що з активності LanGT3 починається трансформація трисахариду ландоміцину Е у гексасахарид ландоміцину А. Визначення функції гену lanGT3 проводили шляхом його інактивації у S.cynogenus S136 завдяки гомологічній рекомбінації між хромосомним алелем lanGT3 та його інактивованою копією на плазміді pOJДGT3. Для конструювання мутантного гену lanGT3 шляхом зсуву рамки зчитування обрали унікальний сайт дії NotI, який знаходиться посередині гену lanGT3. Плазміду pOJДGT3 переносили за допомогою кон'югації в S.cyanogenus S136. Після проходження одиночного кросинговеру з хромосомою плазміда pOJДGT3 інтегрувалася в геном S. cyanogenus S136. В результаті вирощування культури екскон'юганта у середовищі TSB без апраміцину ми одержали 4 чутливих до апраміцину клони, у яких відбулося проходження вторинного кросинговеру та заміна нормального алелю lanGT3 на мутантний. Наявність мутації підтверджували гібридизацією по Саузерну між обробленою ендонуклуазаю NotI геномною ДНК отриманих чутливих клонів та DIG-міченим геном lanGT3. Мутантний штам, отриманий в результаті подвійного кросинговеру, було названо S. cyanogenusДlanGT3.

ТШХ і ВЕРХ екстрактів штаму S.cyanogenusДlanGT3 виявило, що він продукує нову сполуки з УФ спектром поглинання, характерним для ландоміцину А. З допомогою ВЕРХ-МС аналізів виявили, що молекулярна маса нової сполуки становить 712 Да і на 374 Да відрізняється від маси ландоміцину А, тобто на трисахаридний залишок L-родиноза-D-олівоза-D-олівоза. Виходячи з даних ЯМР (¹Н, ¹³С) сполука містить 37 вуглеців і 44 протони, що відповідає якісному складу молекули вже відомого ландоміцину Е (С₃₇Н₄₄О₁₄, M_w=712.75 г. моль^-1). Для підтвердження функції LanGT3 проводили комплементацію мутанта S.cyanogenusДlanGT3 плазмідою pKCGT3, у якій ген lanGT3 субклонований під сильний промотор транскрипції ermE. ВЕРХ МС аналізи отриманого екстракту показали, що комплементований рекомбінант продукує повний спектр сполук, характерних для дикого типу (ландоміцини B, D і A). Отже ми показали, що LanGT3 є D-олівозилтрансферазою, задіяною в приєднанні четвертого цукрового залишку гексасахаридного ланцюга.

Функція гену lanGT4 в S.cynogenus S136.

З великою вірогідністю ми очікували, що LanGT4 у S.cyanogenus відповідає за приєднання L-родинози, як було показано у експериментах по гетерологічній експресії у продуцентах мітраміцину та урдаміцину [Trefzer et al., 2001]. Тому мутант S.cyanogenusДlanGT4 з інактивованим геном lanGT4 повинен накопичувати ландоміцин D з дисахаридним ланцюгом.

Аналіз нуклеотидної послідовності lan-кластеру показав, що гени lanGT3, lanZ2, lanZ3, lanGT4, lanZ4 i lanZ5 знаходяться під спільним промотором в межах однієї транскрипційної одиниці. Отже, інтеграція плазміди pOJДGT3 повинна спричиняти полярний ефект на транскрипцію дистальних генів, в тому числі і на lanGT4. Тому для точного визначення функції глікозилтрансферази LanGT4 ми використали отриманий перед тим штам S.cyanogenus pOJДGT3. Аналізуючи його з допомогою ВЕРХ і ВЕРХ МС ми виявили, що продукт S.cyanogenus pOJДGT3 є відомим ландоміцином F з відсутнім окисгеном в 11 положенні аглікону. ЯМР аналізи підтвердили відсутність гідроксилу у С-11 і наявність тільки двох цукрових залишків, що узгоджується з літературними даними. Така структура може пояснюватись тільки полярним ефектом, викликаним інтеграцією плазміди на розташовані «нижче» гени окисгеназ, які каталізують появу гідроксильної групи у С-11 ландоміцинового аглікону, а також lanGT4, який розташований перед lanZ4 і lanZ5. Щоб підтвердити функцію L-родинозилтрансферази LanGT4, ми проводили два види комплементації даного мутанта:

1) Повністю комплементований мутант S.cynogenus pOJДGT3, в якому відбулася експресія усіх шести генів (lanGT3, lanZ2, lanZ3, lanGT4, lanZ4 i lanZ5 - плазміди pKC1218ermGT3-4 і pUWLoriTZ4Z5) продукував повний спект сполук, характерних для дикого типу (ландоміцини B, D і A).

2) S.cynogenus pOJДGT3, в якому відбулася експресія усіх інактивованих генів (lanGT3, lanZ2, lanZ3, lanZ4 i lanZ5), за виключенням lanGT4, (плазміди pKC1218ermEGT3Z2Z3 і pUWLoriTZ4Z5). Маса основного продукту рекомбінанта, яку визначали за допомогою ВЕРХ МС (рис. 3.4), становила 598 Да. Отже, комплементант S.cynogenus pOJДGT3 (pKC1218ermEGT3Z2Z3 і pUWLoriTZ4Z5) продукує ландоміцин D. Даний результат вказує на те, що LanGT4 виконує функцію L-родинозилтрансферази і відповідає за приєднання третього цукру у процесі біосинтезу ландоміцину А.

Роль lanGT1 в приєднанні п'ятого цукрового залишку (D-олівози) в процесі дозрівання ландоміцину А.

До теперішнього часу існувало дві гіпотези утворення гексасахаридного хвоста ландоміцину А: 1) послідовне додавання активованих монодезоксицукрових залишків, або 2) приєднання спочатку дисахаридної порції (D-олівозил-D-олівоза), потім додавання L-родинози і повторення цього двохстадійного процесу до утворення гексасахариду [Kirsching et al., 1997]. Визначення функції LanGT3 та ідентифікація моно- і дисахаридних ландоміцинів чітко підтвердило перше припущення про утворення першого трисахариду ландоміцину А. В результаті гетерологічної експресії косміди H2-26, яка містить весь lan-кластер, було отримано ландоміцин А, що свідчить про формування шестичленного глікозиду за наяності лише чотирьох генів глікозилтрансфераз. Ми встановили як проходить утворення сахаридної частини до стадії чотирьох цукрових залишків. Очевидно, що деякі з ГТ каталізують приєднання двох останніх цукрів у гексасахариді. Щоб встановити, які ж з чотирьох ландоміцинових ГТ відповідають за приєднання п'ятого та шостого цукрів, ми провели експерименти з біотрансформації ландоміцину Е (трисахаридний ландоміцин) в мутантах S.cynogenus S136 по генах ГТ. Після додавання ландоміцину Е до мутантного штаму S.cyanogenus lanGT2, спостерігали утворення повноцінного гексасахаридного ланцюга, що свідчить про те, що LanGT2 не бере участі у приєднані двох останніх цукрів.

Після внесення 5 мг ландоміцину Е до 50 мл культурального середовища мутанту S.cyanogenusДlanGT1 утворювалась нова сполука з характерним для ландоміцинів УФ спектром поглинання 262 і 450 нм. Використовуючи ВЕРХ-МС аналіз виявилося, що її маса є 841 а.о.м. (рис. 3.5). Різниця з масою ландоміцину А становить 244 а.о.м. і відповідає дисахариду L-родиноза-D-олівоза. Новий метаболіт є ландоміцином J з тетрачленним глікозидним ланцюгом.

Тобто у S.cyanogenusДlanGT1 мутанті біосинтез гексасахариду зупиняється на стадії приєднання п'ятого цукру, отже цю реакцію приєднання п'ятого дезоксицукрового залишку (D-олівози) каталізує ГТ LanGT1.

Роль lanGT4 в приєднанні шостого цукрового залишку (L-родинози) в процесі дозрівання ландоміцину А.

Після додавання 5 мг ландоміцину Е до 50 мл культури мутанта S.cyanogenusДlanGT4, ландоміцину А в екстрактах виявлено не було. Але, як і в попередньому випадку, відбувалася поява нової похідної, УФ-видимий спектр поглинання якої знаходився в області 450 нм. Використання ВЕРХ-МС дозволило виявити молекулярну масу метаболіту, яка становить 971 Да. Вона на 114 а.о.м відрізняється від маси ландоміцину А і відповідає залишку L-родинози (рис. 3.6).

Отже, новий метаболіт є ландоміцином В з п'ятичленним глікозильним ланцюгом. ГТ LanGT4, яка є інактивована в даному мутанті, задіяна в приєднанні шостого дезоксицукрового залишку (L-родиноза).

До сьогоднішнього дня існувала думка, що одна ГТ каталізує тільки один крок глікозилювання під час біосинтезу антибіотика. Наші експерименти з інактивації ландоміцинових ГТ та біотрансформації спростували це ствердження. Нам вперше вдалося виявити антибіотичні ГТ (LanGT1 і LanGT4), які функціонують двічі під час біосинтезу глікозидної частини антибіотика. LanGT1 приєднує другий і п'ятий цукри, а LanGT4 каталізує приєднання третього і шостого цукрів під час біоситезу гексасахаридного ланцюга ландоміцину А. LanGT2 і LanGT3 приєднують першу і четверту D-олівозу, відповідно (Рис. 3.7).

Генерація С-глікозильованих ландоміцинів за допомогою гетерологічної екпресії С-глікозилтрансферази urdGT2 у S.cynogenusS136.

У ландоміцину А гексасахарид приєднаний до аглікону через O-глікозидний зв'язок, у випадку урдаміцину А трисахарид - через нетиповий C-глікозидний зв'язок. Оскільки такі сполуки становлять особливий інтерес у фармацевтичному аспекті через їх більшу стабільність по відношенню до глікозидазної деградації [Luzhetskyy et al., 2005]; ми вирішили отримати ландоміцин А, в молекулі якого глікозидна частина буде приєднуватися до аглікону через C-глікозидний зв'язок. За приєднання першої D-олівози у S.fradiae відповідає C-глікозилтрансфераза UrdGT2 [Trefzer et al., 2000]. Отже ми припустили, що UrdGT2 буде каталізувати приєднання першої D-олівози до 9-го карбону четвертого ароматичного кільця ландоміцинового аглікону. Ген urdGT2 (pSET-urdGT2) вносили y S.cynogenus ДlanGT2 за допомогою кон'югації.

ВЕРХ МС аналіз показав присутність нової сполуки з R_T = 23,5 хв та типовим для тетрангулолу УФ-видимим спектром, яка не продукується мутантом S.cynogenus ДlanGT2 (рис. 3.8). Молекулярна маса нової сполуки складає 434 Да, яка є більшою за тетрангулол (М = 304 Да) на 130 одиниць, що відповідає залишку олівози. Цей результат недвозначно вказує на те, що UrdGT2 здійснює приєднання олівози до ландоміцинового аглікону. Одно - та двох - дименсійний ЯМР аналізи очищеної сполуки показали присутність залишків тетрангулолу та олівози. H-ЯМР зафіксував наявність сигналу, що відповідав 8-гідроксилу тетрангулола, і відсутність протона в C-9. Крім того кореляції HMBC підтвердили, що залишок олівози приєднаний до C-9 позиції тетрангулолу внаслідок C-глікозилювання.

Враховуючи вихідну функцію UrdGT2, сполука була визначена як 9-C-D-олівозилтетрангулол (рис. 3.9).

Цікавим є те, що нова сполука не містить гідроксильних груп у C-6 та C-11. Імовірно обидві оксигенази LanM та LanZ4/Z5 не здатні сприймати C-глікозильований тетрангулол через вузьку субстратну специфічність цих ферментів.

Для одержання С-глікозильованих ландоміцинів з більшою кількістю цукрових залишків ми провели експресію плазміди pSET152lanGT1 S.cynogenus ДlanGT2 (urdGT2). Процедуру ідентифікації нових тетрангулолів проводили так, як і у випадку 9-C-D-олівозилтетрангулолу. У естрактах культури рекомбінанта S.cynogenus ДlanGT2 (urdGT2, lanGT1) ми ідентифікували 3 нових сполуки з R_T = 11,9 хв, 15 хв, 17,9 хв і молекулярними масами 434 Да, 564 Да та 548 Да, відповідно.

Біологічна трансформація похідних антрахінонів штамами Saccharotrіx espanаensіs та S.cyanogenusS136.

Ми продемонстрували ефективніть сучасних методів генетичної інженерії (гетерологічна експресія, спрямований мутагенез) для модифікації глікозидної частини на прикладі молекули ландоміцину А. На протязі довгого часу було помічено, що мікроорганізми можуть модифікувати сполуки додані до середовища у якому вирощують ті чи інші бактерії. Цей процес називається біотрансформацією, яка має ряд переваг перед хімічним синтезом: висока стереоспецифічніть, відсутність потреб високої температури і екстремальних pH, значно менша кількість шкідливих відходів. Тому ми вирішили дослідити можливість глікозилювання ряду сполук антрахінонової природи, використовуючи біотрансформацію штамами актиноміцетів. Для проведення біотрансформації ми використали штами Saccharotrix espanaensis і S.cyanogenus S136 які продукують олігосахаридні антибіотики сахароміцин та ландоміцин А, відповідно. Велика кількість цукрів у цих сполуках є гарантією наявності відповідної кількості глікозилтрансфераз, які відповідають за їхнє приєднання у штамах Sacch. espanaensis і S.cyanogenus S136.

Структурні формули 6 антрахінонів, використаних для біотрансформації показані на рисунку 3.11. Для проведення біотрансформації 50 мкл. замороженої культури штамів висівали на поживне середовище МС. На третю добу одиночний клон переносили в 50 мл рідкого ТSB для отримання попередньої культури.

Після 48 год культивування 1 мл суспензії попередньої культури переносили у 250 мл SG і вирощували наступних 48 годин для отримання основної культури. Після цього до середовища додавали розчинений в метанолі антрахінон в кінцевій концентрації 25 мкг/мл. Для аналізу продуктів біотрансформації використовували ВЕРХ МС і ЯМР.

В результаті інкубації алізарину (рис. 3.11 (1)) з штамом Sacch. espaniensis, ми виявили дві нові сполуки з допомогою ВЕРХ МС. Продукт 1 має УФ спектр поглинання (340 та 220 нм) характерний для алізарину та молекулярну масу (М) 385 Да. Маса молекули алізарину становить М 239 Да. Різниця молекулярних мас продукту 1 і алізарину складає 146 одиниць, що відповідає масі 6-дезоксигексози. Для того, щоби визначити формулу дезоксицукру в продукта 1, ми очистили його з допомогою препаративної ВЕРХ і провели ЯМР аналіз. З'ясувалося, що продукт 1 є алізарином до якого приєднана L-рамноза в С-2 положенні (рис. 3.12 (1)). Також ми виявили фракцію з R_t 7,5 хв (продукт 2), що має УФ спектр поглинання (340 та 220 нм) характерний для алізарину та молекулярну масу (М) 401 Да. Різниця молекулярних мас продукту 2 і алізарину складає 162 одиниці, що відповідає масі гексози чи 6-дезоксигексози плюс атом кисню. Нам не вдалося очистити продукт 2 для проведення ЯМР аналізу через його малу кількість в екстракті. З результатів аналізу ВЕРХ МС можна припустити, що молекула алізарину модифікована L-рамнозою і додатковим атомом кисню, проте невідомо в якому положенні пройшла модифікація.

В результаті інкубації емодіну (рис. 3.11 (2)) з штамом Sacch. espaniensis, ми виявили шість нових сполук з допомогою ВЕРХ МС. Продукт 1 (рис. 3.13) має УФ спектр поглинання (345 та 228 нм) характерний для емодіну та молекулярну масу (М) 416 Да. Маса молекули емодіну становить М 270 Да. Різниця молекулярних мас продукту 1 і емодіну складає 146 одиниць, що відповідає масі 6-дезоксигексози. Для того, щоби визначити формулу дезоксицукру в продукта 1, ми очистили його з допомогою препаративної ВЕРХ і провели ЯМР аналіз. В результаті спектрального аналізу виявили, що продукт 1 є емодіном до якого приєднана L-рамноза в С-9 положенні (рис. 3.12 (3)). Продукт 5 також очистили з допомогою препаративної ВЕРХ і провели ЯМР аналіз. Виходячи з даних ЯМР (¹Н, ¹³С; сполука містить 21 атом вуглецю, 20 протонів і 9 атомів оксигену, що відповідає якісному складу молекули емодіну з 6-деоксигексозою (C₂₁H₂₀O₉, M = 416 г. моль^-1). H-ЯМР зафіксував відсутність протона в положенні С-1. Крім того кореляції HMBC підтвердили, що залишок L-рамнози приєднаний до оксигену в C-1 позиції емодіну (рис. 3.12 (2)). Продукти 2, 3 і 4 теж є похідними молекули емодіну, судячи з їхніх УФ спектрів поглинання. Різниця молекулярних мас продуктів 2, 3 і 4 та емодіну складає 146 одиниць, що відповідає масі 6-дезоксигексози. Нам не вдалося визначити структуру цих сполук, проте з високою ймовірністю ми можемо стверджувати, що ці продукти є похідними емодіну модифікованого 6-дезоксигексозами в різних положеннях.

Наявність аміногрупи в природніх сполуках часто є важливою для їхньої активності і покращує фармакологічні характеристики сполук. В результаті інкубації 1-аміно-4-гідроксиантрахінону (рис. 3.11 (3)) з штамом Sacch. espaniensis, ми виявили одну нову сполуку з допомогою ВЕРХ МС. Продукт 1 має УФ спектр поглинання (250 та 530 нм) характерний для 1-аміно-4-гідроксиантрахінону та молекулярну масу (М) 384 Да. Маса молекули 1-аміно-4-гідроксиантрахінону становить М 238 Да. Різниця молекулярних мас продукту 1 і 1-аміно-4-гідроксиантрахінону складає 146 одиниць, що відповідає масі 6-дезоксигексози. Оскільки у випадку алізарину та емодіну, L-рамноза приєднується через оксиген гідроксигруп, ми припустили, що залишок L-рамнози приєднаний до єдиного оксигену в C-1 позиції 1-аміно-4-гідроксиантрахінону (рис. 3.12 (4)).

Глікозилювання алізарину, емодіну та 1 - аміно-4 - гідрокси-антрахінону відбувається через гідроксильну групу цих молекул. Щоб перевірити, чи наявність гідроксигрупи в молекулі антрахінону є необхідною умовою глікозилювання, ми додавали 1-аміно-4-хлороантрахінон (рис. 3.11 (4)), у якому відсутні гідроксильні групи, до штаму Sacch. еspaniensis. Проте, в результаті інкубації 1-аміно-4-хлороантрахінону з штамом Sacch. espaniensis несподівано ми виявили одну нову сполуку з допомогою ВЕРХ МС. Продукт 1 має УФ спектр поглинання (245 та 475 нм) дуже подібний для 1-аміно-4-хлороантрахінону (255 та 475 нм) та молекулярну масу (М) 420 Да. Зсув спектру поглинання з 245 нм до 255 нм вказує на те, що аглікон молекули 1-аміно-4-хлороантрахінону модифікований не тільки цукром. Маса молекули 1-аміно-4-хлороантрахінону становить М 258 Да. Різниця молекулярних мас продукту 1 і 1-аміно-4-хлороантрахінону складає 162 одиниці, що відповідає масі 6-дезоксигексози (146) і атому оксигену. Очевидно молекула 1-аміно-4-хлороантрахінону гідроксильована і глікозильована одночасно. Продукт 1 очистили з допомогою препаративної ВЕРХ і провели ЯМР аналіз. Виходячи з даних ЯМР (¹Н, ¹³С) сполука містить 20 атомів вуглецю, 18 протонів, 7 атомів оксигену і по одному атому хлору і нітрогену, що відповідає якісному складу молекули 1-хлоро-4-аміноантрахінону з 6-деоксигексозою і додатковим атомом оксигену (C₂₀H₁₈O₇Сl₁N₁, M = 420 г. моль^-1). H-ЯМР зафіксував відсутність протона в положенні С-2. Крім того кореляції HMBC підтвердили, що залишок L-рамнози приєднаний до оксигену в C-2 позиції 1-аміно-4-хлорантрахінону (рис. 3.12 (5)). Очевидно, що 1-аміно-4-хлороантрахінон спочатку гідроксилюється неспецифічною оксигеназою штаму Sacch. еspaniensis, а нанатупному етапі відбувається глікозилювання. При спробі біотрансформувати 1-аміноантрахінон (рис. 3.11 (5)) ніяких нових сполук виявлено не було.

Отже на цьому етапі роботи ми отримали ряд нових глікозильованих похідних синтетичних сполук і вперше виявили, що штам Saccharotrix espaniensis здатний трансформувати широкий спектр антрахінонів, оскільки його глікозилтрансферази володіють широкою субстратною специфічністю. Штам Sacch. еspaniensis можна застосовувати з метою глікозилювання малих ароматичних сполук і отримання нових біологічно активних речовин.

Таким чином, вищеописані результати дають можливість зрозуміти, продукти яких генів задіяні на кожному етапі нарощування глікозильної частини молекули ландоміцину А, або беруть участь у регуляції кількості донорних ТДФ-цукрів. Внаслідок інактивації генів глікозилтрансфераз одержано два нових ландоміцини із зміненою кількістю цукрових залишків у молекулі, а завдяки гетерологічній експресії гену urdGT2 одержано нові природні ангуциклінові аглікони із зміненою позицією приєднання цукрів. Знайдено ефективний господар для біотрансформації синтетичних антрахінонів.

Висновки

В результаті виконаної роботи з'ясовано функції п'яти структурних lan-генів в штамі S. cyanogenus S136. Вперше отримано нові ландоміцини із зміненою структурою та типом приєднання сахаридної частини молекули. Виявлено, що актиноміцетний штам Saccharotrix espaniensis здатний глікозилювати широкий спектр антрахінонів.

1. Інактивація гену lаnGT2 призводить до продукції рекомбінантним штамом нового ангуцикліну - тетрангулолу. Ген lаnGT2 кодує олівозилтрансферазу, що приєднує перший залишок D-олівози під час синтезу ландоміцину А. Глікозилювання передує гідроксилюванню положеннях C-6 та C-11 ландоміцинону.

2. Мутантні штами S. cyanogenus з інактиваними генами lаnGT1, lаnGT3 і lаnGT4 продукують нові ландоміцини J, E та D, відповідно. Ген lаnGT3 кодує олівозилтрансферазу, що приєднує третій залишок D-олівози під час синтезу ландоміцину А. Ген lаnGT4 кодує родинозилтрансферазу.

3. Глікозилтрансфераза LanGT1 приєднує другий і п'ятий цукри, а LanGT4 каталізує приєднання третього і шостого цукрів під час біоситезу гексасахаридного ланцюга ландоміцину А. Це вперше описані антибіотичні ГТ, які функціонують двічі під час біосинтезу глікозидної частини антибіотика.

4. Інактивація гену lаnZ2 призводить до зміни спектру ландоміцинів, які продукуються рекомбінантним штамом. LanZ2 бере участь в підтриманні правильного співвідношення TДФ-активованих дезоксицукрів.

5. Експресія гену urdGT2 в мутанті S. cyanogenus ДlanGT2 призводить до продукції нових С-глікозильованих тетрангулолів. Глікозилтрансфераза UrdGТ2 має широку субстратну специфічність.

6. Штам Saccharotrix espaniensis здатний модифікувати широкий спектр антрахінонів (алізарин, емодін, 1-аміно-4-хлороантрахінон, 1-аміно-4-гідроксиантрахінон) шляхом приєднання дезоксицукру L - рамнози.

Перелік наукових праць, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Fedoryshyn M., Luzhetskyy A., Dьrr C., Taguchi T., Novikov V., Bechthold A. Iteratively acting of glycosyltransferases involved in the hexasaccharide biosynthesis of landomycin A. // ChemBiol. - 2005.-Vol.12. - N11. - P.918-929.

Особистий внесок: одержання рекомбінантних штамів S.cyanogenus S136 з інактивованими генами глікозилтрансфераз, проведення фізико-хімічних аналізів продуктів мутантів, інтерпретація отриманих результатів.

2. Федоришин М.Ю., Лужецький А.М., Бехтольд А., Новіков В.П. Клонування генів біосинтезу дезоксицукру D-олівози. // Вісн. Нац. Унів. «Львівська політехніка». - 2005. - №529. - С. 116-119.

Особистий внесок: конструювання рекомбінантної плазміди pSETOLI, її внесення у штам S.fradiae шляхом кон'югації, участь в обробці результатів.

3. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136 // Вісн. Львів. Унів. - 2002. - Vol.29. - P.62-68.

Особистий внесок: підбір параметрів для здійснення міжродового кон'югантивного схрещування.

4. Luzhetskyy A., Liu T., Fedoryshyn M., Ostash B., Fedorenko V., Rohr J., Bechthold A. Function of lanGT3, a glycosyltransferase gene involved in landomycin A biosynthesis. // Chembiochem. -2004. - Vol.5. - N11. - P.1567-1570.

Особистий внесок: створення рекомбінантної плазміди pKC lanGT3.

5. Luzhetskyy A., Zhu L., Gibson M., Fedoryshyn M., Dьrr C., Hofmann C., Hoffmeister D., Ostash B., Mattingly C., Adams V., Fedorenko V., Rohr J., Bechthold A. Generation of Novel Landomycins M and O Through Targeted Gene Disruption. //ChembioChem. -2005.-Vol.4. - P.675-678.

Особистий внесок: конструювання рекомбінантних плазмід pKClanZ4Z5, та pUWLoriTZ4Z5 та їх внесення у штам S.cyanogenus S136 шляхом кон'югації, участь в обробці результатів біологічної активності синтезованих речовин, формулювання висновків.

6. Luzhetskyy A., Taguchi T., Fedoryshyn M., Dьrr C., Wohlert SE., Novikov V., Bechthold A. LanGT2 catalyzes the first glycosylation step during landomycin A biosynthesis. // Chembiochem. -2005. - Vol.6. - N8. - P.1406-10.

Особистий внесок: одержання рекомбінантного штаму S.cyanogenus S136ДlanGT2, проведення фізико-хімічних аналізів продуктів мутантів, інтерпретація отриманих результатів.

7. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Gromyko O., Ostash B., Rebets Y., Bechthold A., Fedorenko V. IncP Plasmids are most effwective in mediating conjugation between Escherichia coli and Streptomycetes // Rus. J. of Gen. -2006.-Vol.42.-N5. - P.476-481.

Особистий внесок здобувача: участь у конструюванні плазмід, опрацювання літератури.

8. Fedoryshyn M.Y., Luzhetskyy A.M. Obtaining of recombinant strains of Streptomyces galilaeus - producer of aclacinomycins. // Конференція для студентів, аспірантів і молодих науковців з молекулярної біології та генетики, 20-22 вересня, 2001, Київ, Україна. Збірник тез. С. 90.

9. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V.; Conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: Effects of chromosomal insertions on kanamycin production. // «Biologie bakterieller Naturstoffproduzenten» Фрайбург, ФРН, 29 вересня - 1 жовтня, 2002, V3.

10. Luzhetskyy A., Lyabah N., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Heterologous expression of landomycin biosynthesis genes in S. fradiae Tь2717-producer of urdamycines. // Перша Українська конференція молодих науковців. 10-11 лютого 2003, Київ, Україна. Збірник тез. С. 128-129.

11. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Taguchi T., Duerr C., Novikov V., Bechthold A. Unusual pathway of hexasaccharide biosynthesis in landomycin A molecule. // International Symposium in Jena «Biology of Bacteria producing Natural Products» 26-28 вересня, 2004, Р24.

12. Fedoryshyn M., Luzhetskyy A., Dьrr C., Hofmann C., Hoffmeister D., Novikov V., Rohr J., Bechthold A. Characterisation of genes encoding the reductase LanZ4 and the oxygenase lanZ5. // International Symposium in Jena «Biology of Bacteria producing Natural Products» (ФРН). 26-28 вересня, 2004, Р16.

13. Федоришин М., Лужецький А., Бехтольд А., Новіков В. Створення мутантних штамів Streptomyces cyanogenus S136, які продукують нові глікозильовані сполуки. // ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція «Біотехнологія. Освіта. Наука.» Львів, Україна, 6-8 жовтня 2004. Збірник тез С. 94.

14. Лужецький А., Грек М., Федоришин М., Осташ Б., Басілія Л., Бехтольд А., Федоренко В. Використання кон'югації для створення рекомбінантних штамів Streptomyces cyanogenus S136 // І Всеукраїнська науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих учених. 10-11 лютого 2003 р., м. Київ, Україна. Збірник тез С. 127-128.

15. Taguchi T., Fedoryshyn M., Luzhetskyy A., Ichinose K., Bechthold A. Purification and structure elucidation of the novel glycosylated compounds produced by the mutant of landomycin producer, Streptomyces cyanogenus S136. // 10^th International symposium on the genetics of industrial microorganisms. 24-28 червня 2006 р. м. Прага, Чешська республіка. Збірник тез С. 243-244.

Размещено на Allbest.ru