Вплив кріоконсервованих ембріональних соматичних клітин на стан шкіри та хряща щурів після травматичного ушкодження

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 57.043.084.615.018.014.41: 616-001

ВПЛИВ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ЕМБРІОНАЛЬНИХ

СОМАТИЧНИХ КЛІТИН НА СТАН ШКІРИ І ХРЯЩА ЩУРІВ

ПІСЛЯ ТРАВМАТИЧНОГО ПОШКОДЖЕННЯ

03.00.19 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ревенко Олена Борисівна

Харьків - 2007



Дисертацією є рукопис:

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Дедух Нінель Василівна, Інститут патології хребта та суглоба ім. проф. М.І. Сітенка АМН України, завідувач лабораторії морфології сполучної тканини, м. Харків

доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищий Державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава

Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра біохімії, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “ 18 ” вересня 2007 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий “10” серпня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН України Гольцев А.М.



АНОТАЦІЯ

Ревенко О.Б. Вплив кріоконсервованих ембріональних соматичних клітин на стан шкіри та хряща щурів після травматичного ушкодження.- Рукопис. суглобовий кріоконсервування суспензія ембріональний

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007.

Дисертація присвячена визначенню умов отримання та кріоконсервування первинних суспензій соматичних ембріональних клітин (СЭК) щурів, а також з'ясуванню їх впливу на перебіг репаративних процесів при експериментальному термічному ушкодженні шкіри і механічному ушкодженні суглобового хряща, як окремих видів сполучної тканини.

Застосування кріозахисного середовища, до вмісту якого входять 10% ДМСО і 10% ембріональної сироватки, дозволяло отримати високі показники збереженості та життєздатності СЕК.

Введення суспензії свіжоізольованих, кріоконсервованих та летально кріопошкоджених СЕК в зону механічної травми суглобового хряща та в ділянку експериментальної термічної травми шкіри сприяло посиленню проліферації хондробластів та фібробластів в тканинах, підвищенню активності глікозаміногліканів основної речовини позаклітинного матриксу.

Введення первинних суспензій СЕК в ділянку термічного ушкодження призводило до швидкого розвитку грануляційної тканини на фоні зниження рівня лейкоцитарної інфільтрації, що сприяло прискоренню процесів закриття ранового дефекту та скороченню термінів відновлення шкіряного покриву. Використання первинних суспензій СЕК у тварин з термічною травмою призводило до швидкої нормалізації показників периферічної крові (рівня гемоглобіну, кількості еритроцитів та лейкоцитів), а також до нормалізації вмісту основних компонентів міжклітинного матриксу сполучної тканини (колагену, неколагенових білків та глікозаміногліканів). Дія СЕК залежить від їх життєздатності: свіжоізольовані клітини швидше відновлюють уражені ділянки тканини, ніж кріоконсервовані. Позитивний вплив летально кріопошкоджених клітин на відновлення травматично ушкоджених суглобового хряща та дерми вказує на роль біологічно активних речовин в реалізації дії СЕК.

Ключові слова: кріоконсервування, соматичні ембріональні клітини, сполучна тканина, механічна і термічна травма, відновлювальні процеси.



АННОТАЦИЯ

Ревенко Е.Б. Влияние криоконсервированных эмбриональных соматических клеток на состояние кожи и хряща крыс после травматического повреждения. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2007.

Диссертационная работа посвящена определению условий получения и криоконсервирования первичных суспензий соматических эмбриональных клеток (СЭК) крыс, а также оценке их влияния на течение репаративных процессов при экспериментальном термическом поражении кожи и механическом повреждении суставного хряща. Задачи исследования: оценка ферментативного и механического методов получения СЭК крыс; изучение влияния криозащитных сред, содержащих ДМСО, эмбриональную сыворотку (ЭС) и ПЕО-1500, на сохранность и способность к адгезии и пролиферации СЭК после криоконсервирования; оценка влияния свежевыделенных и криоконсервированных СЭК на течение репаративных процессов в суставном хряще на модели травматического повреждения коленного сустава у крыс; изучение влияния свежевыделенных и криоконсервированных СЭК на течение восстановительных процессов в коже крыс после экспериментального термического повреждения; исследование содержания оксипролина, тирозина и гексозаминов и гексуроновых кислот в дерме крыс после термического повреждения и введения свежевыделенных и криоконсервированных СЭК.

Результаты исследований показали, что применение предварительной ферментативной предобработки эмбриональных тканей в условиях гипотермии (5°С) в течение 20-ти часов с последующей механической дезинтеграцией позволило получить максимальный выход клеток с высокой сохранностью. Криоконсервирование под защитой диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 10% с добавлением 10% эмбриональной сыворотки по трехэтапной программе замораживания с отогревом при 37°С позволяет сохранить не менее 60% биологически полноценных клеток первичной суспензии СЭК крыс.

Введение суспензий свежеизолированных, криоконсервированных и, в меньшей степени, летально криоповрежденных СЭК в зону механической травмы суставного хряща и в область экспериментальной термической травмы кожи способствовало усилению пролиферации хондробластов и фибробластов в тканях, повышению активности гликозаминогликанов основного вещества межклеточного матрикса.

Присутствие первичных суспензий СЭК в области термического повреждения приводило к ускорению развития грануляционной ткани на фоне снижения уровня лейкоцитарной инфильтрации, что создавало условия для более раннего заживления термических ран и сокращения сроков восстановления кожного покрова. Применение первичных суспензий СЭК у животных с термической травмой приводило к быстрой нормализации показателей периферической крови (уровня гемоглобина, количества эритроцитов и лейкоцитов) и нормализовало содержание основных компонентов межклеточного матрикса соединительной ткани (коллагена, неколлагеновых белков и гликозаминогликанов).

Результаты работы свидетельствуют о том, что введение первичной суспензии СЭК ускоряет сроки заживления травм как суставного хряща, так и кожи крыс при полноценном восстановлении клеточного состава обоих видов соединительной ткани, а также основных компонентов межклеточного матрикса, что обеспечивает условия для формирования гистотипического регенерата. Действие СЭК зависит от их жизнеспособности: свежеизолированные клетки быстрее восстанавливают поврежденные участки ткани, чем криоконсервированные. Выявленное позитивное влияние летально криоповрежденных клеток на восстановление травматически поврежденных хряща и дермы указывает на роль биологически активных веществ в реализации действия СЕК.

Ключевые слова: криоконсервирование, соматические эмбриональные клетки, соединительная ткань, механическая и термическая травма, восстановительные процессы.



ANNOTATION

Revenko Ye. B. Influence of cryopreserved embryonic somatic cells on skin and cartilage conditions after a traumatic damage in rats. - Manuscript

The dissertation for the candidate of biological sciences degree (PhD equivalent) in specialty 03.00.19 - cryobiology. - Institute for problems of cryobiology and cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2006.

Dissertation thesis is dedicated to the study of primary suspension isolation and cryopreservation of rat somatic embryonic cells (SEC) and elucidation of their influence on regenerative process under condition of experimental skin burn and mechanical damage of articular cartilage as individual types of connective tissues.

The study has shown that enzymatic preconditioning of embryonic tissues at hypothermia (0oC) during 20 hours and subsequent mechanical disaggregation yielded maximum viable cells. Cryopreservation under protection of 10% DMSO and 10% of embryonic serum by three-stage freezing program and thawing at 37°С yielded not less than 60% viable cells of SEC primary suspension.

Administration of freshly isolated and cryopreserved suspension and to a lesser degree lethally cryopreserved SEC in thermal injury area assisted in chondroblast and fibroblast proliferation, glycosaminoglycan activity increase.

The presence primary SEC suspension in thermal injury area accelerated granulation tissue formation, which was accompanied by leucocytic infiltration decrease and facilitated early skin regenerative process. Application of primary SEC suspension in animals with thermal injury resulted in fast normalization of peripheral blood indices (hemoglobin level, erythrocyte and leukocyte number) and intercellular matrix connectivity tissue compounds (collagen, non-colagen proteins, and glycosaminoglycan).

Effect of SEC depends on cell viability: freshly isolated cells recover damaged tissue rather faster than cryopreserved ones. Positive effect of lethally cryopreserved SEC on mechanically damaged cartilage and derma regeneration indicates the role of biologically active substances in implementation of the SEC effects

Key words: cryopreservation, somatic embryonic cells, connectivity tissue, thermal and mechanical injury, reparative process.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасний етап розвитку регенераційної біології пов'язаний з визначенням ролі стовбурових клітин як основи, що забезпечує гомеостаз та відновлення органів і тканин (Alonso L., Fuchs E., 2003). З'ясування конкретних механізмів реалізації потенціалу стовбурових клітин, вироблюваних ними біологічно активних речовин, а також їх взаємодії з тканинним і гуморальним мікрооточенням в експериментальних системах in vivo відкриває перспективу вирішення проблеми репарації ушкоджених тканин.

Повнота структурного відновлення сполучної тканини, представниками якої є суглобовий хрящ і дерма шкіри, залежить від узгодженої взаємодії певних типів клітин, характерних для них, їх окремих метаболітів, а також компонентів позаклітинного матриксу. Тому перспективним підходом для досягнення повноцінного загоєння дефектів сполучної тканини є застосування клітинних суспензій або композиційних матеріалів, до яких входять сполучнотканинні клітини та позаклітинний матрикс (Green E. Bell Е., 1983; Федоров В.Д., Саркисов Д.С., 1997; Путилин А.А. и др., 2000). Особлива увага у цьому аспекті приділяється дослідженню тканин ембріонів та плодів, які мають високий вміст стовбурових і прогеніторних клітин (Dennis J.E. et al., 1999; Pittenger M.F. et al., 1999). Соматичні ембріональні клітини (СЕК), які формують покривно-м'язовий каркас плода, мають в основному мезенхімально-мезодермальне (фібробласти, міобласти, хондробласти та ін.) та ектодермальне (клітини покривного епітелію) походження і характеризуються високою проліферативною активністю (Toma J.G., McKenzie I.A, 2005), а також наявністю складного комплексу стадіоспецифічних біологічно активних сполук (ростових факторів, цитокінів та ін.), які забезпечують швидкий ріст та диференціювання тканин. При такому поєднанні біологічних особливостей можна припустити високу ранозагоюючу ефективність застосування СЕК при травматичних ушкодженнях сполучної тканини, зокрема шкіри та хряща, що зумовлює доцільність дослідження впливу цих клітин на перебіг репаративних процесів у модельних системах.

Збереження на основі ідей та принципів кріобіології унікальних властивостей клітин-попередників всіх гістотипових ліній, присутніх у первинних суспензіях, створення їх достатнього запасу - актуальні задачі, успішне рішення яких забезпечує подальший прогрес в регенераційній біології та медицині, клітинній трансплантології, генній інженерії та при створенні штучних органів. Однак метод кріоконсервування первинної суспензії СЕК, який би дозволив зберегти максимальну кількість клітинних елементів у повноцінному стані, до теперішнього часу не розроблений, а дослідження, спрямовані на порівняння дії свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК при травматичному ушкодженні тканин, залишаються актуальними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії в рамках планової теми НДР ІПКіК НАН України №7 “Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх кріочутливості і механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів”, № ДР 0102U002026, і теми № 9 “Вивчення клоногенного потенціалу і здатності до мультилінійної диференціації фібробластоподібних стромальних клітин ембріонів людини”, яка виконувалася згідно з планом НДР МНЦ ІПКіК НАН, АМН та МОЗ України.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначити умови отримання та кріоконсервування первинних суспензій СЕК щурів, а також оцінити їхній вплив на протікання репаративних процесів при експериментальному термічному ураженні шкіри і механічному ушкодженні суглобового хряща.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1. Визначити вплив попередньої ферментативної обробки тканин при одержанні СЕК щурів методом механічної дезінтеграції.

2. Вивчити вплив кріозахисних середовищ, які містять ДМСО, ембріональну сироватку та ПЕО-1500, на збереженість і здатність до адгезії та проліферації СЕК після кріоконсервування.

3. Оцінити вплив свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК на перебіг репаративних процесів у суглобовому хрящі на моделі травматичного ушкодження колінного суглоба у щурів.

4. Вивчити вплив свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК на перебіг відновлювальних процесів у шкірі щурів після експериментального термічного ушкодження.

5. Дослідити динаміку вмісту колагену, неколагенових білків і глікозаміногліканів у дермі щурів після термічного ушкодження і використання свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК.

Об'єкт дослідження Відновні процеси в дермі і хрящі щурів після їх експериментального ушкодження при використанні свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК із різною життєздатністю.

Предмет дослідження. Первинна суспензія СЕК при кріоконсервуванні та використанні на моделях механічного ушкодження колінного суглоба і термічної травми шкіри у щурів.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених задач були використані кріобіологічні, клініко-лабораторні, морфологічні, біохімічні і статистичні методи: програмне трьохетапне заморожування під захистом кріопротекторів; визначення кількості і збереженості клітин у суспензії; культивування клітин in vitro; моделювання травми сполучної тканини шкіри і суглобового хряща; планіметричне визначення площі ушкодженої шкіри; визначення лабораторних показників периферичної крові; гістологічна і гістохімічна оцінка стану шкіри і хрящової тканини; біохімічне визначення кількості специфічних білків і глікозаміногліканів (ГАГ) у дермі експериментальних тварин.

Отримані результати обробляли за допомогою статистичних методів Фішера-Ст'юдента, використовуючи пакет комп'ютерних програм “Microsoft Excel” та “Origin 6.1”.

Наукова новизна отриманих результатів. Визначені умови виділення та кріоконсервування первинної суспензії СЕК, які забезпечують одержання деконсервованих клітин з високими показниками збереженості і здатністю до існування в умовах культивування.

Вперше показано, що введення кріоконсервованої первинної суспензії СЕК у рану стимулює відновні процеси в зрілій сполучній тканині шкіри та суглобового хряща після їх експериментального ушкодження.

Встановлено, що введення кріоконсервованих СЕК у зону сполучнотканинного ранового дефекту сприяє зниженню місцевої і загальної запальної реакції у експериментальних тварин і посилює метаболічну і проліферативну активність клітинних елементів сполучної тканини, що сприяє прискоренню нормалізації рівня колагену, ГАГ і неколагенових білків у міжклітинній речовині дерми та суглобового хряща.

Вперше встановлено, що повнота і швидкість відновлення ушкодженої ділянки сполучної тканини залежать від життєздатності введених СЕК і знижуються в ряду: свіжоізольовані СЕК > кріоконсервовані СЕК > кріопошкоджені СЕК. При цьому навіть летально кріопошкоджені СЕК також виявляють позитивний вплив на активність проліферативно-відновних процесів у дермі та хрящі.

Практична значимість одержаних результатів. Експериментальне обгрунтування окремих параметрів на етапах виділення і кріоконсервування суспензії СЕК може бути використане задля удосконалення технологічного процесу при створенні низькотемпературного банку цих клітин. Отримані результати щодо скорочення терміну загоєння термічних і механічних ран під дією СЕК можуть бути підґрунтям для розробки нових клінічних прийомів корекції травматичних ушкоджень досліджених видів зрілої сполучної тканини. Результати, які свідчать про скорочення термінів загоєння ран при використанні кріопошкоджених СЕК, можуть стати основою для розробки безклітинних препаратів з високою ранозагоюючою дією.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно проведений аналітичний огляд літератури за темою дисертації, отримані результати експериментальних досліджень, проведений їхній аналіз та статистична обробка. Разом з науковим керівником проф. О.Ю.Петренком дисертантом були обговорені і узагальнені результати досліджень, а також сформульовані остаточні висновки. В опублікованих разом із співавторами роботах особистий вклад дисертанта полягає:

- у роботах [1, 2] _ у виділенні, кріоконсервуванні СЕК і дослідженні їхнього впливу на процеси регенерації при травматичному ушкодженні суглобового хряща у щурів;

- у роботах [3 - 5] _ у дослідженні використання ембріональних клітин при травмах;

- у роботі [6] _ у вивченні впливу факторів кріоконсервування на збереженість і морфофункціональну активність СЕК;

- у роботі [7] _ у проведенні експериментів щодо вивчення впливу ембріональних клітин на репаративні процеси у шкірі щурів після опіку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на III Міжнародній науково-практичній конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003), з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Міжнародній конференції „Проблеми інтеграції функцій у фізіології і медицині” (Мінськ, 2004), Міжнародній конференції „Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини”(Харків, 2005 р.).

Публикації. За матеріалами дисертації опубліковані 5 статей у наукових фахових виданнях, тез доповідей _ 3.

Обсяг і структура дисертації: Дисертаційну роботу викладено на 148 сторінках друкованого тексту, з яких 127 сторінок основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, заключної частини, висновків і списку цитованої літератури (21 сторінка), що включає 221 джерело. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями і 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Експерименти були проведені на 180 безпородних білих щурах відповідно до „Загальних принципів експериментів на тваринах”, схвалених I Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна) і узгоджених з положеннями “Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей” (Страсбург, 1985).

В роботі були використані 38 ембріонів щурів 12-14-ти діб гестації. Їх вилучали в стерильних умовах з рогів матки, промивали розчином Хенкса і відділяли покривні та м'язові тканини, які в подальшому подрібнювали на фрагменти розміром 1-2 мм3. Суспензію СЕК одержували методом механічної дезінтеграції фрагментів тканин у розчині Хенкса (Грищенко В.И., Петренко А.Ю., 2001). У випадку попередньої ферментативної обробки фрагменти тканин витримували в 0,25%-ому розчині трипсину (Голубев Д.Б. и др., 1976) при різних умовах: протягом 40 хвилин при 37°С; протягом 1, 3 або 6 годин при 20°С; 6 або 20 годин при 5°С.

В окремій серії експериментів були використані фрагменти відповідних тканин від 7-ми ембріонів людини 8-11-ти тижнів гестації, яки надходили після запланованого переривання вагітності за соціальними показниками та при наявності інформованої письмової згоди донора на використання даного біоматеріалу для дослідницьких цілей відповідно до вимог комісії з біоетики ІПКіК НАН України.

Кріоконсервування суспензії СЕК проводили на програмному заморожувачі „Сryoson” з використанням трьохетапної програми заморожування: 1єС/хв від 0єС до -40єС; 10єС/хв від -40єС до -80єС; занурення в рідкий азот (Грищенко В.И., Лобынцева Г.С., 1988). Середовищем заморожування був розчин Хенкса з додаванням 2, 5 або 10% однієї з кріозахисних речовин _ ДМСО, ПЕО-1500 чи ембріональної сироватки (ЕС) великої рогатої худоби. В ряді експериментів були використані кріозахисні середовища, які містили суміші вищезазначених компонентів. Відігрів клітинної суспензії проводили перед початком експерименту на водяній бані при 37°С, після чого видаляли кріопротекторний розчин.

В роботі також використовували летально кріопошкоджені клітини, отримані шляхом швидкого заморожування суспензії без кріопротектора (занурення у рідкий азот) з наступним швидким відігрівом при 37°С.

Збереженість клітин у суспензії визначали за допомогою експрес-методу прижиттєвого забарвлення трипановим синім (Seglen P., 1976). Кількість клітин підраховували в камері Горяєва (Меньшиков В.В., 1987).

Культивування СЕК проводили протягом 3 діб в стандартних умовах (Фрешни Р., 1989). При цьому оцінювали здатність клітин до адгезії, розпластування, поділу і формування осередків росту.

Вплив суспензії СЕК на відновні процеси в ранах суглобового хряща і шкіри оцінювали на моделях травматичного ушкодження колінного суглоба (Зупанец И.А. с соавт., 1989) і термічного ушкодження шкіри (Хакимов З.З., 1985) статевозрілих щурів. СЕК у зону дефекту вводили в кількості 1-2 Ч 106 клітин. Для фіксації СЕК в зоні дефектів шкіри і суглобового хряща застосовували різні носії. При травматичному ураженні суглобового хряща носієм була колагенова губка („Collagen-Implant-Braun", Німеччина), а при термічному ураженні шкіри - метилцелюлозний гель (Алюшин М.Т., 1974).

Усі тварини були розділені на такі експериментальні групи:

1 - контроль, самостійне загоєння рани;

2 - використання носія без клітин;

3 - використання свіжоізольованих СЕК;

4 - використання кріоконсервованих СЕК;

5 - використання кріопошкоджених СЕК.

При травматичному ушкодженні колінного суглоба шляхом артротомії суспензію СЕК вводили в рану безпосередньо після операції. Активність репаративних процесів оцінювали гістологічними та гістохімічними методами на 21-шу добу експерименту при використанні алогенних СЕК на 7-му та 14-ту добу - при використанні ксеногенного біоматеріалу (СЕК людини).

Термічне ушкодження шкіри викликали накладанням на 8 с мідної пластинки розміром 2,5 Ч 2,5 см2, яку нагрівали до 200°С. Алогенну суспензію СЕК наносили на поверхню рани через 24 години. Процес відновлення шкіри оцінювали на 3-ю, 7-му, 14-ту, 21-шу та 28-му добу після ушкодження шкіряного покриву. Дію суспензії СЕК на загоєння опікової поверхні в першу чергу оцінювали візуально, а планіметричним методом досліджували швидкість зменшення площі опіку (Попова Л.Н., 1969). Паралельно визначали концентрацію лейкоцитів, еритроцитів і загального гемоглобіну в периферичній крові щурів за загальноприйнятими лабораторними методами (Меньшиков В.В., 1987). Стан сполучної тканини в зоні термічного ушкодження оцінювали біохімічними методами за вмістом оксипроліну, тирозину, гексозамінів і гексуронових кислот та по їхньому співвідношенню (Boas N.P., 1953; Stegemann H., 1967; Bitter T., 1968; Слуцький Л.І., 1969).

Для гістологічних і гістохімічних досліджень фрагменти шкіри та хрящової тканини фіксували в 10%-ому розчині формаліну і заливали в парафін. Для отримання оглядових препаратів зрізи товщиною 5-7 мкм фарбували гематоксиліном та еозином та за методом Ван Гізон (Меркулов Г.А., 1961), глікозаміноглікани (ГАГ) виявляли за допомогою ШИК-реакціі за методом Мак Мануса-Хочкіса, та за комбінованим методом Моурі з альціановим синім (Пирс Э., 1962; Mowry R.W., 1963, Лилли Р., 1969) для визначення активності дезоксинуклеопротеїдів (ДНП) та рибонуклеопротеїдів (РНП) використовували офарблення за Фельгеном-Россенбеком і реакцію Браше (Волкова О.В., 1971).

Отримані результати обробляли за допомогою статистичних методів Фішера-Ст'юдента, використовуючи пакет комп'ютерних програм “Microsoft Exel” и “Origin 6.1”. Рівень вірогідності складав 0,05.

Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені комісією з біоетики ІПКіК НАН України.

Результати досліджень та їх обговорення

Визначення умов виділення і кріоконсервування СЕК щурів. Використання механічного методу дезінтеграції ембріональних тканин забезпечувало отримання первинної суспензії СЕК, збереженість яких була 31,8±3,0%, вихід клітин складав 23,9±2,1Ч106 на 1 г тканини.

Попередня ферментативна обробка вихідних тканин приводила до достовірного збільшення збереженості клітин. У той же час вихід клітин після обробки тканин ферментом протягом 1, 3 або 6 годин залишався низьким. Подовження строків ферментативної обробки до 20 годин в умовах гіпотермії (5°С) дозволило суттєво (у 2 рази) збільшити вихід клітин у порівнянні з механічною дезінтеграцією і отримати максимальний вихід клітин з високою життєздатністю. СЕК, які були отримані при механічній дезінтеграції з використанням попередньої ферментативної обробки тканин в умовах гіпотермії, при короткостроковому культивуванні активно адгезували до субстрату, розпластувалися і в подальшому формували моношар.

Кріоконсервування без використання кріопротекторів за стандартною для клітинних суспензій трьохетапною програмою заморожування не дозволяло зберегти СЕК щурів

Введення в середовище заморожування непроникаючого кріпротектора ПЕО-1500 або ЕС у концентраціях 2 і 5% не сприяло суттєвій кріозахисній дії. Збільшення концентрації ЕС і ПЕО-1500 до 10% дозволило значно покращити результати, однак рівень збереженості деконсервованих СЕК не перевищував 30%.

Введення до складу кріозахисного середовища проникаючого кріопротектора ДМСО в концентрації 2% запобігало загибелі клітин. При використанні концентрації ДМСО 5 і 10% рівень збереженості деконсервованих СЕК збільшувався. Максимальне значення _ 52,8±2,6% _ було отримане при кріоконсервуванні СЕК у присутності 10% ДМСО

Враховуючи можливість адитивного ефекту кріопротекторів із різним механізмом дії, оцінювали сумісний вплив на збереженість СЕК ДМСО, з одного боку, ЕС або ПЕО-1500 - з іншого. Було використано концентрацію ПЕО-1500 і ЕС 10%, яка забезпечувала найбільший кріозахисний ефект при самостійному використанні цих речовин. При додаванні 10% ЕС та 10% ДМСО кількість збереженних клітин збільшувалась на 15,9±1,1% у порівнянні з кріозахисним середовищем без ЕС і складала 68,7±4,4%. У той же час введення 10% ПЕО-1500 в кріозахисне середовище, яке містило 10% ДМСО, не приводило до підвищення збереженості кріоконсервованих СЕК.

Вивчення поведінки кріоконсервованих СЕК в умовах короткочасної культури підтвердило значення складу кріозахисного середовища: тільки ті клітини, які були кріоконсервовані в присутності 10% ДМСО і 10% ЕС, при перенесенні в культуральне середовище після відігріву і відмивання прикріплювалися до пластика, розпластувалися і на 3-ю добу спостереження формували окремі осередки росту, що свідчить про їхню біологічну повноцінність після кріоконсервування. Тому в подальших експериментах з модельними травматичними ушкодженнями шкіри і суглобового хряща використовували СЕК, кріоконсервовані за трьохетапною програмою в середовищі з 10% ДМСО та 10% ЕС.

Вплив СЕК на проліферативно-відновні процеси в хрящі на моделі травматичного ушкодження колінного суглоба у щурів. Порівняльне вивчення дії свіжоізольованих, кріоконсервованих і кріопошкоджених СЕК на перебіг репаративних процесів при травматичному ушкодженні хрящової тканини показало, що через 21-шу добу після травми хряща колінного суглоба у тварин груп 1 (контроль) і 2, (в рану вводили носій - колагенову губку без клітин), відновлювання цілісності суглобового хряща не відбувалось. Поблизу дефекту гістологічно спостерігалися ділянки стоншення і поверхневої деструкції суглобового хряща, а також дистрофічні зміни: послаблення базофілії основної речовини, каріопікноз хондроцитів, зниження, а в деяких випадках і повна відсутність фарбування ядер хрящових клітин, що вказує на деконденсацію ядерного хроматину. Також мали місце послаблення фарбування ядер клітин при реакції Фельгена-Россенбека і слабка піронінофілія цитоплазми клітин при фарбуванні за методом Браше, що свідчить про зниження вмісту ДНП та РНП, отже, про низьку біосинтетичну і проліферативну активність. Хрящовий дефект заміщався, головним чином, за рахунок фіброретикулярної тканини. В зоні травми кількість ГАГ і проліферативна активність клітинних елементів залишались на низькому рівні.

У той же період при спостереженні за тваринами, яким вводили суспензії свіжоізольованих (група 3) або кріоконсервованих (група 4) СЕК, поблизу ранового дефекту виявляли хондробласти в стані активної проліферації. В цих клітинах гістохімічно визначали високий вміст ДНП і РНП, що свідчило про значну проліферативну і біосинтетичну активність клітин, а в міжклітинній речовині виявляли високий рівень ГАГ, тобто мала місце інтенсивна репарація хрящової тканини. Відмічалося заміщення травматичного дефекту новоутвореною хрящовою тканиною.

Після введення в зону дефекту кріопошкоджених клітин (група 5) також виявлялась інтенсифікація репаративно-проліферативних процесів, однак вона була значно меншою, ніж при використанні життєздатних клітин.

Наведені результати свідчать, що свіжоізольовані СЕК, які вводили в зону ушкодження, позитивно впливають на проліферативно-відновлювальні процеси в хрящовій тканині, а кріоконсервування цих клітин дозволяє в достатній мірі зберегти цю здатність. Позитивний вплив на темп відновлення цілісності суглобового хряща виявлено також і при використанні кріопошкоджених СЕК. Це дозволяє припустити, що стимулом репаративної регенерації суглобового хряща є біологічно активні речовини, які присутні в суспензії СЕК та здатні індукувати хондрогенез в зоні дефекту.

Це припущення підтверджують результати експериментів, коли застосовували ксеногенні СЕК людини, які виділяли і кріоконсервували методами, що використовувались для клітин щурів. Введення СЕК людини в зону травматичного ушкодження суглобового хряща щурів приводило до прискорення темпів формування репаративної бластеми в зоні травми. На 14-ту добу після введення клітин дефект у суглобовому хрящі заповнювався молодою гіаліновою хрящовою тканиною. Очевидно, введення СЕК стимулювало проліферативну активність і хондрогенне диференціювання клітин у бластемі, що підтверджувалось більш раннім формуванням гіалінової хрящової тканини в зоні ушкодження порівняно з контролем.

Вплив СЕК на репаративні процеси в дермі при термічному ушкодженні шкіри у щурів. Для більш повного уявлення про відновні процеси, які протікають у травмованих тканинах мезенхімально-мезодермального походження під впливом СЕК, був досліджений перебіг репаративних процесів при введенні алогенних СЕК на іншому виді сполучної тканини, а саме, у дермі після експериментального термічного ушкодження. Використання моделі контактного термічного ушкодження забезпечило формування дефекту шкіряного покриву всіх шарів епідермісу і дерми. Зона ушкодження відразу після нанесення термічної травми мала вигляд щільної ділянки коричневого кольору, площа якої становила 6,25 ± 3,3 см2. Через 24 години після нанесення термічної травми у всіх тварин спостерігали формування ранової поверхні, яка вдвічі перевищувала початкову площу рани. В подальшому площа ушкодження зменшувалась. Термін загоєння і стан рани залежали від наявності та особливостей пластичного матеріалу, що використовувався.

З рисунку 2 видно, що у тварин груп 1 (контроль) та 2 (безклітинний носій), площа рани повільно зменшувалась протягом всього терміну спостереження. У щурів, яким вводили кріопошкоджені клітини (група 5), загоєння відбувалося швидше, ніж в групах 1 і 2. Однак до кінця експерименту (на 28-му добу) шкіра у тварин цієї групи, як і в групах 1 і 2, повністю не відновлювалась. Нанесення на поверхню термічної травми суспензії cвіжоізольованих та кріоконсервованих СЕК (групи 3 і 4, відповідно) приводило до достовірного зменшення площі ран вже на 3-ю добу порівняно з контролем. На 7-му добу площа рани у тварин групи 3 була меншою в 10,3 рази, ніж у контролі, а в групі 4 _ в 5,2 рази. На 14-ту добу експерименту у більшості тварин цих груп спостерігалося повне закриття ранового дефекту, а на 21-шу добу - повноцінне відновлення ураженої ділянки дерми з утворенням тонкого рубця, який зникав на 28-му добу спостережень.

Гістологічний і гістохімічний аналіз препаратів шкіри щурів показав, що на 3-ю добу після термічної травми в групах 1 (контроль) і 2 (носій) в епідермісі та дермі спостерігались дистрофічні та некротичні зміни: різкий пікноз ядер у клітинах епідермісу та дерми, загибель усіх шарів епідермісу, руйнування колагенових волокон, значна запальна реакція та збільшення кількості „++++” ШИК-позитивних нейтральних ГАГ, що вказує на переважання деструктивних процесів над репаративними. Ознаки проліферативно-відновлювальних процесів у сполучній тканині тварин цих груп спостерігалися, починаючи з 14-ї доби. В цей час, незважаючи на присутність лейкоцитарного інфільтрату в тканині, в зоні некрозу спостерігався синтез кислих ГАГ. Епітелізація ран спостерігалась з 21-ї доби експерименту, однак до кінця терміну спостереження (28-а доба) змикання країв рани і повного формування усіх шарів епідермісу не відбувалося.

Після нанесення на ділянку термічно ураженої шкіри суспензії свіжоізольованих та кріоконсервованих СЕК (групи 3 і 4, відповідно) вже на 3-ю добу рівень лейкоцитарної інфільтрації був нижчий, ніж в групах 1 та 2. Виражений розвиток грануляційної тканини виявлявся на 7-му добу, що підтверджувалось присутністю на гістологічних зрізах великої кількості кровоносних судин і клітин фібробластичного ряду, що проліферують. В цей строк спостерігалися помірна „++” _ “+++” ШИК-позитивна реакція на нейтральні ГАГ і більш інтенсивна “++++” реакція на кислі ГАГ, що також вказує на інтенсивність перебігу репаративно-відновлювальних процесів у термічно ураженій тканині. Загоєння дефекту з дифузним відновленням структури шкіри закінчувалось на протязі 3-го тижня спостереження.

Гістологічне і гістохімічне відновлення тканинних структур після використання кріопошкоджених клітин (група 5) відбувалося швидше, ніж в групах 1 і 2, але було менш виразним, ніж у тварин, яким вводили свіжоізольовані і кріоконсервовані СЕК.

Після встановлення позитивного впливу СЕК на загоєння обмеженого термічного дефекту шкіряного покриву доцільно було оцінити загальний стан організму експериментальних тварин за допомогою стандартних лабораторних показників: рівня гемоглобіну, кількості еритроцитів та лейкоцитів у периферічній крові. Термічне ушкодження шкіри призводило до розвитку анемії, яка виражалась в різкому зниженні рівня гемоглобіну (на 52%) і кількості еритроцитів (на 44%) у порівнянні з відповідними показниками інтактних тварин. Починаючи з 3-ї доби, рівень гемоглобіну та кількість еритроцитів повільно підвищувалися, але до кінця строку експерименту (28 діб) вони не досягали значень відповідних показників у інтактних щурів. Використання суспензій СЕК призводило до швидкого відновлення еритропоезу. В групах 3 і 4 на 28-му добу спостереження рівень гемоглобіну і кількість еритроцитів не відрізнялися від норми, а в групі 5 вони, хоча і не досягали значень таких показників у інтактних тварин, але були вищими, ніж у щурів груп 1 та 2.

Кількість лейкоцитів в периферичній крові щурів через добу після термічної травми шкіри збільшувалась в 2,2 рази, на 3-ю добу _ ще на 14,4%, на 7-му добу _ незначно знижувалась і практично не змінювалася до кінця експерименту. Нанесення на термічно уражену поверхню шкіри свіжоізольованих, кріконсервованих чи кріопошкоджених СЕК приводило до суттєвого зниження рівня лейкоцитів у периферічній крові щурів вже на 3-ю добу спостереження, а на 14-ту добу цей показник не відрізнявся від норми.

Таким чином, отримані результати дозволяють вважати, що СЕК, при позитивній місцевій дії, впливають на досліджувані показники периферічної крові, що може вказувати на їхню дію на рівні цілісного організму.

Вплив СЕК на стан компонентів позаклітинного матриксу в дермі щурів після термічного ушкодження. У роботі досліджували показники стану волокон позаклітинного матриксу: рівень оксипроліну (ОП), який характеризує вміст колагену, а також тирозину, який відбиває вміст неколагенових білків шкіри. Крім того, визначали кількість гексозамінів і гексуронових кислот (ГК), які є компонентами основної речовини позаклітинного матриксу.

Як видно з рисунку 3, після термічної травми вміст ОП в шкірі тварин всіх експериментальних груп був значно вищим, ніж в шкірі інтактних тварин. В контрольній групі 1 та групі 2 цей рівень зберігався протягом всього періоду спостереження (до 14-ї доби).

Після нанесення на рану свіжоізольованих і кріоконсервованих СЕК (групи 3 та 4, відповідно) вже на 3-ю добу спостерігалося достовірне зниження вмісту ОП а, починаючи з 7-ї доби, цей показник відповідав нормальним значенням. У тварин групи 5, яким на рану наносили кріопошкоджені клітини, зниження рівня ОП було зафіксовано тільки на 14-ту добу і при цьому значень норми він не досягав.

Вміст тирозину, який входить до всіх видів глікопротеїнів, відбиває рівень неколагенових білків у тканинах. Термічне ушкодження шкіри призводило до підвищення рівня тирозину, збільшення його відбувалося в групах 1 і 2 протягом першого тижня спостереження.

Тенденцію до зниження тирозину спостерігали тільки наприкінці другого тижня експерименту. Усі досліджувані суспензії СЕК сприяли нормалізації цього показника вже на початковому етапі експерименту - у тварин груп 3, 4, та 5 рівень тирозину в рані був значно нижчим, ніж в контрольній групі.

Однак подальше спостереження виявило відмінності в позитивній дії суспензій СЕК з різним ступенем збереженості. В групі 3, де використовували свіжоізольовані СЕК з високою життєздатністю, рівень тирозину нормалізувався швидко і вже на 7-му добу був достовірно нижчим початкових значень. В групі 4 процес був повільнішим, достовірне зниження виявлялося пізніше, але на 14-ту добу рівень тирозину відповідав нормі. Динаміка рівня тирозину в групі 5 після використання суспензії летально кріопошкоджених СЕК була такою ж, як і в групі 4, однак цей показник до кінця експерименту не досягав норми.

Важливим показником стану ураженої шкіри є вміст гексозамінів - вуглеводних компонентів, які містять нейтральні вуглевод-білкові комплекси і глікозаміноглікани. Після термічного ушкодження рівень гексозамінів в групах 1 і 2 підвищувався, що може пояснюватись їх попаданням в тканину з судинного русла внаслідок ексудаці. Підвищений рівень гексозамінів у тварин цих груп зберігався протягом всього експерименту.

При використанні свіжоізольованих та кріоконсервованих СЕК вміст гексозамінів в ушкодженій тканині на 3-ю добу не відрізнявся від значень інтактних тварин. На 7-му добу відзначалося незначне підвищення вмісту гексозамінів, на 14-ту добу цей показник знову відповідав нормі. При використанні кріопошкоджених СЕК спостерігалося підвищення вмісту гексозамінів на 3-ю добу після опікової травми. Починаючи з 7-ої доби, цей показник достовірно знижувався відносно контрольних значень, але на 14-ту добу вміст гексозамінів не досягав норми.

Вивчення динаміки рівня гексуронових кислот - ще одного з показників, що характеризують склад основної речовини дерми - показало, що термічне ушкодження шкіри приводило на 3-ю добу до дворазового його зниження. На 7-му добу спостерігалось достовірне підвищення рівня ГК, однак на 14-ту добу відновлення цього показника до рівня норми не відбувалось.

Після нанесення на рану суспензій СЕК зниження рівня ГК у відповідь на термічне ушкодження було менш виразним. В групах тварин, яким вводили свіжоізольовані і кріоконсервовані СЕК, на 7-му добу експерименту рівень ГК відповідав нормальним значенням. В групі тварин, яким вводили кріопошкоджені клітини, характер змін вмісту ГК був подібним до груп 3 та 4, однак рівень цього показника відновлювався повільніше.

Таким чином, використання свіжоізольованих, кріоконсервованих та кріопошкоджених СЕК в значній мірі прискорювало нормалізацію вмісту компонентів волокнистої строми та основної речовини _ колагену, неколагенових білків і глікозаміногліканів _ в позаклітинному матриксі сполучної тканини. Це можна пояснити, з одного боку, скороченням фази запалення під дією СЕК, що дозволяє клітинним елементам дерми проліферувати і пропорційно синтезувати кількість всіх компонентів позаклітинного матриксу, а з другого - біологічно активні речовини СЕК, очевидно, мають прямий регулюючий вплив на стан сполучної тканини, що забезпечує нормотипове відновлювання травмованої ділянки шкіри.



ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі представлено теоретичне та експериментальне узагальнення наукової проблеми, яка стосується вдосконалення методів кріоконсервування соматичних ембріональних клітин шляхом визначення умов виділення клітин і складу адекватних кріоконсервуючих середовищ, а також доцільності використання кріоконсервованої первинної суспензії СЕК для стимуляції репаративних процесів в ушкодженій сполучній тканині шкіри та суглобового хряща.

1. Визначені умови виділення СЕК щурів: показано, що поєднання попередньої ферментативної обробки тканин протягом 20 годин в умовах гіпотермії з наступною механічною дезінтеграцією є оптимальним для отримання первинної суспензії життєздатних клітин, які спроможні прикріплюватись до субстрату, розпластуватись та формувати моношар в умовах культивування in vitro.

2. Порівняння кріозахисної дії ДМСО, ембріональної сироватки, ПЕО-1500 та їх комбінацій при кріоконсервуванні СЕК за трьохетапною програмою заморожування виявило перевагу середовища заморожування, яке містить 10% ДМСО та 10% ембріональної сироватки - деконсервована cуспензія мала збереженість клітин не нижче 60%, які були здатні при подальшому культивуванні до формування осередків росту.

3. Введення суспензії свіжоізольованих, кріоконсервованих та летально кріопошкоджених СЕК в зону механічної травми суглобового хряща стимулює проліферацію хондробластів і підвищує активність ГАГ матриксу суглобового хряща, що забезпечує формування гіалінового хряща із структурою, яка є специфічною для суглобового хряща.

4. Використання свіжоізольованих та кріоконсервованих СЕК при введенні в ділянку експериментальної термічної травми шкіри сприяє приско-ренню розвитку грануляційної тканини на фоні зниження рівня лейкоцитарної інфільтрації ушкоджених тканин, стимулює проліферацію фібробластів та синтез глікозаміногліканів, що веде до скорочення строків відновлення шкіряного покриву та забезпечує формування нормотипічного регенерату.

5. Місцеве застосування первинних суспензій СЕК у тварин з термічною травмою призводить до нормалізації таких лабораторно-клінічних показників периферічної крові, як рівень гемоглобіну, кількість еритроцитів та лейкоцитів.

6. Введення первинних суспензій СЕК в зону термічного ушкодження шкіри сприяє нормалізації вмісту основних компонентів позаклітинного матриксу сполучної тканини (колагену, тирозину та глікозаміногліканів), що забезпечує прискорення загоєння ушкодженої тканини.

7. Повнота і швидкість відновлення ушкодженої ділянки сполучної тканини залежать від життєздатності введених СЕК і знижуються в ряду: свіжоізольовані СЕК > кріоконсервовані СЕК > кріопошкоджені СЕК.



ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Грищенко В.И., Петренко А.Ю, Жигун А.И., Сукач А.Н., Ревенко Е.Б. Влияние трансплантации криоконсервированных мезенхимальных клеток эмбрионов человека на процессы регенерации при травматическом повреждении суставного хряща крыс // Проблемы криобиологии. - 2001. - №2. - С. 106-108.

2. Ревенко Е.Б., Бабалян В.А., Горголь Н.А., Волкова Н.А., Петренко А.Ю. Аллотрансплантация свежевыделенных и криоконсервированных мезенхимальных эмбриональных клеток, стимулирующая репаративную регенерацию хряща крыс // Проблемы криобиологии. - 2003. - № 1. - С. 7-16.

3. Грищенко В.І., Гончарук О.І., Кощій С.В., Петренко Т.П., Ревенко О.Б., Висеканцев І.П., Гапон Г.О. Новий ембріональний препарат “Ембріогель”: характеристика та перспективи застосування // Трансплантологія. - 2003. - Т.4.- № 1. - С. 20-23.

4. Ревенко Е.Б., Петренко А.Ю., Гончарук Е.И., Волкова Н.А., Петренко Т.Ф., Волина В.В. Изучение возможности биостимуляции заживления ожоговых ран суспензией свежевыделенных и криоконсервированных мезенхимальных эмбриональных клеток // Проблемы криобиологии. - 2004. - № 4. - С.34-41.

5. Ревенко Е.Б., Петренко А.Ю. Способность криоконсервированных эмбриональных клеток стимулировать восстановление соединительной ткани после травматического повреждения в эксперименте // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15. - № 3. - С. 353-356.

6. Ревенко Е.Б., Гурина Т.М., Петренко Т.Ф., Петренко А.Ю. Выбор криозащитной среды для криоконсервирования клеток мезенхимально-мезодермального происхождения // Експериментальна і клінічна медицина. - 2006. - № 1. - С. 53-58.

7. Петренко Т.П., Волкова Н.О., Гончарук О.І., Ревенко О.Б., Грищенко В.І. Оцінка ефективності застосування нативних та культивованих ембріональних фібробластів людин // Тези доповідей. Установчий з`їзд українського товариства клітинної біології. - Львів, 2004. - С. 154.

8. Ревенко Е.Б. Влияние трансплантации суспензии мезенхимальных эмбриональных клеток на процессы восстановления кожных покровов после термического ожога у крыс // Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине: Материалы Международной конференции. - Минск: „Бизнесофсет”, 2004. - С. 329-331.

Размещено на Allbest.ru

...