Модифікація та функціоналізація зондів і субстратів для нанобіотехнології

З 108 індивідуальних молекул ссДНК, якi було досліджено, найхарактерніші варіанти молекул з відповідними параметрами представлено. З них кількість плектонемічних су-перспіральних ДНК) з низькою щільністю супервитків у ~ -0,02 дорівнює 21 %; надсуперспіральні ДНК з високим значенням у ~ -0,13, що утворюють суперспіральну вісь першого порядку (В3), - 12 %; надссДНК, що утворюють вісь суперспіралі другого порядку (С3, В2, С2), - 27 %; молекули, що утворюють суперспіральну вісь третього порядку (D2, D3, E2), - 14 %; найбiльш висококомпактизовані молекули - сфероїди - 17 %.

Довжина суперспіральної осі першого порядку молекул ссДНК становить ~ 466 - 570 нм. При підвищенні рівня компактизації ДНК утворюється вісь суперспіралі другого порядку дов-жиною ~ 280 нм (що становить ~ 20 % від контурної довжини релаксованої молекули). В результа-ті подальшої компактизації утворюються молекули з ще вдвічі меншою довжиною суперспіраль-ної осі (довжина осі третього порядку дорівнює l = 140 нм, що становить ~ 10 % від контурної дов-жини релаксованої молекули), мінітороїди діаметром ~ 50 нм, а також молекули у сферичній конформації - напівсфероїди та сфероїди.

Оскільки раніше конденсацію ДНК під впливом різних факторів було виявлено тільки для ди-мерів, тримерів, але не для поодиноких молекул ДНК (Hansma, 1997; Dunlap, 1997), розглянемо детальніше С-подібну надсуперспіральну молекулу, конформація якої подібна до тороїда. АСМ-зображення цієї молекули з вищою роздільною здатністю та її тривимірне зобра-ження наочно демонструють, що дану надссДНК утворено декількома чітко помітними нитками (стрілками вказано частину молекули, утворену трьома нитками, які локально розійшлися). Показаний профіль перерізу, проведеного через ці нитки (на вставці показано лі-нію, вздовж якої проведено січну площину перпендикулярно площині рисунка), дозволяє визначи-ти їх висоту. Необхідно відзначити, що вимірювання висоти біомолекули, іммобілізованої на суб-страті, з субнанометровою роздільною здатністю є вкрай важливою особливістю атомно-сило-вої мікроскопії, що вигідно відрізняє її і в цьому відношенні від електронної мікроскопії. Оскільки висота двох ниток ДНК становить h = 0,3 нм (що відповідає характерному значенню висоти для дволанцюгової молекули ДНК, іммобілізованої на слюді (Tanigawa et al., 1998)), а висота третьої нитки дорівнює h = 0,6 нм, то це означає, що дві нитки надссДНК, що розійшлися, є дволанцюго-вими нитками ДНК, а нитку, висота якої дорівнює подвійній висоті молекули ДНК на слюді (h = 0,6 нм), утворено двома закрученими дволанцюговими нитками.

Таким чином, аналіз цього профілю перерізу показав, що С-подібну надссДНК утворено чотир-ма дволанцюговими нитками ДНК. Оскільки контурна довжина наведеної надссДНК становить L = 260 нм, це означає, що дану компактизовану структуру утворено поодинокою кільцевою молеку-лою ДНК, “складеною навпіл”. Зазначимо, що за контурної довжини L = 260 нм число ниток ДНК у профілі перерізу для димера повинно було б становити вісім.

Представлений інший профіль перерізу цієї С-подібної молекули також підтверджує, що дану молекулу утворено нитками, висота яких дорівнює висоті двониткової ДНК (h = 0,3 нм). Фактично аналіз профілю перерізу поряд з визначенням виключеного об'єму молекули також до-зволяє диференціювати мономолекулярні структури від агрегатів, утворених декількома молекулами.

Іншою візуалізованою нами структурою, зовні схожою на сфероїд на АСМ-зображенні з неви-сокою роздільною здатністю, є мінітороїд. З профiлiв перерізів можна бачити, що три із чотирьох сегментів тороїда мають однакову висоту (h = 1,74 нм), а четвертий сегмент має майже вдвічі меншу висоту (h = 0,84 нм). Це означає, що у четвертому сегменті число обертів джгута ссДНК менше, ніж у інших трьох сегментах, тобто мінітороїд являє собою своєрідне міні-кільце з розрізом у верхній частині, довжина якого дорівнює чверті довжини кола.

На основі аналізу отриманих АСМ-зображень нами запропоновано схему поетапної компакти-зації як для поодиноких молекул ДНК, так і для димерів. Позиції В1, С1, D1, Е1, якi виді-лені прямокутником, відповідають димерам ссДНК, що визначено на основі обчислення об'ємів вищезгаданих молекул, всі інші позиції - поодиноким молекулам. Найменш компактизовані моле-кули наведено на поз. А1-А3, найкомпактизованіші - на поз. Е1-Е3. На поз. А3 наведено зобра-ження ссДНК pGEMEX, іммобілізованої на свіжосколотій слюді з іонами Mg²⁺. Молекули ссДНК pGEMEX, іммобілізовані на стандартній амінослюді (поз. А1, А2) з високим значенням поверхне-вої щільності заряду у порівнянні із свіжосколотою слюдою, мають інший вигляд. Вони схожі на плектонемічні молекули ДНК, але є компактизованішими, тобто локалізованими на меншій площі субстрату.

При переході до модифікованої амінослюди, яка характеризується значно більшою поверхневою щільністю заряду у порівнянні зі стандартною амінослюдою, спостерігається кілька варіантів компактизації ссДНК. На першому етапі зростає кількість вузлів і утворюються надсуперспіральні молекули ДНК (В3), тобто своєрідні джгути. Кількість вузлів для даної молекули стано-вить n = 19 та, як наслідок, значення щільності супервитків = -0,13. Кількість вузлів в молекулі було розраховано візуально з АСМ-зображення (біла крапка, або пляма, на АСМ-зображенні від-повідає вузлу), а також за допомогою побудови профілів перерізу молекули. У другому варіанті молекулу ДНК було розбито на декілька фрагментів, для кожного з яких побудовано подовжній переріз молекули по висоті площиною, перпендикулярною площині рисунка. Характер поперечно-го профілю перерізу та значення висоти ниток молекули, які локально розійшлися, свідчать про те, що джгутоподібна структура утворена поодинокою молекулою ссДНК.

Нами також візуалізовано молекули ДНК, які мають значно меншу довжину осі суперспіралі - l = 279 нм та l = 140 нм). Оскільки об'єм обох молекул збігається з об'ємом по-одинокої молекули ДНК pGEMEX, можна припустити, що молекулу з l = 279 нм утворено в результаті складання вдвічі молекули з l = 567 нм (рис. 12б), а молекулу з довжиною осі l = 140 нм - складанням вдвічі молекули з довжиною осі l = 279 нм. Таким чином, при іммобілізації молекул ссДНК на поверхні амінослюди з підвищеною щільністю аміногруп ві-зуалізовано надсуперспіральні ДНК, що утворюють осі суперспіралі другого та третього порядку, довжина яких приблизно в два та чотири рази менша, ніж довжина осі супер-спіралі першого порядку відповідно.

Компактизацiя на модифікованiй амінослюдi вiдбувається не тiльки для поодиноких молекул ДНК, а й для олігомерів. Молекули, АСМ-зображення яких показано у поз. В1, С1, D1, Е1, утворюють димери, що визначено нами на основі обчислення їхніх об'ємів. Спочатку дві плектонемічнi молекули (А1, А2) утворюють джгутоподібні структури (В1). У подальшому мож-ливе формування тороїда (С1, D1) або джгута (Е1), довжина суперспіральної осі якого становить чверть контурної довжини релаксованої молекули. Позиція D2 також відповідає тороїду, утворе-ному двома молекулами надссДНК.

Повертаючись до схеми компактизації ДНК, зазначимо, що на другому етапі джгуто-подібна молекула (В3) складається вдвічі - довжина суперспіральної осі зменшується в два рази (С3, В2, С2). На цьому етапі можливе як подальше формування джгутів (С3), так і утво-рення тороїдів (С2). На третьому етапі утворюються коротші джгути з ще вдвічі меншою довжи-ною суперспіральної осі l ~ 140 нм (D2). Крім того, можливе формування мінітороїда (D3) як iз то-роїда (С2), так і з джгутовидної молекули (С3). На четвертому етапі подальша компактизація торо-їдів та джгутів веде до виникнення напівсфероїдів (Е2) та сфероїдів. Цікаво відзначити, що мініто-роїди виникають як групами, так і поодинокими структурами.

Намагаючись відповісти на запитання, чому різні молекули ДНК компактизовані до різного рів-ня, можна припустити, що (і) на поверхні модифікованої амінослюди протоновані аміногрупи ло-калізовані неоднорідно; (іі) найкомпактизованiшi структури - сфероїди та напівсфероїди - утво-рюються на ділянках модифікованої амінослюди з максимальною щільністю активних аміногруп.

Локалізація морфологічно близьких форм ссДНК (мінітороїдів, джгутоподібних молекул з дов-жиною осі суперспіралі l ~ 570 нм та l ~ 280 нм) на ділянках слюди розміром ~ 500 нм Ч 500 нм вказує на те, що поверхнева щільність заряду модифікованої амінослюди варіює. А наявність тако-го градієнта щільності заряду спричиняє різне екранування фосфатних груп ДНК та, як наслідок, утворення варіантів компактизованих ссДНК, що морфологічно відрізняються. Крім того, дослі-джуваний зразок ДНК містить набір топоізомерів, що характеризуються різною щільністю супер-витків. У випадку, якщо характерний час компактизації ДНК має близьке значення до часу досяг-нення молекулами ДНК поверхні амінослюди, топоізомери з різною кількістю супервитків можуть конденсуватися в агрегати з різним рівнем компактизації.

Таким чином, запропонована модель компактизації ДНК демонструє, що в умовах високої поверхневої щільності заряду субстрату, на якому іммобілізовані молекули ДНК, можлива надзви-чайна компактизація не тільки димерів, тримерів ДНК, але й поодиноких молекул ДНК з поетап-ним складанням молекул вдвічі та формуванням осей суперспіралі другого та третього порядків. Однією з причин подовжнього стискування та внутрішньомолекулярної компактизації ДНК може бути збільшення гнучкості ДНК при збільшенні рівня нейтралізації фосфатних груп (саме це передбачає теорія Manning, 1978, а підтверджено експериментально Podesta et al., 2005).

Модифікація та функціоналізація зондів і субстратів для атомно-силової мікроскопії. По-верхневі властивості стандартної амінослюди були охарактеризовані двома методами - (і) атомно-силовою мікроскопією у режимі силових вимірювань та візуалізацією лінійних та суперспі-ральних молекул ДНК, адсорбованих на амінослюді. Режим силових вимірювань контактного ва-ріанта АСМ був застосований для характеристики амінослюди та амінозондів, а також амінозондів, функціоналізованих молекулами ДНК, глютаральдегiду, гомобiфункцiональними лiнкерними агентами та бичачого сироваткового альбумiну шляхом визначення сили адгезії та роботи сили ад-гезії між поверхнями, що взаємодіють. Один цикл силових вимірювань складається із двох етапів: (i) зближення поверхонь зонда та субстрату при переміщенні сканера від деякого заданого поло-ження відносно осі Z до положення Z = 0 та (ii) їхнього наступного віддалення від положення ска-нера Z = 0 до заданого значення Z. При цьому записують два силових графіки, що відповідають зближенню зонда та субстрату з відстані Z = 90-180 нм до Z = 0 нм та наступному їхньому відда-ленню. Характер обох графіків для пар поверхонь аміномодифікована слюда - зонд та свіжосколота (немодифікована) слюда - зонд у буферних розчинах за різних іонних умов вказує на особливості міжмолекулярних сил між поверхнями зонда та субстрату, що взаємодіють.

Аміногрупи, що покривають поверхню слюди після її модифікації за допомогою АПТЕС, є по-зитивно зарядженими за рН 7,6. Це призводить до адгезивного ефекту між позитивно зарядженою амінослюдою та негативно зарядженим зондом завдяки електростатичній взаємодії між аміногрупами модифікованої слюди та гідроксигрупами зонда. Сила адгезії між амінослюдою та зондом зменшується у 1,5-2 рази при зростанні іонної сили у 10 разів з наступним ще значнішим екрануванням заряду аміногруп за рН 11,2. Крім стандартної амінослюди (АП1-слюди) аналогічні силові вимірювання з тими ж самими кантилеверами було проведено для АП2-слюди (час обробки якої в парах АПТЕС становив 2 години при збереженні всіх інших пара-метрів протоколу модифікації), для якої було знайдено зростання сили адгезії та, отже, поверхне-вої щільності позитивного заряду порівняно з АП1-слюдою. Ми випробували значну кількість протоколів аміномодифікації слюди та нітриду кремнію в парах АПТЕС, але найвищу якість АСМ-зображень плектонемічної суперспіральної ДНК було досягнуто для стандартної та модифікованої амінослюди. Зазначимо, що нам також не вдалося отримати якісні АСМ-зображення ДНК, іммобілізованої на АП2-слюді. Цей факт наочно демонструє надзвичайну залежність якості АСМ-зображення ДНК, адсорбованої на слюді, навіть від невеликих змін протоколу модифікації слюди.

Переваги поєднання методики іммобілізації ДНК на амінослюді з можливостями АСМ (над традиційними методами електронної та кріоелектронної мікроскопії) дозволили нам візуалізувати таку неканонічну структуру, як хрест, що утворений інвертованими повторами, суперспіральної ДНК pUC8. Зображення сcДНК pUC8 на стандартній амінослюді, отримане за допомогою вібрую-чого варіанта ACM у повітрі, показує, що хрест виглядає як різко окреслені виступи на нитці ДНК з довжиною пліч (тобто шпильок), яку можна оцінити безпосередньо із АСМ-зображення. Аналіз наших експериментальних результатів показує, що в утворенні шпильки беруть участь 11-12 пар нуклеотидів, а термодинамічний аналіз інвертованих повторів підтвердив, що хрест утворено 52 нуклеотидами. Для порівняння зазначимо, що паліндромні ділянки, у яких за допомогою методів двовимірного електрофорезу та обробки нуклеазами були зареєстровані хрес-топодібні структури у ДНК фага Х 174, плазмід pBR322, ColE1, pAO3, становлять 9-13 п.н. у спі-ральних ділянках кожної з шпильок хреста, а їхні петлі містять 3-5 нуклеотидів (Lilley, 1980; Lya-michev et al., 1984). Вільна енергія G шпильки, яка утворює хрест у ДНК pUC8, становить -17,8 ккал/моль.

З метою з'ясування зв'язку між шпильковими структурами (які було візуалізовано нами для плазміди pUC8 у вигляді утвореного ними хреста) та вірулентністю мікроорганізмів нами були до-сліджені два ізоляти патогенних мікобактерій туберкульозу з повністю секвенованим геномом - лабораторний штам Mycobacterium tuberculosis H37Rv та високопатогенний ізолят CDC1551. Було знайдено, що обидва ізоляти містять по 8 довгих інвертованих термодинамічно стабільних повто-рів довжиною 48-62 нуклеотиди та з вільною енергією G = -38,9 - -56,2 ккал/моль, з яких 6 шпи-льок повністю збігаються. В той же час у геномі CDC1551, на відміну від H37Rv, на 5-кінці (мат-ричного ланцюга ДНК) локалізована високостабільна шпилька довжиною 58 нуклеотидів. Припус-кається, що локалізація високостабільної шпильки з G = -53,9 ккал/моль в області 5-кінця мат-ричного ланцюга ДНК ізоляту CDC1551 може призводити до різного ступеня стабілізації РНК-транскриптів або різної ефективності термінації транскрипції для РНК-полімерази штаму CDC1551 порівняно з ізолятом H37Rv. Це, в свою чергу, незважаючи на те, що ступінь гомології ДНК двох ізолятів мікобактерій становить понад 98 %, може служити однією із причин різної ві-рулентності штамів.

З метою візуалізації біооб'єктів безпосередньо у фізіологічному середовищі були досліджені ін-тактнi ціанобактерії та визначенi їхнi лінійнi розміри. Для збільшення сили взаємодії клітина - субстрат ціанобактерії Synechocystis PCC 6803 були iммобiлiзованi на стандартнiй амiнослюдi у TES буфері. Із АСМ-зображень було визначено, що середній розмір ціанобактерій у буферному розчині становить приблизно 70 нм Ч 90 нм, а їхня висота дорівнює ~ 20 нм.

Модифікація зондів аміногрупами, як і у випадку аміномодифікації слюди, призводить до поя-ви піка на графіку віддалення залежності сила - відстань.

Після аміномодифікації зондів в парах АПТЕС, як і для амінослюди, виникає значна (до 4,6 нН) сила адгезії. Цей адгезивний ефект, як і для аміномодифікованої слюди, обумовлений, в основно-му, електростатичною взаємодією між позитивно зарядженими аміногрупами зонда та негативно зарядженими силанольними групами слюди. Наші дані показують, що збільшення іонної сили в 10 разів призводить до зменшення сили адгезії між амінозондом та слюдою в 1,7-2 рази. Розкид зна-чень сил адгезії може бути пояснений різним радіусом заокруглення зондів, а також утворенням на їхній поверхні амiношарів з різною щільністю аміногруп.

На наступному етапі аміномодифіковані АСМ-зонди були функціоналізовані, тобто було під-тверджено, що аміногрупи амінозондів є реакційними, та вони можуть бути кон'юговані з біомо-лекулами при використанні добре відомої хімії іммобілізації амінів. Для функціоналізації аміно-зондів були використані нековалентне зв'язування ДНК та ковалентна взаємодія з глютаральдегі-дом (ГА). Ковалентне зв'язування аміногруп амінозонда з карбонільними групами ГА призводить до утворення Шиффової основи (Knapp, 1991). В результаті відбувається зменшення поверхневої щільності позитивного заряду амiнозонда та, отже, сили адгезії для системи амiнозонд + ГА - слюда.

Взаємодія негативно заряджених фосфатних груп молекул ДНК з позитивно зарядженими амі-ногрупами амінозонда призводить до їхньої нейтралізації та зникнення ефекту адгезії. В цьому ви-падку силові криві для амiнозонда з іммобілізованою ДНК у ТЕ буфері подібні до силових графі-ків для пари немодифікований зонд - свіжосколота слюда. Силові графіки амiнозонд + ДНК у ТЕ буфері, що записані з інтервалом в декілька секунд, показують, що молекули ДНК, якi адсорбовані на амiнозонді, є лабільними: під впливом прикладеної сили з'являються один або декілька піків адгезії. В процесі силових вимірювань ці піки можуть зникати та з'являтися знову. Нековалентне зв'язування амінозонд - ДНК та ковалентна взаємодія амінозонд - глютаральдегід пока-зали можливість функціоналізації модифікованих амінозондів, що може знайти застосування в до-слідженнях структурних особливостей поверхонь клітин, визначенні їхніх мікромеханічних влас-тивостей, моніторингу клітинної динаміки in vitro.

Силові графіки системи амiнозонд - амiнослюда демонструють наявність значного адгезивного ефекту, незважаючи на те, що обидві поверхні несуть сумарний позитивний заряд. Істотно більш високе значення роботи сил адгезії (тобто площі під кривою віддалення) для пари амiнозонд - амi-нослюда при приблизно однаковому піковому значенні сили адгезії з парою амiнозонд - слюда вказують на утворення значно більшої кількості міжмолекулярних зв'язків між амiнозондом та амiнослюдою порівняно з парою поверхонь амiнозонд - слюда.

З метою з'ясування механізму іммобілізації ДНК на модифікованій аміноповерхні нами були отримані зображення ДНК на амiнослюді за високої іонної сили I = 900 мM Na⁺ та рН 9. Незважа-ючи на елімінацію електростатичних сил взаємодії між аміногрупами на поверхні слюди та нега-тивно зарядженими фосфатними групами ДНК за I = 900 мM Na⁺, на поверхні амінослюди все ще існують сайти для зв'язування нуклеїнових кислот. Ці дані дозволяють припустити, що у зв'язу-ванні молекул ДНК як з аміноповерхнею модифікованого зонда, так і з поверхнею модифікованої слюди беруть участь не тільки електростатичні сили, але можливим є утворення водневих зв'язків між аміногрупами аміноповерхні з електронегативними сайтами ДНК. Оскільки вандерваальсові сили не залежать від pH (Butt, 1991), взаємодію ДНК з амінозондом (як і у випадку амінослюди за pH 9, I = 10 мM Na⁺), на нашу думку, обумовлено суперпозицією електростатичних та вандерва-альсових сил.

На основі методики аміномодифікації АСМ-зондів розроблено загальну схему їхньої функціо-налізації та отримано зонди, функціоналізовані бичачим сироватковим альбуміном (БСА), які мо-жуть бути використанi для вивчення процесів молекулярного впізнавання. Процедура мо-дифікації та функціоналізації АСМ-зонда включає три етапи. Спочатку шляхом модифікації в па-рах похідного аміносилану був отриманий амінозонд, з поверхневими аміногрупами якого на другому етапі взаємодіяв амінореакційний гомобіфункціональний лінкер. На заключному етапі зонд з ковалентно приєднаним лінкером ДСС був функціоналізований молекулами БСА. Отримані АСМ-зонди було охарактеризовано на різних етапах модифікації за допомогою АСМ у режимі силових вимірювань (як після кожного етапу модифікації, так і тільки для зонда з приєднаним БСА) - із силових графіків визначено силу адгезії та роботу сили адгезії.

Оскільки поверхнi модифікованого та функціоналізованого зондiв за своїми властивостями по-дібнi до поверхонь модифікованої та функціоналізованої слюди відповідно, процес функціоналіза-ції був також охарактеризований шляхом візуалізації молекул ДНК та БСА, iммобiлiзованих на модифікованій та функціоналізованій слюді. Відмітною особливістю аміномодифікації зонда за допомогою АПТЕС є те, що одна молекула АПТЕС взаємодіє з трьома поверхневими ОН-групами зонда. Тим самим кількість аміногруп на поверхні зонда, обробленого АПТЕС, може бути істотно меншою, ніж для зонда, обробленого, наприклад, за допомогою етаноламіну з на-ступним утворенням самоасоційованих моношарів (Reiner et al., 2003).

Використання гомобіфункціонального амінореакційного лінкерного агента також спрямоване на зменшення кількості молекул-рецепторів на поверхні зонда. Можливим є варіант, при якому один амінореакційний кінець лінкера (NHS-ефір) взаємодіє з аміногрупою зонда, а другий кінець залишається вільним - з цим реакційним кінцем лінкера можуть взаємодіяти аміногрупи лізинових залишків БСА. Однак також можливе зв'язування обох NHS-кінців лінкера з аміногрупами зонда, що зменшує кількість вільних аміногруп на поверхні амінозонда.

Візуалізація комплексів ДНК - Т7 РНК-полімераза при елонгації транскрипції. Для дослі-дження структури комплексів Т7 РНК-полімераза - ДНК іммобілізацію біомолекул проводили на свіжосколоту слюду з додаванням іонів магнію. ДНК-матриця для транскрипції була сконструйо-вана таким чином, що містила промотор та область термінації транскрипції Т7 РНКП асиметрично локалізованими на кінцях амплікона довжиною 1414 п.н. (його контурна довжина становила 435 15 нм).

В процесі транскрипції утворюються елонгаційні комплекси, які характеризуються типовими вигинами для комплексів ДНК - білок. Транскрипцію можна розглядати як своєрідне ска-нування ДНК-матриці РНК-полімеразою. Напрямок сканування задається послідовністю промото-ру у матричному ланцюгу ДНК (Milligan, 1987). Але для пошуку промотору та виключення мож-ливості пропуску сайту промотору такою високоточною "машиною", якою є РНКП, на нашу дум-ку, цей молекулярний мотор починає сканування з одного з кінцевих фрагментів ДНК. Саме цією обставиною ми пояснюємо доволі велике число візуалізованих кінцевих комплексів, або комплек-сів, які передують утворенню комплексів ініціації транскрипції. Наші припущення узгоджуються з експериментальними результатами з АСМ-візуалізації дифузії РНКП протягом пошуку промотору (Guthold, 1999) та моделлю переміщення білка вздовж ДНК (швидкого перенесення білка між різ-ними фрагментами ДНК за допомогою механізмів одновимірної дифузії та слабкого неспецифіч-ного зв'язування) (Berg, 1981).

Зазначимо, що при взаємодії молекули ДНК з Т7 РНКП утворюються специфічні та неспеци-фічні комплекси. Специфічне зв'язування (взаємодія з промотором) є відносно нечутливим до змі-ни іонної сили розчину, але воно залежить від конформації фрагмента ДНК. Неспецифічні комп-лекси ДНК - Т7 РНКП утворюються за рахунок електростатичної взаємодії позитивно заряджених залишків полімерази з негативно зарядженими фосфатними групами ДНК. Серед доволі великого масиву проаналізованих комплексів ДНК - Т7 РНКП (понад 200) були візуалізовані комплекси, утворені полімеразою саме з термінальними (тобто кінцевими) фрагментами ДНК (близько 30 комплексів). Типові АСМ- та тривимірне зображення таких комплексів. Наяв-ність декількох молекул Т7 РНКП, що утворили комплекс з поодинокою молекулою ДНК, під-тверджує, що після початку транскрипції однією молекулою Т7 РНКП інша молекула ферменту може зв'язатися з термінальним фрагментом ДНК-матриці, що локалізований поряд з промотором Т7 РНКП, для проведення наступної преініціації та елонгації транскрипції.

В області термінації транскрипції декілька молекул Т7 РНКП можуть бути зв'язаними з ДНК-матрицею (показано чорною стрілкою на рис. 22). Ці дані узгоджуються з результатами роботи Epstein et al. (2003), в якій показано можливість об'єднання молекул РНКП в процесі елонгації транскрипції - більшість внутрішніх та зовнішніх блоків транскрипції (сигналів паузи та зупинки) зникають, якщо більше ніж одна молекула РНКП ініціює транскрипцію з одного і того ж промотору. Навпаки, при проведенні саме поодинокого циклу транскрипції наявність внутрішніх терміна-торів істотно впливає на швидкість елонгації та вихід повновимірних транскриптів.

Нами візуалізовано і РНК-транскрипти, що утворилися після проведення транскрипції. Про те, що в результаті транскрипції синтезуються РНК-транскрипти очікуваної довжини, свідчила наяв-ність відповідної смуги на електрофореграмі після проведення електрофорезу за денатуруючих умов продуктів транскрипції. РНК-транскрипти виглядають як конденсовані структури, як і в по-передніх дослідженнях з АСМ-візуалізації РНК (Hansma, 1999), оскільки, на нашу думку, для візу-алізації витягнутих неконденсованих молекул РНК необхідно змінити поверхневі властивості суб-страту (слюди).

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено нове вирішення наукової проблеми створення для досліджень у галузі нанобіотехнології амінозондів (як компонентів біосенсорів) та амінослюди з заданими поверхне-вими властивостями (як субстрату для іммобілізації біополімерів) шляхом модифікації у газовій фазі. На основі узагальнення даних, отриманих за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ), полімеразної ланцюгової реакції, шляхом розробки підходів до візуалізації та наноманіпулювання поодинокими молекулами доведено, що ДНК, іммобілізована на амінослюді, є еластичною моле-кулою, яка може бути не тільки розтягнута, але й стиснута, а також компактизується до рівня сфе-роїдів через три етапи послідовного складання вдвічі.

2. Вперше розроблено технологію отримання аміномодифікованих АСМ-зондів в газовій фазі на відміну від існуючого підходу аміномодифікації у розчині. За допомогою АСМ в режимі сило-вих вимірювань показано, що значення сили адгезії для пари поверхонь амінозонд - слюда (як і для пари стандартна амінослюда - зонд) зменшувались у ряду I = 10 мM Na⁺ I = 100 мM Na⁺ pH 11,2. Модифіковані амінозонди функціоналізовано через нековалентне зв'язування з ДНК та ковалентну взаємодію з глютаральдегідом.

3. Розроблено схему функціоналізації АСМ-зондів протеїнами та проведено їхню функціоналі-зацію бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Модифіковані амінозонди з ковалентно приєдна-ним амінореакційним лінкером та БСА охарактеризовано шляхом силових вимірювань - визначе-но значення сили адгезії та роботи сили адгезії як після кожного етапу функціоналізації, так і тіль-ки для зонда з приєднаним БСА.

4. Розвинуто новий експериментальний підхід витягування молекул ДНК. Тягнуті лінійні моле-кули ДНК фага та тягнуті суперспіральні молекули ДНК pGEMEX візуалізовані на поверхні амі-нослюди із зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю аміногруп. Визначене безпосе-редньо з АСМ-зображення збільшення контурної довжини тягнених ссДНК pGEMEX довжиною 3993 п.н. означає, що молекули ссДНК витягнуто у 1,5-1,7 разу порівняно з В-формою ДНК, що призвело до зростання відстані між нуклеотидами вздовж осі спіралі до H = 4,87 - 5,36 Е.

5. Доведено, що ДНК являє собою своєрідну молекулярну пружину - молекула ДНК може бути не тільки витягнута, але й стиснута. На модифікованій амінослюді поряд з плектонемічно супер-спіральними молекулами ДНК були візуалізовані поодинокі молекули з надзвичайно високим рів-нем компактизації, ступінь суперспіралізації яких значно вищий у порівнянні з раніше досягнути-ми експериментально та розглянутими теоретично. Відстань між нуклеотидами вздовж осі спіралі для цих суперспіральних молекул ДНК змінювалася у діапазоні 1,94 Е < H < 2,19 Е. Такі стиснуті суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною міжнуклеотидною відстанню вздовж осі дуплекса по-рівняно з відомими формами ДНК віднесено до нової форми ДНК - S-ДНК, для якої визначений нахил основ та побудована модель. Важливо, що при цьому утворюються як ліві, так і праві надсу-перспіральні ДНК.

6. Візуалізацією лінійних та суперспіральних молекул ДНК на чотирьох субстратах з різними поверхневими властивостями доведено, що стискування молекул ДНК обумовлено поверхневими властивостями субстрату - високою гідрофобністю та щільністю заряду модифікованої амінослю-ди.

7. Вперше візуалізовано етапи компактизації поодиноких молекул суперспіральної ДНК pGEMEX, іммобілізованих на модифікованій амінослюді. Показано, що компактизація поодино-ких молекул відбувається через три етапи послідовного складання навпіл із зменшенням довжини осі суперспіралі, тобто з утворенням осей суперспіралі другого та третього порядків.

8. Вперше візуалізовані напівсфероїди та сфероїди - структури, утворені поодинокими супер-спіральними молекулами ДНК, - та показано, що тороїди також можуть бути утворені поодиноки-ми молекулами ДНК. На основі аналізу отриманих зображень запропоновано модель можливих конформаційних переходів суперспіральної ДНК in vitro за відсутності протеїнів при зростанні рівня компактизації ДНК. Компактизація поодиноких суперспіральних молекул ДНК обумовлена екрануванням негативно заряджених фосфатних груп ДНК, що взаємно відштовхуються, позитив-но зарядженими аміногрупами амінослюди.

9. Показано, що новий метод характеризації субстратів, заснований на візуалізації конформації плектонемічно суперспіральних молекул ДНК, є надзвичайно інформативним навіть порівняно з АСМ у режимі силових вимірювань, оскільки дозволяє отримати додаткову інформацію про по-верхневі властивості субстрату, на якому іммобілізовані молекули ДНК. Візуалізовано хрестопо-дібну структуру суперспіральної ДНК pUC8 і показано, що розмір стебла її шпильки становить 11 пар нуклеотидів, а петля містить 4 нуклеотиди.

10. Візуалізовано РНК-транскрипти (у вигляді джгутоподібних конденсованих структур) та комплекси, що утворює РНК-полімераза (РНКП) бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею (яка містить промотор та термінатор транскрипції Т7 РНКП) в процесі транскрипції. Показано, що на одній мо-лекулі ДНК-матриці 2-3 молекули Т7 РНКП одночасно утворюють як специфічні комплекси з кін-цевими фрагментами ДНК-матриці, так і комплекси в області термінації та в процесі елонгації транскрипції. Візуалізовані комплекси ДНК - Т7 РНКП з трьома молекулами білка на одній моле-кулі ДНК-матриці відповідають етапам ініціації, елонгації та термінації транскрипції.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лиманский А.П. Визуализация крестообразной структуры суперспиральной ДНК посредством атомно-силовой микроскопии // Биофизика. - 2000. - Т. 45, № 6. - С. 1039-1043.

2. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Атомно-силова мікроскопія: від візуалізації молекул ДНК та клітин до вимірювання сили міжмолекулярних взаємодій // Биологический вестник. - 2001. - Т. 5, № 1-2. - С. 124-132.

3. Лиманский А.П. Исследование аминомодифицированной слюды как субстрата для атомно-сило-вой микроскопии нуклеиновых кислот // Біополімери і клітина. - 2001. - Т. 17, № 4. - С. 292-297.

4. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Вивчення геномної ДНК мікроорганізмів методом атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. - 2002. - Т. 36, № 4. - С. 30-36.

5. Limansky A., Shlyakhtenko L., Schaus S., Henderson E., Lyubchenko Y. Aminomodified probes for ato-mic force microscopy // Probe Microscopy. - 2002. - Vol. 2, № 3-4. - Р. 227-234.

6. Лиманский А.П. Исследование аминомодифицированных зондов для атомно-силовой микроско-пии биомолекул // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 1. - С. 62-70.

7. Лиманський О.П. Вивчення хрестоподібної структури суперспіральної ДНК плазміди pUC8 за допомогою атомно-силової мікроскопії та комп'ютерного моделювання // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 5. - С. 401-405.

8. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Візуалізація ціанобактерій у водному розчині за допомогою атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37, № 1. - С. 68-71.

9. Лиманский А.П. Атомно-силовая микроскопия: от визуализации молекул ДНК и белков до изме-рения силы межмолекулярных взаимодействий // Успехи современной биологии. - 2003. - Т. 123, № 6. - С. 531-542.

10. Лиманский А.П., Лиманская О.Ю., Волянский Ю.Л. Компьютерный анализ инвертированных повторов в геноме микобактерий туберкулеза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и имму-нобиологии. - 2004. - № 5. - С. 48-52.

11. Лиманський О.П. Надсуперспіралізація та компактизація суперспіральної ДНК // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 39, № 2. - С. 64-71.

12. Лиманська О.Ю., Лиманська Л.О., Лиманський О.П. S-форма ДНК - надсуперспiральна макро-молекула з ~ 2 Е вiдстанню мiж парами нуклеотидів вздовж осi дуплекса // Біополімери і клітина. - 2005. - Т. 21, № 6. - С. 515-524.

13. Лиманский А.П. Визуализация ампликонов после проведения полимеразной цепной реакции // Биофизика. - 2005. - Т. 50, № 6. - С. 1019-1024.

14. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. S-форма ДНК - суперспиральная ДНК с 1.94 - 2.19 Е рассто-янием между парами оснований вдоль оси дуплекса // Молекулярная биология. - 2006. - Т. 40, № 1. - С. 122-136.

15. Лиманська О.Ю., Лиманська Л.О., Лиманський О.П. Компактизацiя суперспiральної ДНК на модифiкованiй амiнослюдi // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 1. - С. 18-28.

16. Лиманський О.П. Аміномодифіковані зонди з ковалентно приєднаними молекулами для атом-но-силової мікроскопії // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40, № 1. - С. 70-80.

17. Лиманский А.П. Функционализация аминомодифицированных зондов для атомно-силовой микроскопии // Биофизика. - 2006. - Т. 51, № 2. - С. 225-235.

18. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспиральной ДНК, адсорбированных на аминослюде // Биоорганическая химия. - 2006. - Т. 32 , № 5. - С. 494-510.

19. Лиманський О.П. Візуалізація комплексу ДНК з Т7 РНК-полімеразою за допомогою атомно-си-лової мікроскопії // Біополімери і клітина. - 2007. - Т. 23, № 1. - С. 3-13.

20. Лиманський О.П. Візуалізація комплексів РНК-полімерази бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею при елонгації транскрипції // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т. 79, № 1. - С. 94-103.

21. Лиманський О.П. Візуалізація РНК-транскриптів за допомогою атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. - 2007. - Т. 41, № 2. - С. 12-18.

22. Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспиральной ДНК, иммобилизован-ных на аминослюде: от дуплекса к минитороидальной и сферической конформации // Биофизика. - 2007. - Т. 52, № 2. - С. 252-260.

23. Пат. 13571Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб модифікації слюди, субстрату для атом-но-силової мікроскопії: Пат. 13571 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиман-ська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко С.С., Драч М.І., Лиманська Л.О., Клімов О.І. (Україна); Ін-ститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. - № 200508247; Заявл. 22.08.2005; Опубл. 17.04.2006. - 14 с.

24. Пат. 17942 Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб витягнення лінійних та суперспіраль-них молекул ДНК: Пат. 17942 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко С.С., Драч М.І., Лиманська Л.О., Клімов О.І. (Україна); Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. - № 200604603; Заявл. 25.04.2006; Опубл. 16.10.2006. - 8 с.

25. Пат. 17981 Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб стиснення лінійних та суперспіральних молекул ДНК: Пат. 17981 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко Л.М., Кучма І.Ю., Лиманська Л.О., Пугач Н.Б. (Україна); Інсти-

тут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. - № 200604883; Заявл. 03.05.2006; Опубл. 16.10.2006. - 8 с.

26. Limansky A., Limanskaya O., Kamensky Yu., Vovk O., Vashchenko L. Study of fullerene structure by scanning tunneling microscopy // Proc. 185^th Meeting of The Electrochemical Society. - San Francisco (USA). - 1994. - P. 215-216.

27. Limansky A. Chemical force microscopy of aminomodified AFM tips and substrates // Proc. Interna-tional Symp. “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Nanostructures”. - Tokyo (Japan). - 2001. - P. 85.

28. Limansky A. Imaging of cruciform structure in supercoiled DNA by atomic force microscopy // Proc. International Symp. “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Nanostructures”. - Tokyo (Japan). - 2001. - P. 86.

29. Limansky A. Imaging of linear and supercoiled nucleic acids in air and cells in aqueous solution by atomic force microscopy // Конф. для молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики. - Київ (Україна). - 2001. - C. 106.

30. Lymanskiy A. Cruciform structure in supercoiled DNA: imaging by atomic force microscopy and computer modeling // Proc. 8^th International Symp. on Molecular Aspects of Chemotherapy. - Gdansk (Poland). - 2001. - P. 192.

31. Lymanskiy A. Atomic force microscopy aminomodified tips and substrates for DNA immobilization // Proc. 8^th International Symp. on Molecular Aspects of Chemotherapy. - Gdansk (Poland). - 2001. - P. 193.

32. Limanskii A., Limanskaya O. Inverted repeats: computer analysis of microorganisms genome and imaging of cruciform structure in DNA by atomic force microscopy // Proc. SPIEs First International Symp. on Microtechnologies for the New Millennium. - Maspalomas (Spain). - 2003. - Vol. 5119. - P. 337-348.

33. Limanskii A., Limanskaya O. Inverted repeats in microorganisms: comparison of two isolates of My-cobacterium tuberculosis with complete genome and visualization of cruciform structure in plasmid DNA by atomic force microscopy // Proc. 1^st FEMS Congress of European Microbiologists. - Ljubljana (Slo-venia). - 2003. - P. 442.

34. Limanskaya O., Limanskii A. Imaging of S-DNA - new DNA form with ~ 2 Е rise per base pair // Proc. 15^th IUPAB & 5^th EBSA International Biophysics Congress. - Montpellier (France). - 2005. - P. 673.

35. Limanskaya O., Limanskii A. Compaction of single supercoiled DNA molecules on the modified ami-no mica // Proc. 15^th IUPAB & 5^th EBSA International Biophysics Congress. - Montpellier (France). - 2005. - P. 673.

36. Limanskaya O., Limanskii A. Imaging stretched and compressed supercoiled DNA // Proc. III Interna-tional Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions. - Kyiv (Ukraine). - 2006. - P. 124.

37. Limanskaya O., Limanskii A. Compaction of supercoiled DNA molecules into spheroids // Proc. III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions. - Kyiv (Ukraine). - 2006. - P. 125.

38. Limanskii A., Limanskaya O. Visualizing stretched and compressed single supercoiled DNA molecul-es // Proc. Optical Spectroscopy of Biomolecular Dynamics II. - Eilat (Israel). - 2006. - P. 64.

39. Limanskii A., Limanskaya O. Imaging compacted single supercoiled DNA molecules with different length of superhelix axis // Proc. Optical Spectroscopy of Biomolecular Dynamics II. - Eilat (Israel). - 2006. - P. 52.

Размещено на Allbest.ru