Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ГАЛИЦЬКА СВІТЛАНА МИКОЛАЇВНА

УДК 57.083.3:615.357:616.438+557.115

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

СТВОРЕННЯ ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ АКТИВНОСТІ ЛІПОСОМНОЇ ФОРМИ ПРЕПАРАТУ ТИМІЧНИХ ГОРМОНІВ

03.00.09 - імунологія

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, лабораторії імуногенетики.

Науковий керівник: доктор медичних наук Нікольський Ігор Сергійович Науковий центр радіаційної медицини АМН України, Інститут експериментальної радіології, завідувач лабораторії імуногенетики.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Малижев Вадим Олексійович, Український науково-практичний центр ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України, завідувач лабораторії клінічної імунології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бичкова Ніна Григорівна, Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, головний науковий співробітник Науково-дослідного лабораторного центру.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України.

Захист відбудеться “19” червня 2007 року о 14⁰⁰ на засіданні спеціалізованої вченої ради 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада 26.001.14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “18” травня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Експерименти 60-х років визначили провідну роль тимусу як центрального органу імунної системи, котрому притаманна цитокринна і ендокринна функції. Добре відоме значення тимусу в становленні клітинного імунітету і участь його продуктів - гормонів тимусу, в регуляції імунної відповіді Гриневич Ю.А. и др., 1989; Ярилин А.А. и др., 1991. Імунопрепарати на їх основі досить широко використовуються вже кілька десятиліть Арион В.Я. и др., 1999; Baumgarden R., 1999; Billich A., 2002; Goldstein A.L., Badamchian M., 2004. Вагомий внесок в розробку препаратів гормонів тимусу зробили вітчизняні вчені [Гриневич Ю.А. и др., 1989].

Дослідження тимічних гормонів, механізму їх дії не лише не припиняється, а стає все більш інтенсивним. Сьогодні відомо, що гормони тимусу впливають на проліферацію, диференціювання, активність і апоптоз практично всіх імунокомпетентних клітин, хоча основною мішенню їх дії є лімфоцити Т-ряду Гриневич Ю.А. и др., 1989; Ярилин А.А. и др., 1991; Ohmori H. et al, 2001; Evstrafieva A.G. et al, 2003. Тимічні фактори не лише приймають участь у регуляції імунної відповіді, але й є важливими посередниками в мережі імунонейроендокринних відносин Savino W. et al, 2002; Goya R.G. et al, 2004. Дослідження останніх років визначають важливу регуляторну роль - та тимозинів на внутрішньоклітинному рівні Freire J. et al, 2001; Huff T. et al, 2001; Hannappel E., Huff T., 2003, що дозволяє краще зрозуміти механізми їх участі у формуванні імунних реакцій і регуляції гомеостазу. Відкриття останніх років зумовлюють і нові підходи до їх клінічного використання. Визначені нові можливості застосування препаратів гормонів тимусу при онкологічних захворюваннях Garaci E. et al, 2003; Shuqun C. et al, 2004; відмічена суттєва їх ефективність при хронічних інфекціях, зокрема хронічних гепатитах В і С Liaw Y.F., 2004; Chien R.N., Liaw Y.F., 2004; Iino S. et al, 2005, при усуненні наслідків старіння Лабунець І.Ф., 2002; Ярилин А.А., 2003; Khavinson V.Kh., Morozov V.G., 2003 та в багатьох інших випадках.

Але, не зважаючи на високу потребу, в Україні відсутні розробки власного вітчизняного препарату для парентерального введення на основі гормонів тимусу. Більш того, імпортовані препарати морально дещо застарілі, показання для їх застосування та їх клінічна ефективність вже досить добре відомі, але, в той же час, вона не задовольняє потреб в деяких випадках. Тому актуальності набуває розробка нового препарату з використанням сучасних підходів, що дозволило б зробити наступний крок в підвищенні лікувальної ефективності.

На сьогодні вважається перспективним створення ліпосомних форм ліків. Широко використовується такий відомий вітчизняний ліпосомний препарат як ліпін [Стефанов А.В. и др., 1990; Новикова Р.И. и др., 1993]. Розглядаються можливості використання ліпосомних препаратів при інфекційних захворюваннях і в онкології [Wasan K.M., Lopez-Berestein G., 1995; Stebbing J., Gaya A., 2002; Graybill J.R. еt al, 2003].

Ліпосомна форма препаратів є одним з ефективних способів захисту біологічно активних речовин білкової природи від дії протеолітичних ферментів, що дуже доречно по відношенню до тимічних гормонів. Крім цього, ліпосомна форма ліків іноді надає їм здатність проникати в середину клiтини, що відкриває певні перспективи збільшення ефективності та пролонгації терапевтичної дії препарату при одночасному зниженні дози. Також ліпосомна форма препарату змінює його фармакодинаміку та фактично наділяє відомі препарати новим механізмом дії [Клейнерман Ю.С., Фидлер И.Дж., 2002; Березов Т.Т. и др., 2004; Оборотова Н.А. и др., 2006; Толчева Е.В., Оборотова Н.А., 2006].

Надзвичайно перспективними з точки зору направленого транспорту є ліпосоми, що зроблені з компонентів клітин або тканин. Для приготування таких ліпосом використовують сумарні ліпіди клітин [Розенберг О.А., 1987; Куликов В.И. и др., 1988; Музя Г.И. и др., 1991; Sprott G.D. et al, 2004], значно рідше - додають гангліозиди [Бурханов С.А. и др., 1985; Саатов Т.С. и др., 1987]. Існують також окремі роботи, в яких ліпосоми отримують з цілісних екстрактів [Бекренева В.Ю. и др., 1990], що може дозволити забезпечення пропорційного до клітинного ліпідного складу. Саме такий підхід уявляється одним із найбільш прийнятних для отримання ліпосомної форми препаратів тимічних гормонів і, теоретично, може наділити препарат цілим рядом важливих якостей, що змінить певною мірою механізм дії імуномодулятора і дозволить розширити показання для його клінічного використання та підвищення лікувальної ефективності тимічних гормонів при певній патології, що разом узяте можна вважати перспективним напрямком вивчення імунобіології гормонів тимусу.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота була виконана згідно з науковими дослідженнями лабораторії імуногенетики відділу медичної генетики Інституту експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України за темою “Створення та вивчення механізму дії нового імунокоректора на основі композиції ліпосомних структур із гормонів тимусу та загальних ліпідів” (№ ДР 0103U005714).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є розробка методики отримання ліпосомної форми препарату на основі гормонів та загальних ліпідів тимусу і вивчення деяких особливостей механізму його дії.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання.

Дослідити технологічні схеми фракціонування водно-сольового екстракту тимусу для отримання біологічно активного розчинного препарату гормонів тимусу.

Розробити методику створення ліпосомного препарату на основі гормонів та ліпідів тимусу з урахуванням технологічних особливостей отримання розчинного препарату. Вивчити фізико-хімічні властивості ліпосомного препарату.

Визначити активність розчинного та ліпосомного препаратів в тесті відновлення Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей in vitro та здатність індукувати продукцію речовин з тимозинподібною активністю у нормальних і тимектомованих мишей in vivo.

Вивчити дію ліпосомного препарату на продукцію фактору некрозу пухлин, адгезивну та проліферативну активність Т-лімфоцитів, природну цитотоксичність, поглинальну та бактерицидну активність нейтрофілів периферичної крові в нормі, у людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, та хворих на ВІЛ-інфекцію in vitro.

Об'єкт дослідження: препарати гормонів тимусу та їх імунобіологічна активність.

Предмет дослідження: способи одержання активних розчинного та ліпосомного препаратів гормонів тимусу, особливості регуляції активності імунної системи тимічними гормонами в нормі і патології.

Методи дослідження: імунологічні, фізико-хімічні, біохімічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримано препарат тимічних гормонів в ліпосомній формі - тимосомін. Застосований метод обернення фаз, який включає одержання розчину гормонів та ліпідів тимусу в 70% ацетоні з наступним його випаровуванням. При дослідженні умов створення ліпосомного препарату гормонів тимусу вперше встановлено, що ефективне фракціонування водно-сольового екстракту тимусу з метою отримання препарату, активного в тесті відновлення експресії Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей, може бути досягнуто за допомогою ацетону практично без застосування допоміжних процедур. Найбільш активна фракція осаджується при 70-85% концентрації ацетону. На способи отримання розчинного та ліпосомного препаратів гормонів тимусу отримано патенти.

Тимосомін відновлює експресію Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей та індукує синтез речовин з тимозиноподібною активністю in vivo. В дослідах in vitro встановлено, що тимосомін є імуномодулятором і проявляє виражену активність in vitro на об'єктах різного походження: лімфоцити і нейтрофіли донорів крові, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих людей, в різних імунологічних реакціях: адгезивній та проліферативній активності лімфоцитів, природній цитотоксичності, поглинальній і бактерицидній активності нейтрофілів та продукції ФНП. Вперше показано, що в досліджуваних системах вплив тимосоміну відрізняється від такого і розчинних тимічних препаратів, і від ліпіну, що може свідчити про особливості механізму його дії.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблені і запатентовані нові способи одержання розчинного та ліпосомного препаратів гормонів тимусу. Висока імунобіологічна активність препаратів, важливі відмінності в механізмі дії ліпосомного препарату і простота технологічних схем його одержання разом з наявною потребою в ефективних тимічних імуномодуляторах робить перспективними ці технології з точки зору впровадження у фармацевтичну промисловість з наступним клінічним використанням. Результати експериментальних досліджень механізму дії нового препарату виявили деякі найбільш суттєві точки його впливу на клітини імунної системи, що в подальшому може бути покладено в основу розробки показань для клінічного застосування препаратів тимічних гормонів в ліпосомній формі.

Особистий внесок здобувача. Планування роботи, її теоретичне обгрунтування та розробка методичних підходів щодо проведення досліджень здійснені разом з науковим керівником. Автор самостійно проаналізувала відповідну літературу, виконала експериментальні дослідження, статистично обробила й проаналізувала отримані результати, зробила висновки. Біохімічні дослідження (електрофорез та тонкошарову хроматографію) здійснено спільно з к.б.н. Васильєвим В.М. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації оприлюднені на науково-практичній конференції “Профілактика і лікування основних захворювань постраждалого населення через 16 років після Чорнобильської катастрофи” (Київ, 2002), VI звітно-виборній та науковій конференції Українського товариства фахівців з імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2002), науково-практичній конференції “Експериментальна радіобіологія. Гігієна харчування. Дієтологія” (Київ, 2003), Четвертій міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми навчання та виховання людей з особливими потребами” (Київ, 2003), І Всеукраїнській науково-практичній конференції “Імунотропні препарати в клінічній практиці” (Київ, 2004), VII Всеукраїнській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2005), Науково-практичній конференції молодих вчених ”Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини” (Харків, 2005), Міжнародній конференції “Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє” (Київ, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 15 робіт, із них 4 статті в фахових виданнях, 8 тез доповідей в матеріалах науково-практичних конференцій, 1 інформаційний лист, отримано 2 патенти.

Обсяг та структура дисертації. Робота складається із вступу, огляду літератури, викладу основних методик дослідження, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Роботу викладено на 172 сторінках друкованого тексту, ілюстровано 51 таблицею та 21 рисунком. Перелік використаних джерел містить 361 найменування, серед яких 125 вітчизняних та 236 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи досліджень. Для отримання препаратів використовували тимус телят. При фракціонуванні екстрактів тимусу застосовували такі маніпуляції як висолювання сульфатом амонію, осадження органічними розчинниками, нагрівання та діаліз. Концентрацію білку визначали методом Лоурі Шелифіст А.Є. та ін., 2003. Поліпептидну частину отриманих фракцій характеризували за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі, що містив додецилсульфат натрію Гааль Э. и др., 1982. Ліпідний склад ліпосомного препарату тимосоміну вивчали за допомогою тонкошарової хроматографії Шаршунова М. и др., 1980. Визначення діаметру та концентрації ліпосом проводили методом спектру мутності Безрукова А.Г., Розенберг О.А., 1981; Кленин В.И. и др., 1977. Активність фракцій визначали за чутливістю спонтанних розеткоутворюючих клітин (сРУК) селезінки тимектомованих мишей СВА до анти-Thy1-сироватки Bach J.F. et al, 1973. Визначення здатності отриманих препаратів індукувати синтез речовин з тимозинподібною активністю (РТПА) у нормальних та тимектомованих мишей проводили в експерименті на 30 мишах лінії СВА Bach J.F. et al, 1973.

Імунобіологічну активність тимосоміну визначали in vitro зі зразками крові 24 донорів крові, 21 постраждалого від аварії на ЧАЕС та 25 ВІЛ-інфікованих людей. ліпосомний тимус гормон біологічний

Група людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, складалась із осіб 20-34 років, які були відселені з м. Прип'ять в 1986 році. Компонента дози отриманого зовнішнього опромінення, обумовлена перебуванням на території 30-кілометрової зони до моменту евакуації, складала 3-6,4 Бер.

Група хворих на ВІЛ-інфекцію в стадії СНІД-асоційованого комплексу складалася із осіб 20-30-річного віку.

Для формування уявлення про особливості дії тимосоміну його активність порівнювали із такою ліпосомного препарату ліпіну (”Біолік”) в концентрації 0,175 мг/мл (за перерахунком з рекомендованої дози) та розчинного препарату гормонів тимусу тималіну (“Біофарма”) в концентрації, яка за вмістом білку, визначеного методом Лоурі, відповідала концентрації тимосоміну.

Вплив тимосоміну на адгезивну активність лімфоцитів вивчали в тесті розеткоутворення за дещо модифікованою нами методикою Никольский И.С. и др., 1998. Визначали такі клітини: Т-лімфоцити, які активно утворюють розетки з еритроцитами барана (аЕ-РУК) та субпопуляцію незрілих В-лімфоцитів, які реагують з еритроцитами миші (Ем-РУК). В цих тестах додатково використовували тималін в концентрації 200 мкг/мл (концентрація, яку рутинно використовують для визначення дії гормонів тимусу на Е-РУК). Така концентрація забезпечує прямий вплив на лімфоцити.

Вплив тимосоміну на спонтанну та індуковану ФГА (20 мкг/мл) проліферативну активність лімфоцитів визначали по інтенсивності бластоутворення in vitro Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978.

Вплив тимосоміну на природну цитотоксичність лімфоцитів визначали морфологічним методом Шпакова и др., 2000. В якості клітин-мішеней для природних кілерів використовували клітини еритробластоїдної лінії К-562.

Дію тимосоміну на функціональну активність нейтрофілів вивчали шляхом визначення їх поглинальної та бактерицидної активності. Поглинальну активність нейтрофілів визначали як відносну кількість нейтрофілів, здатних поглинати клітини St.aureus. Кисневозалежну бактерицидну активність нейтрофілів оцінювали методом відновлення нітросинього тетразолію (НСТ) за кількістю (у відсотках) поліморфноядерних клітин, що містять темно-сині гранули діформазану. Визначали три види бактерицидності - спонтанну, індуковану та резервну. Індукована бактерицидність - це значення бактерицидності зразків клітин, що інкубували з інактивованим стафілококом. Резервна бактерицидність - це різниця значень індукованої та спонтанної бактерицидності Дуглас С.Д., Куй П.Г., 1983.

Вплив тимосоміну на продукцію фактору некрозу пухлин (ФНП) визначали за цитотоксичною дією супернатантів клітинних культур на чутливі до ФНП клітини L929 Дзюблик І.В. та ін., 2001. Визначали вплив тимосоміну на спонтанну та індуковану ліпополісахаридом (ЛПС) продукцію цього цитокіну.

Для статистичного аналізу використовували критерій Ст`юдента (t) і непараметричний критерій Вілкоксона-Манна-Уітні (U) та критерій знаків (z) Лакин Г.Ф., 1990.

Результати досліджень та їх обговорення. Для фракціонування екстракту тимусу звичайно і найчастіше використовується певний набір стандартних методичних підходів в різних комбінаціях. Завдяки тому, що активні фактори знаходяться в досить широкому діапазоні молекулярної маси, комбінацію процедур фракціонування можна підібрати таким чином, щоб умови отримання активних фракцій підходили і для подальшого їх одержання в ліпосомній формі.

Маючи за мету розробку методики отримання активного препарату гормонів тимусу, ми використали фракціонування водно-сольового екстракту тимусу телят сірчанокислим амонієм, органічними розчинниками (ацетоном та етанолом), діаліз та нагрівання для дослідження технологічних схем отримання препаратів гормонів тимусу. Дослідження фракцій, отриманих при фракціонуванні водно-сольового екстракту тимусу ацетоном показало, що таке осадження біологічно-активних речовин тимусу, навіть практично без будь-яких додаткових процедур, забезпечує досить ефективне очищення від значної кількості баластних речовин. Для одержання активного препарату тимічних гормонів збирали матеріал, який осаджувався в діапазоні обємного вмісту ацетону між 55% та 85%, так як саме в цих фракціях спостерігалась досить висока активність в тесті відновлення Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей - 3 мкг/мл. Найбільша кількість поліпептидів в такому препараті визначалась, головним чином, в діапазоні ММ нижче 30 кД, тобто мала молекулярну масу, притаманну поліпептидам родини тимозинів.

Для вивчення здатності отриманого препарату індукувати синтез РТПА нормальним і тимектомованим мишам СВА вводили 1 мкг препарату внутрішньомязово і через 4 або 24 години в пулах сироватки крові вимірювали титр РТПА. Log₂ титру РТПА у нормальних мишей СВА становив 6,0. Через 4 години після введення тимоіндуктину він складав 6,2, а через 24 години - 5,8. У тимектомованих мишей вихідна кількість РТПА складала 0,2 (log₂ титру). Під впливом тимоіндуктину log₂ титру збільшувався до 5,6 через 4 години та дорівнював 2,5 через 24 години після введення. Враховуючи, що фракція 55-85 виявила здібність до індукції РТПА in vivo в менших дозах, ніж кількість препарату, що проявляє вплив in vitro в тесті Bach, а також те, що індукція РТПА є одним із головних механізмів дії гормонів тимусу in vivo, наявність такої активності підкреслили в назві препарату - тимоіндуктин. Спосіб отримання препарату запатентовано Нікольський та ін., 2003.

Далі здавалось необхідним отримати не лише активний розчинний і в багатьох відношеннях традиційний препарат за простою економічною схемою, але й доповнити притаманні препаратам гормонів тимусу властивості новими механізмами впливу. Враховуючи, що при отриманні тимоіндуктину найбільший вихід біологічно активних субстанцій тимусу спостерігається при фракціонуванні ацетоном в діапазоні 55-85% його концентрації, при цьому високоактивна і найменш гетерогенна фракція отримується в діапазоні концентрації ацетону 70-85%, а також маючи на увазі здатність ацетону розчиняти полярні ліпіди, зокрема фосфоліпіди, котрі є основним будівельним матеріалом при утворенні ліпідного бішару ліпосом, було розроблено методику отримання ліпосомного препарату гормонів тимусу методом обернення фаз. Препарат отримав назву тимосомін. Спосіб отримання препарату запатентовано Нікольський та ін., 2003.

Активність тимосоміну в тесті відновлення експресії Thy1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей виявлялась при концентрації білку 1,3 мкг/мл. Середній діаметр ліпосом та їх концентрація в тимосоміні становили відповідно 0,55 мкм та 1,5х10⁸ ліпосом/мл, а вміст білка складав близько 1 мг/мл. Білкова частина ліпосомного препарату представлена набором поліпептидів, які, за даними електрофорезу в поліакриламідному гелі, переважно містяться в зоні активної фракції отриманого нами імунокорегуючого препарату тимоіндуктину. Ліпідна складова тимосоміну, проаналізована методом тонкошарової хроматографії, містить холестерин, фосфатидилетаноламін, фосфатидилхолін, сфінгомієлін і лізофосфатидилхолін.

Індукторну активність тимосоміну вивчали на мишах лінії СВА по здатності препарату індукувати in vivo синтез РТПА. Нормальним або тимектомованим мишам вводили внутрішньом'язово 1 мкг тимосоміну (по білку, визначеному за методом Лоурі) і через 4 та 24 години в пулах сироватки крові мишей вивчали рівень РТПА.

Log₂ титру РТПА в сироватці крові нормальних мишей СВА становив 6,0. через 4 години після введення тимосоміну він збільшувався до 7,8, а через 24 години - до 7,2. У тимектомованих мишей вихідна кількість РТПА складала 0,2 (log₂ титру). Під впливом тимосоміну log₂ титру збільшувався до 10,0 через 4 години та до 5,6 через 24 години після введення. З отриманих даних можна зробити висновок про високу індукторну активність тимосоміну.

Для визначення особливостей впливу тимосоміну на функціональну активність клітин, що приймають участь в імунних реакціях, дослідження проводили in vitro з клітинами імунної системи донорів крові та двох груп імуноскомпроментованих людей: ВІЛ-інфікованих та постраждалих від аварії на ЧАЕС. Досліджувані групи людей з імунодефіцитами принципово відрізняються за механізмами, що формують порушення імунної системи, за виключенням обєднуючої для обох груп характеристики, а саме недостатності ендокринної функції тимусу Головизин М.В., 1996; Ярилин А.А., 1997; Чумак А.А., Холодная Л.С., 2001; Запорожан В.М., Аряєв М.Л., 2004. Відповідно, клітини імунної системи таких людей, що досліджуються у порівнянні, є важливою, адекватною та інформативною моделлю для визначення можливостей нового препарату гормонів тимусу.

Концентрацію тимосоміну, що застосовувалась в тестах in vitro, визначали за відсутністю токсичного впливу на еритроцити барана. Такою є концентрація 6 мкг/мл. Для визначення впливу менших кількостей препарату також вивчався тимосомін в концентрації 0,6 мкг/мл. Для більш чіткого формування уявлення про особливості механізму дії тимосоміну досліджували ліпосомний препарат ліпін в концентрації 0,175 мг/мл (за перерахунком з рекомендованої дози) та розчинний препарат гормонів тимусу тималін в концентрації 6 мкг/мл (в відповідності до концентрації тимосоміну).

При вивченні адгезивної активності лімфоцитів визначили, що така в групі ВІЛ-інфікованих людей достовірно знижена (р<0,05) в порівнянні з показниками групи донорів крові. Визначене нами зниження показників аЕ-РУК в групі ВІЛ-інфікованих говорить про виражену функціональну недостатність Т-лімфоцитів і, ймовірно, свідчить про поглиблення імунних розладів у обстежених людей.

Відносна кількість аЕ-РУК у постраждалих від аварії на ЧАЕС не відрізнялась від такої у донорів крові (табл. 1).

Таблиця 1 Кількість аЕ-РУК після інкубації лімфоцитів з препаратами in vitro (%)

Групи	Фізіологічний розчин	Тималін	Ліпін 0,175 мг/мл	Тимосомін
		200 мкг/мл	6 мкг/мл		6 мкг/мл	0,6 мкг/мл
Донори крові	61,62,3	63,52,2	59,92,9	56,73,0	66,12,0*	60,23,8
n	18	18	18	11	18	16
ВІЛ-інфіковані	54,22,2#	57,12,0	55,72,5	51,23,8	59,72,4*	58,62,8
n	24	24	24	16	24	20
Постраждалі від аварії на ЧАЕС	61,62,2	56,92,6	60,63,3	59,11,7	59,62,2	62,52,8
n	20	20	20	20	20	20

^# - показники достовірно відрізняються від таких групи донорів крові (р<0,05); * - показники достовірно відрізняються від тих, що отримані при інкубації з ФР (р<0,05)

В групі донорів крові інкубація лімфоцитів периферичної крові з препаратами в більшості випадків не викликала помітної зміни % аЕ-РУК, лише реакція на тимосомін (6 мкг/мл) була достовірно вище. Аналогічний вплив тимосомін (6 мкг/мл) справляв на лімфоцити ВІЛ-інфікованих людей (табл. 1). Аналіз отриманих результатів показав, що збільшення показників аЕ-РУК в цих групах відбувається за рахунок лімфоцитів з низьким рівнем аЕ-РУК по відношенню до середнього значення аЕ-РУК донорів крові (<61,6%).

В групі людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС жоден з досліджуваних препаратів не справляв суттєвого впливу на адгезивну активність лімфоцитів (табл. 1). Але ліпін суттєво (р0,05) впливав на лімфоцити постраждалих від аварії на ЧАЕС з високим рівнем аЕ-РУК (>61,6, середнє значення 67,01,0) та знижував показники аЕ-РУК до 60,32,2%.

Показники Ем-РУК в групі ВІЛ-інфікованих (2,30,8) практично не відрізнялись від таких донорів крові (2,20,5), хоча є дані про їх підвищений вміст при ВІЛ-інфекції на стадії лімфаденопатії та вторинних інфекцій як наслідок поліклональної активації В-лімфоцитів Покровский В.В. и др., 1990.

В-клітини є одними з найчутливіших до дії радіації Комиссаренко С.В. и др., 1994; Чумак А.А., Холодна Л.С., 2001. Визначене суттєве зниження (р0,05) показників Ем-РУК у постраждалих від аварії на ЧАЕС (1,00,2) узгоджується з такими даними.

Тимосомін, як і інші досліджувані препарати, практично не впливав на показники Ем-РУК донорів крові та ВІЛ-інфікованих. На суттєво знижені показники Ем-РУК в групі постраждалих від аварії на ЧАЕС достовірно (р0,05) впливав як тимосомін, так і інші препарати - тималін (6 мкг/мл) та ліпін, збільшуючи показники до 2,20,5%, 1,7%0,3 та 2,00,4% відповідно.

Визначення спонтанної проліферативної активності лімфоцитів показало, що в групах донорів крові та постраждалих від аварії на ЧАЕС показники практично не відрізнялись (1,80,3% та 1,90,6% відповідно). В групі ВІЛ-інфікованих рівень спонтанної РБТЛ (10,71,9%) був достовірно (р0,05) вищим, ніж такий у донорів крові, що зумовлено наслідками персистенції ВІЛ, які проявляються активацією зрілих Т-клітин, в тому числі обумовлюють їх спонтанну проліферацію Головизин М.В., 1996.

Тимосомін не виявив індукуючого впливу на проліферативну активність лімфоцитів в обстежених групах. На відміну від цього, ліпін достовірно (р0,05) збільшував показники РБТЛ в групі постраждалих від аварії на ЧАЕС до 3,00,5%, що говорить, враховуючи здатність ліпосом до взаємодії з клітинними мембранами, скоріш за все, про структурні порушення мембран лімфоцитів постраждалих від аварії на ЧАЕС, на які може вплинути присутність фосфатидилхоліну.

На відміну від спонтанної проліферативної активності, показники РБТЛ, індукованої ФГА, навпаки, у ВІЛ-інфікованих були значно зниженими в порівнянні з показниками в групі донорів крові. Тимосомін в концентрації 6,0 та 0,6 мкг/мл, достовірно підвищував індуковану ФГА проліферативну активність лімфоцитів ВІЛ-інфікованих, хоч і не до рівня показників донорів крові. Аналогічну дію виявляв тималін. На індуковану ФГА проліферативну активність лімфоцитів донорів крові та людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, препарати не впливали (табл. 2). Тимосомін (6 мкг/мл) є здатним достовірно (р0,05) знижувати проліферативну активність лімфоцитів в групі донорів крові з високим рівнем РБТЛ (>59,4, середнє значення 64,31,0) до 60,23,0%, що заслуговує на увагу як позитивна якість препарату, перспективна з точки зору можливого використання тимосоміну при лімфопроліферативних процесах.

Таблиця 2 Показники РБТЛ після інкубації з препаратами in vitro (%)

Групи	Фізіологічний розчин	Тималін 6 мкг/мл	Ліпін 0,175 мг/мл	Тимосомін
				6 мкг/мл	0,6 мкг/мл
Донори крові	59,41,5	57,31,9	56,82,4	57,32,1	58,72,3
n	21	21	21	21	21
ВІЛ-інфіковані	38,93,5#	43,93,8*	39,14,1	47,04,0*	46,54,2*
n	20	20	20	20	20
Постраждалі від аварії на ЧАЕС	57,11,9	56,92,9	57,42,9	55,42,9	58,02,6
n	21	21	21	21	21

^# - показники достовірно відрізняються від таких групи донорів крові (р<0,05); * - показники достовірно відрізняються від тих, що отримані при інкубації з ФР (р<0,05)

Визначаючи вплив досліджуваних препаратів на цитотоксичну активність природних кілерних клітин, отримали дані, які показують, що цитотоксичність в групах донорів крові та постраждалих від аварії на ЧАЕС достовірно не відрізнялась, а цитотоксичність в групі ВІЛ-інфікованих була значно зниженою в порівнянні з такою в групі донорів крові (табл. 3), що є характерним для цієї групи хворих Goodier M.R. et al, 2003.

Суттєво відрізнялась реакція лімфоцитів людей обстежених груп на препарати. Так показники цитотоксичності в групі донорів крові дещо підвищувались під впливом тималіну і ліпіну (табл. 3). При цьому ліпін підвищував цитотоксичність в групі донорів крові як з низьким (<59,9, середнє значення 47,72,7%), так і з високим (>59,9, середнє значення 69,81,5%) рівнем природної цитотоксичності, а тималін збільшував і так вже високу цитотоксичну активність.

Цитотоксична активність лімфоцитів постраждалих від аварії на ЧАЕС збільшувалась під впливом тимосоміну (0,6 мкг/мл) (табл. 3) через його вплив, більшою мірою, на клітини з низьким рівнем цитотоксичної активності (<59,9, середнє значення 41,54,1%).

Знижену цитотоксичність лімфоцитів ВІЛ-інфікованих всі досліджувані препарати підвищували, хоч і не до рівня показників практично здорових людей (табл. 3), при цьому вплив тимосоміну був достовірно (р<0,05) більш вираженим в порівнянні з іншими препаратами.

Таблиця 3 Показники природної цитотоксичності після інкубації з препаратами in vitro (%).

Групи	Фізіологічний розчин	Тималін 6 мкг/мл	Ліпін 0,175 мг/мл	Тимосомін
				6 мкг/мл	0,6 мкг/мл
Донори крові	59,93,0	66,84,0*	68,73,4*	60,54,5	64,44,3
n	20	20	20	20	20
ВІЛ-інфіковані	25,65,5#	39,35,3*	39,35,7*	46,05,7*	48,44,5*
n	20	19	19	19	19
Постраждалі від аварії на ЧАЕС	53,24,2	60,44,9	59,93,9	59,64,7	65,53,7*
n	19	19	18	19	18

^# - показники достовірно відрізняються від таких групи донорів крові (р<0,05); * - показники достовірно відрізняються від тих, що отримані при інкубації з ФР (р<0,05)

Вивчення впливу тимосоміну на поглинальну активність нейтрофілів периферичної крові проводились паралельно в двох варіантах: 1) досліджувані препарати додавались одночасно з об'єктом фагоцитозу, за яким підраховувались результати (клітини інактивованого Staphylococcus aureus); 2) об'єкт фагоцитозу додавався через дві години інкубації зразка крові з досліджуваними препаратами. За отриманими даними попередня інкубація 2 години при 37⁰С призводила до значного (р<0,05) збільшення поглинальної активності нейтрофілів навіть без впливу препаратів в усіх обстежених групах (табл. 4).

При інкубації тимосомін і ліпін пригнічували поглинання нейтрофілами Staphylococcus aureus в групах донорів крові та постраждалих від аварії на ЧАЕС людей. На цю ж функцію нейтрофілів ВІЛ-інфікованих препарати не впливали. Преінкубація нейтрофілів з препаратами протягом двох годин приводить до пригнічення поглинальної активності у нейтрофілів донорів крові тимосоміном і ліпіном, у постраждалих від аварії на ЧАЕС - тималіном і тимосоміном і у ВІЛ-інфікованих - ліпіном (табл.4). Зниження показників під впливом ліпосомних препаратів можна пояснити корпускулярною структурою тимосоміну і конкуренцією в поглинанні частинок ліпосом і Staphylococcus aureus.

Таблиця 4 Поглинальна активність нейтрофілів (%) після інкубації з препаратами in vitro

Групи	Об'єкт фагоцитозу додається одночасно з препаратами	Об'єкт фагоцитозу додається через 2 години інкубації з препаратами
	Фізіологічний розчин	Тималін 6 мкг/мл	Ліпін 0,175 мг/мл	Тимосомін	Фізіологічний розчин	Тималін 6 мкг/мл	Ліпін 0,175 мг/мл	Тимосомін
				6 мкг/мл	0,6 мкг/мл				6 мкг/мл	0,6 мкг/мл
Донори крові	71,4 2,8	71,6 2,8	59,4 3,8*	61,2 3,6*	62,2 3,9*	83,7 1,9^	81,2 2,3	76,5 2,8*	76,4 2,3*	76,4 2,5*
n	24	21	20	24	22	20	20	18	20	20
ВІЛ-інфіковані	68,7 2,8	65,3 3,0	65,4 4,1	61,8 4,0	66,2 4,5	78,2 2,8^	76,1 3,0	69,6 2,4*	78,8 3,9	73,3 3,1
n	20	18	16	20	20	20	18	16	20	20
Постраждалі на ЧАЕС	79,0 2,6	78,6 2,2	73,2 3,2*	72,6 1,9*	74,4 2,5	86,7 1,9^	79,1 2,3*	81,3 2,3	80,8 1,8*	83,0 1,9
n	20	20	20	20	20	20	20	20	20	20

^ - показники достовірно відрізняються від отриманих без попередньої інкубації з препаратами (р<0,05); * - показники достовірно відрізняються від тих, що отримані при інкубації з ФР (р<0,05)

У відношенні НСТ-тесту в групі донорів крові, за винятком відомого стандартного індуктора бактерицидності Staphylococcus aureus, найбільшу індукторну активність виявляв тимосомін. У ВІЛ-інфікованих тимосомін і ліпін індукували бактерицидність у повному обсязі. В групі людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, і ліпін, і тимосомін проявляли знижену індукторну активність, незважаючи на звичайну дію стафілококу, що може бути свідченням порушень якихось механізмів індукції бактерицидної активності у цієї групи хворих (табл. 5). Здатність тимосоміну індукувати бактерицидну активність тимосоміну, ймовірно, також пов'язана з його корпускулярною структурою.

Таблиця 5 Бактерицидна активність нейтрофілів (%) після інкубації з препаратами in vitro

Групи	Показники НСТ-тесту
	Спонтанний	Індукований
		St.aureus	Тималін 6 мкг/мл	Ліпін 0,175 мг/мл	Тимосомін
					6 мкг/мл	0,6 мкг/мл
Донори крові	23,53,2	39,94,1*	27,44,0	23,84,4	32,24,3*	29,04,0
n	24	24	24	19	24	22
ВІЛ-інфіковані	23,73,4	32,24,1*	24,83,9	34,05,0*	31,33,6*	31,94,6
n	25	25	24	16	25	20
Постраждалі від аварії на ЧАЕС	15,43,3	30,73,4*	11,72,7	8,51,7*	12,62,3	9,52,0*
n	20	20	19	20	20	20

* - показники достовірно відрізняються від тих, що отримані при інкубації з ФР (р<0,05)

Визначення впливу тимосоміну на продукцію ФНП показало, що лейкоцити периферичної крові донорів крові, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих спонтанно за першу добу продукували досить невелику кількість ФНП (1,10,6, 0,70,4, та 0,60,6 log₂ титру відповідно).Додавання ЛПС, який є стандартним індуктором ФНП, викликало достовірне (р<0,05) збільшення продукції цитокіну до 2,30,6 в групі донорів крові, 2,60,5 в групі постраждалих від аварії на ЧАЕС та 2,81,0 в групі ВІЛ-інфікованих. На другу добу інкубації кількість індукованого ЛПС ФНП у донорів крові та постраждалих від аварії на ЧАЕС зменшувалась (до 1,30,5 та 1,40,5 відповідно), що є природним відображенням зменшення продукції фактору через кілька годин після індукції. В той же час концентрація ФНП в групі ВІЛ-інфікованих продовжувала залишатися на високому, притаманному першій добі, рівні (2,01,0), що свідчить не тільки про відому високу спонтанну продукцію ФНП при цій патології [Хаитов Р.М. и др., 1995, Brazille P. et al., 2003], але й дозволяє припустити, що лейкоцити ВІЛ-інфікованих продукують цей цитокін у підвищеній кількості після індукції значно триваліше.

В групі донорів крові під впливом препаратів гормонів тимусу, як тималіну, так і тимосоміну, продукція ФНП достовірно (р<0,05) підвищується (до 2,20,6 та 1,90,4 відповідно). Тимосомін підвищує продукцію ФНП лейкоцитами постраждалих від аварії на ЧАЕС (до 2,30,6) (р<0,05). В групі ВІЛ-інфікованих вплив тимосоміну (6 мкг/мл) мав такі ж тенденції як і в інших обстежених нами групах. Збільшення синтезу ФНП відбувається в першу добу і є короткочасним.

При сумісному впливі тимосоміну та ЛПС на лейкоцити людей всіх досліджуваних груп спостерігається чітка тенденція до збільшення продукції ФНП до 3,10,6 в групі донорів крові, 4,00,6 в групі постраждалих від аварії на ЧАЕС та 4,21,0 в групі ВІЛ-інфікованих, що говорить про адитивний ефект препаратів.

Таким чином, виходячи з даних, визначених при дослідженні технологічних схем фракціонування водно-сольового екстракту тимусу, був отриманий розчинний препарат гормонів тимусу тимоіндуктин і розроблений ефективний, малоетапний та економічний метод отримання активного препарату гормонів тимусу в ліпосомній формі - тимосоміну. При вивченні імунобіологічної активності визначили, що тимосомін може реалізовувати свій вплив шляхом суттєвої зміни функціональної активності лімфоцитів, природних кілерів і нейтрофілів та індукувати при певних умовах продукцію ФНП. При цьому тимосомін проявляв як властивості, характерні для гормонів тимусу, так і нові здатності, зумовлені ліпосомною формою. Дія тимосоміну була модулюючою. Важливим фактором, що визначав направленість впливу тимосоміну, був вихідний стан клітин в групах донорів крові, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих. Тобто тимосомін мав не лише властивості, які притаманні тимічним гормонам, а також проявляв нові риси в механізмі дії, що аргументує необхідність подальшого вивчення імунобіології препарату і робить тимосомін перспективним у відношенні практичного використання.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведене теоретичне обгрунтування та експериментальні дані по вирішенню наукового завдання щодо дослідження умов створення ліпосомного препарату гормонів тимусу та вивчення його здатності індукувати синтез речовин з тимозинподібною дією in vivo та впливу на функціональну активність клітин імунної системи донорів крові, людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, та ВІЛ-інфікованих in vitro.

Активні в тесті відновлення Thy-1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей фракції тимічних гормонів можуть бути отримані при фракціонуванні водно-сольового екстракту тимусу за кількома схемами із залученням стандартних методичних підходів у різній послідовності та сполученні. Найбільш ефективним і простим виявився спосіб вилучення активних поліпептидів при високій концентрації ацетону практично без попередніх додаткових процедур. Найбільш активна і найменш гетерогенна фракція формується в діапазоні 70-85% обємного вмісту ацетону.

Вперше розроблена схема отримання активного препарату тимічних гормонів в ліпосомній формі - тимосоміну в результаті обробки тканини тимусу 70% ацетоном і наступного випаровування екстракту при 60⁰С. Середній діаметр ліпосом та їх концентрація в тимосоміні становлять відповідно 0,55 мкм та 1,5х10⁸ ліпосом/мл; вміст білка складає 1 мг/мл. Пептидний склад тимосоміну представлений недіалізабельними поліпептидами з молекулярною масою нижче 30 кД. Ліпідна складова тимосоміну містить холестерин, фосфатидилетаноламін, фосфатидилхолін, сфінгомієлін і лізофосфатидилхолін.

Тимосомін відновлює експресію Thy-1-антигену на спленоцитах тимектомованих мишей in vitro, індукує синтез речовин з тимозинподібною дією у нормальних і тимектомованих мишей in vivo, а також індукує синтез ФНП лейкоцитами донорів крові та постраждалих від аварії на ЧАЕС, що свідчить про належність тимосоміну до імунопрепаратів з індукторним механізмом дії.

Тимосомін суттєво збільшує рівень адгезивної активності лімфоцитів донорів крові та ВІЛ-інфікованих людей за рахунок стимуляції клітин з низьким рівнем Е-розеткоутворення. Препарат також стимулює Ем-розеткоутворення лімфоцитами постраждалих від аварії на ЧАЕС. Тимосомін достовірно підвищує знижену ФГА-індуковану проліферативну активність лімфоцитів ВІЛ-інфікованих, а також активує природну цитотоксичність лімфоцитів людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, та хворих на ВІЛ-інфекцію, що разом узяте свідчить про характерну для гормонів тимусу імуномоделюючу дію препарату.

Тимосомін зменшує показники поглинальної активності нейтрофілів донорів крові та постраждалих від аварії на ЧАЕС. Також тимосомін індукує бактерицидну активність в НСТ-тесті нейтрофілів донорів крові та ВІЛ-інфікованих пацієнтів. В такому ж напрямку діє і ліпін, що дозволяє припустити, що однією з головних причин зазначеного впливу тимосоміну на досліджувані реакції є його корпускулярна структура і конкурентний механізм.

Проведеними дослідженнями встановлено, що тимосомін є індуктором синтезу речовин з тимозинподібною активністю та ФНП і проявляє імуномодулюючу дію in vitro на об'єктах різного походження: Т-і В-лімфоцитах, природних кілерах і нейтрофілах донорів крові, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих людей в різних імунологічних реакціях: адгезивній та проліферативній активності лімфоцитів, природній цитотоксичності, поглинальній і бактерицидній активності нейтрофілів. У досліджуваних системах дія тимосоміну відрізняється від такої і розчинних тимічних препаратів, і від ліпіну, що свідчить про особливості механізму його дії.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М. Отримання ліпосомної форми препарату тимічних гормонів із ліпідів та поліпептидів тимусу // Імунологія та алергологія. - 2002. - “№2. - С.44.

2. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М. Пат. 55164 Україна, МПК 7 А61К 35/55, А61К 35/00. Спосіб отримання препарату тимоіндуктину Заявлено 11.07.2002; Опубл. 17.03.2003; Бюл. №3.

3. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М. Пат. 56613 Україна, МПК 7 А61К 35/55, А61К 35/00. Спосіб отримання препарату тимосоміну Заявлено 30.07.2002; Опубл. 15.05.2003; Бюл. №5.

4. Нікольський І.С., Галицька С.М. Отримання нового імунокоректора на основі ліпосомних структур з білкових компонентів та ліпідів тканини тимусу // Актуальні проблеми навчання та виховання людей з особливими потребами: Тези доповідей. - К., Університет “Україна”, 2003. - С.310-312.

5. Галицька С.М. Визначення впливу ліпосомного препарату гормонів тимусу тимосоміну на адгезивну активність Т-лімфоцитів // Імунологія та алергологія. - 2004. - №1. - С.62.

6. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М., Крімерман Г.М. Імунопрепарат на основі композиції ліпосомних структур із гормонів тимусу та загальних його ліпідів // Імунологія та алергологія. - 2005. - №2. - С.50-52.

7. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М., Тітомир А.І., Петренко Н.О. Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів // Імунологія та алергологія. - 2005. - №3. - С.125.

8. Галицька С.М., Кузьменко О.В. Визначення впливу ліпосомного препарату гормонів тимусу на синтез фактору некрозу пухлин лейкоцитами постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих людей // Імунологія та алергологія. - 2005. - №3. - С.77.

9. Нікольський І.С., Галицька С.М., Бариляк І.Р., Нікольська В.В., Кузьменко О.В., Кривохатська Л.Д., Пузанова Л.М., Тітомир А.І. Визначення впливу ліпосомного препарату гормонів тимусу на синтез фактору некрозу пухлин лейкоцитами постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованими // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: збірник наукових праць - Київ, Луганськ, Харків, 2005. - Вип. 6 (69). - С.170-179.

10. Галицька С.М. Створення ліпосомної форми препарату гормонів тимусу та визначення його активності // Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини: Мат. наук.-практ. конф. молодих вчених. - Харків, 2005. - С. 19.

11. Галицька С.М., Кузьменко О.В. Синтез фактору некрозу пухлин лейкоцитами людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих, під впливом ліпосомного препарату гормонів тимусу // Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини: Мат. наук.-практ. конф. молодих вчених. - Харків, 2005. - С. 20.

12. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М., Крімерман Г.М. Дослідження технологічних схем отримання препаратів гормонів тимусу // Імунологія та алергологія. - 2005. - №4. - С.9-13.

13. Нікольський І.С., Васильєв В.М., Нікольська В.В., Галицька С.М., Тарануха Л.І., Кузьменко О.В. Марущенко Ю.Л. Спосіб отримання ліпосомного препарату на основі гормонів тимусу та загальних його ліпідів // Інформаційний лист з проблеми “Проблеми радіаційної медицини”. - Київ, 2005. - Вип. 12. - 2 с.

14. Нікольський І.С., Галицька С.М., Нікольська В.В., Пузанова Л.М. Вивчення впливу ліпосомного препарату гормонів тимусу тимосоміну на функціональну активність нейтрофілів донорів крові та ВІЛ-інфікованих людей // Імунологія та алергологія. - 2006. - №1. - С. 10-13.

15. Нікольський І.С., Галицька С.М., Нікольська В.В. Ліпосомний препарат тимічних гормонів // Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє: Збірка тез. - Київ, 2006. - С.136.

АНОТАЦІЯ

Галицька С.М. Створення та експериментальне дослідження активності ліпосомної форми препарату тимічних гормонів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.09 - імунологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007.

Дисертація присвячена розробці методики отримання ліпосомної форми препарату на основі гормонів та загальних ліпідів тимусу і вивченню деяких особливостей механізму його дії.

Виходячи з даних, отриманих при дослідженні технологічних схем фракціонування водно-сольового екстракту тимусу і одержання розчинного препарату гормонів тимусу тимоіндуктину, розроблена методика створення препарату гормонів тимусу в ліпосомній формі - тимосоміну. За пептидним складом тимосомін близький до розчинного препарату тимоіндуктину і, загалом, містить речовини з молекулярною масою, що притаманні родині тимозинів. З ліпідів тимозин містить холестерин, фосфатидилетаноламін, фосфотидилхолін, сфінгомієлін та лізофосфатидилхолін.

Тимосомін має високу біологічну активність, яка проявляється здатністю індукувати Thy1-антиген на спленоцитах тимектомованих мишей in vitro та синтез речовин з тимозинподібною дією у нормальних та тимектомованих мишей. Отриманий препарат є імуномодулятором, який проявляє активність in vitro на об'єктах різного походження: лімфоцити і нейтрофіли донорів крові, постраждалих від аварії на ЧАЕС та ВІЛ-інфікованих, в різних імунологічних реакціях: адгезивній та проліферативній активності лімфоцитів, природній цитотоксичності, поглинальній і бактерицидній активності нейтрофілів та продукції фактора некрозу пухлин.

Отримані результати свідчать, що ліпосомний препарат гормонів тимусу тимосомін має не лише властивості, які притаманні тимічним гормонам, а проявляє також нові риси механізму дії, що свідчить про можливість використання ліпосомної форми для розширення можливостей імуномодулюючих препаратів і про перспективність подальшого їх дослідження.

Ключові слова: імуномодулятори, гормони тимусу, ліпосоми, імунна система.

АННОТАЦИЯ

Галицкая С.Н. Создание и экспериментальное исследование активности липосомной формы препарата тимусных гормонов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 - иммунология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007.

Диссертация посвящена разработке методики получения липосомной формы препарата на основе гормонов и липидов тимуса, а также изучению некоторых особенностей механизма его действия.

Изучены биохимические и иммунобиологические свойства фракций водно-солевого экстракта тимуса, полученных фракционированием исходного материала сульфатом аммония, органическими растворителями, диализом и нагреванием. Исследование фракций, полученных при фракционировании водно-солевого экстракта тимуса, показало, что осаждение биологически активных веществ тимуса ацетоном практически без каких-либо дополнительных процедур обеспечивает достаточно эффективное очищение от значительного количества балластных веществ. Разработана эффективная схема получения растворимого препарата гормонов тимуса - тимоиндуктина. Препарат обладает высокой иммунобиологической активностью, которая, выражается в его способности индуцировать синтез веществ с тимозиноподобной активностью (ВТПА).

С учетом данных, полученных при изучении различных схем фракционирования, разработана методика получения липосомного препарата гормонов тимуса методом обращения фаз. Препарат обозначен как тимосомин. По пептидному составу тимосомин близок к ранее полученному тимоиндуктину и, в целом, представлен веществами с молекулярной массой семейства тимозинов. Липиды в тимосомине представлены холестерином, фосфатидилэтаноламином, фосфотидилхолином, сфингомиелином и лизофосфатидилхолином. Тимосомин обладает высокой иммунобиологической активностью, которая проявляется способностью индуцировать ВТПА у нормальных и тимэктомированных мышей, а также проявляет иммуномодулирующее действие in vitro на объектах различного происхождения: лимфоцитах и нейтрофилах доноров крови, людей, пострадавших от аварии на ЧАЭС и ВИЧ-инфицированных.

Тимосомин повышет уровень адгезивной активности лимфоцитов за счет стимуляции, в основном, лимфоцитов с низкой изначальной активностью. Препарат также способен ингибировать пролиферативную активность лимфоцитов с высокой изначальной реакцией на ФГА. При инкубации с нейтрофилами тимосомин ингибирует поглощение Staphylococcus aureus, как можно предположить, посредством конкуренции из-за своей корпускулярной структуры, и стимулирует их бактерицидную активность.

В группе ВИЧ-ннфицированных тимосомин in vitro повышет сниженную адгезивную и пролиферативную активность лимфоцитов и природную цитотоксичность. На поглотительную активность нейтрофилов ВИЧ-инфицированных, в отличие то группы доноров крови, тимосомин практически не влияет, но стимулирует их бактерицидную активность.

Тимосомин in vitro повышает природную цитотоксичность лимфоцитов людей, пострадавших от аварии на ЧАЭС. В отличие от других обследованных, у пострадавших от аварии на ЧАЭС тимосомин проявляет сниженное индукторное влияние на бактерицидную активность, несмотря на обычное действие Staphylococcus aureus.

Тимосомин также индуцирует синтез ФНО лейкоцитами доноров крови и людей, пострадавших вследствие аварии на ЧАЭС. При совместном действии на лейкоциты тимосомина и ЛПС определялся аддитивный эффект.

Полученные результаты свидетельствуют, что липосомный препарат гормонов тимуса тимосомин проявляет не только свойства гормонов тимуса, но также имеет особенности механизма действия, которые придают ему новые качества. Эти данные говорят не только о возможности использования липосомной формы для расширения возможностей иммуномодулирующих препаратов, но и о перспективности в будущем практического использования тимосомина.

...