Методы изучения возбудимых клеток

Анализ электрических явлений, происходящих в тканях. Методы электрофизиологических исследований. Внутриклеточная регистрация трансмембранных потенциалов и электростимуляция клеточной мембраны. Разность концентраций ионов калия снаружи и внутри клетки.

Рубрика Биология и естествознание
Вид контрольная работа
Язык русский
Дата добавления 15.09.2014
Размер файла 447,5 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы изучения возбудимых клеток

Электрические явления, которые возникают в возбудимых тканях, обусловлены электрическими свойствами клеточных мембран. Поэтому необходимо остановиться на методических подходах современной физиологии возбудимых тканей, используемых при исследовании электрических характеристик клеточных мембран.

Любая физиологическая установка, предназначенная для изучения возбудимых клеток и тканей, должна содержать следующие основные элементы: 1) электроды для регистрации и стимуляции; 2) усилители биоэлектрических сигналов; 3) регистратор; 4) стимулятор; 5) систему для обработки физиологической информации. В зависимости от задач исследования обычно требуется дополнительное оборудование. Поскольку в современной медицине широко используются методы электрофизиологического исследования и воздействия электрическим током, необходимо кратко познакомиться с основными методическими приемами.

При работе на изолированных органах, тканях и отдельных клетках применяют специальные камеры и растворы определенного состава, например Рингера-Локка, Тироде, Хэнкса, позволяющие в течение длительного времени поддерживать нормальную жизнедеятельность биологического объекта. Во время эксперимента раствор должен быть насыщен кислородом и иметь соответствующую температуру (для хладнокровных животных +20°С, для теплокровных +37°С). В процессе эксперимента необходимо использовать проточные камеры для непрерывного обновления раствора, в котором находится биологический объект.

При электрофизиологических исследованиях используют различные типы электродов, детальное описание которых можно найти в соответствующих руководствах. В то же время есть определенные требования ко всем без исключения электродным системам.

Электроды, которые используют в эксперименте, должны оказывать минимальное влияние на объект исследования, т. е. они должны только передавать информацию от объекта или на объект.

Если в электрофизиологическом эксперименте исследуют собственно процесс возбуждения, то необходимо применять два электрода с различной величиной площади контактной поверхности (желательно в соотношении не менее 1:100), при этом электрод меньшей площади называют активным, или референтным, большей площади -- пассивным, или индифферентным. При исследовании процесса распространения возбуждения необходимо использовать два активиых электрода с одинаковой площадью контактных поверхностей, устанавливаемых на возбудимой ткани на некотором расстоянии друг от друга, и индифферентный электрод, который устанавливается в отдалении. В первом случае говорят о моно-(уни-) полярном способе отведения потенциала (раздражении), во втором -- о биполярном способе. Необходимо подчеркнуть, что термин «униполярный» способ весьма условен, поскольку всегда регистрируется разность потенциалов, а не абсолютное значение потенциала.

Поскольку работа с биологическим объектом подразумевает контакт электрода с жидкостью, содержащейся в биологическом объекте, высока вероятность возникновения контактных поляризационных потенциалов, которые могут существенно исказить результаты исследования. Чтобы избежать возможных искажений в электрофизиологических экспериментах, как правило, используют специальные слабополяризующиеся электроды, например хлорсеребряные или каломельные, имеющие незначительный поляризационный потенциал.

При исследовании электрофизиологических характеристик отдельных клеток используют стеклянные микроэлектроды. Они представляют собой микропипетку с диаметром кончика менее 0,5 мкм, заполненные ЗМ раствором хлорида калия.

В электрофизиологических экспериментах применяют самые различные усилители биологических сигналов, позволяющие измерять минимальные изменения тока (до 10 А) и напряжения (до 10 -7 В) В связи с тем что регистрируемые сигналы могут иметь высокую скорость нарастания переднего фронта, усилители должны иметь достаточно широкую полосу пропускания (сотни кГц). Наибольшие требования предъявляются ко входным каскадам усилителей, которые должны быть согласованы с внутренним сопротивлением измерительного электрода, причем наибольшие трудности экспериментатор встречает при использовании микроэлектродов для регистрации быстрых изменений тока или потенциала, поскольку микроэлектроды могут иметь очень высокое внутреннее сопротивление (до 150 мОм).

Стимуляторы, регистраторы, системы управления экспериментом и обработки физиологической информации еще более разнообразны и их описание можно найти в специальной литературе.

Рис. 1. Внутриклеточная регистрация трансмембранных потенциалов и электростимуляция клеточной мембраны: К -- схема установки для изучения электрических характеристик клеточных мембран; Б -- момент введения микроэлектрода а клетку. 1 -- стеклянный микроэлектрод для подачи тока; 2 -- стеклянный микроэлектрод для регистрации реакции клеточной мембраны; 3 -- электроды сравнения; 4 -- измеритель величины раздражающего тока; 5 -- усилитель; 6 -- регистратор.

На рис.1, А показана схема простейшей установки для измерения трансмембранной разности потенциалов и изучения реакций возбудимой мембраны при ее электрической стимуляции.

Исследуемый биообъект (клетка, кусочек ткани) помещен в камеру, содержащую солевой раствор и электрод сравнения. Если измерительный электрод также находится в растворе, то разность потенциалов между ним и электродом сравнения стремится к нулю. В момент проникновения микроэлектрода внутрь клетки регистрируют отрицательный потенциал относительно внешней среды (рис. 1, Б). Перемещение кончика микроэлектрода внутри клетки не приводит к изменению измеряемой разности потенциалов, если электрод не повредил клетку. У покоящейся клетки с нормальным метаболизмом и стабильными условиями внешней и внутренней среды постоянная разность потенциалов будет регистрироваться неопределенно долго. Эта постоянная разность потенциалов называется потенциалом покоя, или мембранным потенциалом покоя. При этом потенциал внеклеточной среды принимается равным нулю. Величина потенциала покоя неодинакова у различных типов клеток и колеблется обычно от -70 до -95 мВ.

В том случае, если в клетку введен второй, стимулирующий микроэлектрод, можно исследовать реакцию возбудимой мембраны на действие электрического тока. Если стимулирующий электрод электроотрицателен по отношению к внутренней среде клетки, то говорят о входящем токе, при этом общая трансмембранная разность потенциалов увеличивается, т. е. происходит гиперполяризация клеточной мембраны. Напротив, если стимулирующий электрод электроположителен по отношению к внутренней среде клетки, то говорят о выходящем токе, при этом общая трансмембранная разность потенциалов уменьшается, т. е. происходит деполяризация клеточной мембраны (рис. 2). Как правило, при действии гиперполяризующего тока потенциал мембраны изменяется в соответствии с законом Ома. При этом изменение потенциала не зависит от молекулярных процессов в мембране, поэтому говорят, что изменяются пассивные электрические свойства мембраны.

Б

Рис. 2. Реакция возбудимой мембраны на действие деполяризующего и гиперполяризующего токов: А -- реакция клеточной мембраны на гиперполяризуюший (I, 2) и деполяризующий (3, 4) ток; Б -- величина и направление гиперполяриэующего 1', 2') и деполяризующего (3', 4') стимулирующего тока.

При действии деполяризующего тока потенциал мембраны не подчиняется закону Ома, что связано с изменением функциональных характеристик ионных каналов клеточной мембраны. Если деполяризация клеточной мембраны достигает так называемого критического уровня, происходит активация ионных каналов клеточной мембраны и возникает потенциал действия. Критический потенциал (Eкp) -- уровень мембранного потенциала, при котором начинается генерация потенциала действия. Потенциал действия (ПД, спайк, импульс) -- быстрое колебание мембранного потенциала покоя в положительном направлении. В этом случае мембрана реагирует активно, поскольку изменение трансмембранной разности потенциалов обусловлено изменением функциональных свойств ионных каналов.

Детальный анализ процессов, протекающих в мембранах возбудимых клеток, был проведен Ходжкиным, Хаксли и Катцем в опытах на гигантском аксоне кальмара и привел к созданию современной теории происхождения потенциала покоя и потенциала действия.

Потенциал покоя

Схема опыта Ходжкина--Хаксли приведена на рис.3. В аксон кальмара диаметром около 1 мм, помещенный в морскую воду, вводили активный электрод, второй электрод (электрод сравнения) находился в морской воде.

клетка мембрана ион

Рис. 3. Опыт Ходжкина-Хаксли на гигантском аксоне кальмара. А -- стимуляция аксона электрическим стимулом прямоугольной формы; Б -- форма потенциала действия, зарегистрированная в данном опыте. 1 -- аксон; 2 -- активный электрод; 3 -- электрод сравнения; 4 -- усилитель. Стрелками показано направление распространения возбуждения.

В момент введения электрода внутрь аксона регистрировали скачок отрицательного потенциала, т. е. внутренняя среда аксона была заряжена отрицательно относительно внешней среды.

Считают синонимами такие понятия, как трансмембранная разность потенциалов в покое, потенциал покоя, мембранный потенциал. Обычно величина потенциала покоя колеблется от -70 до -95 мВ. Согласно концепции Ходжкина и Хаксли, величина потенциала покоя зависит от ряда факторов, в частности от селективной (избирательной) проницаемости клеточной мембраны для различных ионов; различной концентрации ионов цитоплазмы клетки и ионов окружающей среды (ионной асимметрии); работы механизмов активного транспорта ионов. Все эти факторы тесно связаны между собой и их разделение имеет определенную условность.

Известно, что в невозбужденном состоянии клеточная мембрана высокопроницаема для ионов калия и малопроницаема для ионов натрия. Это было показано в опытах с использованием изотопов натрия и калия: спустя некоторое время после введения внутрь аксона радиоактивного калия его обнаруживали во внешней среде. Таким образом, происходит пассивный (по градиенту концентраций) выход ионов калия из аксона. Добавление радиоактивного натрия во внешнюю среду приводило к незначительному повышению его концентрации внутри аксона. Пассивный вход натрия внутрь аксона несколько уменьшает величину потенциала покоя.

Установлено, что имеется разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки, причем внутри клетки ионов калия примерно в 20--50 раз больше, чем вне клетки (табл. 1).

Таблица 1. Концентрация ионов снаружи и внутри клетки, ммоль/л

Ионы

Аксон кальмара

Мышечное волокно (лягушка)

внутри клетки

снаружи клетки

внутри клетки

снаружи клетки

к+

397

20

124

2.2

Na+

50

437

4

109

Сl-

40

556

1.5

77

Разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки и высокая проницаемость клеточной мембраны для ионов калия обеспечивают диффузионный ток этих ионов из клетки наружу и накопление избытка положительных ионов К+ на наружной стороне клеточной мембраны, что противодействует дальнейшему выходу ионов К+ из клетки. Диффузионный ток ионов калия существует до тех пор, пока стремление их двигаться по концентрационному градиенту не уравновесится разностью потенциалов на мембране. Эта разность потенциалов называется калиевым равновесным потенциалом.

Равновесный потенциал (для соответствующего иона, Ек) -- разность потенциалов между внутренней средой клетки и внеклеточной жидкостью, при которой вход и выход иона уравновешен (химическая разность потенциалов равна электрической).

Важно подчеркнуть следующие два момента: 1) состояние равновесия наступает в результате диффузии лишь очень небольшого количества ионов (по сравнению с их общим содержанием); калиевый равновесный потенциал всегда больше (по абсолютному значению) реального потенциала покоя, поскольку мембрана в покое не является идеальным изолятором, в частности имеется небольшая утечка ионов Na+. Сопоставление теоретических расчетов с использованием уравнений постоянного поля Д. Голдмана, формулы Нернста показали хорошее совпадение с экспериментальными данными при изменении вне- и внутриклеточной концентрации К+ (рис. 4).

Трансмембранная диффузионная разность потенциалов рассчитывается по формуле Нернста:

Ek=(RT/ZF)ln(Ko/Ki)

где Ек -- равновесный потенциал, R -- газовая постоянная, Т -- абсолютная температура, Z -- валентность нона, F -- постоянная Фарадея, Ко и Ki -- концентрации ионов К+ вне и внутри клетки соответственно.

Рис. 4. Зависимость величины потенциала покоя от внеклеточной концентрации К+ (расчетная и экспериментальная кривые). По оси абсцисс - содержание калия во внешней среде в мМ, по оси ординат - величина мембранного потенциала в мВ.

В состоянии покоя клеточная мембрана высокопроницаема не только для ионов К+. У мышечных волокон мембрана высокопроницаема для ионов СГ. В клетках с высокой проницаемостью для ионов Сl-, как правило, оба иона (Сl- и К+) практически в одинаковой степени участвуют в создании потенциала покоя.

Известно, что в любой точке электролита количество анионов всегда соответствует количеству катионов (принцип электронейтральности), поэтому внутренняя среда клетки в любой точке электронейтральна. Действительно, в опытах Ходжкина, Хаксли и Катца перемещение электрода внутри аксона не выявило различие в трансмембранной разности потенциалов.

Поскольку мембраны живых клеток в той или иной степени проницаемы для всех ионов, совершенно очевидно, что без специальных механизмов невозможно поддерживать постоянную разность концентрации ионов (ионную асимметрию). В клеточных мембранах существуют специальные системы активного транспорта, работающие с затратой энергии и перемещающие ионы против градиента концентраций. Экспериментальным доказательством существования механизмов активного транспорта служат результаты опытов, в которых активность АТФазы подавляли различными способами, например сердечным гликозидом оуабаином. При этом происходило выравнивание концентраций ионов К+ вне и внутри клетки и мембранный потенциал уменьшался до нуля.

Важнейшим механизмом, поддерживающим низкую внутриклеточную концентрацию ионов Na+ и высокую концентрацию ионов К+, является натрий-калиевый насос (рис. 5). Известно, что в клеточной мембране имеется система переносчиков, каждый из которых связывается с 3 находящимися внутри клетки ионами Na+ и выводит их наружу. С наружной стороны переносчик связывается с 2 находящимися вне клетки ионами К+, которые переносятся в цитоплазму. Энергообеспечение работы систем переносчиков обеспечивается АТФ. Функционирование насоса по такой схеме приводит к следующим результатам.

1. Поддерживается высокая концентрация ионов К+ внутри клетки, что обеспечивает постоянство величины потенциала покоя. Вследствие того что за один цикл обмена ионов из клетки выводится на один положительный ион больше, чем вводится, активный транспорт играет роль в создании потенциала покоя. В этом случае говорят об электрогенном насосе. Однако величина вклада электрогенного насоса в общее значение потенциала покоя обычно невелика и составляет несколько милливольт.

2. Поддерживается низкая концентрация ионов натрия внутри клетки, что, с одной стороны, обеспечивает работу механизма генерации потенциала действия, с другой -- обеспечивает сохранение нормальных осмолярности и объема клетки.

3. Поддерживая стабильный концентрационный градиент Na+, натрий-калиевый насос способствует сопряженному транспорту аминокислот и сахаров через клеточную мембрану.

Таким образом, возникновение трансмембранной разности потенциалов (потенциала покоя) обусловлено высокой проводимостью клеточной мембраны в состоянии покоя для ионов К+ (для мышечных клеток и ионов Сl-), ионной асимметрией концентраций для ионов К+ (для мышечных клеток и для ионов Cl-), работой систем активного транспорта, которые создают и поддерживают ионную асимметрию.

Рис. 5. Участие натрий-калиевого насоса в генерации потенциала покоя. А -- внеклеточная среда; Б -- внутриклеточная среда.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • Изучение строения биологической мембраны, ионоселективного канала, видов электрических явлений в возбудимых тканях. Характеристика устройства синапса и механизма передачи возбуждения. Анализ возрастных особенностей развития центральной нервной системы.

    курсовая работа [61,7 K], добавлен 09.06.2011

  • Особенности строения и роста растительных клеток. Методы изучения растительной клетки. Электронная микроскопия, возможности светового микроскопа. Метод замораживания-скалывания. Дифференциальное центрифугирование, фракционирование. Метод культуры клеток.

    реферат [30,9 K], добавлен 04.06.2010

  • Виды возбудимых тканей и свойственные им формы возбуждения. Механизм поддержания электролитного гомеостаза клеткой. Строение и функции клеточной мембраны. Формирование потенциалов покоя и действия. Роль возбуждения в процессах дыхания и пищеварения.

    реферат [1,2 M], добавлен 08.12.2013

  • Регуляции биологических систем. Функции клеточной мембраны. Пассивный, активный трансмембранный транспорт. Изменение проницаемости ионов натрия и калия при развитии потенциала действия. Распространение возбуждения по немиелинизированному нервному волокну.

    презентация [3,2 M], добавлен 21.03.2014

  • Достижения в области изучения стволовых клеток. Виды стволовых клеток, особенности их функционирования. Эмбриональные и гемопоэтические стволовые клетки. Стволовые клетки взрослого организма. Биоэтика использования эмбриональных стволовых клеток.

    презентация [908,9 K], добавлен 22.12.2012

  • Исследование основных этапов развития клеточной теории. Анализ химического состава, строения, функций и эволюции клеток. История изучения клетки, открытие ядра, изобретение микроскопа. Характеристика форм клеток одноклеточных и многоклеточных организмов.

    презентация [1,4 M], добавлен 19.10.2013

  • Рассмотрение структуры бактериальной клетки, устройства и функций клеточной мембраны. Изучение основных методов дезинтеграции. Описание особенностей разрушения клеточной стенки при использовании физических, химических и химико-ферментативных методов.

    реферат [171,5 K], добавлен 17.01.2015

  • История изучения клетки. Открытие и основные положения клеточной теории. Основные положения теории Шванна-Шлейдена. Методы изучения клетки. Прокариоты и эукариоты, их сравнительная характеристика. Принцип компартментации и поверхность клетки.

    презентация [10,3 M], добавлен 10.09.2015

  • Основные факторы, влияющие на степень проводимости и проницаемости ионного канала, значение концентрации ионов калия в данном процессе. Метод определения потенциала, необходимого для уравновешивания эффекта реальной разницы концентраций ионов калия.

    реферат [46,7 K], добавлен 24.10.2009

  • Цитология как наука, изучающая строение, функции и эволюцию клеток. История изучения клетки, появление первых микроскопов. Открытие мастерской оптических приборов в России. История развития клеточной теории, ее основные положения в современной биологии.

    презентация [347,3 K], добавлен 23.03.2010

  • Развитие современной молекулярной биологии. Атомистическое истолкование основных явлений жизни. Электричество в клетке. Разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями мембраны. Возникновения деполяризации и последующего возбуждения.

    реферат [269,2 K], добавлен 11.03.2013

  • Методы изучения клетки, их зависимость от типа объектива микроскопа. Положения клеточной теории. Клетки животного и растительного происхождения. Фагоцитоз - поглощение клеткой из окружающей среды плотных частиц. Подходы к лечению наследственных болезней.

    презентация [881,2 K], добавлен 12.09.2014

  • Клеточная теория Шлейдена и Шванна. Состав вирусов. Методы изучения клетки. Строение и функции ее поверхностного аппарата, мембраны, надмембранного комплекса, хромопластов, лейкопластов, рибосом, органелл, ядра, ядерной оболочки, кариоплазмы, хромосом.

    презентация [3,6 M], добавлен 13.11.2014

  • Положения клеточной теории. Особенности электронной микроскопии. Детальная характеристика строения и функции клеток, их связи и отношения в органах и тканях у многоклеточных организмов. Гипотеза тяготения Роберта Гука. Сущность строения клетки эукариот.

    презентация [1,6 M], добавлен 22.04.2015

  • История развития клеточной теории, ее эволюция. Строение и функции оболочки клетки, характеристика оболочки, цитоплазмы, ядра. Роль плазматической мембраны и аппарата Гольджи в жизнедеятельности клеток. Рибосомы и митохондрии, их функции и состав.

    реферат [529,8 K], добавлен 16.08.2009

  • Возбудимые ткани и их свойства. Структура и функции биологических мембран, транспорт веществ через них. Электрические явления возбудимых тканей, их характер и обоснование. Рефрактерные периоды. Законы раздражения в возбудимых тканях, их применение.

    презентация [1,8 M], добавлен 05.03.2015

  • Структурная матрица мембраны. Углеводы клеточных мембран. Мембранные белки как переносчики ионов. Содержание ионов в интерстиции и цитозоле. Условия и причины существования потенциала покоя. Функциональная модель натриевого потенциалзависимого канала.

    реферат [31,1 K], добавлен 19.11.2008

  • Методы изучения клетки: микроспектромериз, цитофотометрия, флуоресцентная и ультрафиолетовая микроскопия. Способы деления клеток, их сходство и различия. Функции биологических мембран, диффузия (пассивная и облегченная) и активный транспорт молекул.

    контрольная работа [39,9 K], добавлен 01.06.2010

  • Элементарная генетическая и структурно-функциональная биологическая система. Клеточная теория. Типы клеточной организации. Особенности строения прокариотической клетки. Принципы организации эукариотической клетки. Наследственный аппарат клеток.

    контрольная работа [47,7 K], добавлен 22.12.2014

  • Биологическое значение, классификация, изучение и регуляция каталитической активности ферментов биологической мембраны, их отличия от растворимых ферментов. Методы реконструкции белка. Функции липидов и методы изучения их влияния на мембранные ферменты.

    курсовая работа [21,9 K], добавлен 13.04.2009

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.