Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних з них водно-сольових екстрактів

Після закінчення уведення тетрахлорметану для моделювання цирозу печінки, вона мала загострені края та мілкобугристу структуру. У деяких тварин у черевній порожнині з'являлася асцитична рідина. Циротичні зміни печінки супроводжувались збільшенням активності амінотрансфераз.

Таблиця 6 Активність амінотрансфераз (мкмоль/мл/60 хв) у сироватці крові щурів з цирозом печінки та при його лікуванні екстрактом печінки поросят

Примітки: 1-відмінності статистично достовірні в порівнянні з цирозом печінки, р < 0,05; 2 - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з нормою, р > 0,05.

Активність АлАТ була вище норми в 5,4 рази, а АсАТ- в 2. На 15-ту добу при введенні екстракту печінки поросят спостерігається достовірне зменшення активності трансаміназ в порівнянні з нелікованим цирозом печінки. На 30-ту добу активність ферментів зменшується в обох випадках, але при використанні екстракту печінки поросят цей показник повертається до норми.

Рівень ТБКАП на 1-ту добу спостереження був вище норми в печінці у 3 рази, а в сироватці крові - майже в 2,9. На 15-ту та 30-ту доби спостерігається зменшення рівня перекисного окислення ліпідів в усіх випадках.

Після закінчення моделювання цирозу печінки на гістологічних препаратах спостерігалась типова для цієї патології картина: некроз гепатоцитів групами по кілька клітин, розростання фіброзної тканини в паренхимі, вузлова перебудова та інш. Спостерігалося різке зменшення кількості та звивистості функціонуючих синусоїдів та їх калібру. Термінальні та портальні венули меншого діаметра, укорочені, а діаметр печінкових венул - збільшений. Таким чином має місце зміна архітектоніки печінки і перебудова судинного русла. Практично таку ж картину спостерігали на 15-ту добу.

Прояви цирозу зменшилися на 30-ту добу спостереження зменшення обох групах тварин, але вони відрізнялися ступенем цього зменшення. При гістологічному дослідженні у тварин, які отримували екстракт печінки поросят, прояви внутрішньоклітинної, клітинної та тканинної регенерації були більш вираженими, ніж у тварин, які не отримували лікування. В сполучній тканині несправжніх часток та септ утворення капілярів відмічалось тільки в групі тварин, яким уводили екстракт. В цій же групі частіше фіксували дво- та багатоядерні гепатоцити та зменшення кількості сполучної тканини.

Методом прижиттєвої мікроскопії було встановлено, що у щурів, яким уводили екстракт, на 30-ту добу спостерігалось значне збільшення кількості функціонуючих судин та діаметра синусоїдів. Швидкість кровотоку збільшувалась в 2 - 2,5 рази. В цілому картина гемоциркуляторного русла печінки у цих тварин наближалась до нормальної, хоча повного відновлення структури русла не відбувалося. У контрольних тварин нормалізація гемоциркуляції хоча і спостерігалася, але була виражена в значно меншій мірі.

Вплив екстракту селезінки свиней на процес регенерації шкіри при опіковій травмі. В результаті візуального контролю стану опікових ран було встановлено, що на 1-шу добу з моменту травми спостерігається значна гіперемія і набряк шкіри. На 3-ю добу відмінностей в лікованих і нелікованих ранах відмічено не було.

У контрольній групі на 7-му добу опікові рани були покриті некротизованою тканиною та фібрином, спостерігалась плазморея на всій опіковій поверхні. У тварин, яким уводили екстракт селезінки, рани набули рівномірного рожевого забарвлення, грануляція розросталася на всій площі, гранулююча поверхня була гладшою. Площа опікової поверхні в контролі становила 4,9±0,6 см², а у тварин, яким уводили екстракт - 2,5±0,3 см². Відмінності в середніх розмірах ран статистично достовірні (р < 0,05).

У контрольній групі тварин на 14-ту добу на опіковій поверхні зберігався важко відокремлюваний струп. В дослідній групі тварин рани практично загоїлися. Середній строк загоєння контрольних і дослідних ран становив 23,2±2,3 та 13,8±2,1 діб відповідно (р < 0,05). Таким чином, при уведенні екстракту селезінки відмічався вищий темп загоєння опікової рани, що виражалося в прискоренні зміни фаз регенеративного процесу: скорочувалися терміни періоду клітинної інфільтрації і прискорювалося утворення грануляції. Спостерігається більш рання ерадикація ран від мікроорганізмів.

Порівняльне вивчення біологічної дії екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів. При цукровому діабеті було досліджено ефективність екстрактів селезінки та печінки свиней, а при токсичному гепатиті проведено вивчення впливу екстракту селезінки та підшлункової залози свиней на перебіг цієї патології.

На 7-му добу після початку уведення екстрактів у контрольних та дослідних щурів з цукровим діабетом концентрація глюкози в крові значно перевищувала норму і достовірних відмінностей цього показника між групами не відмічалося. У тварин з цукровим діабетом і у тих, які отримували екстракт печінки, рівень глюкози на 15-ту добу збільшувався в порівнянні з 7-ю добою. Якщо ж вони отримували екстракт селезінки, то на 15-ту добу концентрація глюкози була достовірно нижчою, ніж у щурів з цукровим діабетом, а на 30-ту добу поверталася до норми. У інших тварин вона залишалася значно вище норми. Концентрація ТБКАП в сироватці крові при цукровому діабеті та уведенні екстракту печінки залишалась високою протягом всього експерименту. При уведенні екстракту селезінки цей показник не відрізнявся від норми вже на 15-ту добу експерименту.

При токсичному гепатиті екстракт селезінки сприяв достовірному в порівнянні з контролем зменшенню активності АлАТ на 5-ту добу, тоді як при уведенні екстракту підшлункової залози такого ефекту не спостерігалось. Ще більш ефективно екстракт селезінки свиней зменшував активність АсАТ і концентрацію ТБКАП в сироватці крові, які на 5-ту добу повертались до норми. У тварин, яким уводили екстракт підшлункової залози, спостерігалося тільки зменшення концентрації ТБКАП на 5-ту добу.

Отримані результати дозволяють стверджувати, що екстракти печінки та підшлункової залози свиней, які при експериментальних патологіях відповідних органів у щурів проявляють високу біологічну активність, практично не призводять до нормалізації досліджених біохімічних показників в організмі при ураженні інших органів. Таким чином, їх вплив спрямований на клітини органа, з якого вони були отримані, а їх дія є органоспецифічною. Екстракт селезінки свиней сприяє нормалізації досліджених показників як при цукровому діабеті, так і при токсичному гепатиті. Отже його дія видається органонеспецифічною. Але, якщо прийняти до уваги, що екстракт селезінки нормалізує імунний статус організму, в тому числі і систему лімфоцитів (В.В. Бызов и др., 2001), то можна припустити, що його органоспецифічність проявляється саме в такій дії. При цьому, стимуляція репарації в ураженому органі відбувається опосередковано завдяки нормалізації кількості і функціональної активності лімфоцитів, які приймають активну участь в регуляції фізіологічної та репараційної регенерації (В.И. Донцов, 1998).

Біологічна дія екстрактів при їх уведенні молодим та старим щурам. Хронічне уведенні щурам з 6-місячного віку екстрактів ксеноорганів не впливає на зміну маси тварин, обумовлену фізіологічними причинами. Концентрація ТБКАП в плазмі крові дослідних тварин достовірно не відрізнялась від цього показника у контрольних тварин протягом усього строку спостереження (12 місяців).

Вище було показано, що екстракти тканин ксеноорганів сприяють нормалізації перекисного окислення ліпідів в організмі при різних патологіях. Тому ми дослідили, як впливає уведення суміші екстрактів на інтенсивність пероксидації ліпідів в сироватці крові та печінці старих тварин. Отримані дані свідчать, що рівень ТБКАП в крові та печінці 24-місячних щурів перевищує в 1,3 та 1,4 рази показники, характерні для 6-тимісячних тварин. Уведення суміші екстрактів приводить до зменшення інтенсивності перекисного окислення ліпідів в організмі старих щурів до рівня, який спостерігався у 6-місячних. При цьому тривалість життя таких тварин збільшувалася.

Експериментальне вивчення впливу суміші екстрактів на ріст пухлини Герена. У тварин, яким суміш екстрактів уводили, починаючи з 1-ї доби перевивання пухлини (доба перевивання пухлини вважається нульовою), спостерігалося відставання в рості пухлин у порівнянні з контрольними пухлинами. Середній об'єм пухлин у дослідних тварин на 10-ту добу після трансплантації був меншим в 1,3 рази в порівнянні з контрольними. Відсоток гальмування росту пухлини на 10-ту добу склав 24,7% . На 15-ту і 21-шу добу спостереження також відмічався менший розмір пухлин в цій групі.

У другій серії експериментів, при уведенні суміші екстрактів починаючи з 10-ї доби після трансплантації пухлини, гальмування росту пухлини на 30-ту добу склало 12,1% по відношенню до групи контрольних пухлин.

Після перевивання пухлини середня тривалість життя щурів у контрольній групі дорівнювала 33,3±2,6 діб. У дослідних групах цей показник був вищим в середньому в 1,2 рази. Достовірне збільшення тривалості життя щурів було відмічено в обох дослідних групах, і відсоток збільшення тривалості життя у цих групах склав відповідно 21,3 і 27,9%. Таким чином, уведення суміші екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней сприяє гальмуванню росту карциноми Герена у щурів і збільшує тривалість життя дослідних тварин.

Аналіз та узагальнення результатів. У розділі проведено підсумковий аналіз, зроблено порівняння одержаних результатів з даними, наведеними в літературі, а також узагальнення одержаних теоретичних та експериментальних даних і зроблено висновки.

ВИСНОВКИ

Вивчення впливу режимів кріоконсервування на збереження фрагментів ксеноорганів представляє значний науковий та практичний інтерес. Адже одержані в результаті фундаментальних досліджень дані можуть бути застосовані при розробці методів кріоконсервування і створенні низькотемпературних банків фрагментів органів, які все ширше використовуються в наукових дослідженнях та клінічній практиці. Активізація фундаментальних і прикладних досліджень, присвячені одержанню та вивченню біологічної дії препаратів, які містять біорегулятори пептидної природи, обумовлена тим, що такі препарати проявляють високу біологічну активність у вигляді стимуляції процесів репарації та регенерації при різних патологічних процесах в організмі. На цій підставі в дисертаційній роботі проведені дослідження, результати яких дали змогу теоретично та експериментально вирішити вказані вище проблеми. Вивчено вплив різних кріопротекторів, їх концентрацій та швидкостей охолодження на збереження фрагментів органів свиней та поросят, а також на склад одержуваних з них водно-сольових екстрактів. Проведено також вивчення біологічної дії одержаних екстрактів при різних експериментальних патологічних станах.

1. Під час гіпотермічного зберігання фрагментів підшлункової залози поросят протягом 15 год ендогенне дихання та інтенсивність перекисного окислення ліпідів залишаються на рівні контролю, а через 24 год спостерігається незначне зменшення ендогенного дихання та активація процесів пероксидації ліпідів. При температурі зберігання 37°С аутолітичні процеси активуються в значно більшій мірі, що призводить до значного пошкодження матеріалу. Після 24 год гіпотермічного зберігання інсулінпродукуюча здатність фрагментів підшлункової залози поросят достовірно не відрізняється від цього показника для свіжевилученого матеріалу.

2. Краще збереження фрагментів підшлункової залози при кріоконсервуванні забезпечують ДМСО та ПЕО-1500, причому ПЕО-1500 є ефективним кріопротектором в більш широкому діапазоні швидкостей охолодження, в той час як ДМСО проявляє кріопротекторну активність при швидкості охолодження 1^оС/хв. Деконсервований матеріал в культурі адекватно відповідає збільшенням продукції інсуліну на збільшення концентрації глюкози до стимулюючих значень, а повернення біоматеріалу до умов з низьким вмістом глюкози призводить до зменшення продукції інсуліну, що свідчить про функціональну повноцінність деконсервованих фрагментів.

3. Кріоконсервування фрагментів печінки свиней та поросят призводить до зменшення як ендогенного дихання, так і сполучення дихання та окислювального фосфорилювання. При використанні в якості кріопротекторів поліетиленоксидів в деконсервованих фрагментах спостерігається відновлення цих показників до рівня контролю. Ендогенне дихання фрагментів селезінки свиней, кріоконсервованих у присутності поліетиленоксидів зі швидкістю охолодження 1°С/хв, статистично достовірно не відрізняється від контролю. При цьому спостерігається незначне сполучення дихання та окислювального фосфорилювання, яке на 60 хв після відігріву статистично достовірно не відрізняється від контрольного показника.

4. Виявлено, що вихід у розчин білків, пептидів і нуклеотидів з кріоконсервованих фрагментів органів свиней та поросят більший, ніж з нативних, а концентрація і співвідношення цих речовин залежать від використаного кріопротектора. При одержанні екстрактів максимальна концентрація пептидів у супернатанті відмічається в тому випадку, коли фрагменти органів заморожували під захистом ПЕО-1500. Вихід пептидів у розчин не залежить від використаних концентрацій кріопротектора. Спектри молекулярних мас пептидів, які входять до складу екстрактів, залежать від органу, з фрагментів якого вони були одержані, та віку тварин.

5. Встановлено, що складові досліджених екстрактів зв'язуються з альбуміном сироватки крові, і це зв'язування може розглядатися як один із специфічних механізмів транспортування біологічно активних речовин до відповідних органів і тканин.

6. Кріоконсервовані фрагменти підшлункової залози поросят та екстракт кріоконсервованих фрагментів підшлункової залози свиней сприяють зменшенню рівня глюкози в крові, а також зменшують рівень пероксидації ліпідів в організмі експериментальних тварин. При цьому в деяких випадках нормалізація досліджених показників при застосуванні екстракту більш виражена, ніж при використанні фрагментів.

7. Екстракти кріоконсервованих фрагментів печінки проявляють високу біологічну активність при дифузних її ураженнях. Вони нормалізують біохімічні показники та процеси репарації при токсичному гепатиті та цирозі печінки, що виявляється в зниженні активності амінотрансфераз у сироватці крові тварин та в зниженні інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів як в ураженій печінці, так і в сироватці крові щурів. Спостерігаються нормалізація гістологічної будови органа, збільшення кількості функціонуючих судин, їх діаметра та швидкості кровотоку.

8. Місцеве застосування екстракту кріоконсервованих фрагментів селезінки свиней прискорює загоєння опікових ран. Скорочується час проходження фази запалення, а ерадикація ран від мікроорганізмів і утворення грануляційної тканини відбуваються в більш ранні строки.

9. Екстракти кріоконсервованих фрагментів печінки та підшлункової залози свиней не сприяють нормалізації біохімічних показників в організмі при експериментальному цукровому діабеті та токсичному гепатиті відповідно. Отже їх дія є органоспецифічною. Екстракт кріоконсервованих фрагментів селезінки свиней сприяє нормалізації досліджених показників при обох патологічних станах.

10. Хронічне уведення молодим щурам екстрактів ксеноорганів не впливає на вікову зміну маси тварин, обумовлену фізіологічними причинами, і не стимулює процеси перекисного окислення ліпідів в організмі. Уведення суміші екстрактів 24-місячним щурам призводить до зменшення інтенсивності процесів пероксидації ліпідів в організмі до рівня, який спостерігається у 6-місячних щурів. При цьому тривалість життя тварин збільшується.

11. Уведення суміші екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней сприяє гальмуванню росту карциноми Герена у щурів і збільшує тривалість життя дослідних тварин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н. Влияние криопротекторов на уровень перекисного окисления липидов нативных и криоконсервированный фрагментов ткани печени новорожденных и половозрелых свиней // Проблемы криобиологии.-1996.-№ 3.-С.26-29.

2. Тыныныка Л.Н., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Интенсивность перекисного окисления липидов фрагментов ткани печени новорожденных и половозрелых свиней в зависимости от скоростей охлаждения // Укр. биохимич. журнал.-1997.-№ 2.-С. 130-133.

3. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Сандомирский Б.П. Влияние режимов криоконсервирования фрагментов селезенки свиньи на интенсивность перекисных процессов // Пробл. криобиологии.-1998.-№1.-С.58-61.

4. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Тыныныка Л.Н., Сандомирский Б.П. Влияние криоконсервирования на интенсивность дыхания фрагментов ксеноорганов // Пробл. криобиологии.-1998.-№3.-С.45-48.

5. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Сандомирский Б.П. Сохранность спленоцитов после криоконсервирования фрагментов селезенки // Пробл. криобиологии.-1998.-№4.-С.57-59.

6. Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белочкина И.В. Влияние режимов криоконсервирования на сохранность микрофрагментов поджелудочной железы поросят // Пробл. криобиологии.-2000.-№ 2.-С. 76-80.

7. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Опыт применения эндотрахеального введения экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезенки в комплексном лечении больных с гнойными процессами в легких // Пробл. криобиологии.-2001.-№ 3.-С87-88.

8. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Влияние эндобронхиального введения экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезенки на некоторые факторы местного иммунитета в комплексной терапии больных с абсцессами легких //Пробл. криобиологии.-2001.-№ 4.-С.65-70.

9. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н. Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при различных условиях криоконсервирования // Пробл. криобиологии.-2003.-№ 4.-С. 77-84.

10. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., І.П. Михайлова., Гальченко К.С., Сандомирський Б.П. Вплив комплексного застосування екстракту підшлункової залози свиней і ліофілізованого молозива корів на перебіг експериментального цукрового діабету // Клініч. та експерим. патологія.-2004.-Т. 3, № 2.-С. 158-159.

11. Гальченко С.Є. Показники окислювального метаболізму фрагментів печінки свиней та поросят після їх кріоконсервування в присутності поліетиленоксидів // Пробл. криобиологии.-2004.-№ 3.-С. 72-78.

12. Гальченко С.Є. Склад водно-сольових екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней / /Пробл. криобиологии.-2004.-№ 4.-С. 72-78.

13. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В, Мамонтова А.В., Михайлова І.П., Сандомирський Б.П. Вплив препаратів із ксеногенної підшлункової залози на рівень глікемії і вільнорадикальні процеси у щурів з експериментальним цукровим діабетом // Мед. хімія.-2004.-№ 4.-С. 63-67.

14. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Вплив екстрактів з кріоконсервованих фрагментів ксеногенної печінки на активність амінотрансфераз та перекисне окислення ліпідів при експериментальному токсичному гепатиті // Мед. хімія.-2005.-№ 1.-С. 67-71.

15. Гальченко С.Е., Узленкова Н.Е., Слета И.В., Сандомирский Б.П. Влияние экстрактов криоконсервированных фрагментов ксеноорганов на рост опухоли Герена // Експерим. і клініч. медицина.-2005.-№ 1.-С. 17-20.

16. Гальченко С.Є. Тканинна та вікова специфічність водно-сольових екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів // Пробл. криобиологии.-2005.-Т. 15, № 2.-С. 153-158.

17. Гальченко С.Є. Екстракти кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів: одержання та біологічна дія // Пробл. кріобіології.-2005.-Т. 15, № 3.-С. 403 - 406.

18. Гальченко С.Є, Тыныныка Л.Н, Сандомирский Б.П. Стимуляция репарационных процессов в печени при токсическом гепатите // Експерим. і клініч. медицина.-2005.-№ 4.-C. 26-30.

19. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Паценкер Л.Д., Сандомирский Б.П. Спектрофлуориметрическое исследование экстрактов криоконсервированных фрагментов органов свиней. I. Собственная флуоресценция // Експерим. і клініч. медицина.- 2006.- № 1.- С. 48-52.

20. Гальченко С.Є. Кріоконсервування фрагментів селезінки свиней у присутності поліетиленоксидів // Проблеми кріобіології.-2006.-Т. 16, № 1.-С. 82-87.

21. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Сандомирский Б.П., Паценкер Л.Д. Спектрофлуориметрическое исследование экстрактов криоконсервированных фрагментов органов свиней. II. Анализ с помощью флуоресцентного зонда К-35 // Експерим. і клініч. медицина.- 2006.- № 3.- С. 57-61.

22. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н. Влияние условий криоконсервирования на сохранность фрагментов печени свиней и поросят // Пробл. медич. науки та освіти.-2003.-№ 2.-С. 46 - 48.

23. Гальченко С.Є., Бєлочкіна И.В., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Вплив екстрактів підшлункової залози і печінки свиней на щурів з експериментальними патологіями відповідних органів // Трансплантологія.-2003.-Т. 4, № 1.-С. 68 -70.

24. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П., Ганулич Т.В. Вплив екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеногенної печінки на структуру печінки щурів при токсичному гепатиті // Пробл. медич. науки та освіти.-2004.-№ 2.-С. 58-60.

25. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Сандомирський Б.П. Водно-сольові екстракти ксенотканин як альтернатива ксенотрансплантації // Трансплантологія.-2004.-Т. 7, № 3.-С. 258-260.

26. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Мамонтова А.В., Сандомирський Б.П. Ефективність екстракту кріоконсервованих фрагментів ксенопечінки при експериментальному цирозі // Трансплантологія.-2004.-Т. 7, № 3.-С. 260-262.

27. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Зинченко А.В., Сандомирский Б.П., Поврозин Е.А., Паценкер Л.Д. Исследование механизмов взаимодействия биологически активных ксеногенных тканевых экстрактов с сывороточным альбумином // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок: Матер. I міжнарод. наук.-практ. конф.- Тернопіль, 2004.- С. 332-335.

28. Гальченко С.Є., Дюбко Т.С., Зінченко О.В., Сандомирський Б.П., Поврозін Е.О. Дослідження впливу ксеногенних тканинних екстрактів на процес термоденатурації альбуміну // Актуальные проблемы медицины и биологии: Сб. научн. трудов.- Киев, 2004.- С. 403-408.

29. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Гальченко К.С., Сандомирський Б.П. Стимуляція регенерації підшлункової залози у щурів з експериментальним цукровим діабетом // 4-і Данилевські читання "Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології" (Харків, 24-25 лютого 2005р.).-Харків, 2005.-С. 39-41.

30. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Слета І.В., Гойденко Н.И., Сандомирський Б.П. Стимуляція регенерації при експериментальному цирозі печінки // Пробл. медич. науки та освіти.-2005.-№ 1.-С. 58-61.

31. Гальченко С.Є. Рівень перекисного окислення ліпідів у щурів різного віку після дії ксеноекстрактів // Пробл. мед. науки та освіти.-2005.-№ 3.-С. 47-48, 56.

32. Гальченко С.Е, Бєлочкіна І.В., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Порівняльне вивчення біологічної дії екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів // Пробл. мед. науки та освіти.-2006.-№ 1.-С. 67-69.

33. Пат. 54055 Україна, МПК⁷ A61K35/28. Засіб для лікування ран ”Кріосплін”: Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Гальченко К.С., Грищенко В.І., Синчикова О.П., Шевченко Л.Є.; ІПКіК НАН України.- № 2002043527; Заявл. 26.04.2002; Опубл. 17.02.2003; Бюл. № 2.

34. Пат. 64381 А Україна, МПК⁷ А61К35/12. Спосіб отримання екстрактів ксеногенних органів: Гальченко С.Є., Шкодовська Н.Ю., Сандомирський Б.П., Грищенко В.І.; ІПКіК НАН України.-№ 2003054649; Заявл. 22.05.2003; Опубл. 16.02.2004; Бюл. № 2.

35. Пат. № 6704, Україна, А61 К35/39. Засіб "Експан" для лікування цукрового діабету: Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Михайлова І.П., Сандомирський Б.П.; ІПКіК НАН України.-№ 20041108980; Заявл. 03.11.04; Опубл. 16.05.05. Бюл. № 5.

36. Пат. № 11183, Україна, G01N21/64, G01N33/48, A61K35/12. Спосіб оцінки біологічної активності екстрактів тканин: Грищенко В.І., Дюбко Т.С., Гальченко С.Є., ІПКіК НАН України.-№ u200505293; Заявл. 03.06.2005; Опубл. 15.12.2005. Бюл. №. 12.

37. Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белочкина И.В. Криоконсервирование инсулинпродуцирующей ткани поджелудочной железы поросят для клинического применения // Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии: Тез. докл. науч.-практич. конф. (Харьков, 1-3 октября 1991).-Харьков, 1991.-С. 227-228.

38. Sandomirsky B.P., Volkova N.A. Galchenko S.E.,Shapovalov D.V. Creation of low temperature bank of pancreas island tissue xenocultures for clinical use // Conference Theoretical basis of cryopreservation: Abstract.-Hradek Kralove, 1992.-Р. 37.

39. Sandomirsky B.P., Nikonenko A.S., Kovalyov A.A., Zavgorodny S.N., Volkova N.A. Galchenko S.E., Shapovalov D.V. Xenogenous transplantation of Pancreatic Islets // Раны, ожоги, повязки: Международный хирургич. конгресс (7-9 марта, 1994).-Тель-Авив, 1994.-С. 71.

40. Sandomirsky B.P., Nikonenko A.S., Kovalyov A.A., Zavgorodny S.N., Volkova N.A. Galchenko S.E., Shapovalov D.V. The transplantation of xenogenous pancreatic islets // J. Data Medica.-1994.-Vol. 2, № 1.-Р. 60.

41. Сандомирский Б.П., Никоненко А.С., Ковалев А.А., Завгородний С.Н., Волкова Н.А., Шаповалов Д.В. Гальченко С.Е. Ксенотрансплантация островковой ткани поджелудочной железы в хирургической клинике//Proc. 3-rd Intern. Congress on Wound, Burn and Dressing.-Tel-Aviv, 1994.-Р. 165-166.

42. Sandomirsky B.P., Nikonenko A.S., Kovalyov A.A., Zavgorodny S.N., Volkova N.A. Galchenko S.E., Shapovalov D.V. Cellular therapy implantation of cryopreserved pancreatic islets // Proc. I^st Intern. Congress on Biological Med. (21-23 Nov., 1994.-Israil).-Tel.-Aviv, 1994.-Р. 48.

43. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Tynynyka L.N. Cryopreservation of xenogenic spleen and fragments for clinical application // CRYO-95 The 32-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology.-Madison, Wisconsin, 1995.-P. 61.

44. Сандомирский Б.П., Никоненко А.С., Ковалев А.А., Волкова Н.А., Завгородний С.Н., Гальченко С.Е. Ксенотрансплантация криоконсервированных культур островковой ткани поджелудочной железы в комплексном лечении инсулинзависимого сахарного диабета и его осложнений // Сучасні проблеми клінічної та експериментальної трансплантології // Укртрансплант.-К., 1995.-С. 155-156.

45. Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белочкина И.В. Банк криоконсервированных культур ОТПЖ для клинического применения // I З'їзд українського товариства кріобіології і кріомедицини (18-20 жовтня 1995 р.): Тези доповідей.-Харків, 1995.- С. 223-225.

46. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н., Мамонтова А.В. Разработка технологии криоконсервирования фрагментов ксеноорганов для клинического применения // I З'їзд українського товариства кріобіології і кріомедицини.-Харків, 1995.-С. 222-223.

47. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Volkova N.A., Mamontova A.V., Tynynyka L.N., Belochkina I.V. Xenogenic fragments preservation for clinical application // CRYO'96 “The 33-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology” USA Indiana Indianapolis, 1996, P.- 164.

48. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Volkova N.A., Belochkina I.V., Mamontova A.V., Tynynyka L.N. High cooling rate effect on the integrity of some tissue fragments // CRYO'97 The 34-th Annual Meeting of the Society for Cryobiology (Spain, Barcelone, June, 8-12).- Barcelone, 1997.-P. 171.

49. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Тыныныка Л.Н. Криоконсервирование фрагментов ксеноорганов для клинического применения // Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины: Сб. науч. трудов. - Харьков, 1998.-С. 198-201.

50. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Tynynyka L.N. Cryopreservation of pig spleen and liver fragment // Allograft against disability”: 2^nd World Congress on Tissue Banking and 8^th International Conference of EATB (October 7-10, 1999.-Warsawa, Poland).- Warsawa, 1999.-Р. 201.

51. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Белочкина И.В., Мамонтова А.В., Гальченко Е.С. Криобиологические технологии получения ряда препаратов из ксеногенного сырья // Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины: Тез. докл. Всеукраинской науч. конф.-Харьков, Украина, Пробл. криобиологии.-2001.-№ 3.-С. 30-31.

52. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Гальченко Е.С. Криобиологические подходы к созданию препаратов из ксеногенного сырья // Лекарства-человеку: Мат. науч.-практич. конф.-Харьков, 2001.-Т.14, № 1.-С. 56-57.

53. Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П., Бызов В.В., Слета И.В. Криобиологические технологии получения экстракта из фрагментов свиной селезенки с целью его клинического применения // Новые технологии получения биологически активных веществ: Тез. докл. международ. науч.-практич. конф.-Алушта, 2002.-С. 185-186.

54. Гальченко С.Е., Белочкина И.В., Гальченко Е.С., Сандомирский Б.П. Эффективность комплексного применения экстракта поджелудочной железы свиней и лиофилизированного молозива коров при экспериментальном сахарном диабете // Сучасні напрямки розвитку ендокринології“ (Другі Данилевські читання): Мат. наук.-практич. конф. (Харків, 27-28 лютого 2003).-Харків, 2003.-С. 39-41.

55. Galchenko S.E., Belochkina I.V., Sleta I.V., Galchenko E.S., Shkodovskaya N.Yu., Sandomirsky B.P. Biologically active substance extracting from xenogenic organs with applying cryobiological technologies // Cryobiomol, Low temperature biology.-(Coimbra, Portugal, 14-18 September 2003).-Coimbra, 2003.-P. 164.

56. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Тининика Л.М., Слета І.В., Гальченко К.С., Шкодовська Н.Ю., Сандомирський Б.П. Порівняльне вивчення ефективності різних форм препаратів з ксеногенних органів // Х конгрес світової федерації українських лікарських товариств: Тез. допов.-Чернівці, 2004.-С. 617.

57. Гальченко С.Е., Узленкова Н.Е., Слета И.В., Сандомирский Б.П. Экспериментальное изучение влияния экстрактов криоконсервированных фрагментов ксеногенных органов на рост опухоли Герена // III съезд онкологов и радиологов СНГ: Материалы съезда (Минск, 25-28 мая 2004 г.).-Минск, 2004.-Ч. І.-С. 329-330.

58. Гальченко С.Є., Сандомирський Б.П. Застосування екстрактів ксенотканин замість ксенотрансплантації при патологіях відповідних органів // Каразинські природознавчі студії: Міжнар. наук. конф. (14-16 червня 2004 р., м. Харків).-Харків, 2004.-С. 260.

59. Ромоданова Э.А., Дюбко Т.С, Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П., Поврозин Е.А., Погожих Д.Н. Изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на взаимодействие альбумина с экстрактами различных тканей // Применение лазеров в медицине и биологии: Мат. XXI Международ. науч.-практ. конф. (26-29 мая 2004 г., Одесса).-Одесса, 2004.-С. 110-111.

60. Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування фрагментів селезінки свиней та екстракту з них: Методич. рекомендації / ІПКіК НАН України.-Уклад. Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Бизов В.В., Грищенко В.І., Велигоцький М.М., Велигоцький О.М.- Харків, 2001.-9 с.

61. Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування фрагментів печінки свиней і поросят, підшлункової залози поросят та екстракту з них: Методич. рекомендації / ІПКіК НАН України.-Уклад. Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Грищенко В.І., Бєлочкіна І.В., Слета І.В.-Харків, 2002.- 8 с.

АНОТАЦІЇ

Гальченко С.Є. Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних з них водно-сольових екстрактів.-Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія.-Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків-2007.

У роботі досліджено вплив умов кріоконсервування фрагментів органів (підшлункова залоза, печінка, селезінка) свиней та новонароджених поросят на їх збереження та склад одержуваних з цих фрагментів водно-сольових екстрактів. Показана висока кріопротекторна ефективність поліетиленоксидів при кріоконсервуванні фрагментів органів. Встановлено, що вихід речовин пептидної природи в розчин більший з фрагментів органів, кріоконсервованих під захистом поліетиленоксиду з м.м. 1500. Встановлено, що молекулярно-масовий розподіл пептидів в екстрактах залежить від органа та віку тварин. Екстракт підшлункової залози нормалізує біохімічні показники при експериментальному цукровому діабеті, а екстракт печінки стимулює процеси репарації в ураженому органі при токсичному гепатиті та цирозі печінки. Уведення екстракту селезінки позитивно впливає на перебіг цукрового діабету, токсичного гепатиту та прискорює загоєння опікових ран. Суміш екстрактів сприяє гальмуванню росту карциноми Герена і збільшує тривалість життя щурів.

Ключові слова: кріоконсервування, фрагменти органа, екстракт, пептиди, цукровий діабет, токсичний гепатит, цироз печінки, рана, пухлина.

Гальченко С.Є. Криоконсервирование фрагментов органов млекопитающих и биологическое действие полученных из них водно-солевых экстрактов.-Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология.-Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков-2007.

В работе исследовано влияние условий криоконсервирования фрагментов органов (поджелудочная железа, печень, селезенка) свиней и новорожденных поросят на их сохранность и состав получаемых из этих фрагментов водно-солевых экстрактов. Показана высокая криопротекторная эффективность полиэтиленоксидов при криоконсервировании фрагментов органов. Установлено, что выход веществ пептидной природы в раствор больше из фрагментов органов, криоконсервированных под защитой полиэтиленоксида с м.м. 1500. Определено, что молекулярно-массовое распределение пептидов в экстрактах зависит от органа и возраста животных.

Экстракт поджелудочной железы нормализует биохимические показатели при экспериментальном сахарном диабете, а экстракт печени стимулирует процессы репарации в пораженном органе при токсическом гепатите и циррозе печени. Введение экстракта селезенки положительно влияет на протекание сахарного диабета, токсического гепатита и сокращает сроки заживления ожоговых ран. Смесь экстрактов способствует торможению роста карциномы Герена и увеличивает продолжительность жизни крыс.

Ключевые слова: криоконсервирование, фрагменты органа, экстракт, пептиды, сахарный диабет, токсический гепатит, цирроз печени, рана, опухоль.

Galchenko S.E. Cryopreservation of mammals' organ fragments and the biological effect of obtained water-saline extracts.-Manuscript. Thesis for conferring a scientific degree for Doctor of Biological Sciences, speciality 03.00.19 - cryobiology.-Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv-2007.

The effect of cryopreservation conditions on the integrity of mature pigs' and newborn piglets' organ fragments (pancreas, liver, spleen) and on the composition of water-saline extracts derived from these fragments has been studied in the work. The biological effect of extracts has also been investigated under different pathological conditions.

The best preservation of pancreas fragments was observed under cryoprotection with DMSO and PEO-1500, the latter acting effectively in the wider range of cooling rates, while DMSO showed cryoprotective activity at 1єC/min. The cultured tissue responded adequately to the increase in glucose concentration up to stimulative indices (16.7 mmol/l), while low glucose level (5.6 mmol/l) led to the decrease in insulin production. Cryopreservation of pigs' and newborn piglets' liver fragments in the presence of polyethylene oxides led to the decrease of both endogenous respiration and coupling between respiration and oxidative phosphorylation. In 60 min in contrast to the decrease of native material respiration, the cryopreserved fragments showed respiration recovery. The increase of coupling between respiration and oxidative phosphorylation was also defined in cryopreserved fragments, but by 120 min these indices were lower than in the control.

Endogenous respiration of pigs' liver fragments cryopreserved with polyethylene oxides at 1єC/min did not differ significantly in comparison to the control. At the same time slight coupling between respiration and oxidative phosphorylation was defined both in the control and in cryopreserved material. By 60 min of incubation there were no changes in endogenous respiration intensity, although the normalization of respiration and oxidative phosphorylation coupling was identified. By 120 min a considerable decrease of the studied bioenergetic indices was observed both in the control and in cryopreserved fragments.

During extracts obtaining the maximum peptide concentration in the supernatant was defined after organ fragments preservation under PEO-1500 protection. The amount of peptides in the solution did not depend on cryoprotectant concentrations used. The significant decrease of peptide concentration in solution was observed during first 60 min of incubation. Extracts obtained from cryopreserved xenogenic organ fragments are characterised by presence of substances of peptide nature with wide spectra of molecular masses. These spectra are different for extracts derived from different organ fragments, and extracts composition also depends on animal age.

It was established that extracts' ingredients bind to blood serum albumin, and this binding could be regarded as one of the specific mechanisms of biologically active substances transportation to relevant organs and tissues.

Both newborn piglets' pancreas fragments and the extract derived from pigs' cryopreserved pancreas fragments promoted the decrease of glucose level in blood as well as the decrease of lipid peroxidation level in the organism of diabetic rats. In some instances the normalization of the studied indices was more noticeable under extract injection rather than under fragments application.

Extracts, obtained from cryopreserved fragments of pigs' and piglets' liver, stimulated reparative processes under diffuse diseases of liver. The effect of extracts manifested in the decrease of aminotransferase activity in blood serum of rats and also in the decrease of lipid peroxidation intensity both in the damaged liver and blood serum of animals. The normalisation of organ histological structure, the increase in number and diameter of functioning vessels as well as the increase in blood flow rate were also observed.

The local application of the extract of pigs' cryopreserved spleen fragments accelerated the healing of burns in experimental animals. This manifested in earlier eradication of wounds from microorganisms, shortening of inflammation phase time as well as earlier granulative tissue formation.

Extracts of pigs' cryopreserved liver fragments and pancreas fragments did not promote the normalisation of biochemical indices in the organism of rats under experimental diabetes mellitus and toxic hepatitis accordingly. The extract of pigs' cryopreserved spleen fragments promoted the normalisation of the studied indices under both pathological conditions.

Chronic injection of xenogenic organ extracts to young rats did not influence the animals' weight change, caused by physiological effects, and did not stimulate lipid peroxidation processes in the organism. The injection of extract mixture to 24-months old animals led to the decrease in lipid peroxidation intensity to the level observed in 6-months old animals. The lifetime of treated animals was prolonged.

The injection of extracts obtained from pigs' cryopreserved organs inhibited the tumour growth (Heren's carcinoma) and promoted the increase of the life in rats.

Key words: cryopreservation, organ fragments, extract, peptides, diabetes mellitus, toxic hepatitis, liver cirrhosis, burn, tumour.

Размещено на Allbest.ru