Фізіолого-біохімічні механізми формування адаптивних реакцій рослин: роль активних форм кисню та іонів кальцію

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Пізнання механізмів стійкості рослин до несприятливих умов навколишнього середовища в останні десятиліття увійшло до числа найактуальніших проблем фітофізіології і загальної біології. Це зумовлено передусім глобальними кліматичними змінами і посиленням впливу на рослини чинників антропогенного походження (ксенобіотики, різні види випромінювання тощо) [Мокроносов, 2000]. Крім сільськогосподарського аспекту, проблема стійкості має велике природно-екологічне значення, адже здатність рослин адаптуватися до умов існування - один із факторів, що визначає ареали поширення видів на планеті і можливість їх інтродукції [Косаківська, 2003, Кордюм и др., 2003, Трунова, 2007].

Упродовж більшої частини 20 століття досліджувалася феноменологія загального адаптаційного синдрому і фізіологічних змін, що супроводжують пристосування рослин до конкретних несприятливих чинників. Було встановлено, що адаптаційний синдром є необхідним етапом формування пристосувальних реакцій, фактором збереження гомеостазу [Веселовский, 1993, Lichtanthaler, 1998, Таран, 2001]. На якісно новому рівні дослідження механізмів адаптації рослин почалися після з'ясування загальних принципів трансдукції стресових сигналів в їх клітинах, ідентифікації генів і кодованих ними специфічних білків, причетних до розвитку стійкості [Яворская, Драговоз, 1999, Тарчевский, 2002, Дмитриев, 2003, Kacperska, 2004, Bhattacharjee, 2005]. Разом з тим, гіпотези щодо сигнальної ролі окремих сполук (іонів), вміст і внутрішньоклітинна компартментація яких змінюється за умов стресу, потребували експериментального обґрунтування.

До ранніх реакцій організму на дію стресорів відносять посилення утворення активних форм кисню (АФК) і активацію пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ). В останні десятиліття досить активно досліджується роль АФК в стійкості рослин до дії патогенів. Проте майже не з'ясованим залишається фізіологічне значення зрушення тканинного балансу антиоксидантів та прооксидантів у бік останніх (окиснювальний стрес) за дії абіотичних стресорів. Так, одними авторами розглядається зв'язок між нагромадженням АФК, продуктів ПОЛ та ступенем пошкодження тканин рослин за дії екстремальних факторів [Scandalios, 2002]. Водночас іншими дослідниками висловлюється припущення про роль АФК і продуктів ПОЛ як медіаторів, необхідних для запуску захисних реакцій рослинного організму [Dat et al., 2000, Suzuki, Mittler, 2006], хоча дотепер практично відсутні прямі докази участі АФК в індукуванні стійкості рослин до абіотичних стресорів. Мало відомо про те, які саме захисні реакції, корисні для розвитку стійкості до несприятливих абіотичних чинників, індукуються за зміни окиснювально-відновного балансу.

Разом з цим останнім часом активно досліджується роль кальцію як вторинного месенджера, що бере участь у передачі сигналів в рослинних клітинах. Іони Са2+ прямо чи опосередковано задіяні у роботі більшості сигнальних систем рослинних клітин [Медведев, 2005, Kaur, Gupta, 2005]. Проте відомості щодо впливу екзогенного кальцію і внутрішньоклітинного його пулу на стійкість рослин залишаються вельми суперечливими. Так, є дані щодо підвищення іонами Са2+ чутливості рослинних клітин до абіотичних стресорів [Бияшева и др., 1993, Лукаткин и др., 1997], з другого боку, нагромаджено і досить чисельні відомості про зростання стійкості рослин до несприятливих чинників під впливом екзогенного кальцію [Gong et al., 1998, Nayyar, Kaushal, 2002]. Встановлене важливе значення кальцію для розвитку окиснювального стресу як складової реакції надчутливості за ураження рослин патогенами [Grant et al., 2000]. Водночас недостатньо доказів причетності іонів кальцію до регуляції процесу генерації АФК і окиснювально-відновного балансу (зокрема, активності про-/антиоксидантних ферментів) у рослинних тканинах за дії абіотичних стресорів, з іншого боку, неоднозначними залишаються і відомості стосовно впливу потенційних агентів окиснювального стресу на кальцієвий статус рослинних клітин [Sagi, Fluchr, 2006]. В цілому значення зв'язків Са2+ та АФК, як компонентів сигнальної мережі рослинних клітин, в адаптації рослин є маловивченим, особливо за дії абіотичних стресорів [Rentel, Knight, 2004].

У зв'язку з викладеним з використанням чинників різної природи досліджувалися характер і механізми змін окиснювально-відновного балансу при індукуванні стійкості рослин до абіотичних стресорів, а також значення генерації АФК рослинними тканинами і роль кальцієвого статусу у запуску конкретних адаптивних реакцій.

Мета і завдання дослідження. Основною метою роботи було з'ясування ролі АФК та іонів кальцію як взаємопов'язаних інтермедіатів єдиної системи передачі стресових сигналів у рослинних клітинах у формуванні стійкості рослин до дії абіотичних стресорів. Відповідно було поставлено такі завдання:

- з'ясувати особливості впливу екзогенних пероксиду водню, саліцилової кислоти (СК), абсцизової кислоти (АБК) та іонів Са2+ як можливих агентів окиснювального стресу на стійкість рослинних тканин до гіпертермії і дії NaCl;

- дослідити часову динаміку вмісту АФК і продуктів ПОЛ за індукування стійкості рослин природними агентами окиснювального стресу та гіпертермії та після дії засолення середовища;

- встановити можливість супресії антиоксидантами фізіологічних ефектів агентів окиснювального стресу;

- оцінити значення змін активності гваяколпероксидази, супероксиддисмутази (СОД) і каталази в регуляції окиснювально-відновного балансу в рослинних тканинах за дії екзогенних індукторів окиснювального стресу та пошкоджуючих чинників;

- виявити можливу роль кальцію як сигнального інтермедіата в реалізації фізіологічних ефектів саліцилату та Н2О2;

- дослідити особливості сумісної дії іонів кальцію та пероксиду водню на показники окиснювального метаболізму рослинних об'єктів за умов гіпертермії та їх теплостійкість;

- визначити можливість індукування нагромадження низькомолекулярних поліфункціональних протекторів (пролін, розчинні вуглеводи) агентами окиснювального стресу і довести наявність зв'язку цих ефектів зі змінами вмісту АФК в рослинних тканинах;

- вивчити вплив штучних антиоксидантів на теплостійкість, показники окиснювально-відновного балансу та порівняти їх ефекти з дією агентів окиснювального стресу, здатних підвищувати стійкість рослин до абіотичних стресорів.

1. Об'єкти досліджень

Основними об'єктами досліджень були відрізки колеоптилів та етіольовані проростки озимої м'якої пшениці (Triticum aestivum L.) сорту Донецька 48. Окремі експерименти проводили на сортах пшениці Донецька 46, Харківська 81, Харківська 96. Вибір етіольованих проростків або їх частин як об'єктів досліджень зумовлений складністю регуляції про-/антиоксидантної рівноваги в зелених частинах рослин. Водночас незелені органи рослин - корені та колеоптилі, а також інтактні етіольовані проростки - можуть бути чутливими моделями для створення експериментального окиснювального стресу [Минибаева и др., 1997]. Для попередження можливого розвитку явищ апоптозу в колеоптилях під час досліджень насіння пшениці пророщували 4 доби за температури 18-20°С, а експерименти з ізольованими колеоптилями закінчували на 6-7добу. При цьому в контрольних колеоптилях, що не зазнавали стресу, не спостерігалося змін, які б могли свідчити про початок апоптозних явищ (вміст білка і показники окиснювального метаболізму залишалися стабільними). Частину досліджень проводили також на етіольованих проростках ярого ячменю (Hordeum vulgare L. - сорт Козак) та ізольованих сім'ядолях огірка (Cucumis sativum L. - сорт Джерело).

Обробка рослинного матеріалу ефекторами. Як агенти окиснювального стресу використовували пероксид водню або сполуки, здатні посилювати генерацію АФК тканинами (СК, іони кальцію, АБК).

У дослідах з вивчення ефектів блокаторів кальцієвих каналів використовували блокатор потенціалзалежних кальцієвих каналів верапаміл, а також хлориди лантану та кобальту (LaCl3 i CoCl2), що блокують різні типи кальцієвих каналів [Дячок и др., 1997]. Крім того, досліджували ефекти антагоніста кальмодуліну хлорпромазину.

Для оцінки внеску білоксинтезуючої системи в реалізацію дії досліджуваних ефекторів використовували інгібітор синтезу білка на 80S рибосомах циклогексимід (ЦГ).

З метою з'ясування ролі АФК в реалізації ефектів екзогенних СК, кальцію і АБК на рослинні об'єкти використовували антиоксиданти іонол та глутатіон. Дослідження включали також оцінку впливу диметилсульфоксиду (ДМСО) на теплостійкість проростків і відокремлених колеоптилів пшениці та показники окиснювально-відновного балансу. В окремій серії експериментів вивчалася дія екзогенного цитокініну (кінетин) на теплостійкість сім'ядолей огірка та вміст в них пероксидів [Колупаєв та ін., 2006].

В експериментах з колеоптилями пшениці досліджувані речовини додавали в основне середовище їх інкубації (2%-ний розчин сахарози). Сім'ядолі огірка інкубували на дистильованій воді (контроль), у дослідні варіанти додавали відповідні ефектори. В інтактні проростки пшениці та ячменю досліджувані сполуки вводили шляхом інкубації кореневої системи у відповідних розчинах.

Дія стрес-факторів на досліджувані об'єкти. У роботі вивчали вплив жорстких (потенційно летальних) “доз” стрес-факторів [Мелехов, 1985] і оцінювали їх ефекти за рівнем виживання об'єктів досліджень.

Як основний абіотичний стресор використовували ушкоджуюче нагрівання. Нагрівання здійснювали, занурюючи досліджувані об'єкти (етіольовані проростки пшениці або ячменю, відрізки колеоптилів пшениці, сім'ядолі огірка) у ванну водного ультратермостату на 10 хв. Температуру прогріву вибирали на підставі результатів попередніх дослідів. Для колеоптилів пшениці в різних серіях дослідів вона становила 43-45С, для інтактних проростків пшениці та ячменю - 44,5-45,0С, для сім'ядолей огірка - 46-47С.

Досліджували також дію осмотичного і сольового стрес-факторів на рослинні об'єкти. Вплив зневоднення вивчали на прикладі колеоптилів пшениці, які занурювали на 3 год. у 25%-ний ПЕГ-4000. Ефекти засолення середовища досліджували на колеоптилях та інтактних проростках пшениці. Відрізки колеоптилів експонували 48 год. у вологій камері на фільтрувальному папері, зволоженому 2%-ним розчином сахарози з додаванням 0,4 М NaCl. У випадку з проростками пшениці їх кореневу систему занурювали в 4% (0,68 М) NaCl на 5 год., далі відмивали від солі і переносили зразки на воду.

Біохімічні аналізи. Для характеристики окиснювально-відновного балансу оцінювали генерацію рослинними об'єктами супероксидного радикала (за відновленням нітротетразолію синього) [Шоринг и др., 2000], вміст пероксидів в тканинах [Sagisaka, 1976] та кінцевих продуктів ПОЛ - тіобарбітурат-активних (ТБК-активних) сполук [Мерзляк и др., 1978].

Активність розчинної пероксидази та іоннозв'язаної пероксидази клітинних стінок (КФ 1.11.1.7) визначали за методом Ріджа і Осборна [Ridge, Osborne, 1970] з деякими модифікаціями [Колупаев и др., 2005], як відновник використовували гваякол. Активність СОД (КФ 1.15.1.1) визначали за методом, описаним Чеварі та співавт. [Чевари и др., 1985]. Активність каталази (КФ 1.11.1.6) визначали за кількістю розкладеного Н2О2 [Королюк и др., 1988].

Вміст білка в рослинному матеріалі визначали за [Bradford, 1976], проліну - за методом Бейтса [Bates, 1973], вміст відновних цукрів та суму розчинних вуглеводів - ферроціанідним методом [Арасимович, 1987].

Виживання рослинних об'єктів оцінювали візуально. Стан колеоптилів пшениці визначали через 48 год. після дії стресора. Ушкоджені колеоптилі набували специфічного відтінку і втрачали тургор [Мелехов и др., 1983]. Виживання проростків пшениці та ячменю оцінювали за їх здатністю до росту після дії несприятливого фактора. Оцінку проводили через 3-4 доби після дії стресора, при цьому 2-3 останні доби проростки інкубувалися на світлі (2 клк, фотоперіод 14 год.). Виживання сім'ядолей огірка визначали через 4 доби після ушкоджуючого нагрівання [Анев и др., 1987].

Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятими методами [Лакин, 1990]. Крім випадків, відзначених окремо, обговорюються результати, достовірні при Р ? 0,05.

2. Окиснювальний стрес і стійкість рослин до несприятливих абіотичних чинників

Одним із досить простих і водночас інформативних методичних підходів з'ясування ролі АФК в індукуванні стійкості рослин є штучна зміна окиснювально-відновного балансу в тканинах. З такою метою може бути використана як обробка рослинних об'єктів стабільними екзогенними АФК, наприклад, пероксидом водню, так і сполуками - індукторами утворення ендогенних АФК в рослинних тканинах. Ми досліджували вплив екзогенних пероксиду водню, СК і хлориду кальцію на тепло- і солестійкість ізольованих органів рослин (колеоптилі пшениці, сім'ядолі огірка) та інтактних проростків пшениці. В окремих експериментах вивчалася дія СК на теплостійкість проростків ячменю.

Передобробка колеоптилів 1 і 10 мМ розчином Н2О2 підвищувала їх виживання після ушкоджуючого нагрівання на 16-20%. Дія Н2О2 у 20 мМ концентрації виявляла ознаки токсичного ефекту (торцеві некрози), хоча й незначною мірою підвищувала їх виживання після нагрівання. Низькі концентрації пероксиду водню були неефективними, ймовірно, через швидке розщеплення Н2О2 позаклітинними формами антиоксидантних ферментів

Під впливом Н2О2 підвищувалася стійкість колеоптилів до дії тривалого сольового стресу. При цьому діапазон ефективних концентрацій пероксиду водню не відрізнявся від встановлених у дослідах з тепловим стресом і складав 1-10 мМ.

Підвищення стійкості рослин до абіотичних стресорів спостерігалося і за дії СК. У певному (відносно вузькому) концентраційному діапазоні вона підвищувала теплостійкість усіх досліджуваних об'єктів (табл. 1). Необхідно наголосити, що підвищені концентрації СК, які не виявляли токсичних ефектів, тобто не впливали на життєздатність рослинних об'єктів за фізіологічно нормальних умов, знижували їх теплостійкість. Такі ефекти спостерігалися за двогодинної дії на колеоптилі 250 мкМ СК, 24 год впливу на інтактні проростки пшениці 100 мкМ СК або добового впливу 100 мкМ саліцилату на сім'ядолі огірка. Як показали спеціальні експерименти з визначення вмісту продуктів ПОЛ, при цьому підвищені концентрації СК спричиняли надмірний (некерований) окиснювальний стрес у досліджуваних об'єктів (див. нижче).

Таблиця 1. Вплив саліцилової кислоти на виживання проростків та ізольованих органів різних видів рослин після потенційно летального нагрівання

Підвищення стійкості рослинних об'єктів викликав й екзогенний кальцій. 16-20-годинна інкубація колеоптилів пшениці на розчинах СаCl2 призводила до підвищення їх виживання після дії теплового і осмотичного стресів. Ефективними виявилися досить високі концентрації іонів кальцію - 5-50 мМ. Однак такі ефекти не пов'язані з осмотичною дією кальцію, адже обробка колеоптилів індиферентним (метаболічно неактивним) вуглеводом маннітом не призводила до підвищення їх стійкості [Колупаев и др., 2002]. Ідентичні результати отримані на інтактних проростках пшениці [Колупаев, Карпец, 2006].

З метою оцінки ролі АФК у формуванні адаптивних реакцій з'ясовували, чи супроводжувалося описане вище підвищення стійкості рослин до дії абіотичних стресорів під впливом екзогенних пероксиду водню, СК та хлориду кальцію, змінами показників про-/антиоксидантної рівноваги.

Обробка колеоптилів екзогенним пероксидом водню (1-10 мМ) призводила до збільшення вмісту пероксидів приблизно в 3 рази, але він був на 5 порядків нижчим від концентрації Н2О2 в інкубаційному середовищі і знаходився в межах фізіологічних концентрацій [Колупаєв, Карпець, 2007]. Під впливом 1 та 10 мМ Н2О2 вміст ТБК-активних продуктів зростав відповідно в 1,4-1,5 раза. Проте після ушкоджуючого нагрівання у зразках, оброблених перед стресом пероксидом водню, вміст пероксидів і ТБК-активних продуктів був значно меншим від контролю, в якому відзначалося зростання цих показників [Колупаєв, Карпець, 2007, Kolupaev, 2007].

СК в концентраціях, що підвищували теплостійкість рослинних об'єктів, як і екзогенний пероксид водню, викликала тимчасове зростання вмісту пероксидів в тканинах [Колупаев, Карпец, 2005, Колупаєв та ін., 2006]. Посилення генерації рослинами АФК, як правило, призводить до підвищення інтенсивності ПОЛ [Меньшикова, Зенков, 1993]. Такий ефект спостерігався нами і у разі обробки колеоптилів СК [Колупаєв, Акініна, 2005]. Ми порівняли вплив на інтенсивність ПОЛ СК в концентрації, що чинила захисний ефект (10 мкМ) і посилювала пошкодження (250 мкМ, див. табл. 1). Після двогодинної обробки 10 мкМ СК вміст ТБК-активних продуктів в тканинах зростав приблизно на 25%, дія 250 мкМ СК призводила до дворазового збільшення вмісту ТБК-активних продуктів. Тепловий стрес спричиняв додаткове підвищення вмісту продуктів ПОЛ у колеоптилях, оброблених СК, що спостерігалося через 1 год. після нагрівання. У разі обробки 10 мкМ СК це явище не пов'язане з пошкодженням колеоптилів, оскільки вже через 3 год. після теплового стресу (5 год. від початку експерименту) вміст ТБК-активних продуктів у зразках, оброблених СК, був набагато нижчим порівняно з контролем і меншим за передстресовий. Через 24 год. після нагрівання вміст продуктів ПОЛ дещо збільшувався як у контролі, так і у варіанті з 10 мкМ СК, водночас вміст ТБК-активних продуктів у дослідному варіанті був значно меншим від контролю. Зовсім іншою була динаміка ПОЛ в колеоптилях, оброблених 250 мкМ СК. Відбувалося незворотне підвищення інтенсивності ПОЛ після нагрівання, тобто мав місце розвиток некерованого окиснювального стресу. Вміст ТБК-активних продуктів досягав високих значень і не зменшувався в ході післястресової інкубації колеоптилів. Отже, захисний ефект (підвищення виживання колеоптилів після нагрівання) СК викликала лише в концентрації, яка спричинювала керований (оборотний) окиснювальний стрес. Висока концентрація СК, яка призводила до незворотного посилення ПОЛ, знижувала показники виживання колеоптилів.

Іони кальцію, які ми розглядаємо як потенційний агент окиснювального стресу, також призводили до підвищення вмісту АФК в рослинних тканинах. Так, інкубація колеоптилів на середовищі з СаСl2 спричинювала достовірне підвищення (на 35%) вмісту пероксидів. Іншою була картина після теплового стресу. Через 1 год. після ушкоджуючого нагрівання вміст пероксидів в колеоптилях контрольного варіанта достовірно не змінювався. Водночас у відрізках, оброблених іонами кальцію, цей показник зменшувався. Через 24 год. після стресового впливу в контролі виявлялася тенденція до збільшення вмісту пероксидів, у варіанті з СаСl2 відбувалося подальше зниження вмісту пероксидів. Схожа картина відзначалася і при визначенні генерації зразками супероксидного радикала [Колупаев, Карпец, 2005] та оцінці вмісту в них ТБК-активних продуктів [Колупаев и др., 2005]: “попередній” окиснювальний стрес, спричинений обробкою рослинних тканин екзогенним кальцієм, зменшував його прояви після наступного ушкоджуючого нагрівання колеоптилів або інтактних проростків пшениці.

Значення окиснювального сплеску, спричинюваного екзогенними пероксидом водню, СК та іонами кальцію в реалізації захисних ефектів було доведено в експериментах з усуванням нагромадження АФК антиоксидантами. Є відомості, що обробка рослин антиоксидантами може пригнічувати індукований СК синтез PR-білків, необхідний для формування стійкості рослин до патогенів [Wendehene et al., 1998]. Водночас такий методичний підхід за умов дії абіотичних стресорів не використовувався. У зв'язку з цим дію СК на теплостійкість колеоптилів та інтактних етіольованих проростків пшениці, а також сім'ядолей огірка досліджували у поєднанні з антиоксидантами - глутатіоном та іонолом. На прикладі колеоптилів та інтактних проростків пшениці вивчали також сумісну дію іонів кальцію та іонолу на теплостійкість та показники окиснювально-відновного балансу.

Інкубація проростків пшениці у розчині СК спричинювала посилення генерації ними супероксидного радикала. Необхідно зауважити, що через 4 год. від початку експерименту підвищувалася і генерація „зовнішнього” супероксиду контрольними проростками. Такий ефект може бути пов'язаний з перенесенням проростків на початку експерименту у свіжу дистильовану воду, що спричинювало механічний стресовий вплив на корені [Часов и др., 2005]. Надалі (через 24 год. інкубації) генерація супероксиду проростками як в контролі, так і у варіанті з СК зменшувалася. Проте і в цьому випадку виділення О2.- проростками, обробленими СК, приблизно на 30% перевищувало величину контролю. Іонол знижував генерацію супероксиду проростками і повністю знімав ефект СК.

Через 1 год. після нагрівання посилювалася генерація О2.- проростками усіх варіантів, при цьому відмінності між варіантами досліду нівелювалися. Через 24 год. після нагрівання утворення супероксиду зменшувалося, а вірогідної різниці між варіантами не було. Необхідно зауважити, що у проростках, які не нагрівали, генерація О2.- через добу після перенесення на дистильовану воду дещо зменшувалася у варіанті з СК і зростала у варіантах з іонолом та іонолом + СК.

Зміни сумарного вмісту пероксидів в коренях і пагонах корелювали зі змінами генерації супероксиду в період обробки проростків досліджуваними речовинами [Колупаєв, Карпець, 2007]. Отже, обробка проростків СК перед нагріванням спричиняла ефект окиснювального стресу, що усувався антиоксидантом іонолом.

В концентрації, яка посилювала генерацію АФК перед нагріванням, СК підвищувала теплостійкість проростків, про що свідчить збільшення відсотка їх виживання через 4 доби після теплового стресу. Захисний вплив на проростки за умов нагрівання чинила і обробка їх іонолом, хоча ефекти антиоксиданту були меншими порівняно з СК. Проте комбінована обробка проростків СК та іонолом призводила до повного нівелювання ефекту СК. Таким чином, антиоксидант, пригнічуючи генерацію АФК, індуковану обробкою СК, знімав водночас і позитивний вплив СК на теплостійкість проростків. Ідентичні результати ми отримали і на прикладі відокремлених колеоптилів пшениці та сім'ядолей огірка [Колупаев и др., 2004, 2006].

Подібну картину спостерігали при дослідженні дії екзогенного кальцію у поєднанні з іонолом на проростки пшениці: антиоксидант усував прояви окиснювального стресу, спричинюваного екзогенним кальцієм і водночас значно зменшував позитивний вплив обробки сіллю кальцію на виживання проростків після ушкоджуючого нагрівання [Колупаев, Карпец, 2006].

Отже, одержані результати свідчать про участь АФК в індукуванні стійкості рослин до абіотичних стресорів. Підвищення тепло- і солестійкості інтактних рослин та їх ізольованих органів вдавалося досягти, змінюючи про-/антиоксидантний статус різними способами - прямою обробкою АФК (екзогенним пероксидом водню) або дією екзогенних індукторів утворення АФК - СК, іонами кальцію, а також АБК [Колупаєв та ін., 2006]. Всі види таких обробок призводили до тимчасового підвищення вмісту пероксидів в рослинних тканинах та короткочасної активації процесів ПОЛ.

Зміна про-/антиоксидантної рівноваги, ймовірно, пов'язана з модуляцією активності ферментів, що беруть участь в генерації і руйнуванні АФК. Так, індукування окиснювального стресу СК включало в себе тимчасове зниження активності каталази, підвищення активності гваяколпероксидази (потенційний продуцент АФК, зокрема, супероксиду) і зростання активності СОД, яке може бути причиною нагромадження пероксиду водню [Колупаєв, Акініна, 2005, Колупаєв, 2007]. В посилення генерації АФК рослинними тканинами під впливом екзогенного кальцію певний внесок робить підвищення активності гваяколпероксидази, передусім її іоннозв'язаної форми [Колупаев и др., 2005].

Після тимчасового (оборотного) зрушення про-/антиоксидантної рівноваги у прооксидантний бік відбувалося підвищення стійкості рослинних тканин. При цьому рослинні об'єкти, попередньо „загартовані” (передадаптовані) обробкою названими індукторами окиснювального стресу, після потенційно летальних впливів високої температури або засолення краще зберігали про-/антиоксидантну рівновагу і мали менші пошкодження. Про пряму причетність АФК до індукування стійкості свідчить супресія антиоксидантами позитивних ефектів СК, АБК та іонів кальцію на стійкість рослинних тканин.

3. Роль кальцієвого статусу у розвитку окиснювального стресу та адаптивних реакцій рослинних клітин

Залежність впливу пероксиду водню та СК на теплостійкість рослинних клітин від їх кальцієвого статусу. Між вмістом іонів кальцію, їх розподілом в рослинних клітинах і тканинах, з одного боку, та утворенням і елімінацією АФК з іншого, існують досить складні і далеко не повністю з'ясовані зв'язки. Є відомості як про індукування генерації АФК за збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію, так і про здатність АФК спричиняти вихід Са2+ в цитозоль [Bolwer, Fluhr, 2000, Kaur, Gupta, 2005].

Виникає запитання, наскільки залежать ефекти індукторів окиснювального стресу, які використовувалися в наших експериментах - екзогенних пероксиду водню та СК - від кальцієвого статусу клітин? Для з'ясування цього питання проводили обробку рослинних тканин названими сполуками разом з модифікаторами кальцієвого статусу клітин - блокаторами кальцієвих каналів та антагоністом кальмодуліну.

В одній із серій експериментів оцінювали вплив екзогенного пероксиду водню в поєднанні з модифікаторами кальцієвого статусу - блокатором кальцієвих каналів LaCl3 та антагоністом кальмодуліну хлорпромазином - на стійкість колеоптилів пшениці до ушкоджуючого нагрівання. Як показали результати наших досліджень, блокатор кальцієвих каналів LaCl3 повністю, анатогоніст кальмодуліну хлорпромазин значною мірою знімали позитивний вплив пероксиду водню на теплостійкість колеоптилів пшениці [Kolupaev, 2007].

Ми досліджували також вплив блокаторів кальцієвих каналів (верапаміл, хлориди лантану і кобальту) та антагоніста кальмодуліну (хлорпромазин) на генерацію АФК, інтенсивність ПОЛ і активність ферментів, причетних до утворення АФК, в колеоптилях пшениці, які обробляли екзогенною СК. Всі антагоністи кальцію пригнічували прояви окиснювального стресу, спричинюваного дією СК. Так, у колеоптилях пшениці, оброблених СК у поєднанні з верапамілом або хлорпромазином, на відміну від зразків, оброблених лише СК, не відбувалося активації утворення О2.-. Водночас нагрівання колеоптилів викликало тенденцію до посилення генерації супероксидного радикала в усіх варіантах досліду за винятком варіанта з СК.

Верапаміл пригнічував спричинюване СК підвищення активності гваяколпероксидази в рослинних тканинах [Колупаев и др., 2004]. Гваяколпероксидаза розглядається як фермент, причетний до генерації АФК, зокрема, супероксидного радикала [Shannon, 1986]. Знімаючи прояви окиснювального стресу, індукованого обробкою колеоптилів пшениці екзогенною СК, модифікатори кальцієвого статусу водночас нівелювали і позитивний вплив СК на теплостійкість рослинних клітин. Обробка колеоптилів верапамілом у досліджуваних концентраціях сама по собі дещо зменшувала їх виживання після ушкоджуючого нагрівання. Хлорид лантану і хлорпромазин істотно не впливали на теплостійкість відрізків колеоптилів. Водночас обидва блокатори кальцієвих каналів (верапаміл і LaCl3), а також антагоніст кальмодуліну хлорпромазин повністю нівелювали підвищення теплостійкості колеоптилів, індуковане СК.

Отже, одержані результати свідчать про участь іонів кальцію і кальмодуліну у розвитку окиснювального спалаху, індукованого СК. Одним із шляхів впливу СК на про-/антиоксидантний статус клітин може бути безпосереднє інгібування каталази [Chen et al., 1993, 1997]. На прикладі колеоптилів пшениці нами показано, що концентрація СК 10 мкМ цілком достатня для інгібування каталази in vitro [Колупаєв та ін., 2006]. Інгібування каталази призводить до підвищення концентрації пероксиду водню. Транзиторне збільшення вмісту внутрішньоклітинного Са2+ під впливом нагромаджуваного пероксиду водню може бути важливою складовою окиснювального стресу. Інший шлях індукування саліцилатом окиснювального стресу і захисних реакцій, ймовірно, полягає в активації (посиленні синтезу) супероксид-генеруючих ферментів, таких як фенолпероксидази [Shannon, 1986] і НАДФН-оксидаза [Тарчевский, 2002]. Прикметно, що як пероксидаза [Кутузова, Угарова, 1981], так і НАДФН-оксидаза [Keller et al., 1998] мають Са2+-зв'язуючі ділянки. Підвищення активності НАДФН-оксидази і фенолпероксидаз може посилювати генерацію супероксиду. Останній, як відомо, під впливом СОД перетворюється на стабільну АФК - пероксид водню. Важливо, що екзогенна СК здатна підвищувати активність цього ферменту. Нами встановлено, що за обробки колеоптилів СК в них не лише тимчасово знижувалася активність каталази і підвищувалася активність пероксидази, а й мало місце істотне зростання активності СОД [Колупаєв, 2007]. На цьому тлі зростав вміст пероксидів в тканинах. Напевно, пероксиди, накопичувані в тканинах колеоптилів під дією СК, беруть безпосередню участь в процесі ПОЛ, адже СК викликала також тимчасове нагромадження продуктів ПОЛ.

Продукти ПОЛ і самі по собі АФК, зокрема, пероксид водню, після досягнення певних концентрацій здатні впливати на експресію різних генів, у т.ч. викликати активацію генів антиоксидантного захисту [Neill et al., 2002] та індукувати розвиток інших захисних реакцій.

Сумісний вплив іонів кальцію і пероксиду водню на окиснювальний метаболізм і теплостійкість рослинних клітин. Нами показана здатність іонів кальцію спричиняти ефект окиснювального стресу і ймовірна роль цього явища у запуску адаптивних реакцій рослин. Водночас в літературі є дані і про посилення теплового ушкодження клітин в суспензійній культурі Beta vulgaris при підвищенні концентрації іонів кальцію в середовищі, яке в таких експериментальних умовах спричиняло збільшення концентрації Са2+ в цитозолі [Бияшева и др., 1993]. Ймовірно, характер ефектів екзогенного Са2+ за дії стресорів на рослинні об'єкти може визначатися здатністю клітин контролювати кальцієвий гомеостаз, що, в свою чергу, певною мірою залежить від про-/антиоксидантного статусу. Так, є відомості про підвищення концентрації Са2+ в цитозолі рослинних клітин під впливом екзогенного Н2О2 [Logan, Knight, 2003]. Показано, що О2.? і Н2О2 можуть бути фізіологічними модуляторами транспорту Са2+ з внутрішньоклітинних компартментів [Rentel, Knigh, 2000]. Цілком можливо, що за певних обставин саме через порушення кальцієвого гомеостазу і надмірне надходження іонів Са2+ в цитозоль відбувається розвиток некерованого окиснювального стресу.

Водночас вплив екзогенного Са2+ у поєднанні з прооксидантами на стійкість рослинних об'єктів до абіотичних стресорів спеціально не досліджувався. Тому ми вивчали комбінований вплив іонів Са2+ і АФК (пероксиду водню) на теплостійкість колеоптилів пшениці та показники, що характеризують виникнення окиснювального стресу.

Передобробка колеоптилів як Са2+, так і Н2О2, а також їх комбінацією викликала підвищення вмісту ТБК-активних продуктів. Додавання блокатора кальцієвих каналів хлориду лантану в середовище інкубації колеоптилів спричиняло значне зниження нагромадження продуктів ПОЛ. Перенесення колеоптилів на середовище без добавок поступово нівелювало прояв ефектів в усіх варіантах, крім випадку з комбінованою обробкою Са2+ + Н2О2. У варіанті з одночасною обробкою колеоптилів Са2+, Н2О2 і La3+ мала місце тенденція до збільшення вмісту продукту ПОЛ, хоча він все одно залишався нижчим від контролю.

Нагрівання викликало підвищення вмісту ТБК-активних продуктів (в основному малоновий діальдегід - МДА) в контролі. У варіантах з обробкою колеоптилів окремо іонами Са2+ та пероксидом водню через 1 год. після нагрівання також відбувалося підвищення вмісту МДА, але через 24 год. після нагрівання в цих варіантах вміст продукту ПОЛ знижувався. Іншою була картина у разі комбінованої обробки колеоптилів Са2+ та Н2О2. У даному випадку найбільших значень вміст МДА досягав через 24 год. після нагрівання. Цей показник значно перевищував відповідні величини з окремою обробкою зразків тільки Са2+ або лише Н2О2. Додавання La3+ в суміш Са2+ та Н2О2 пригнічувало нагромадження МДА, яке мало місце через 1 год. після нагрівання, але через 24 год. подібний ефект був менш помітним.

Як уже зазначалося, обробка рослинних тканин окремо іонами кальцію та пероксидом водню підвищувала їх теплостійкість. Водночас обробка сумішшю Н2О2 та СаCl2, викликаючи незворотний окиснювальний стрес, знижувала показники виживання колеоптилів після їх нагрівання [Колупаєв, Карпець, 2007]. Розвиток окиснювального стресу, спричинений комбінованою обробкою Са2+ та Н2О2, гальмувався блокатором кальцієвих каналів La3+. Це може свідчити про причетність кальцію до розвитку пошкоджень клітин колеоптилів. Розвиток некерованого окиснювального стресу за обробки колеоптилів іонами кальцію та пероксидом водню, йомвірно, пов'язаний із синергічним посиленням їх ефектів. Н2О2 і продукти ПОЛ у присутності кальцію могли спричиняти надмірне його надходження в клітини шляхом відкриття кальцієвих каналів та посилення неспецифічного проникнення через мембрани (ефект пероксидів ліпідів як іонофорів). Надлишок кальцію в цитозолі міг бути причиною подальшої активації ферментів, що генерують утворення АФК. Таким чином, довготривале підвищення концентрації кальцію в цитозолі через надмірне посилення утворення АФК або іншим шляхом, очевидно, здатне посилювати пошкодження клітин.

4. Активація системи ферментативного антиоксидантного захисту індукторами окиснювального стресу

Для оцінки стану ферментативної антиоксидантної системи ми аналізували активність СОД і каталази. Вони є ключовими в системі антиоксидантного захисту, присутні в різних компартментах рослинних клітин [Scandalios, 2005]. Важливою особливістю даних ферментів є відсутність потреби в кофакторах, що зумовлює певну автономність їх роботи, незалежність від функціонування інших клітинних структур [Зенков и др., 2003], а отже, дозволяє однозначно інтерпретувати отримувані результати. Крім того, відомо, що СОД і каталаза працюють зазвичай як єдина система [Байляк и др., 2006].

У зв'язку з викладеним ми вважали за доцільне встановити можливість модифікації активності СОД і каталази прямою дією АФК (пероксид водню), а також іонами кальцію як ефекторами, що спричиняють окиснювальний стрес; дослідити, як позначиться передобробка рослинних об'єктів агентами окиснювального стресу на функціонуванні антиоксидантних ферментів за наступної дії потенційно летального теплового стресу; та, використовуючи антиоксиданти, встановити залежність індукції антиоксидантних ферментів від наявності АФК в тканинах.

Передобробка колеоптилів пшениці пероксидом водню підвищувала активність СОД, більш помітним це підвищення було після нагрівання [Колупаєв, Карпець, 2007].

Передобробка відрізків пероксидом водню підвищувала й активність каталази в них. Наступне їх перенесення на розчин сахарози без додавання Н2О2 призводило до поступового зниження активності ферменту практично до рівня контролю. Через 1 год. після нагрівання активність каталази істотно не змінювалася в усіх варіантах. А через 3 год. після дії температури 430С відбувалося незначне підвищення активності ферменту в контролі. У варіанті з обробкою Н2О2 (особливо 10 мМ) активність ферменту зростала і значно перевищувала відповідний контроль. До кінця спостережень (через 24 год. після нагрівання) активність ферменту в усіх варіантах трохи знижувалася, однак у колеоптилях, оброблених Н2О2, була вищою від контролю.

Можна припустити, що окиснювальний стрес, спричинюваний дією Н2О2, слугував сигналом для активації експресії генів антиоксидантних ферментів. Ефект індукування синтезу СОД і каталази екзогенним Н2О2 доведений прямими методами на прикладі дріжджів [Байляк и др., 2006]. Проте необхідно наголосити, що підвищення активності СОД в рослинах у відповідь на дію пероксиду водню не є типовим явищем. Так, відомо, що Cu/Zn-СОД - одна з поширених форм ферменту в евкаріот - інактивується Н2О2 in vitro [Alscher et al., 2002]. Але злакові можуть містити певний пул Mn-СОД [Dat et al., 2000], яка є стійкою до пероксиду водню [Alscher et al., 2002]. Крім того, ймовірно, пероксид водню, інгібуючи певні форми СОД in vitro, здатний активувати синтез ферменту in vivo.

Підвищення активності СОД і каталази відбувалося в колеоптилях та інтактних проростках пшениці і під впливом екзогенного кальцію, який також спричинював прояви ефектів окиснювального стресу [Колупаев и др., 2005, Колупаев, Карпец, 2006]. Прикметно, що викликане кальцієм підвищення активності каталази в коренях проростків пшениці майже повністю знімалося антиоксидантом іонолом, що можна вважати свідченням причетності АФК до індукування каталази. Важливо також, що у рослинних об'єктах, оброблених іонами кальцію перед нагріванням, зберігалася більш висока порівняно з контролем активність каталази. Характер змін активності антиоксидантних ферментів в рослинах, оброблених індукторами окиснювального стресу, узгоджується з даними щодо підвищення їх виживання після дії стресорів. Тобто агенти окиснювального стресу спричиняють ефект передадаптації, “готуючи” антиоксидантну систему до функціонування за умов дії ушкоджуючого стресора (в наших експериментах нагрівання, яке викликає загибель частини рослинних об'єктів).

Підвищення активності антиоксидантних ферментів спричиняли не лише агенти окиснювального стресу, а й речовини, які традиційно вважаються антиоксидантами, наприклад, ДМСО. Нами встановлено підвищення активності каталази в проростках пшениці під впливом ДМСО. Такий ефект мав місце лише в системі in vivo і не відтворювався in vitro при додаванні ДМСО до екстракту ферменту [Колупаєв, Карпець, 2007]. Питання активації антиоксидантних ферментів ДМСО потребує спеціального вивчення. Не виключено, що ця сполука на певних етапах виявляє малопомітний прооксидантний ефект або ж здатність індукувати антиоксидантні ферменти є його специфічною особливістю.

5. Окиснювальний стрес і нагромадження рослинами низькомолекулярних протекторних сполук

Адаптація рослин до стресорів включає в себе нагромадження різноманітних низькомолекулярних сполук, для яких властива поліфункціональність дії. До таких сполук належать, зокрема, пролін та розчинні вуглеводи. Ми порівнювали вплив СК, пероксиду водню й кальцію на нагромадження проліну в рослинних тканинах. Всі три агенти окиснювального стресу викликали підвищення вмісту проліну в рослинних тканинах [Колупаєв, Акініна, 2005, Колупаев и др., 2005].

СК спричинювала підвищення вмісту проліну в коренях проростків пшениці за участю АФК, адже антиоксидант іонол знімав ефект нагромадження проліну, спричинюваний СК. У пагонах виявлялася лише тенденція до незначного підвищення вмісту проліну під впливом СК. В інших дослідних варіантах вміст проліну не відрізнявся від контролю. Сольовий стрес викликав нагромадження проліну в коренях проростків усіх варіантів досліду. Проте найбільші абсолютні значення спостерігалися у варіанті з СК. У випадку з іонолом та комбінацією іонолу й СК вміст проліну в коренях не відрізнявся від відповідного (стресового) контролю. У пагонах після дії стресора вміст проліну незначною мірою знижувався в усіх варіантах досліду. Найбільші абсолютні значення при цьому залишалися у варіанті з СК, хоча різниця порівняно з контролем була недостовірною.

СК підвищувала вміст суми розчинних вуглеводів і відновних цукрів у коренях проростків (табл. 2). Іонол не впливав на загальний вміст цукрів у коренях, хоча й дещо підвищував вміст відновних цукрів як сам по собі, так і в комбінації з СК. Але цей ефект поступався дії однієї СК. Крім того, іонол знімав підвищення сумарного вмісту розчинних вуглеводів у коренях, спричинюване СК. У пагонах підвищення сумарного вмісту цукрів, а також вмісту відновних цукрів під впливом СК було менш істотним, ніж у коренях, хоча й достовірним (табл. 2). Іонол, а також комбінація СК та іонолу не впливали на вміст розчинних вуглеводів у пагонах за відсутності дії стресового чинника.

Після сольового стресу загальний вміст розчинних вуглеводів у коренях зростав в усіх варіантах, вміст відновних цукрів підвищувався лише в контролі. При цьому найбільші абсолютні значення сумарного вмісту розчинних вуглеводів і вмісту відновних цукрів спостерігалися у варіанті з СК. У пагонах після сольового стресу загальний вміст цукрів в контролі знижувався, а у варіантах з СК, іонолом та їх комбінацією істотно не змінювався. Вміст відновних цукрів у пагонах після дії сольового стресу у контролі істотно не змінювався, але зростав в усіх дослідних варіантах (див. табл. 2). Особливо помітним було це зростання у варіанті з СК.

Таблиця 2. Розчинні вуглеводи (мг/г сухої речовини) в коренях і пагонах проростків пшениці

Отже, обробка проростків пшениці СК призводила до нагромадження проліну та розчинних вуглеводів у коренях і (меншою мірою) у пагонах. Такі ефекти СК пригнічувалися антиоксидантом іонолом. При цьому антиоксидант практично повністю знімав захисний ефект СК за сольового стресу. З отриманих результатів випливає, що індуковане СК нагромадження проліну і цукрів в коренях і пагонах належить до реакцій, причетних до підвищення солестійкості проростків пшениці. Індуковане саліцилатом нагромадження протекторних речовин, ймовірно, відбувається за участю АФК. Важливо, що антиоксидант також знімав ефект нагромадження проліну в колеоптилях пшениці, спричинюваний екзогенним кальцієм [Колупаев и др., 2007].

6. Узагальнення результатів досліджень

Обробка рослинних об'єктів АФК або індукторами їх утворення спричинювала оборотні (тимчасові) прояви окиснювального стресу, що призводило до активації захисних реакцій - нагромадження низькомолекулярних протекторів та підвищення активності антиоксидантних ферментів. Рослини, передадаптовані дією АФК або агентів їх утворення, мали істотно вищу стійкість до абіотичних стресорів. Обробка рослинних об'єктів антиоксидантами сама по собі і при застосуванні в комбінації з агентами окиснювального стресу призводила до зменшення вмісту в тканинах АФК та продуктів ПОЛ. Водночас антиоксиданти нівелювали спричинюване агентами окиснювального стресу зростання вмісту низькомолекулярних протекторів; менш помітними були зміни активності антиоксидантних ферментів. Необхідно наголосити, що самі по собі антиоксиданти (принаймні у дозах, які нами використовувалися) призводили до деякого підвищення стійкості рослин. Такий ефект напевно пов'язаний з прямою антиоксидантною дією, яка реалізується за наявності пулу антиоксиданту в тканинах. Комбінована дія антиоксидантів (іонол, глутатіон) з індукторами окиснювального стресу призводила до нівелювання позитивного впливу останніх на стійкість рослин [Колупаев и др., 2004, Колупаєв, Карпець, 2006, 2007], що можна розглядати як свідчення участі АФК в індукуванні захисних реакцій.

Вплив блокаторів кальцієвих каналів та їх комбінації з агентами окиснювального стресу був значною мірою подібним до дії антиоксидантів, що свідчить про участь цитозольного кальцію в активації утворення АФК і процесів ПОЛ. Як показали наші дослідження, підвищення теплостійкості рослин, спричинюване пероксидом водню, СК та іонами кальцію, усувалося блокаторами Са2+-каналів [Колупаев и др., 2002, 2004, Колупаєв, Акініна, 2005]. Більше того, блокатори кальцієвих каналів і антагоніст кальмодуліну хлорпромазин нівелювали ефект окиснювального стресу, який викликала обробка рослинного матеріалу СК. Таким чином, для істотного посилення утворення АФК необхідні підвищення внутрішньоклітинного вмісту кальцію та наявність кальмодуліну в активній формі [Колупаєв, Карпець, 2006]. Блокатор різних типів кальцієвих каналів хлорид лантану пригнічував процес ПОЛ в колеоптилях пшениці, активований екзогенними пероксидом водню, СК і кальцієм, і при цьому зменшував їх захисний вплив на рослинні об'єкти, що зазнавали нагрівання [Колупаєв та ін., 2005, Kolupaev, 2007].

На підставі отриманих експериментальних даних та літературних відомостей нами складено гіпотетичну схему індукування адаптивних реакцій рослин.

Як уже зазначалося, процеси, що забезпечують підвищення стійкості рослинних об'єктів до дії стресорів, можуть бути активовані як екзогенним кальцієм, так і АФК (Н2О2 або сполуками, що спричиняють його нагромадження в тканинах, наприклад, в наших експериментах СК або АБК). При цьому ефекти зміни кальцієвого статусу і про-/антиоксидантної рівноваги є взаємозалежними. Так, екзогенний Са2+ активує гваяколпероксидазу (її іоннозв'язана форма причетна до утворення АФК) [Колупаев и др., 2005] і, ймовірно, НАДФН-оксидазу [Keller et al., 1998], що призводить до збільшення вмісту АФК в тканинах. Це, в свою чергу, напевно викликає підвищення вмісту цитозольного кальцію, адже відомо, що АФК сприяють відкриттю потенціалзалежних кальцієвих каналів [Mori, Schroeder, 2004]. Зміна кальцієвого статусу клітин здатна спричинити додаткову активацію АФК-генеруючих ферментів, а, отже, посилювати первинний вплив кальцію на нагромадження АФК.

Зовнішній пероксид водню або агенти його утворення також, ймовірно, здатні сприяти надходженню кальцію в клітини, адже більшість ефектів індукторів окиснювального стресу в наших експериментах інгібувалася блокаторами кальцієвих каналів [Kolupaev, 2007]. Підвищення концентрації цитозольного Са2+, яке може бути викликане як дією екзогенних АФК, так і самого кальцію, призводить до посилення пероксидації ліпідів [Колупаев и др., 2005, Колупаєв та ін., 2005], що, ймовірно, пов'язано з його впливом на активність фосфоліпази А2 та ліпоксигенази [Leshem, 1987]. АФК, кальцій і продукти ПОЛ через низку посередників, очевидно, викликають зміни активності ряду протеїнкіназ і протеїнфосфатаз [Kaur, Gupta, 2005], що, в свою чергу, спричиняє зміни стану факторів регуляції транскрипції і зміни в експресії генів. Фосфорилювання протеїнкіназ може бути індуковане і безпосередньою дією АФК [Scandalios, 2005]. Показано також, що транскрипт-фактори деяких стресових білків можуть модифікуватися прямою дією Н2О2 [Miller, Mittler, 2006]. Нами доведена участь як АФК, так і кальцію в індукуванні антиоксидантних ферментів - СОД [Колупаев и др, 2005, Колупаєв, Карпець, 2007] і каталази, а також нагромадження проліну та розчинних вуглеводів [Колупаев и др., 2005, Колупаєв та ін., 2007]. Необхідно наголосити, що підвищення стійкості рослинних об'єктів за дії екзогенної СК (агент окиснювального стресу) також відбувалося за обов'язковою участю як АФК, так і кальцію (див. рис. 5-8). Можна припустити, що спектр реакцій, індукованих АФК та іонами кальцію і важливих для розвитку стійкості значно ширший від запропонованого нами сценарію розвитку подій. Розширення спектра конкретних реакцій, індукованих зміною окиснювально-відновного балансу і кальцієвого статусу рослинних клітин, і важливих для стійкості до абіотичних стресорів може бути напрямом подальших досліджень.

Таким чином, є підстави стверджувати, що процес індукування стійкості до абіотичних стресорів відбувається лише за умови взаємопов'язаного зростання вмісту АФК в тканинах і проникнення іонів Са2+ в цитозоль. Отже, АФК і кальцій можна вважати взаємозалежними месенджерами єдиної мережі передачі стресових сигналів в рослинних клітинах. На різних етапах її функціонування можливе взаємне підсилення дії цих месенджерів.

Результати проведених досліджень можуть стати основою для розробки нових підходів захисту рослин від окиснювальних ушкоджень. В контексті експериментально доведеної нами можливості індукування антиоксидантної системи рослин за допомогою екзогенних агентів окиснювального стресу набуває актуальності пошук прийомів, які б дозволили підвищувати активність власної системи захисту рослин від надлишку АФК. За таких обставин з'являється можливість індукування не лише антиоксидантної системи як такої, а й цілої низки інших “корисних” реакцій, здатних зробити рослини “компетентними” для адекватного реагування на стресори різної природи. При цьому для скринінгу перспективних протекторних препаратів як інформативні критерії можуть використовуватися динамічні зміни комплексу показників про-антиоксидантної рівноваги після обробки рослин досліджуваними сполуками і наступної дії стресорів.

Висновки

абсцизовий окиснювальний інтермедіат фізіологічний

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення важливої наукової проблеми в галузі фізіології стійкості рослин. Сформульовано положення, відповідно до якого керований окиснювальний стрес може виступати індуктором адаптивних реакцій рослинного організму, що призводять до підвищення стійкості до абіотичних стресорів, а не чинником пошкодження. Досліджені механізми виникнення в рослинних об'єктах ефекту окиснювального стресу за дії екзогенних АФК, СК та іонів кальцію. Запропоновано й експериментально обгрунтовано гіпотетичний механізм зв'язків між АФК та іонами кальцію як інтермедіатами запуску стресових і адаптивних реакцій рослин. Згідно з ним індукування стійкості відбувається за умови взаємозалежного зростання вмісту АФК і проникнення іонів кальцію в цитозоль. Визначені конкретні реакції, фізіологічно важливі для стійкості рослин до абіотичних стресорів, що розвиваються внаслідок керованого окиснювального стресу. До таких реакцій належать, зокрема, активація ферментативної антиоксидантної системи та нагромадження низькомолекулярних сполук-протекторів поліфункціональної дії.

1. Передадаптація рослин екзогенними чинниками (сигнальні сполуки та АБК) призводить до АФК- і кальційзалежної стимуляції комплексу реакцій, в результаті яких формується здатність рослин до адекватної відповіді на дію ушкоджуючих чинників (біохімічної і фізіологічної адаптації).