Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. КАРАЗІНА

УДК 616.441 - 008.64:612.66

Вікові особливості проявлення оксидативного стресу при гіпотиреозі в нормі та при фізичному навантаженні

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МОХАМАД САЛЕМ ДЖАЗАЕРЛІ

Харків 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Давидов Вадим В'ячеславович, Харківська медична академія післядипломної освіти Міністерства охорони здоров'я України, професор кафедри клінічної біохімії та судово-медичної токсикології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бабенко Наталія Олексіївна, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України, НДІ біології, завідувач відділу фізіології онтогенезу

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бондаренко Людмила Олександрівна, Інститут проблем ендокринної патології імені В.Я. Данилевського АМН України, м. Харків, завідувач лабораторії хроноендокринології

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України (лабораторія регуляції метаболізму), м. Київ

Захист відбудеться “ 21 ” ____11___ 2007 року о 15.15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ -15).

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ _15__“ ____10____ 2007 року

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Дзюба В.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Останнім часом серед населення України та інших європейських країн широке розповсюдження мають захворювання, пов'язані з недостатністю щитовидної залози (Ю.И. Караченцев и соавт., 2002, 2004; И.Н. Караченцева, 2006). Важливу роль в їх виникненні набуває хронічний вплив стресорних факторів на організм (I. Harsch et al., 1992; A.M. Santos et al., 2002; A. Fukao et al., 2003). Беручи до уваги той факт, що стимуляція вільнорадикальних процесів відіграє важливу роль в патогенезі стресорних ушкоджень внутрішніх органів (Ф.З. Меерсон, 1984; А.Н. Саприн, Е.В. Калинина, 1999; Е.Б. Меньшиков и соавт., 2006 та багато інших), також є вірогідною їх участь в патогенезі гіпотиреозу. Проте результати багаточисельних досліджень за даним питанням характеризуються великим протиріччям (S. Varghese et al., 2001; R. Gredilla et al., 2001; E. Brzezinska-Slebodzinska, 2003; S. Yilmaz et al., 2003; K. Das, G.B. Chainy, 2004; R. Mogulkoc et al., 2005). Поряд із цим з'ясування ролі вільнорадикальних механізмів у формуванні гіпотиреозу відкриває широкі перспективи в розробці нових підходів до його діагностики та лікування.

Однією з вірогідних причин протиріччя літературних даних про стан вільнорадикальних процесів в тканинах внутрішніх органів при гіпотиреозі можуть бути значні вікові та індивідуальні коливання базального рівня продуктів вільнорадикального окислення в різних тканинах. З цього приводу значно більший інтерес може мати з'ясування характеру відповідної реакції на зовнішні впливи з боку вільнорадикальних процесів тканин внутрішніх органів, аніж просто вивчення базальної концентрації продуктів вільнорадикального окислення. Особливе значення набуває вивчення ефекту тих факторів, під впливом яких відбувається підвищення швидкості вільнорадикальних реакцій. До них відносяться стресорні фактори (Ф.З.Меерсон, 1984; Г.И. Парамонова, 1994; V.V. Davydov, V.N. Shvets, 2001, 2003).

Стрес виникає в умовах впливу на організм різноманітних фізичних та хімічних факторів. Існує багато відомостей про те, що стан стресу формується в організмі в умовах виконання фізичного навантаження (C.E.Cooper et al., 2002; G. Mastorakos, M. Pavlatou, 2005 та ін.). Спираючись на цей факт, для подальшого розширення існуючих уявлень про механізми формування метаболічних порушень при станах, що супроводжуються пониженням функції щитовидної залози, великий інтерес представляє вивчення впливу фізичного навантаження на стан вільнорадикальних процесів в тканинах внутрішніх органів при гіпотиреозі.

Особливу актуальність набуває також з'ясування вікових особливостей формування гіпотиреозу. Це зумовлено двома основними причинами. По-перше, збільшенням в останні десятиріччя захворюваності гіпотиреозом у дитячого та підліткового контингенту населення, а по-друге, існуванням особливостей в його клінічному проявленні у дітей та підлітків в порівнянні з хворими більш зрілого віку (Л.Е.Браверман, 2000). При цьому порівняно слабке клінічне проявлення гіпотиреозу в ранньому віці обумовлює появу серйозних проблем з його діагностикою, що в свою чергу погрожує необоротними наслідками в більш пізньому віці (Л.Е.Браверман, 2000).

Важливе значення в з'ясуванні причин формування розбіжностей в перебігу гіпотиреозу на різних етапах онтогенезу може мати вивчення вікових особливостей в стані вільнорадикальних процесів в тканинах внутрішніх органів та їх відповіді на дію прооксидантних факторів при даній патології. Такі дослідження відкривають перспективи в розробці нових підходів до діагностики, лікування й профілактики недостатності щитовидної залози у дитячого та підліткового контингенту хворих.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано на кафедрі клінічної біохімії та судово-медичної токсикології Харківської медичної академії післядипломної освіти в рамках держбюджетної теми “Вивчити вікові особливості метаболічної адаптації до дії ушкоджуючих факторів окислювального стресу“ (№ державної реєстрації 0102U002283).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є вивчення процесів вільнорадикального окислення ліпідів та білків, а також активності ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в печінці 1,5- та 12-місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом, що були піддані інтенсивному фізичному навантаженню (ІФН).

Для реалізації вищезазначеної мети були визначені наступні завдання: у 1,5- та 12-місячних щурів, що були піддані інтенсивному фізичному навантаженню, а також у тварин з експериментальним гіпотиреозом після ІФН та без нього:

1. Дослідити концентрацію тиреотропіну (ТТГ) та тиреоїдних гормонів в крові.

2. Визначити вікові особливості накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та білків в печінці, а також в її субклітинних фракціях.

3. Оцінити швидкість індукованого перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та індукованого накопичення карбонільованих білків (КБ) в мітохондріальній та постмітохондріальній фракції печінки.

4. Вивчити активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту (каталази та супероксиддисмутази) в субклітинних фракціях печінки.

Об'єкт дослідження - вільнорадикальні процеси та стан ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в печінці при експериментальному гіпотиреозі у щурів різного віку в нормі та при інтенсивному фізичному навантаженні. ліпід білок печінка антиоксидантний

Предмет дослідження - печінка (дієнові кон'югати (ДК), основи Шиффа (ШО), карбонільовані білки (КБ), супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, індуковане ПОЛ та вільнорадикальне окислення білків) та кров (ТТГ, тиреоїдні гормони).

Методи дослідження: спектрофотометрія в видимій та ближній ультрафіолетовій зоні спектру (визначення активності ферментів першої лінії антиоксидантного захисту та вмісту продуктів вільнорадикального окислення); спектрофлуориметрія (вимір концентрації основ Шиффа); диференціальне центрифугування (фракціонування гомогенатів печінки), імуноферментний аналіз (визначення вмісту тиреотропного гормону та гормонів щитовидної залози в крові), статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів обумовлена тим, що вперше вивчені вікові особливості зміни стану вільнорадикального окислення ліпідів та білків у печінці щурів з експериментальним гіпотиреозом, що піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню. Встановлено, що в печінці щурів з гіпотиреозом виникає стан оксидативного стресу, який є більш вираженим у тварин пубертатного віку. Важливу роль в його формуванні набуває підвищення інтенсивності вільнорадикальних процесів в мікросомах.

Після інтенсивного фізичного навантаження в печінці щурів з гіпотиреозом відбувається посилення проявів оксидативного стресу. Важливе значення у виникненні цього феномену набуває підвищення інтенсивності вільнорадикального окислення ліпідів у мітохондріальній фракції печінки, що є більш вираженим у 1,5-місячних, ніж у 12-місячних тварин.

Підвищення концентрації тиреоїдних гормонів в крові у 1,5-місячних щурів з гіпотиреозом після інтенсивного фізичного навантаження супроводжується посиленням проявів оксидативного стресу в печінці. При цьому у щурів пубертатного віку (1,5-місячних) відбувається обмеження регуляторного ефекту ТТГ на рівень трийодтироніну (Т₃) та тироксину (Т₄), що є одним з факторів, які обумовлюють появу у них особливостей в перебігу вільнорадикальних процесів у печінці.

Було показано, що посилення проявів оксидативного стресу в печінці 1,5-місячних щурів з гіпотиреозом після ІФН, на відміну від дорослих статевозрілих тварин, виникає в умовах зменшення виразності гормональних зрушень, що характеризують недостатність щитовидної залози. Виникнення цієї особливості відображає посилення альтерації печінки та обумовлює виникнення ускладнень з її боку при гіпотиреозі в періоді статевого дозрівання.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють сучасні уявлення про роль вільнорадикальних процесів у виникненні зрушень з боку функціонування печінки при захворюваннях, що супроводжуються пониженням функції щитовидної залози. Вони вказують на існування вікових особливостей в зміні стану вільнорадикального окислення ліпідів та білків в печінці тварин із гіпотиреозом в період статевого дозрівання. З'ясування цих особливостей створює реальні передумови до розробки нових диференційованих підходів до лікування гіпотиреозу в періоді статевого дозрівання та статевозрілому віці з використанням антиоксидантних засобів, а також моніторуванню його перебігу на основі вивчення динаміки вмісту продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та білків.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконане під керівництвом доктора медичних наук, професора В.В. Давидова, з яким автор має спільні публікації. Всі результати, наведені в рукописі, автор отримав самостійно. Дисертант особисто проводив експериментальні дослідження, статистичну обробку та аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів. Основні результати дисертаційної роботи викладено на науково-практичній конференції молодих вчених “Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини” (Харків, 2005); на IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); на Всеукраїнській науковій конференції "Сучасні досягнення молодих вчених на допомогу практичній медицині” (Харків, 2006); на науково-практичній конференції з міжнародною участю “Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження та апробації лікарських засобів“ (Харків, 2006).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладено в 8 наукових публікаціях - 4 статтях, 3 з яких в журналах, рекомендованих ВАК України, та 4 - в збірниках тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Роботу викладено на 169 сторінках машинописного тексту, вона складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, що містить 298 найменувань. Роботу проілюстровано 16 таблицями та 23 малюнками.

Основний зміст роботи

Огляд літератури містить аналіз даних сучасної періодичної літератури про оксидативний стрес. Розглядаються основні причини виникнення цього стану, його характерні прояви в тканинах внутрішніх органів, а також значення у формуванні адаптивних реакцій та патологічних процесів. Детально розглядаються механізми виникнення оксидативного стресу при інтенсивному фізичному навантаженні. Особливу увагу приділено сучасним уявленням про роль вільнорадикальних процесів в патогенезі захворювань, пов'язаних із порушенням функції щитовидної залози, в тому числі з гіпотиреозом.

Матеріали та методи дослідження. Роботу виконано на 157 щурах-самцях лінії Вістар. Усі тварини були поділені на дві вікові групи: дорослі статевозрілі - 10-12 місяців (маса 240-360 г) та молоді в періоді статевого дозрівання - 1,5 місяці (маса 80-90 г). Кожну групу, в свою чергу, було поділено на чотири підгрупи: 1 - інтактні, 2 - щури, що піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню (плаванню до виснаження), 3 - тварини, у яких відтворювався експериментальний гіпотиреоз, 4 - щури з експериментальним гіпотиреозом, яких піддавали інтенсивному фізичному навантаженню.

Для відтворення моделі інтенсивного фізичного навантаження щурів піддавали плаванню до виснаження. З цією метою їх розміщували в круглі пластикові ємкості діаметром 40 см. Через годину після припинення плавання тварин піддавали евтаназії. Знеживлювання контрольних і піддослідних тварин проводили під ефірним наркозом відповідно до умов евтаназії, зазначених в методичних рекомендаціях МОЗ України та загальних етичних принципів проведення експериментів на тваринах, узгоджених з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей”.

Експериментальний гіпотиреоз відтворювали шляхом внутрішньоочеревинного введення мерказолілу на фізіологічному розчині з розрахунку 1 мг препарату на 100 г маси тварини. Введення проводилося щоранку протягом 15 днів (O.A.Krasilnikova et al., 2002).

Ефективність відтворення експериментального гіпотиреозу контролювали за концентрацією в крові тиреоїдних гормонів ( Т₃ та Т₄)_, а також тиреотропного гормону передньої долі гіпофіза (ТТГ). Визначення вмісту гормонів проводили за допомогою наборів для імуноферментних досліджень фірми “DAI” (США). Виміри проводили на імуноферментному аналізаторі “HUMAREADER” (Німеччина).

З печінки за допомогою скляного гомогенізатора Поттера-Ельвегейма готували 10% гомогенати на 0,25 М сахарозі (рН 7,4). Гомогенати піддавали субклітинному фракціонуванню за допомогою метода диференціального центрифугування.

В гомогенатах та субклітинних фракціях печінки визначали вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів - дієнових кон'югатів, основ Шиффа та карбонільованих білків. Концентрацію дієнових кон'югатів визначали за методом Стальної І.Д. (1977) з використанням в розрахунках коефіцієнта молярної екстинкції, що відповідає 2,2 х10⁵ М^-1. см^-1. В основу методу виміру вмісту основ Шиффа було покладено флуориметричний метод Rice-Evans C.A. et al. (1991). Визначення концентрації карбонільованих білків проводили за методом Дубиніної Є.Є. (2000). В розрахунках використовували коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,1 х 10⁴ М^-1. см^-1.

В мітохондріальній, мікросомальній та постмітохондріальній фракціях печінки проводили вимір швидкості індукованого ПОЛ та індукованого накопичення карбонільованих білків. В основу цих досліджень було покладено метод В'юшина А.В. та співавт. (2002). З цією метою 0,1 мл досліджуваної проби змішували з 1,5 мл 0,015 М калій-фосфатного буферу (рН 7,4). Суміш преінкубували в ультратермостаті при 37^оС протягом 3 хвилин. Реакцію починали шляхом внесення в реакційну суміш 0,2 мл 0,01 М солі Мора та 0,2 мл 1 М перекису водню. Проби інтенсивно струшували та інкубували протягом 10 хвилин при 37°С. Після цього в реакційній суміші визначали вміст карбонільованих білків та речовин, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактивних речовин). Вимір концентрації ТБК-реактивних речовин проводився за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою. Для розрахунків використовували коефіцієнт молярної екстинкції для малонового діальдегіду, що відповідає 1,53 х 10⁵ М^-1. см^-1 (H.Esterbauer, K.H.Cheeseman, 1990).

В мітохондріальній та постмітохондріальній фракціях печінки визначали активність супероксиддисмутази (КФ. 1.15.1.1.) та каталази (КФ. 1.11.1.6.). Для визначення активності супероксиддисмутази використовували метод Костюка В.А. (1990). Активність ферменту виражали в умовних одиницях із розрахунку на мг білку проби за хвилину. За одиницю активності ферменту було прийнято активність СОД, при якій відбувалося 50% гальмування швидкості окислення кверцетину. Визначення активності каталази проводили за методом Барабой В.А. та співавт. (1991).

Концентрацію білка в пробах визначали за методом Lowry O. et al. (1955).

Результати досліджень статистично обробляли за методом Wilcoxon-Mann-Whitney. Вірогідними вважали результати при Р<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження показали, що при гіпотиреозі у тварин обох вікових груп в печінці виникав стан оксидативного стресу. Його проявленням слугувало накопичення в печінці та її субклітинних фракціях продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та карбонільованих білків (див. табл. 1 та 2). Формування такого зрушення не супроводжувалося ані підвищенням чутливості субклітинних фракцій печінки до дії прооксидантів (див. табл. 3 та 4), ані виникненням умов для пониження ефективності функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріях та цитозолі клітин печінки. У зв'язку з цим однією з причин виникнення оксидативного стресу при експериментальному гіпотиреозі могла бути стимуляція процесів радикалоутворення в цьому органі.

Важливими джерелами вільних радикалів в клітинах тканин внутрішніх органів є електротранспортні ланцюги мітохондрій (C.Leeuwenburgh, J.W. Heinecke, 2001; A.Olgun et al., 2002; P. Hartman et al., 2004; P.S.Brooker, 2005; D.L.Meany et al., 2006 та ін.) та мікросом (Е.Б.Меньшикова, Н.К.Зенков, 1994; T.D.H.Bugg, 2001). Беручи це до уваги, далі було проведене вивчення вмісту продуктів вільнорадикального окислення в цих субклітинних структурах.

Дослідження показали, що в мітохондріальній фракції печінки щурів з гіпотиреозом не виявилося посилення процесів вільнорадикального окислення. Більше того, в ній відбувалося пониження вмісту продуктів ПОЛ (у 1,5-місячних щурів) та карбонільованих білків (у 12-місячних тварин). Зрушення, що виникають, можуть бути одним з проявів адаптивних реакцій печінки при гіпотиреозі, що спрямовані на обмеження утворення активних форм кисню та елімінацію з мітохондрій молекул, підданих вільнорадикальному окисленню.

Таблиця 1

Вміст продуктів вільнорадикального окислення в печінці та її субклітинних фракціях 1,5-місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом після ІФН (M + m), n = 5-6

Група	Інтактні	ІФН (контроль)	Гіпотиреоз	Гіпотиреоз + ІФН
Печінка
ШО	2,60±0,20	2,60±0,10	3,60±0,40*	1,80±0,20**
ДК	0,50±0,03	0,57±0,11	0,70±0,09*	1,12±0,26
КБ	13,20±0,60	13,50±0,50	20,70±1,80*	10,40±1,40
Мітохондріальна фракція
ШО	43,3±4,7	18,1±2,1*	12,8±1,7*	25,4±2,3**
ДК	8,8±2,8	9,6±3,1	2,4±0,6*	15,6±5,3
КБ	175,0±14,0	161,0±22,0	200,0±34,0	148,0±26,0
Мікросомальна фракція
ШО	2,3±0,2	3,3±0,5*	4,5±0,7*	5,0±0,7
ДК	1,9±0,2	3,9±0,6*	5,9±1,4*	15,3±2,4**
КБ	11,0±2,1	9,8±1,2	16,8±2,9	22,7±3,1**
Постмітохондріальна фракція
ШО	1,26±0,09	0,92±0,06*	1,70±0,17*	1,70±0,27**
ДК	0,40±0,10	0,49±0,13	0,96±0,23	1,45±0,42**
КБ	5,70±0,30	6,80±0,80	12,90±1,30*	15,10±2,10**

Примітка: ШО - основи Шиффа (мкмоль^. мг білка^-1); ДК - дієнові кон'югати (нмоль. мг білка^-1); КБ - карбонільовані білки (нмоль. мг білка^-1).

^*P<0,05 до інтактних; ^**P<0,05 до ІФН

В мікросомальній фракції печінки щурів обох вікових груп при гіпотиреозі відбувалося виражене накопичення продуктів вільнорадикального окислення. Це могло відбивати підвищення інтенсивності радикалоутворення в окислювально-відновних процесах, пов'язаних з функціонуванням оксигеназних ланцюгів ендоплазматичного ретикулума.

Незважаючи на те, що стан оксидативного стресу в печінці при гіпотиреозі виникав у тварин обох досліджуваних груп, виразність його проявів мала характерну вікову залежність.

Більш виражене накопичення продуктів вільнорадикального окислення спостерігалося у щурів пубертатного (1,5-місячного) віку. У них відбувалося підвищення концентрації продуктів вільнорадикального окислення в печінці, а також її мікросомальній та постмітохондріальній фракції. У дорослих статевозрілих (12-місячних) щурів при гіпотиреозі накопичення продуктів ПОЛ та карбонільованих білків відбувалося тільки в мікросомальній фракції.

Виникнення вікових відмінностей в проявленні оксидативного стресу в печінці щурів з гіпотиреозом не супроводжувалося обмеженням ефективності функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріальній та цитозольній фракціях.

Таблиця 2

Вміст продуктів вільнорадикального окислення в печінці та її субклітинних фракціях 12-місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом після ІФН (M + m), n = 5-6

Група	Інтактні	ІФН (контроль)	Гіпотиреоз	Гіпотиреоз + ІФН
Печінка
ШО	7,00±0,60	9,60±0,50*	7,80±0,70b	11,70±1,20a
ДК	0,81±0,13	0,95±0,09	0,83±0,10	1,00±0,14
КБ	16,10±1,00	17,60±1,30	13,20±0,90b	19,70±1,70a
Мітохондріальна фракція
ШО	64,7±5,2	62,2±4,3	73,6±0,7b	57,8±9,0a
ДК	10,3±1,7	6,5±0,9*	11,8±1,4b	33,3±6,5**a
КБ	277,0±43,0	163,0±15,0*	185,0±18,0*	207,0±43,0
Мікросомальна фракція
ШО	12,8±1,9	13,1±2,8	12,5±2,9b	17,0±2,2a
ДК	8,9±1,8	12,9±2,7	21,3±7,7b*	9,8±2,3
КБ	12,6±2,5	34,8±5,7*	47,4±13,4b*	36,7±4,6a
Постмітохондріальна фракція
ШО	1,54±0,15	1,29±0,21	1,21±0,07b*	1,04±0,07a
ДК	0,56±0,13	0,47±0,19	0,43±0,08	0,42±0,07a
КБ	9,10±0,80	8,30±0,70	8,80±0,80b	7,60±1,30a

Примітка: позначення ті самі, що й в таблиці 1.

^*Р?0,05 до інтактних; ^aP?0,05 до групи гіпотиреоз+ІФН (1,5-місячні);

^bР?0,05 до групи гіпотиреоз (1,5-місячні)

Таблиця 3

Інтенсивність індукованого ПОЛ (в нмоль/мг білка хв) в субклітинних фракціях печінки щурів різного віку з експериментальним гіпотиреозом (М + m), n = 5-6

Вік	1,5 місяці	12 місяців
Група	інтактні	гіпотиреоз	інтактні	гіпотиреоз
МТ	57,0±5,0	82,0±9,0	72,0±6,0	30,0±5,0*
МС	3,5±0,4	5,4±0,8	6,8±1,3	11,5±2,2
Пост МТ	2,1±0,9	3,4±0,4	1,9±0,3	1,1±0,1*

Примітка: МТ - мітохондріальна фракція, МС - мікросомальна фракція, Пост МТ - постмітохондріальна фракція, ^* - Р<0,05 до інтактних

Певне значення в їх появі набувало пониження у 12-місячних тварин з гіпотиреозом чутливості мітохондріальної та постмітохондріальної фракцій до ініціації вільнорадикального окислення ліпідів, а також вільнорадикального

Таблиця 4

Інтенсивність індукованого вільнорадикального окислення білків (в нмоль/мг білка хв) в субклітинних фракціях печінки щурів різного віку з експериментальним гіпотиреозом (М + m), n = 5-6

Вік	1,5 місяці	12 місяців
Група	інтактні	гіпотиреоз	інтактні	гіпотиреоз
МТ	6,10±1,20	3,70±1,00	4,90±1,40	6,30±1,20
МС	0,70±0,30	0,90±0,41	0,60±0,10	0,22±0,06*

Примітка. Позначення ті самі, що й в Таблиці 3

окислення білків у мікросомальній та постмітохондріальній фракціях. Важливу роль у попередженні накопичення кінцевих продуктів ПОЛ (основ Шиффа) в печінці дорослих щурів при гіпотиреозі також могла мати більш висока ефективність функціонування у них ферментативної системи, що бере участь в утилізації карбонільних продуктів вільнорадикального окислення (глутатіонтрансферази, альдегіддегідрогенази, альдегідредуктази), аніж у щурів пубертатного віку (Е.В.Фомина, В.В.Давыдов, 2004).

Суттєвий вплив на формування вікових особливостей в проявленні оксидативного стресу в печінці тварин з експериментальним гіпотиреозом міг чинити й базальний рівень вмісту в ній продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та білків. Проведені дослідження показали, що вміст продуктів ПОЛ в печінці та її субклітинних фракціях у 12-місячних щурів значно вищий, аніж у 1,5-місячних тварин. Базуючись на цьому, можна висловити припущення про те, що початково більш висока концентрація продуктів вільнорадикального окислення в печінці дорослих щурів обмежувала можливість їх подальшого накопичення під впливом різних прооксидантних факторів.

Акцентуючи увагу на ролі локальних метаболічних зрушень в печінці, необхідно також враховувати значення центральних механізмів регуляції вільнорадикальних процесів у виникненні вікових особливостей формування в ній оксидативного стресу при гіпотиреозі. Це дуже важливо у зв'язку з тим, що у тварин пубертатного та статевозрілого віку суттєво розрізняються механізми нейрогуморальної регуляції обміну речовин. Саме з ними й можуть бути пов'язані особливості регуляції системи антиоксидантного захисту організму в умовах in vivo, що зумовлюють формування виявлених зрушень в печінці, проте їх поява, за нашими даними, не пов'язана зі зміненням функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту.

Вікові розбіжності в рівні проявлення оксидативного стресу в печінці при експериментальному гіпотиреозі, вірогідніше за все, можуть відображати вікові особливості залучення цього органа в патологічний процес. Враховуючи значення оксидативного стресу, в якості неспецифічної ланки пошкодження тканин внутрішніх органів (Меерсон Ф.З., 1984), можна припустити, що в пубертатному віці формуються певні метаболічні передумови для підвищення важкості ушкодження печінки при гіпотиреозі, в порівнянні із середнім віком. Очевидно, що стан значно ускладнюватиметься при стресі, в умовах якого відбувається підвищення інтенсивності вільнорадикальних процесів в організмі (Ф.З.Меерсон, 1984; Г.И. Парамонова, 1994; V.V. Davydov, V.N. Shvets, 2001, 2003). Для перевірки цього припущення були проведені подальші дослідження, пов'язані з вивченням впливу інтенсивного фізичного навантаження на стан вільнорадикальних процесів в печінці щурів різного віку з експериментальним гіпотиреозом.

В попередніх експериментах було встановлено, що ІФН дійсно супроводжується виникненням явищ оксидативного стресу в печінці щурів обох досліджуваних груп. Це в повній мірі відповідає сучасним уявленням про стимуляцію вільнорадикальних процесів в організмі в умовах виконання інтенсивного фізичного навантаження (C.E.Cooper et al., 2002; G. Mastorakos, M. Pavlatou, 2005).

Подальші експерименти показали, що фізичне навантаження сприяє посиленню оксидативного стресу в печінці при експериментальному гіпотиреозі. На це вказує додаткове накопичення в ній продуктів перекисного окислення ліпідів, в порівнянні з їх вмістом у щурів контрольної групи (з гіпотиреозом). Характерно, що виникнення такого зрушення не супроводжується зміненням співвідношення активності ферментів першої лінії антиоксидантного захисту ані в мітохондріальній, ані в постмітохондріальній фракції (рис. 1).

Особливості накопичення продуктів ПОЛ в субклітинних фракціях печінки тварин поданої групи (див. табл.1 та 2), дозволяють думати про те, що в основі формування цього зрушення лежать зміни стану вільнорадикальних процесів в мітохондріях. Саме в мітохондріальній фракції у щурів обох досліджених вікових груп із гіпотиреозом після ІФН відбувалося збільшення концентрації продуктів перекисного окислення ліпідів.

Беручи до уваги, що поява цього зрушення не супроводжується обмеженням функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту, причиною його виникнення може бути стимуляція радикалоутворення в мітохондріях. В її основі, вірогідніше за все, знаходиться збільшення інтенсивності утворення активних форм кисню в процесах, пов'язаних з транспортом електронів по дихальному ланцюгу, в умовах підвищення інтенсивності тканинного дихання при фізичному навантаженні (C.Leeuwenburgh, J.W.Heinecke, 2001; C.E.Cooper et al., 2002). В той же час, у 12-місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом певне значення в посиленні радикалоутворення в мітохондріях при ІФН набуває підвищення їх чутливості до дії прооксидантів.

У тварин пубертатного віку з гіпотиреозом, на відміну від дорослих статевозрілих щурів, в посиленні проявів оксидативного стресу в печінці після ІФН, поряд із стимуляцією радикалоутворення в мітохондріях, певне значення набувало підвищення швидкості радикалоутворення в мікросомах. На це вказувало суттєве збільшення в них вмісту дієнових кон'югатів (див. табл.1).

Посилення проявів оксидативного стресу в печінці щурів при гіпотиреозі під впливом ІФН набувало деякі вікові особливості. У 1,5-місячних тварин вони проявлялися в додатковому накопиченні початкових продуктів ПОЛ (дієнових кон'югатів), а у 12-місячних щурів - в додатковому накопиченні кінцевих продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (основ Шиффа). Оцінюючи можливі причини появи цієї особливості, можна припустити важливу роль вікових розбіжностей в шляхах утилізації карбонільних переміжних продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та білків в печінці в умовах стресу (V.V. Davydov, V.N. Shvets, 2001).

Іншим проявом вікових особливостей виникнення оксидативного стресу у щурів цієї експериментальної групи служать розбіжності у величині зрушень, що виникають у 1,5- та 12-місячних тварин. Було встановлено, що прояв додаткового посилення вільнорадикальних процесів у субклітинних фракціях печінки 1,5-місячних щурів із гіпотиреозом після ІФН було значно вище, ніж у 12-місячних тварин. Причиною цього могло бути більше посилення у них швидкості процесів радикалоутворення в мітохондріях та мікросомах клітин печінки за рахунок більш вираженої стимуляції окислювально-відновних процесів в їх ланцюгах транспорту електронів.

Аналіз можливих причин підвищення інтенсивності окислювально-відновних процесів в мітохондріях у тварин пубертатного віку з гіпотиреозом після ІФН дозволяє припустити важливу роль в цьому вікових особливостей впливу фізичного навантаження на секрецію тиреоїдних гормонів. Це припущення базується на сучасних уявленнях про роль тиреоїдних гормонів в регуляції основного обміну в організмі, пов'язаної з їх впливом на обмінні процеси в мітохондріях (P.Venditti et al., 2006).

І дійсно, проведені в даному напрямку дослідження показали, що під впливом ІФН у щурів пубертатного віку з гіпотиреозом відбувалося суттєве підвищення концентрації тироксину та трийодтироніну в крові (рис. 2). В той же час, у 12-місячних тварин при цьому виникало зменшення вмісту тиреоїдних гормонів в крові. Пониження концентрації тироксину та трийодтироніну у 12-місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом, що виникало під впливом фізичного навантаження, що сприяло обмеженню у них додаткової стимуляції вільнорадикальних процесів в печінці.

Різноспрямовані зміни концентрації тиреоїдних гормонів в крові 1,5- та 12-місячних щурів із гіпотиреозом після ІФН в умовах пониження рівня ТТГ відображають змінення у них характеру секреції тиреотропіну передньою долею гіпофізу на вплив стресорних факторів на організм (Рис.3). Багаточисельними дослідженнями різних авторів було встановлено факт підвищення секреції тиреоїдних гормонів при стресі (G.Johansson et al., 1987; Y.Friedman et al., 1999) та, відповідно, при фізичному навантаженні (J.W.Castellani, 2002; W.S.Huang, 2004; F.Ciloglu et al., 2005; G.Brabant, 2005).

Пониження рівня ТТГ при фізичному навантаженні у щурів з гіпотиреозом не мало залежного від віку характеру та виявлялося у тварин обох вікових груп. В той же час, у 1,5- та 12-місячних щурів з'являлися характерні вікові особливості в реакції щитовидної залози на зміни концентрації ТТГ в крові. У дорослих тварин з експериментальним гіпотиреозом в умовах стресу, що супроводжує інтенсивне фізичне навантаження, вони відображали збереження фізіологічного характеру відповіді щитовидної залози на зміни концентрації ТТГ в крові. У щурів пубертатного віку аналогічна відповідь відсутня, що вказує на порушення у них регуляторних взаємовідносин між секрецією тиреотропіну передньою долею гіпофізу та щитовидною залозою. Обмеження ролі ТТГ в регуляції секреції гормонів щитовидної залози зумовлює появу особливостей в перебігу гіпотиреозу та посилення проявів стресорного впливу на організм в пубертатному періоді.

Оцінюючи результати проведених досліджень, беручи до уваги дані щодо концентрації ТТГ та тиреоїдних гормонів в крові, можна дійти висновку, що ефективність проявлення експериментального гіпотиреозу була більш високою у 12-місячних, ніж у 1,5-місячних щурів. Поряд із цим в печінці у 1,5-місячних тварин із гіпотиреозом виникали значно виражені прояви оксидативного стресу, ніж у 12-місячних. Такі особливості в зміні стану вільнорадикальних процесів зумовлюють вірогідність посилення альтерації печінки та виникнення ускладнень з її боку при гіпотиреозі в пубертатному віці, не дивлячись на слабкіші прояви гормональних зрушень. Також про це свідчать дані про більш високу ефективність реалізації у них прооксидантних ефектів стресу в печінці, що супроводжує інтенсивне фізичне навантаження.

Важливу роль у виникненні особливостей перебігу гіпотиреозу в пубертатному періоді набувають характерні для цього періоду розвитку зміни в ендокринній регуляції метаболізму, які реалізуються в зміні стану вільнорадикальних процесів в печінці.

Висновки

1. Під впливом інтенсивного фізичного навантаження у щурів з гіпотиреозом відбувається зменшення концентрації ТТГ в крові, що є більш вираженим у 12-місячних, ніж у 1,5-місячних тварин. Водночас у 12-місячних щурів виникає пониження концентрації Т₃ та Т₄, тоді як у 1,5-місячних тварин відбувається збільшення їх вмісту.

2. Характер зрушень в концентрації ТТГ та тиреоїдних гормонів в крові вказує на те, що у 1,5-місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом після інтенсивного фізичного навантаження відбувається обмеження регуляторного ефекту ТТГ на рівень Т₃ и Т₄, що є одним з факторів, зумовлюючих появу у них особливостей в перебізі вільнорадикальних процесів в печінці.

3. Експериментальний гіпотиреоз супроводжується накопиченням продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та карбонільованих білків в печінці. У 1,5-місячних тварин збільшення вмісту продуктів вільнорадикального окислення ліпідів та білків виникає в гомогенаті печінки, а також в її мікросомальній та постмітохондріальній фракції, а у 12-місячних - тільки в мікросомальній фракції. Накопичення продуктів ПОЛ та карбонільованих білків в субклітинних фракціях печінки щурів обох вікових груп при гіпотиреозі не пов'язане ані з підвищенням їх чутливості до дії прооксидантів, ані зі зміненням ефективності функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту (каталази та супероксиддисмутази) в мітохондріальній та постмітохондріальній фракції.

4. При інтенсивному фізичному навантаженні в печінці щурів формується стан оксидативного стресу, проявлення якого має характерні вікові особливості. У 1,5-місячних тварин вони пов'язані з накопиченням продуктів перекисного окислення ліпідів (основ Шиффа, дієнових кон'югатів) та підвищенням швидкості індукованого ПОЛ, а у 12-місячних щурів - з підвищенням вмісту карбонільованих білків та підвищенням швидкості їх індукованого накопичення в мікросомальній фракції печінки.

5. Інтенсивне фізичне навантаження призводить до посилення проявів оксидативного стресу в печінці щурів з експериментальним гіпотиреозом. Важливе значення в виникненні цього ефекту здобуває підвищення інтенсивності вільнорадикального окислення ліпідів в мітохондріальній фракції печінки, яке є більш вираженим у 1,5-місячних тварин.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Мохамад Салем Джазаерлі, Давидов В. В. Особливості формування оксидативного стресу в печінці щурів з гіпотиреозом при інтенсивному фізичному навантаженні в залежності від віку тварин // Український біохімічний журнал. 2006. т. 78, № 5. С. 81-87. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).

2. Мохамад Салем Джазаерлі, Давидов В. В. Вікові особливості проявлення оксидативного стресу в печінці щурів при інтенсивному фізичному навантаженні // Експериментальна і клінічна медицина. 2006. № 3. С. 15-18. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).

3. Мохамад Салем Джазаерлі, Давидов В. В. Вікові особливості дії мерказолілу на вільнорадикальні процеси в печінці // Проблеми ендокринної патології. 2006. № 3. С. 29-33. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).

4. Мохамад Салем Джазаерлі, Давидов В. В. Вікові особливості змінення концентрації тиреоїдних гормонів в крові при інтенсивному фізичному навантаженні у щурів з експериментальним гіпотиреозом // Міжнародний ендокринологічний журнал. 2006. № 2, 4. С. 78-80. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).

5. Мохамад Салем Джазаерлі, Давидов В. В. Вільнорадикальне окислення білків та ліпідів в печінці щурів різного віку при інтенсивному фізичному навантаженні // Матеріали IX Українського бiохiмiчного з'їзду (Харків, 24-27 жовт. 2006 р.) - Харків, 2006. т. 2. С. 48-49. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).

6. Мохамад Салем Джазаерлі. Вікові особливості змінення концентрації тиреоїдних гормонів при експериментальному гіпотиреозі в умовах інтенсивного фізичного навантаження // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції Сучасні досягнення молодих вчених на допомогу практичній медицині (Харків, 20 жовт. 2006 р.). Харків, 2006. С. 73.

7. Мохамад Салем Джазаерлі. Вікові особливості впливу мерказоліла на стан вільнорадикальних процесів у щурів // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю “Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження та апробації лікарських засобів“ (Харків, 23 берез. 2006 р.). Харків, 2006. С. 82-83.

8. Мохамад Салем Джазаерлi. Вiковi особливості змінення секреції тиреоїдних гормонів при інтенсивному фізичному навантаженні у щурів з гiпотиреозом // Матеріали науково-практичної конференцiї молодих вчених “Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини“ (Харків, 22 листоп. 2005 р.). Харків, 2005. С. 29-30.

Анотація

Мохамад Салем Джазаерлi. “Вікові особливості проявлення оксидативного стресу при гіпотиреозі в нормі та при фізичному навантаженні”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків - 2007.

Дисертацію присвячено вивченню вікових особливостей виникнення оксидативного стресу в печінці при експериментальному гіпотиреозі.

Встановлено, що при експериментальному гіпотиреозі відбувається виникнення оксидативного стресу в печінці, що є більш вираженим у щурів пубертатного віку. Його формування пов'язане з підвищенням інтенсивності вільнорадикальних процесів в мікросомах.

Після інтенсивного фізичного навантаження в печінці щурів з гіпотиреозом посилюються проявлення оксидативного стресу, що виявляється в додатковому підвищенні вмісту в ній продуктів вільнорадикального окислення ліпідів. Посилення оксидативного стресу у 1,5-місячних тварин є більш вираженим, ніж у 12-місячних. Вікові розрізнення в формуванні оксидативного стресу в печінці щурів з гіпотиреозом, супроводжуються характерними зміненнями у вмісті тиреоїдних гормонів в крові.

Ключові слова: печінка, гіпотиреоз, оксидативний стрес, перекисне окислення ліпідів, вільнорадикальне окислення білків, інтенсивне фізичне навантаження.

Аннотация

Мохамад Салем Джазаэрли. “Возрастные особенности проявления оксидативного стресса при гипотиреозе в норме и при физической нагрузке”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков - 2007 г.

Диссертация посвящена изучению возрастных особенностей возникновения оксидативного стресса в печени при экспериментальном гипотиреозе.

Работа выполнена на 1,5- и 12-месячных крысах, которые делились на 4 группы: 1 - интактные, 2 - крысы, которые подвергались интенсивной физической нагрузке (плаванью “до отказа”), 3 - животные, у которых при помощи двухнедельного введения мерказолила воспроизводился экспериментальный гипотиреоз, 4 - крысы с экспериментальным гипотиреозом, подвергавшиеся интенсивной физической нагрузке.

Эффективность воспроизведения гипотиреоза контролировалась по уровню ТТГ и тиреоидных гормонов в крови. Состояние оксидативного стресса оценивалось по содержанию в печени и ее субклеточных фракциях продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов, оснований Шиффа) и карбонилированных белков, а также интенсивности индуцированного накопления продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков. В митохондриальной и постмитохондриальной фракции измерялась активность ферментов первой линии антиоксидантной защиты (каталазы и супероксиддисмутазы).

На основании результатов проведенных исследований было установлено, что в печени крыс с экспериментальным гипотиреозом возникает состояние оксидативного стресса, в большей мере выраженное у животных пубертатного возраста. Появление этого сдвига связано с повышением интенсивности свободнорадикальных процессов в микросомах и не сопровождается изменением скорости индуцированного свободнорадикального окисления белков и липидов, а также модуляцией эффективности функционирования ферментов первой линии антиоксидантной защиты.

После интенсивной физической нагрузки в печени крыс с гипотиреозом усиливаются проявления оксидативного стресса, что проявляется в дополнительном повышении содержания в ней продуктов свободнорадикального окисления липидов (диеновых конъюгатов и шиффовых оснований). Одновременно, в митохондриальной фракции печени возрастает концентрация продуктов перекисного окисления липидов, в большей мере выраженная у 1,5-месячных, чем 12-месячных животных. Повышение содержания диеновых конъюгатов и шиффовых оснований в митохондриях не сопровождается изменением в них соотношения активности каталазы и супероксиддисмутазы.

Параллельно с усилением проявлений оксидативного стресса в печени 1,5-месячных крыс с гипотиреозом после интенсивной физической нагрузки происходит повышение концентрации тиреоидных гормонов в крови. В отличие от них, у 12-месячных животных при этом происходит понижение содержания тироксина и трийодтиронина в крови.

Характер сдвигов в содержании исследованных гормонов в крови указывает на то, что у взрослых половозрелых (12-месячных) крыс с гипотиреозом при интенсивной физической нагрузке сохраняется физиологическая реакция щитовидной железы на изменение уровня ТТГ в крови.

В тоже время у животных пубертатного возраста (1,5-месячных) нарушается характер регуляторных взаимоотношений между передней долей гипофиза и щитовидной железой. Возникновение этого сдвига предрасполагает к появлению особенностей в течении свободнорадикальных процессов в печени крыс пубертатного возраста с экспериментальным гипотиреозом. Их проявлением служит уменьшение гормональных сдвигов, отражающих недостаточность щитовидной железы у 1,5-месячных крыс, при более выраженной стимуляции у них оксидативного стресса в печени, по сравнению с 12-месячными животными.

Появление этих особенностей, а также повышение эффективности реализации прооксидантных эффектов стресса, способствует усилению повреждения печени и возникновению осложнений с ее стороны при гипотиреозе в периоде полового созревания.

Ключевые слова: печень, гипотиреоз, оксидативный стресс, перекисное окисление липидов, cвободнорадикальное окисление белков, интенсивная физическая нагрузка.

Annotation

Mohamad Salem Jzaerli. “Age-related peculiarities in oxidative stress manifestation during hypothyroidism at rest and during exercise” - Manuscript.

Thesis for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 - biochemistry. - Kharkiv V.N. Karazin National University, Kharkiv - 2007.

The thesis is devoted to age-related peculiarities research of oxidative stress manifestation in liver during hypothyroidism.

Assay showed that during hypothyroidism concentration of lipid peroxidation products (Schiff bases and conjugated dienes) and protein carbonyl increases in liver. Accumulation of the free radical oxidation products is not accompanied by change in catalase and superoxide dismutase activity. Founded changes reflect oxidative stress initiation in liver.

During the hypothyroidism oxidative stress in liver arises that is more expressed at puberty. Its formation is connected with intensity increase of free radical processes in microsomes. After exercise oxidative stress manifestation increases in liver during hypothyroidism that is displayed by additional increase of free radical lipid peroxidation products in it. Oxidative stress intensification at puberty is expressed more than in adulthood. Age-related differences of oxidative stress formation in liver during hypothyroidism are accompanied by specific changes in thyroid hormones concentration in blood.

Key words: liver, hypothyroidism, oxidative stress, lipid peroxidation, free radical protein oxidation, exercise.

Перелік умовних скорочень

ДК дієнові кон'югати

ІФН інтенсивне фізичне навантаження

КБ карбонільовані білки

ПОЛ перекисне окислення ліпідів

СОД супероксиддисмутаза

Т₃ трийодтиронін

Т₄ тироксин

ТБК 2-тіобарбітурова кислота

ТТГ тиреотропний гормон (тиреотропін)

ШО основи Шиффа

Размещено на Allbest.ru

...