Соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання багаторічних садових культур

Размещено на http://allbest.ru

Українська Академія Аграрних наук

Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

03.00.20 - біотехнологія

Соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання багаторічних садових культур

Виконала Митрофанова Ірина В'ячеславівна

Ялта - 2007

АНОТАЦІЯ

Митрофанова І.В. Соматичний ембріогенез та органогенез як основа біотехнології отримання багаторічних садових культур. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за фахом 03.00.20 - біотехнологія. - Нікітський ботанічний сад - Національній науковий центр УААН, Ялта, 2007.

Дисертаційну роботу присвячено розробленню ефективних біотехнологічних систем одержання та збереження декоративних, субтропічних і кісточкових плодових, ефіроолійних рослин на основі вивчення особливостей соматичного ембріогенезу та органогенезу цих культур в умовах in vitro.

Досліджено процеси соматичного ембріогенезу у ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного паралельно з пошуком комплексу оптимальних факторів, що регулюють утворення незиготичних зародків і виявленням закономірностей розвитку ембріоїдів. Підтверджено висунуту нами гіпотезу про важливість ролі “індуктора” у соматичному ембріогенезі ломиноса. В результаті вивчення молекулярно-генетичної гетерогенності рослин ломиноса нами встановлені особливості мінливості геному при різних способах регенерації in vitro. Вперше розроблено високоефективні біотехнологічні системи одержання рослин ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез та органогенез, де в якості компетентних експлантів було використано вегетативні бруньки та листя.

Проведено порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин ківі, зизифуса, хурми та фейхоа і показано високу регенераційну здатність листкових експлантів до адвентивного пагоноутворення. Запропоновано комплекс умов для регенерації рослин м'яти котячої та гісопу з листкових дисків. Уперше створено реципієнтні системи in vitro для зизифуса, хурми, фейхоа, ківі, м'яти котячої та гісопу.

Вперше визначено оптимальні експланти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах in vitro. Встановлено найважливіші фактори, що впливають на тривалість збереження в умовах in vitro експлантів досліджуваних рослин. Розроблено спосіб мінімізації росту рослин в умовах in vitro і на його основі створено генобанк цінних видів і сортів декоративних, кісточкових і субтропічних плодових культур у вигляді повільно зростаючих колекцій.

ембріогенез морфогенетичний культивування рослина

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біотехнологічні підходи, засновані на культивуванні органів і тканин багаторічних садових рослин поза організмом, на штучних живильних середовищах у регульованих асептичних умовах, відкривають принципово нові можливості для фундаментальних і прикладних досліджень. Рослинні системи in vitro є зручними моделями для дослідження складних механізмів, що лежать в основі проліферації, клітинної диференціації, гістогенезу, органогенезу, соматичного ембріогенезу та регенерації цілого організму з клітин, що культивую. У прикладному аспекті на основі знань про біологію клітини in vitro розробляються меристемні технології, ембріокультура, гаплоїдні технології, клітинна селекція, генна та клітинна інженерія (Здруйковская-Рихтер, 2003; Ігнатова, 2001; Мельничук та ін., 2003; Jain, Ishii, 2003). Теоретичну основу абсолютно всієї методології культури клітин, органів і тканин, у тому числі клонального мікророзмноження, становить морфогенез in vitro. Незважаючи на наявні експериментальні роботи в галузі вивчення процесів морфогенезу і регенерації рослин в умовах in vitro, досі залишаються не розробленими системи отримання та збереження рослин in vitro для більшості багаторічних садових культур. Це обумовлено відсутністю чітких, добре відтворюваних методик, їх трудомісткістю, а також нестачею знань про морфогенетичні потенції органів і тканин цих культур та способи управління морфогенезом.

Колекційний генофонд Нікітського ботанічного саду - Національного наукового центру містить у собі різноманітні види та сорти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових, ефіроолійних рослин, що мають як естетичне, так і господарське значення. Разом з цим, складнощі, що виникають при традиційному розмноженні, у процесі селекції і збереження багаторічних садових культур, спонукають науковців звертатися до сучасних методів біотехнології рослин.

Отже, спрямовані на глибоке вивчення процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу дослідження є вельми актуальними, бо не тільки дозволяють поповнити знання про морфогенез рослин у цілому, зробити істотний внесок у розробку його теоретичних основ, але й розробити біотехнологічну методологію розмноження та збереження цінних видів і сортів декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур та ефіроолійних рослин.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - виявити закономірності процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу декоративних, субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних культур і на їх основі розробити системи розмноження та збереження in vitro досліджуваних видів і сортів.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити такі завдачі:

1. Встановити морфогенетичні потенції органів і тканин ломиноса і розробити систему прямого і непрямого соматичного ембріогенезу.

2. Виявити особливості регенерації рослин каладіума і показати можливі шляхи морфогенезу in vitro цієї культури.

3. Визначити оптимальні умови культивування експлантів фікуса ліровидного, що індукують процес соматичного ембріогенезу.

4. Установити закономірності регенерації рослин субтропічних плодових культур (зизифус, ківі, фейхоа, хурма) в умовах in vitro.

5. Дослідити особливості прямої регенерації рослин in vitro з листкових дисків ефіроолійних рослин (м'ята котяча, гісоп).

6. На основі встановленого регенераційного потенціалу експлантів декоративних (ломиніс, троянда, орхідея, юка), субтропічних (ківі, фейхоа) і кісточкових плодових (алича, персик, слива) культур розробити систему in vitro для тривалого збереження рослин при низьких позитивних температурах.

7. Провести порівняльний аналіз особливостей морфогенезу in vitro культур, які вивчалися і виявити закономірності та шляхи регенерації рослин.

Об'єкт дослідження. Процеси соматичного ембріогенезу та органогенезу in vitro.

Предмет дослідження. Шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу різних експлантів досліджуваних культур, особливості одержання та депонування рослин в умовах іn vіtro.

Методи дослідження. Методи культури органів і тканин, молекулярно-біологічний метод (полімеразно-ланцюгова реакція, ПЛР), гістологічні методи, метод світлової та флуоресцентної мікроскопії, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі проведеного глибокого дослідження процесів прямого і непрямого соматичного ембріогенезу in vitro ломиноса, каладіума, фікуса ліровидного встановлено морфогенетичні потенції їх органів і тканин та закономірності індукції формування і розвитку ембріоїдів. Виявлено основні фактори, що впливають на частоту соматичного ембріогенезу рослин і обумовлюють реалізацію морфогенетичних потенцій in vitro у досліджуваних культур (індуктор, генотип, тип експланта, концентрація цитокініну, температура та інтенсивність освітлення). Доведено висунуту гіпотезу про провідну роль індуктора (соматичний зародок або група соматичних зародків) у процесі соматичного ембріогенезу ломиноса. Показано можливість формування 7 морфологічних типів соматичних зародків ломиноса, з яких тільки 4 здатні до формування повноцінних рослин. Вперше в результаті вивчення молекулярно-генетичної гетерогенності рослин ломиноса, одержаних при різних способах регенерації in vitro, встановлено особливості мінливості геному. Визначено, що збільшення кількості пасажів підвищувало частоту вторинного соматичного ембріогенезу ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного. Вперше показано різні шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу вегетативних бруньок ломиноса та висічок листка каладіума і фікуса ліровидного.

Вперше установлено високу регенераційну здатність листкових експлантів ряду субтропічних плодових культур до адвентивного пагоноутворення, а сім'ядолей - до соматичного ембріогенезу і прямої регенерації мікропагонів.

Показано вплив розташування експланта на живильному середовищі, концентрації фітогормонів, інтенсивності освітлення і температури на процес прямої регенерації рослин м'яти котячої та гісопу. Доведено позитивний ефект оптимальної концентрації тідіазурону на процес прямої регенерації мікропагонів ефіроолійних культур.

Створено реципієнтні системи in vitro ківі, зизифуса, фейхоа, хурми, м'яти котячої та гісопу на основі прямої регенерації цих рослин з листкових експлантів, що свідчить про високу тотипотентність клітини.

Вперше розроблено основні принципи депонування in vitro декоративних, субтропічних і кісточкових плодових рослин. Основним підходом до збереження колекцій цінних генотипів є мінімізація росту експлантів і запобігання їх старінню за рахунок комплексного використання кількох ефекторів, таких як температура, інтенсивність освітлення, склад живильного середовища, концентрації осмотика та ретарданту.

Практичне значення одержаних результатів. Уперше розроблено спосіб прямого соматичного ембріогенезу ломиноса, що дав змогу масово розмножити генетично однорідний посадковий матеріал. Підібрано склад живильних середовищ для прямого і непрямого соматичного ембріогенезу ломиноса. Розроблено способи соматичного ембріогенезу та органогенезу каладіума. В результаті непрямого соматичного ембріогенезу і регенерації мікропагонів з калюсу листків каладіума отримано нові форми, що відрізняються розміром і забарвленням листкової пластинки. Вдосконалено метод мікророзмноження фікуса ліровидного за рахунок розробки способу прямого соматичного ембріогенезу з листка.

На основі вивчення впливу гормональних, трофічних і фізичних факторів культивування на органи і тканини цінних субтропічних культур, таких як зизифус, ківі, хурма та фейхоа розроблено способи регенерації рослин in vitro з листкових дисків і подано реципієнтну систему для подальших маніпуляцій, що підвищують ефективність створення нових форм і сортів. Уперше розроблено і запатентовано в Україні спосіб прямої регенерації мікропагонів з листкових експлантів ківі. Форми хурми, одержані внаслідок прямої регенерації мікропагонів із сім'ядолей незрілих зиготичних зародків, вирощуються в дослідному господарстві “Новокаховське” (Херсонська обл.).

Уперше розроблено і запатентовано спосіб прямої регенерації адвентивних мікропагонів гісопу звичайного. Використання цього методу дозволило розмножити рослини м'яти котячої, які передано до відділу нових ароматичних і лікарських рослин НБС-ННЦ і які перебувають у колекційних посадках.

Уперше в Україні створено повільно зростаючу in vitro колекцію цінних декоративних, субтропічних, кісточкових плодових рослин на основі розробки біотехнологічної системи депонування рослин при низьких позитивних температурах, що представлена 27 сортами троянди, 3 видами орхідей, 1 видом юки, 9 сортами ломиноса, 4 сортами й 2 гібридами ківі, 2 формами фейхоа, 2 сортами аличі, 1 сортом абрикоса та 10 сортами сливи.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У літературному огляді наведено детальний опис шляхів реалізації морфогенетичного потенціалу органів і тканин вищих рослин в умовах in vitro за допомогою соматичного ембріогенезу, як найважливішого біологічного механізму розвитку і регенерації рослин. На численних прикладах різних видів розглянуто його різні типи, генезис і фактори, необхідні для ефективного функціонування цього унікального способу розмноження рослин у різних системах in vitro, спрямованих на поліпшення поданих культур та їх широкомасштабну репродукцію. Відзначено переваги і недоліки кожного з досліджених різними авторами шляхів соматичного ембріогенезу. Особливу увагу приділено складу живильних середовищ у взаємозв'язку з вмістом трофічних компонентів і регуляторів росту. Розглянуто роль останніх як індукторів, інгібіторів і тригерів етапів соматичного ембріогенезу. Показано вплив фізичних факторів (інтенсивність освітлення, спектральний склад світла, фотоперіод, температура) на ефективність проходження окремих етапів цього процесу. Відображено питання прояву сомаклональної мінливості при культивуванні органів і тканин рослин в умовах in vitro. Представлено галузі застосування соматичного ембріогенезу в біотехнології для цілей розмноження, селекції і кріозбереження цінного рослинного матеріалу. Показано сучасний стан питань прямої і непрямої регенерації вищих рослин з різних експлантів і показано результати, одержані різними авторами в процесі досліджень.

Для проведення досліджень було використано модельні рослини, представлені видами, сортами та формами родин: Ranunculaceae, Rosaceae, Ebenaceae, Myrtaceae, Moraceae, Agavaceae, Actinidiaceae, Araceae, Orchidacea, Lamiaceae з колекційного генофонду НБС-ННЦ. В експерименти з соматичного ембріогенезу та орагногенезу було включено експланти ломиноса (Clematis L.), каладіума (Caladium hortulanum Birdsey.) і фікуса ліровидного (Ficus lyrata Warb.). Для розроблення реципієнтних систем in vitro як вихідний рослинний матеріал використано вегетативні бруньки, листя, мікропагони і зародки хурми (Diospyros kaki Thunb.), фейхоа (Feijoa sellowiana Berg.), зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.), ківі (Actinidia deliciosa (Chev.) Liang, Ferguson), м'яти котячої (Nepeta cataria L.) та гісопу (Hyssopus officinalis L.). У дослідженнях з депонування рослин і створення повільно зростаючих колекцій в умовах in vitro використовувалися такі культури, як троянда (Rosa L.), ломиніс (Clematis), цимбідіум (Cymbidium hybridum, C. minima), досинія (Dossinia sp.), юка (Yucca aloifolia L., Y. torrey Shafer.), ківі (A. deliciosa), фейхоа (F. sellowiana), абрикос (Prunus armeniaca L.), алича (Prunus cerasifera Ehrh.), слива (Prunus domestica L.).

Умови стерилізації рослинного матеріалу підбиралися під кожну з досліджуваних культур. Залежно від походження експланта, що вводився, опрацьовувалися експозиція і концентрація стерилізуючого агента. Як антисептики було використано комерційний препарат Domestos (Unilever Madyarorszбg Kft., Угорщина), що містить 5% розчин гіпохлориту Na, 70% етиловий спирт (Медасепт, Україна), 0,08% розчин AgNO₃ (Merсk, Німеччина), 1% розчин Thimerosal (Merсk, Німеччина), які звільняли експланти, що вводяться, від бактеріальної та грибної інфекції. Результати цих експериментів викладено в розділах 3, 4, 5 дисертації.

При вивченні морфогенетичних потенцій органів і тканин в умовах in vitro досліджуваних культур було використано ряд базових живильних середовищ, таких як Моньє (Monnier, 1973), Кнудсона С (Knudson, 1925), МС (Murashige, Skoog, 1962), В5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), КЛ (Quoirin, Lepoivre, 1977), які при виконанні експериментів було модифіковано. Для регулювання процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу рослин in vitro до складу живильного середовища вводили фітогормони цитокінінового (0,44-44,00 мкМ БАП, 0,46-46,00 мкМ кінетину, 0,46-45,62 мкМ зеатину, 1,0-9,0 мкМ ТДЗ) і ауксинового типу дії (0,29-11,47 мкМ ІО_цК, 0,25-9,8 мкМ ІО_лК, 0,27-10,74 мкМ НОК, 4,52-13,56 мкМ 2,4-Д. Як основний вуглевод для культивування органів і тканин застосовували сахарозу в концентрації 20-40 г/л. Експланти вирощували в культуральній кімнаті, де залежно від об'єкта дослідження, що культивується, та експерименту підтримувалася температура 20-30С, 16-годинний фотоперіод, інтенсивність освітлення 0-62,5 мкМ м^-2 с^-1 і 70% відносна вологість повітря. Частину експлантів поміщали до термостату з температурою 25С. Субкультивування тканин і органів проводили через 15-30 діб.

Приготування та забарвлення препаратів проводили відповідно до методик, викладених у роботах У. Дженсена (1965), Є. Пірса (1962) і М.Н. Прозіної (1960). Зрізи забарвлювали 0,1% водяним розчином акридинового жовтогарячого, 0,5% водяним розчином толуїдинового синього та водяним розчином DAPI (10 мкг/мол). На постійних препаратах досліджували особливості формування первинних і вторинних соматичних зародків, а також утворення адвентивних бруньок ломиноса, каладіума та фікуса ліровидного. Зрізи (5 і 10 мкм) одержували з використанням мікротома МС-2 (Росія). Всі препарати аналізували та фотографували під флуоресцентним мікроскопом Leica DMLB (Німеччина). Розвиток соматичних зародків і утворення адвентивних бруньок досліджували під стереомікроскопом МБС-9 (Росія).

Молекулярно-біологічний аналіз рослин ломиноса, одержаних у результаті органогенезу, прямого та непрямого соматичного ембріогенезу in vitro, проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. ДНК виділяли за допомогою СТАВ-буфера (Сиволап, 1998). Для ампліфікації використовували прилад “Терцік” (ДНК-технологія, Росія). Реакційна суміш для проведення ISSR - ПЛР обсягом 20 мкл містила: 50 мМ КСl, 20 мМ трис-НСl (рН 8,4 при Т 25С), 2-5 мМ MgCl₂, 0,01% Tween 20, з 0,2 мМ кожного нуклеотиду, 0,2 мкМ праймера, 20 нг ДНК й 1 од. Taq-полімерази. Ампліфікацію з сімома ISSR-праймерами проводили в режимі: перша денатурація - 93С - 1 хв. 30 с, 35 циклів - 60С - 40 с, 70С - 1 хв., 93С - 30 с, остання елонгація - 70С - 1 хв. 30 с. Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК проводили в однократному буфері (0,045 М Трис-борат і 10 мМ ЕДТА, рН 8,0) в 2%-ному агарозному гелі довжиною 12 см при 100-130 В протягом 2,5 год. Гелі, попередньо забарвлені бромистим етидієм, після електрофоретичного поділу продуктів ампліфікації фотографували в ультрафіолетовому світлі на плівку “Мікрат-300”. Результати ISSR-аналізу обраховували згідно з M. Nei і W. Li (1979).

При проведенні експериментів зі створення зростаючих in vitro колекцій декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для характеристики регенераційної здатності експлантів використовували ряд показників: ростовий індекс, частота регенерації, органогенетичний індекс, ефективність мікророзмноження, викладених у методиках оцінки рослинних об'єктів (Калинин и др., 1980; Dudits, Hesky, 1990). Уповільнення ростових процесів досліджуваних культур проводилося за допомогою введення до складу живильного середовища таких інгібіторів росту: 15, 20, 30, 60, 90 г/л сахарози, 40, 50, 60 мг/л маніту, 40, 50, 60 мг/л сорбіту, 20, 30 г/л глюкози, 0,9, 1,8 мг/л -аспарагіну, 5-10 мг/л АБК і 0,2-1,2 мг/л хлор холін хлориду (ССС). Методика введення інгібіторів опрацьовувалася нами в процесі проведення експериментів. Пробірки, колби та банки з експлантами поміщали до холодильних камер з регульованою низькою позитивною температурою (5 1С) та інтенсивністю освітлення 1,25-3,75 мкМ м^-2 с^-1. Рослинний матеріал фіксували через 3, 6, 12, 24, 36 місяців культивування. Оцінювали якісні (бонітування за допомогою 4-бальної шкали) та кількісні характеристики депонованих експлантів (життєздатність, довжина мікропагона, кількість міжвузль, кількість коренів).

Для вкорінення мікропагонів використовували 0,49-9,80 мкМ ІО_лК і 1,07-5,37 мкМ НОК. Експланти поміщали на живильне середовище, що містить Ѕ норми солей з МС, 1-1,5% сахарози, 25 мг/л мезоінозиту, 0,6-0,8% агару (Sigma-Aldrich, США). Укорінені мікропагони та рослини, одержані із соматичних зародків, висаджували до стерильного субстрату (торф: пісок - 2:1, торф: пісок: лісова земля - 2:1:1, торф: пісок: лісова земля - 1:1:2). Адаптовані до умов in vivo рослини вирощували в теплиці.

Математичну обробку даних проводили, використовуючи комп'ютерну програму STATISTICA for Windows, 6/0 (StatSoft, Inc/ 1984-2001) за допомогою методів статистичного аналізу, викладених у посібнику Г.Ф. Лакіна (1990).

Для розроблення біотехнологічної системи розмноження рослин ломиноса вперше вивчено особливості регенерації рослин через соматичний ембріогенез і органогенез іn vіtro і виявлено основні фактори, що впливають на морфогенетичний потенціал органів і тканин досліджуваних сортів.

У процесі досліджень визначено оптимальні строки введення в умови іn vіtro вегетативних бруньок сортів ломиноса Серенада Крима, Юность, Нєвєста, Crіmson Star, Космічєская мєлодія, Вєчний зов, Ай-Нор, Лєсная Опєра. Так, у період з лютого по квітень кількість бруньок, що утворюють мікропагони або соматичні зародки, досягала 90-100%. Поряд із тим, визначено ефективний спосіб стерилізації рослинного матеріалу (спосіб послідовного застосування 70% етилового спирту - 1 хв. і 4%-ного розчину гіпохлориту Na - 15 хв.), при якому кількість експлантів, вільних від контамінації, досягала 98%.

Проведено вивчення компонентного складу індукційного живильного середовища як фактора, що не тільки виявляє, але й підтримує якісні характеристики морфогенетичних подій, які відбуваються у вегетативних бруньках ломиноса, що розвиваються в процесі культивування іn vіtro. Для експлантів ломиноса експериментально підібрано сольову основу середовища МС і визначено необхідність присутності в ньому для індукції процесу непрямого соматичного ембріогенезу в якості дедиференціатора зеатину в концентрації 1,8 мкМ. Установлено, що протягом 30 діб культивування ембріогенного калюсу з'являлися ембріогенні зони, меристематичні бугорці та ембріоїди. Гістологічний аналіз показав, що в ембріогенній масі є як ембріогенні, так і неембріогенні клітини. Виявлено, що на 3 добу культивування активізувалися процеси мітотичної та меристематичної активності в ембріогенній масі клітин. Проембріо починав формуватися внаслідок асиметричних поділів найчастіше безпосередньо всередині калюсу. Соматичні зародки з'являлися на поверхні калюсу тільки на 35-40 добу культивування.

Показано, що присутність у середовищі зеатину індукувала утворення біполярних структур на поверхні та всередині калюсу. Так, максимальну кількість ембріоїдів на експлант (25 2,6 шт.) було одержано на середовищі МС, доповненому 1,8 мкМ зеатину через 4 тижні культивування. На стадії дозрівання в умовах іn vіtro відзначали утворення глобулярних, сердечковидних і торпедовидних ембріоїдів ломиноса, подібно до розвитку зиготичних зародків.

Уперше встановлено, що розвиток соматичних зародків ломиноса в умовах іn vіtro залежав від його морфологічного типу. З виявлених 7 морфологічних типів соматичних зародків, тільки 4-и мали регенераційний потенціал: 1 - односім'ядольний, 2 - двосім'ядольний, 3 - полісім'ядольний, 4 - трубчастий. Проростання таких соматичних зародків відбувалося протягом 30-40 діб культивування.

Наступне субкультивування соматичних зародків на середовище, що містить 1,8 мкМ зеатину і різні концентрації ІО_лК, приводило до утворення вторинних ембріоїдів на поверхні вже сформованих зародків, що розвиваються. При цьому встановлено, що частота вторинного ембріогенезу залежала від концентрації ІО_лК у живильному середовищі. Оптимальною виявилася концентрація 0,9 мкМ ІО_лК, при якій середня кількість ембріоїдів склала 30 5,2 штук на експлант.

Використання фізичних факторів як ефекторів соматичного ембріогенезу дало змогу встановити оптимальні значення температури (26С) і інтенсивності освітлення (40 мкМ м^-2 с^-1), при яких кількість розвинених ембріоїдів досягала 25-30 штук на експлант.

Поряд із тим, вивчено особливості утворення мікропагонів із калюсу ломиноса. Показано, що калюс листкового походження діаметром 7-10 мм є компетентним експлантом, здатним формувати максимальну кількість адвентивних бруньок на живильному середовищі МС, що містить 2,3 мкМ зеатину.

Проведено молекулярно-генетичний аналіз донорної рослини та сомаклонів ломиноса сорту Серенада Крима, одержаних шляхом органогенезу та соматичного ембріогенезу. Встановлено особливості мінливості геному при різних способах регенерації іn vіtro. За допомогою ІSSR праймерів виявлено 105 ампліконів, з яких поліморфними виявилися 6. Середній показник гетерогенності рослин ломиноса склав 5,7%. На дендрограмі видно, що найбільш генетично диференційованим від інших є контроль (материнська рослина, що не ввійшла до жодного з двох кластерів). Разом з тим, всі рослини, одержані з соматичних зародків і доведені до цвітіння, не відрізнялися за фенотипом від вихідної.

На основі порівняльного вивчення морфогенетичних потенцій вегетативних бруньок 8 сортів ломиноса (Серенада Крима, Юность, Нєвєста, Crіmson Star, Космічєская мєлодія, Вєчний зов, Ай-Нор, Лєсная Опєра) розроблено систему прямого соматичного ембріогенезу. Встановлено залежність формування соматичних зародків від генотипу та концентрації БАП у живильному середовищі МС. Оптимальною виявилася концентрація БАП, що дорівнювала 2,22 мкМ, присутність якої в середовищі індукувала соматичний ембріогенез та утворення максимальної кількості зародків у всіх сортів ломиноса. В усіх досліджуваних сортів утворення соматичних зародків відбувалося безпосередньо на поверхні вегетативних бруньок, найчастіше в зоні апекса, де клітини активно діляться. На 20 добу культивування експлантів відзначено появу маси глобулярних структур. Поряд із тим, характерною рисою цих сортів була здатність первинних соматичних зародків до вторинного ембріогенезу. Досліджувані сорти розрізнялися між собою за частотою вторинного ембріогенезу. Так, високу частоту ембріогенезу, що досягала 65-100%, було відзначено у сортів Нєвєста, Crіmson Star, Серенада Крима, Юность, Ай-Нор при культивуванні на середовищі, що містило 2,2 мкМ БАП. Таким чином, як у випадку первинного, так і вторинного ембріогенезу, вищий ембріогенний потенціал мали бруньки сортів ломиноса, що відносилися до груп Ланугіноза і Жакмана.

У процесі досліджень уперше виявлено існування зони активізації утворення соматичних зародків ломиноса - тобто існували ембріоїд або група ембріоїдів, які були здатні індукувати як первинний, так і вторинний соматичний ембріогенез. Такий експлант був названий нами "індуктором". Вплив "індуктора" на соматичний ембріогенез виявлявся в активному утворенні додаткових зародків на експлантах, поміщених на живильне середовище. Це було нами відзначено в усіх сортів ломиноса, за винятком сорту Космічєская мелодія. Наша гіпотеза щодо впливу "індуктора" на сусідні експланти ломиноса через живильне середовище, до якого виділялися індукуючи речовини (метаболіти, гормони тощо) не підтвердилася. Поряд із тим, було встановлено, що "індуктор" міг діяти досить тривалий відрізок часу (до 2-3 років). Позитивною стороною призупинення процесу соматичного ембріогенезу за рахунок видалення "індуктора" була можливість поділу соматичних зародків на окремі фракції, шляхом їх згрупування за розміром і стадією розвитку.

На основі проведених досліджень визначено основні фактори, що впливають на процес прямого соматичного ембріогенезу ломиноса. Такими факторами є концентрація екзогенного цитокініну БАП, температура, інтенсивність освітлення, "індуктор" соматичного ембріогенезу та генотип. Встановлено, що при концентрації БАП 2,22 мкМ, температурі 24С та інтенсивності освітлення 40 мкМ·м^-2·с^-1 активізація процесів первинного і вторинного соматичного ембріогенезу відбувається тільки в присутності "індуктора". Частка його впливу складала 50%.

Всі одержані в умовах іn vіtro рослини адаптовано іn vіvo і висаджено іn sіtu. Адаптація соматичних зародків і рослин, одержаних з них, до умов іn vіvo проходила протягом 20-30 діб. Висадження до відкритого ґрунту сформованих рослин з потужною мочкуватою кореневою системою та дерев'янистими або напівдерев'янистими стеблами здійснювали через 9-12 місяців після адаптації до умов закритого ґрунту.

Таким чином, нами вперше створені оптимальні умови регенерації рослин через непрямий і прямий соматичний ембріогенез ломиноса та запропонована біотехнологічна система одержання рослин іn vіtro через прямий соматичний ембріогенез.

На відміну від ломиноса, у каладіума та фікуса ліровидного саме листя виявилося компетентним експлантом, здатним до утворення як соматичних зародків, так і мікропагонів.

Установлено строки введення первинних експлантів каладіума і фікуса. Так, листя каладіума, відібране в період із травня по липень, було найбільш морфогенним, при цьому частота утворення соматичних зародків досягала 86-100%. Бруньки фікуса ліровидного вводили протягом усього року, а експланти листка відбирали з регенерантів, які культивувались в умовах in vitro. Визначено оптимальні способи стерилізації рослинного матеріалу обох видів, що дали змогу одержувати до 100% експлантів, вільних від контамінації: каладіум - 1,8%-ний розчин гіпохлориту натрію (5 хв.) 70%-ний етанол (1 хв.) дистильована H₂O; фікус ліровидний - 70%-ний етанол (1 хв.) 4%-ний розчин гіпохлориту натрію (15 хв.) дистильована H₂O.

У процесі дослідження було модифіковано склад живильного середовища МС (С1) та підібрано оптимальні концентрації цитокініну для індукції морфогенетичних процесів у тканинах листків двох сортів каладіума, що приводять до соматичного ембріогенезу. Серед випробуваних концентрацій кінетину оптимальною виявилася 2,32 мкМ, при якій формувалися соматичні зародки на 66,67% та 70,78% листкових дисків у сортів Pink Gem і Triumphe de Compte відповідно. Поряд із тим, удалося визначити найбільш морфогенні зони, здатні до прямого і непрямого соматичного ембріогенезу. Такими зонами виявилися - зона з'єднання листової пластинки з черешком і край висічки листка. Період розвитку від уведення первинних експлантів каладіума в культуру до появи глобулярних структур по краю висічки листка без етапу калюсоутворення склав 30 діб.

У процесі досліджень також установлено, що шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу експлантів залежали від умов культивування. У разі відсутності освітлення формувалися тільки соматичні зародки. На світлі відбувалося три морфогенетичних процеси: органогенез у морфогенному калюсі, непрямий і прямий соматичний ембріогенез. У зоні з'єднання листкової пластинки з черешком ембріогенні структури з'являлися безпосередньо в епідермальній і субепідермальній зоні висічки листка. Протягом наступних 30 діб спостерігали розвиток повноцінних соматичних зародків. Наступні пасажі соматичних зародків на живильне середовище С1 індукували вторинний ембріогенез. Весь процес від уведення експлантів до регенерації рослин склав 3 місяці.

Непрямий соматичний ембріогенез і пряму регенерацію мікропагонів з висічок листка каладіума спостерігали на середовищах С2 з БАП і НОК. Установлено оптимальні концентрації фітогормонів (2,22 мкМ БАП і 2,69 мкМ НОК), які індукували утворення максимальної кількості мікропагонів і ембріоїдів.

У результаті непрямого соматичного ембріогенезу у сорту Triumphe de Compte, непрямої регенерації мікропагонів і непрямого соматичного ембріогенезу у сорту Pink Gem отримано нові форми з різними соматичними мутаціями. У виділених рослин соматичні мутації виявлялися у вигляді різних форм листкової пластинки, її забарвленні та жилкуванні.

Вивчення регенераційної здатності зон листка фікуса ліровидного показало, що всі вони мали високий морфогенетичний потенціал, який реалізувався через соматичний ембріогенез і пряму регенерацію мікропагонів. Відзначено, що край листкової пластинки виявився найбільш компетентним до утворення соматичних ембріоїдів. У зоні уздовж основної жилки і у черешка найчастіше індукувався процес прямої регенерації мікропагонів.

Ефективність індукції соматичного ембріогенезу фікуса ліровидного залежала від концентрації БАП у живильному середовищі Куорін і Лепойвре. Максимальна кількість ембріоїдів формувалася на живильному середовищі КЛ, доповненому 0,89-1,33 мкМ БАП. Кількість соматичних зародків досягала в середньому 7,5 0,2 штук на експлант. Соматичні зародки проходили всі стадії розвитку, які було чітко видно вже на 30 добу культивування. Повноцінні рослини з ембріоїдів фікуса формувалися на 40-60 добу від початку індукції формування соматичних зародків.

Як і у випадку з культурами ломиноса та каладіума, вторинний соматичний ембріогенез фікуса ліровидного відбувався на індукційному живильному середовищі. Збільшення кількості субкультивувань значно підвищувало частоту вторинного соматичного ембріогенезу. Безперервний процес соматичного ембріогенезу фікуса ліровидного відбувався протягом 2 років, при цьому частота ембріогенезу залишалася на одному рівні і досягала 95-100%.

Підвищення концентрації БАП до 1,78 мкМ індукувало процес прямої регенерації адвентивних мікропагонів з листкових експлантів фікуса ліровидного. Поряд із тим, показано, що максимальна кількість коренів (5,8 0,1 штук на мікропагін) утворилася на Ѕ норми середовища МС, доповненого 0,98 мкМ ІО_лК.

У процесі досліджень вивчено умови адаптації in vivo регенерантів каладіума та фікуса.

Таким чином, розроблено біотехнологічні системи одержання рослин каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез і органогенез. Розроблені біотехнологічні системи розмноження рослин дають можливість одержувати до 40.000000 регенерантів каладіума та 4.000000 регенерантів фікуса ліровідного на рік.

Біотехнологія розмноження субтропічних плодових культур створювалася нами на основі порівняльного вивчення прямої регенерації рослин із зиготичних зародків і листкових експлантів зизифуса, ківі, фейхоа і хурми та була спрямована на розроблення реципієнтної системи в умовах in vitro.

На етапі введення первинних експлантів в умови in vitro виявлено, що здатність ізольованих бруньок фейхоа, ківі, хурми і зизифуса регенерувати мікропагони залежала від генотипу і концентрації цитокінінів у живильному середовищі. Так, 0,88 мкМ і 4,40 мкМ БАП виявилися ефективними для регенерації мікропагонів з ізольованих бруньок зизифуса і ківі, відповідно. Культивування протягом 3 тижнів ізольованих бруньок хурми на живильному середовищі МС, що містить 2,22 мкМ БАП стимулювало активну регенерацію мікропагонів. Тим часом додавання в середовище МС зеатину в концентрації 0,91 мкМ індукувало первинну регенерацію мікропагонів фейхоа. Однак наступний розвиток мікропагонів відбувався на середовищі, доповненому 2,73 мкМ зеатину.

Поряд із тим, у процесі досліджень установлено оптимальні строки попередньої обробки зиготичних зародків зизифуса, ківі, фейхоа і хурми, введених у культуру in vitro. Проведене порівняльне вивчення компетентності зиготичних зародків 4-х субтропічних культур до проростання під впливом низьких позитивних температур показало, що частота проростання зародків досягала 100% при попередній обробці фейхоа і ківі протягом 15 діб. Однак для розвитку зародків хурми і зизифусу тривалість попередньої обробки збільшували до 30 діб.

При вивченні морфогенетичних потенцій сім'ядолей, листків і сегментів мікропагонів ківі, зизифуса, фейхоа та хурми було встановлено, що регенераційний потенціал залежав від генотипу, типу експланта і концентрації ТДЗ. Використання ТДЗ у концентрації від 1,0 мкМ до 9,0 мкМ для прямої і непрямої регенерації мікропагонів дало змогу індукувати розвиток мікропагонів із сім'ядолей і листкових експлантів зизифуса та хурми, з листкових дисків фейхоа, ківі та сегментів мікропагонів фейхоа, ківі і хурми. Так, для прямої регенерації мікропагонів з листкових експлантів і сім'ядолей хурми оптимальними були середовища, що містять 6,0 мкМ і 9,0 мкМ ТДЗ відповідно. Утворення максимальної кількості мікропагонів з листка та сім'ядолей зизифуса спостерігали на середовищах, доповнених 3,0 мкМ і 9,0 мкМ ТДЗ відповідно.

Встановлено оптимальні концентрації ІО_лК і НОК, що індукують процеси коренеутворення у мікропагонів зизифуса, ківі, фейхоа та хурми, поміщених на живильні середовища з половинним набором макро- і мікросолей по МС. Активний ризогенез в усіх субтропічних культур удалося індукувати тільки після 7-8-ми пасажів. Відзначено, що в процесі культивування мікропагонів зизифуса на живильному середовищі Ѕ МС, що містить 4,90 мкМ ІО_лК і 5,37 мкМ НОК, значно збільшувалася частота коренеутворення і середня кількість коренів досягала 2,3 0,1 штук на експлант. Установлено, що концентрація ІО_лК 0,98 мкМ стимулювала утворення коренів у 100% мікропагонів фейхоа, ківі, хурми та середня кількість коренів на експлант досягала 4,5 0,2 штук. Повноцінні рослини ківі, фейхоа, зизифуса та хурми для наступного висадження на адаптацію були одержані через 2, 3, 4 і 5 місяців культивування відповідно. Визначено основні умови адаптації in vivo регенерантів досліджуваних субтропічних плодових культур.

Таким чином, на підставі одержаних результатів уперше розроблено біотехнологічну систему отримання рослин ківі, зизифуса, фейхоа та хурми через пряму регенерацію мікропагонів з вегетативних бруньок, сім'ядолей і листя, прямий соматичний ембріогенез із сім'ядолей, органогенез і непрямий соматичний ембріогенез у морфогенному калюсі.

Для розроблення реципієнтної системи ефіроолійних рослин проведено вивчення морфогенетичних потенцій висічок листка м'яти котячої (N. catarіa var. cіtrіodora Beck.) і гісопу (H. offіcіnalіs L.).

Встановлено, що частота регенерації листкових експлантів м'яти котячої і гісопу залежала від ряду факторів і насамперед від концентрації тідіазурону та тривалості культивування. У гісопу і м'яти котячої максимальну кількість листкових експлантів, здатних до регенерації адвентивних бруньок і мікропагонів, відзначали на 8 тиждень культивування. Визначено оптимальні концентрації ТДЗ для гісопу - 6,0 мкМ і для м'яти котячої - 9,0 мкМ, застосування яких індукувало утворення мікропагонів у 75-90% листкових дисків при адаксіальному розташуванні на середовищі. При цьому показано залежність регенерації мікропагонів м'яти котячої і гісопу від інтенсивності освітлення. Визначено оптимальні показники (для гісопу - 25 мкМ м-² с^-1, для м'яти котячої - 37,5 мкМ м^-2 с^-1), при яких, 50% і 70% листкових дисків гісопу і м'яти котячої були здатні до утворення адвентивних бруньок і регенерації мікропагонів. Крім того, встановлено, що регенерація максимальної кількості адвентивних бруньок і мікропагонів відбувалася на листових експлантах, відібраних з мікропагонів м'яти котячої і гісопу, які культивуються in vitro, після 4-5-того пасажу.

Протягом року від одного листкового експланта м'яти котячої і гісопу було одержано 10.000 мікропагонів, які відокремлювали та укорінювали на Ѕ норми середовища МС, доповненого ІО_лК (2,46 мкМ і 9,80 мкМ, відповідно). Число укорінених мікропагонів м'яти котячої і гісопу досягало 72% й 80% відповідно.

Таким чином, як результат проведених досліджень подано біотехнологічну систему мікророзмноження м'яти котячої і гісопу, що складається з послідовних етапів і дала змогу одержати до 10.000 рослин у рік.

Поряд з вивченням особливостей соматичного ембріогенезу, органогенезу та розробленням реципієнтних систем декоративних, субтропічних і ефіроолійних рослин, одним з важливих напрямів у біотехнології рослин є збереження рослинних об'єктів в умовах іn vіtro, що дає змогу створити резервний банк генетичної плазми цінних, рідкісних, зникаючих, нових видів і сортів.

На основі ростового індексу, частоти регенерації і органогенетичного індексу вперше визначено оптимальні експланти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для депонування в умовах іn vіtro (табл.)

Таблиця 1. Характеристика оптимальних експлантів декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах in vitro

Попередні експерименти з підбору оптимальних температур для тривалого збереження експлантів ківі, абрикоса, аличі, троянди, орхідей і ломиноса в умовах іn vіtro показали, що серед досліджуваних культур найвищу життєздатність мали експланти ківі. Однак спосіб збереження експлантів в умовах іn vіtro тільки за рахунок регулювання температури та інтенсивності освітлення виявився малоефективним, оскільки більшість експлантів після депонування надто витягувалися і не були здатні до регенерації пагонів після перенесення до стандартних умов культивування.

Отже, далі був вивчений вплив кожного з ефекторів, і зіставлені одержані оптимальні показники, що дало змогу відпрацювати правильну стратегію в збереженні іn vіtro експлантів троянд, ломиноса, юки, орхідей, фейхоа, ківі, аличі, сливи та абрикоса.

У процесі досліджень показано, що при тривалому культивуванні всіх досліджуваних видів рослин на середовищах, що містять 15-90 г/л сахарози, ясно простежується тенденція зниження життєздатності експлантів при збільшенні періоду депонування та підвищення життєздатності при збільшенні концентрації сахарози в живильному середовищі. Встановлено, що на середовищах з концентрацією сахарози 90 г/л життєздатність експлантів троянд, орхідей, ломиноса, юки, фейхоа та ківі досягала 50-90%. Серед цих культур вищу життєздатність мали соматичні зародки ломиноса та протокорми цимбідіума. В експлантів юки відзначено низький рівень життєздатності (20-25%) порівняно з іншими досліджуваними видами та сортами рослин. Практично в усіх видів і сортів на середовищах з 60 і 90 г/л сахарози спостерігали утворення адвентивних бруньок і розвиток коренів. Крім того, при додаванні в середовища 90 г/л сахарози кінетика росту експлантів знижувалася в 2-3 рази порівняно з контролем залежно від виду та сорту рослини. Збільшення періоду депонування до 24 місяців дало змогу знизити кінетику росту експлантів троянди мініатюрної і зберігати мікропагони життєздатними. В експлантів ломиноса встановлено залежність кінетики росту від строків збереження та типу експланта, закладеного на депонування в умови іn vіtro.

Введення в живильні середовища маніту та сорбіту також знижувало кінетику розвитку експлантів і підвищувало життєздатність. Після 6-місячного депонування використання 60 мг/л маніту стабілізувало розвиток експлантів. Залежно від генотипу досліджуваної рослини життєздатність досягала 70-90%. Наявність у середовищі маніту збільшувало життєздатність мікропагонів мініатюрної троянди сорту Бебі Бантінг. Однак через 12 місяців депонування 20-30% експлантів досліджуваних культур були здатні розвиватися після перенесення до стандартних умов культивування.

Введення в живильне середовище ретарданта - хлор холін хлориду (ССС) значно підвищувало життєздатність експлантів порівняно з контролем. Проведений скринінг досліджуваних культур, що піддавалися впливу низьких позитивних температур і ретарданту ССС протягом 12 місяців, дав змогу виділити найбільш життєздатні культури. Встановлено, що при концентрації ССС 0,2-0,4 г/л кількість життєздатних експлантів у таких рослин як троянда, ломиніс, орхідея, юка, алича, слива, абрикос досягала 100%. Поряд з інгібуванням росту експлантів, ССС індукував ріст коренів у таких культур як троянда, ломиніс, юка, фейхоа і слива. Частота укорінення мікропагонів ломиноса у таких сортів, як Серенада Крима і Юность через 24 місяці депонування досягала 100%.

Спільне використання оптимальних концентрацій ССС і сахарози, показників інтенсивності освітлення і температури значно збільшило як період збереження в безпересадочній культурі, так і життєздатність експлантів досліджуваних культур. Це дало змогу нам уперше розробити спосіб мінімізації росту декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур в умовах іn vіtro, та створити генобанк цінної рослинної плазми.

Отже, на основі комплексного вивчення процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу запропоновано біотехнологічну схему отримання та збереження цінних видів і сортів декоративних, субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних рослин. В поданій на рисунку схемі, що складається з кількох системних блоків удалося розкрити регенераційний потенціал досліджуваних культур і продемонструвати основні фактори (індуктор, генотип, тип експланта та його походження, живильне середовище, фітогормони та їх концентрації, інтенсивність освітлення та температура), показати ступінь їх впливу на процеси соматичного ембріогенезу і органогенезу та відобразити кінцевий продукт - біотехнологічні системи розмноження, реципієнтні системи і системи збереження багаторічних рослин в умовах іn vіtro.

ВИСНОВКИ

1. У результаті проведеного вивчення шляхів морфогенезу та особливостей регенерації рослин in vitro у багаторічних садових культур (ломиноса, каладіума, троянди, орхідей, фікуса, юки, зизифуса, ківі, хурми, фейхоа, аличі, сливи, абрикоса, мґяти котячої та гісопу) установлено загальні закономірності індукції і реалізації процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу, що полягають у визначальній ролі типу експланта і його походження, генотипу, живильного середовища, концентрації фітогормону, температури та інтенсивності освітлення. Особливе значення для розвитку соматичних зародків має індуктор. На основі виявлених закономірностей процесів соматичного ембріогенезу та органогенезу створено та вдосконалено системи розмноження і збереження in vitro декоративних, субтропічних, кісточкових плодових і ефіроолійних культур для клонування видів і сортів, які важко розмножуються, розробки реципієнтних систем і створення генобанку цінної рослинної плазми.

2. Вперше визначено 4 шляхи реалізації морфогенетичного потенціалу органів і тканин різних сортів ломиноса. Для оцінки ступеня гетерогенності рослин ломиноса сорту Серенада Крима, отриманих у результаті реалізації експлантами різних шляхів регенерації, показано інформативні можливості молекулярно-генетичного маркера - ПЛР аналізу. Встановлено середній показник гетерогенності рослин, що склав 5,7%. При цьому виявлено, що регенеранти, одержані з соматичних зародків, які вступили до фази цвітіння, не відрізнялися за фенотипом від материнського сорту.

3. Вперше встановлено залежність індукції включення ембріогенного шляху розвитку в меристемних клітинах бічних, верхівкових бруньок і калюсу через прямий і непрямий соматичний ембріогенез від генотипу, концентрації БАП (2,22 мкМ) або зеатину (1,3 мкМ), температури (24 1С), інтенсивності освітлення (40 мкМ·м^-2·с^-1) та наявності індуктора, яким є соматичний зародок. Продемонстровано провідну роль індуктора в процесі соматичного ембріогенезу, частка впливу якого становила 50%.

4. Виявлено 7 морфологічних типів соматичних зародків ломиноса, з яких 4 здатні до формування повноцінних рослин.. Показано здатність первинних соматичних зародків досліджуваних сортів ломиноса до вторинного ембріогенезу. Продемонстровано високу частоту як первинного, так і вторинного ембріогенезу, що досягала 65-100% у сортів Нєвєста, Crіmson Star, Юность, Серенада Крима і Ай-Нор.

5. Уперше розроблено біотехнологічні системи отримання рослин ломиноса через прямий і непрямий соматичний ембріогенез (каулігенну ембріоїдогенію), і показано можливість масового клонального мікророзмноження окремих сортів на індукційному живильному середовищі.

6. Визначено основні фактори, що впливають на ефективність регенерації рослин каладіума та фікуса ліровидного через соматичний ембріогенез: час відбору експланта і введення його в умови іn vіtro, тип експланта та зона листкової пластинки, трофічний фактор (живильне середовище для каладіума - МС, для фікуса - КЛ) і концентрація цитокініну (0,89 мкМ БАП у фікуса ліровидного і 2,32 мкМ кинетину у каладіума).

7. Розроблено біотехнологічні системи соматичного ембріогенезу (фоліарної ембріоїдогенії) та органогенезу для каладіума та фікуса ліровидного. Установлено залежність підвищення ефективності мікророзмноження за рахунок використання різних способів регенерації рослин з експлантів листка.

8. Проведено порівняльне вивчення морфогенетичних потенцій органів і тканин ківі, зизифуса, хурми і фейхоа та показано високу регенераційну здатність листкових експлантів до адвентивного пагоноутворення. Визначено оптимальні концентрації фітогормонів, які індукують процес прямої регенерації мікропагонів із листкових експлантів ківі (8,90 мкМ БАП і 8,56 мкМ ІО_цК), зизифуса (3,0 мкМ ТДЗ), фейхоа (9,0 мкМ ТДЗ) та хурми (6,0 мкМ ТДЗ). В результаті прямої регенерації мікропагонів із сім'ядолей хурми отримано 99 нових селекційних форм. Установлено оптимальні концентрації ауксинів, що сприяють 100% укоріненню мікропагонів ківі, фейхоа, хурми та зизифуса. Вперше для ківі, зизифуса, фейхоа та хурми подано 5 різних шляхів регенерації рослин.

9. Установлено залежність прямої регенерації мікропагонів гісопу та м'яти котячої від генотипу, концентрації ТДЗ, кількості субкультивувань, розташування листкових дисків на живильному середовищі та інтенсивності освітлення. Визначено концентрації ТДЗ для гісопу - 6 мкМ та для м'яти котячої - 9 мкМ, застосування яких індукувало утворення мікропагонів у 70-90% листових дисків при адаксіальному розташуванні на середовищі. Максимальна кількість адвентивних бруньок і мікропагонів розвивалася з листкових експлантів досліджуваних культур, відібраних в умовах іn vіtro з мікропагонів після 4-5 пасажу при інтенсивності освітлення 25 мкМ м^-2 с^-1 (гісоп) і 37,5 мкМ м^-2 с^-1 (м'ята котяча).

10. Уперше розроблено реципієнтні системи зизифуса, ківі, хурми, фейхоа, м'яти котячої і гісопу для подальшого їх використання в селекції на продуктивність, адаптивність до несприятливих абіотичних факторів і стійкість до хвороб.

11. На основі визначення ростового індексу, частоти регенерації і органогенетичного індексу подано оптимальні експланти декоративних, субтропічних і кісточкових плодових культур для подальшого депонування в умовах іn vіtro.

12. Установлено найважливіші фактори, що впливають на тривалість збереження в умовах іn vіtro експлантів досліджуваних рослин: генотип, температура (51С) та інтенсивність освітлення (1,25-3,75 мкМ м^-2 с^-1), склад живильного середовища (Ѕ МС, В5, КЛ, Кнудсона С), концентрації ретарданту та осмотика. Виявлено залежність зміни кінетики росту експланта та його життєздатності від концентрації сахарози, маніту, сорбіту, АБК і ССС у середовищі для депонування. Показано, що спільне використання 90 г/л сахарози і 0,4 г/л ССС дає змогу зберігати експланти життєздатними в безпересадочній культурі протягом 12-24 місяців.