Трансгенез. Методы и этапы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Трансгенез: методы и этапы

Автор: Баженова В.А.

Введение

Трансгенез - это техника переноса экзогенной ДНК, то есть генов, через клетки зародыша в целый новый организм. Эксплуатируя этот метод, можно получать животных, несущих качественно новые признаки. Например, возможно создание пород, устойчивых к заболеваниям или несущих новые, полезные для промышленной деятельности человека признаки. С распространением трансгенеза процесс создания новых пород и линий продуктивных животных значительно ускорится, кроме того, этот метод позволяет уже в настоящее время перенести исследования функциональной активности генов in vitro (на культурах клеток) в условия in vivo (на живых организмах), что важно для понимания фундаментальных основ жизни. По мнению многих видных ученых, технология создания трансгенных животных - это одна из наиболее захватывающих отраслей науки, появившихся в последние два десятилетия.

Производство человеческих рекомбинантных медицинских препаратов из молока трансгенных животных служит выходом из многих затруднений, связанных с микробными биореакторами, таких как отсутствие у бактерий посттрансляционных модификаций белков, неправильное складывание молекул синтезируемого вещества, высокие расходы на очищение. Использование клеточных культур животных в качестве биореакторов характеризуется высокими расходами на культуральные среды и невысоким выходом продукта. Поэтому многие специалисты в области клонирования видят главную задачу в применении технологии переноса ядер для создания и размножения трансгенных животных с полезными свойствами.

трансгенез молекула регенерация днк

1. Общие этапы трансгенеза

1. Первый этап получения заключается в создании искусственной генетической структуры в виде рекомбинантной молекулы ДНК с заданными свойствами. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Определенные фрагменты ДНК, в том числе содержащие гены, получают с использованием рестриктаз. Соединение их в единую молекулу производится несколькими методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК

Ключевыми вопределении рекомбинантной ДНК являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д.

Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно-лигазный метод)

Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Некоторые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" (рис. 36). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов.

Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)

Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента -- олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 40). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно ис¬пользуют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами

В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

Существуют большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.

2. Введение рекомбинантной ДНК в клетку

Все методы получения ГМО делят на прямые (безвекторные) и непрямые (векторные).

Все прямые способы получения трансгенных животных имеют ряд существенных недостатков: трудоемкость, использование дорогостоящего оборудования и реактивов, зачастую случайная встройка молекул ДНК в геном клеток трансформируемых животных, большое количество гибнущих после трансформации клеток, мозаичность по введенному трансгену.

Значительным преимуществом использования прямых методов является довольно высокая эффективность переноса чужеродной ДНК, то есть удается перенести трансген в большее, чем при непрямых методах, количество клеток.

Требования к векторной ДНК, ее состав

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора - донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент, встроить ее в геном, позволить идентификацию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экспрессию введенного гена.

Таким образом, вектор должен быть небольшим, способным поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), многократно копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать соответствующий ген (содержать соответствующие регуляторные последовательности), должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для эффективной селекции их; должен быть способен передаваться в клетку соответствующего организма.

Вместе с геном интереса в клетку-реципиент вводят маркерные гены, необходимые для определения трансгенности организма.

Можно выделить 2 группы маркерных генов, позволяющие отличить трансформированные клетки:

1. Селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам (канамицину, тетрациклину, неомицину и др.), гербицидам (у растений). Это могут быть гены ауксотрофности по какому-либо субстрату и т.д. Основной принцип работы такого маркера - способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде, с добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформированных, нормальных клеток.

2. Репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

Чаще всего в качестве репортерных используются гены в-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GFP), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). К настоящему времени из этого арсенала наиболее часто используют гены GUS и GFP и, в меньшей степени, LUC и CAT. Используемый в настоящее время как репортерный ген GUS является модифицированным геном из Escherichia coli, кодирующим в-глюкуронидазу с молекулярной массой 68 кД. GUS активен в широком диапазоне условий среды с оптимумом при рН 5-8 и 37°С. Он может гидролизовать обширный спектр природных и синтетических глюкуронидов, что позволяет подбирать соответствующие субстраты для спектрофотометрического или флюориметрического определения активности фермента, а также для гистохимического окрашивания тканей in situ (например, в синий цвет). Фермент достаточно стабилен: он устойчив к нагреванию (время полужизни при 55°С составляет около 2 ч) и к действию детергентов. В процессе замораживания-оттаивания потери активности GUS не происходит. В составе химерных белков, созданных генно-инженерными методами, GUS обычно сохраняет свою функциональную активность. В живых клетках белок GUS также весьма стабилен и активен от нескольких часов до нескольких суток.

GFP (green fluorescent protein - зеленый флюоресцентный белок, или белок зеленой флюоресценции) был обнаружен Shimomura с соавт. в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. Ген GFP был клонирован в 1992 г. Prasher и соавт., и уже через несколько лет началось активное использование этого гена как репортерного в работах с самыми разными про- и эукариотическими организмами. В настоящее время ген GFP применяется в сотнях работ во всем мире, и число их стремительно нарастает. Столь быстрый рост вызван особыми свойствами белка GFP, а именно его способностью флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ. Эта флюоресценция обусловлена непосредственно белком, для ее проявления не требуется субстратов или кофакторов. Благодаря этому свойству ген GFP является очень перспективным репортерным геном, позволяющим проводить разнообразные прижизненные (недеструктивные) исследования с трансгенными организмами.

Из морской анемоны Discosoma sp. недавно выделен еще один белок DsRed, флуоресцирующий в красном свете. Еще несколько аналогичных флюоресцирующих белков было выделено в самое последнее время учеными Российской академии наук из различных коралловых полипов порядка Anthozoa. Он может быть денатурирован очень высокой температурой, крайними значениями рН или сильными восстановителями типа Na2SO4. При возвращении к физиологическим условиям GFP в значительной степени восстанавливает способность к флюоресценции. В составе химерных белков, созданных генноинженерными методами, GFP обычно сохраняет свою функциональную активность. В живых клетках белок GFP также очень стабилен.

CAT - гены отвечают за синтез хлорамфениколацетилтрансферазы (выделены из Escherihia coli). Этот фермент катализирует реакцию переноса ацетильной группы от ацетил-КоА к хлорамфениколу. Определяется гистохимически, по изменению окраски ткани при добавлении соответствующего субстрата.

3. Отбор трансгенных клеток и доказательство экспрессии перенесенных генов

После введения трансгена дальнейшим важным этапом получения ГМО является отбор трансгенных клеток и доказательство экспрессии перенесенных генов. Стратегия отбора трансгенных клеток зависит от генетических конструкций, используемых для трансформации.

Так, например, если трансген несет селективный маркер - чаще всего ген устойчивости к антибиотикам, то после трансформации ведется длительный отбор трансгенных клеточных популяций в условиях повышенной концентрации данного антибиотика.

Для определения трансгенности эмбрионов широкое применение нашел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).Полимерамзная цепнамя реамкция (ПЦР) -- экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Однако стоит помнить о том, что в действительности достоверные способы определения трансгенности связаны, как минимум, с рождением предположительно трансгенных животных. Ни один из методов определения трансгена на ранних стадиях не дает прямого ответа на вопрос, прошла ли интеграция экзогенной ДНК в геном, или же генетическая конструкция находится во внехромосомной форме. Поэтому в случае определения экзогенной ДНК на доимплантационных стадиях следует учитывать ряд допущений. Например, при использовании метода ПЦР следует помнить, что (1) не все копии экзогенной ДНК попадают в пронуклеус и остаются в ядре, (2) не все копии, попавшие в пронуклеус, интегрируют в геном, и (3) не все копии, не интегрировавшие в геном, элиминируются нуклеазами к моменту приготовления препарата

4. Основные медоты введения экзогенной ДНК. Преимущества и недостатки

Безвекторные (прямые) методы

1. Метод микроиньекций

В настоящее время широко используемым методом переноса генов (трансгеноза) в получении трансгенных животных является метод микроинъекций. Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора.

Генетическую конструкцию инъецируют в одноклеточный эмбрион - зиготу. В зиготе генетический материал, полученный от отца и матери, находится в двух пузырьках, окруженных ядерной мембраной, - в мужском и женском пронуклеусах. Результативной является микроинъекция в пронуклеус. Как показано многими исследователями, микроинъекция ДНК в цитоплазму не приводит к встраиванию конструкции в геном.

Необходимое количество копий генетической конструкции вводится при помощи микропипетки, закрепленной в держателе микроманипулятора .Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, индивидуально метят, берут у них пробу тканей или крови для доказательства интеграции ДНК.

Минусы: не все животные, родившиеся из инъецированных зигот, несут чужеродный ген. А те, которые все-таки являются трансгенными, обычно оказываются мозаичными по введенному гену, то есть несут его не во всех тканях организма. На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаичными по трансгену. Факторы, влияющие на частоту интеграции при использовании метода микроинъекции :степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции и др.

В настоящее время методом микроинъекций удачно получены трансгенные особи некоторых видов рыб (Sin, 1997). Причем процент выживших трансформированных эмбрионов у морских рыб довольно высок - до 85% у лосося (Devlin et al.,1995). Однако процент эмбрионов, несущих инъецированный трансген, и не мозаичных, довольно низок. К примеру, доказана трансгенность всего лишь 6% выживших эмбрионов у лосося, 13% у теляпии (Martinez et al., 1996).

Преимущества: Метод представляет собой быструю одноэтапную процедуру.

2. Электропорация

Ещё одним способом внедрения экзогенной ДНК в клетки является метод электропорации, впервые примененный в 1982 г. Т. Вонгом и Е. Нейманом с сотрудниками. Суть подхода заключается в кратковременном (5 - 20 мс) воздействии электрического поля высокой напряженности (1 - 15 кВ/см) на бислойную липидную мембрану, что приводит к образованию в ней пор. Время существования и размер пор позволяют таким макромолекулам, как ДНК, войти в клетку под действием осмотических сил. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, а также концентрация экзогенной ДНК и количество клеток-реципиентов подбираются экспериментально. Электропорация является наиболее простым, эффективным и хорошо воспроизводимым методом введения молекул ДНК в клетки.

Изменение количества пор в мембране обратимо при условии, что величина или продолжительность импульсов высокого напряжения не превысит критического предела. Размер пор зависит от длины импульсов, силы электрического поля, а также ионного состава среды.

Электропорация была проведена, например, для эмбрионов креветки (Tseng et al., 2000) и моллюсков (Powers et al., 1995).

Недостатком использования электропорации является постепенная деградация и уменьшение экспрессии трансгена со временем (Powers et al., 1995)

3.Биобаллистическая трансформация

Суть метода биобаллистической трансформации заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, платины или золота, диаметром от 0,1 до 3,5 мкм, напыляется векторная ДНК, содержащая необходимую для трансформации генную конструкцию. Вольфрамовые, платиновые или золотые частички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются внутрь биобаллистической пушки. Суспензия животных клеток или эмбрионов, на ранней стадии развития, помещается под биобаллистическую пушку на расстоянии 10-25 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из пушки и, пробивая мембраны, входят в цитоплазму и ядра клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления частичек металла, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра будут находиться трансформированные клетки (Рис.3). Далее клетки или эмбрионы животных переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

Бомбардировка микрочастицами была использована, например, для трансформации оплодотворенных яйцеклеток креветки (Gendreau et al., 1995), морского ежа (Akasaka et al., 1995). Зеленин с соавторами (Zelenin et al., 1991) сообщают, что процент выживших клеток после бомбардировки составляет приблизительно 70%, а также ими доказана экспрессия трансгена у некоторых разновидностей рыб.

Главным преимуществом данного метода является высокая эффективность встройки векторной ДНК, а также то, что можно получить трансгенные клетки в самые кратчайшие сроки.

Существенным недостатком этого метода является то, что эмбрионы, подвергшиеся бомбардировке, довольно редко развиваются в полноценных взрослых особей, большая часть из них рано или поздно гибнет (Sin., 1997).

4. Липофекция

Липосомы - это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов.

Для защиты липосом от преждевременного разрушения используют своего рода стелс-технологии: шарики покрывают слоем полиэтиленгликоля -- инертного вещества, которое делает микрочастицы невидимыми для иммунной системы. Такие микросферы защищают ДНК от ферментов на пути к клетке.

Метод липофекции основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами ДНК. В настоящее время предложены три модели ассоциаций между ДНК и фосфолипидами (Smith et al., 1993).

Например, суть одной из них состоит в том, что положительно заряженные липосомы присоединяются к отрицательно заряженным молекулам ДНК. Число липосом, присоединившихся к ДНК, зависит от размеров молекулы нуклеиновой кислоты. Во втором случае молекулы ДНК "проглатываются" липосомами, то есть ДНК электростатически взаимодействует с внутренней поверхностью липосомы (Рис.4). В третьем случае молекула ДНК окружена несколькими молекулами фосфолипидов, которые формируют своеобразную ленту с нуклеиновой кислотой.

Липосомы, несущие положительный заряд, легко присоединяются к несущей отрицательный заряд плазматической мембране животных клеток, после чего путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клеток (Felgner et al., 1987; Behr et al., 1989; Gershon et al., 1993; Smith et al., 1993). Механизмы же, обеспечивающие встраивание в геном и экспрессию ДНК, не достаточно изучены.

Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений.

К преимуществам данного метода можно отнести низкую токсичность липосом по отношению к клеткам, а также то, что экзогенный генетический материал защищен от действия нуклеаз посредством транспортировки в липосомах.

Недостатком данного метода является то, что количество особей, экспрессирующих трансген сокращается с возрастом (Szelei et al., 1994).

5. Трансфекция

При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется неспецифическая ДНК-носитель. Обычно для этой цели берут ДНК из тимуса теленка или спермы лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способны экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10-3 - 10-5 клеток.

Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран, полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере).

Векторные (непрямые) методы

6. Трансформация с помощью сперматозоидов

В 1971 году Bracket и соавт. показали, что после инкубации спермиев кролика с меченной тритием векторной ДНК радиоактивный материал обнаруживается в головках сперматозоидов, причем была доказана экспрессия введенной ДНК. Соответственно, возник вопрос об использовании сперматозоидов в качестве природного вектора, доставляющего ДНК в клетки. В 1989 году это открытие было повторено для других видов.

В литературе имеются противоречивые сведения относительно условий и предполагаемых механизмов взаимодействия экзогенной ДНК со сперматозоидами (Wu et al., 1990; Atkinson et al., 1991). Сообщалось, что на процесс связывания не оказывают заметное влияние ионный состав среды (Macha et al., 1994) и температура ( Кузнецов, Кузнецова, 1995). В других работах отмечен температурный эффект (Wu et al., 1990; Сигаева и др., 1996) и влияние условий инкубации (Sun et al., 1994).

Известно, что только живые сперматозоиды способны ассоциировать ДНК, а максимум связывания наблюдается при высокой подвижности спермиев и концентрации ДНК (Castro et al., 1990; Lauria, Gandolfi, 1993). Некоторое время оставался открытым вопрос, способна ли посторонняя ДНК проникать внутрь сперматозоида в его ядро или она остается на поверхности спермия. В настоящее время при помощи радиоавтографии и иммунохимии показано, что чаще всего чужеродная ДНК локализуется на мембране головки сперматозоида, хотя у некоторых видов ДНК была обнаружена в области ядра (Brakket et al., 1971; Lavitrano et al., 1992)

Обратим внимание на то, что количество ассоциированной со спермиями ДНК варьируется в зависимости от вида животного и других факторов.

В некоторых работах приведены данные, касающиеся "емкости" сперматозоидов для чужеродной ДНК. Так, на примере спермиев морского ежа Paracentrotus lividus, инкубированных в течение 90 мин в присутствии радиоактивной ДНК было показано, что одним сперматозоидом связывается от 3.103 до 104 молекул ДНК (Arezzo, 1989).

Можно разделить трансформацию при помощи сперматозоидов на естественную и искусственную (Кузнецов, Кузнецова, 1995). Под естественной трансформацией понимают непосредственную инкубацию чужеродной ДНК со спермиями, в этом случае происходит спонтанное поглощение ДНК сперматозоидами.

При искусственной трансформации применяют различные способы инкорпорирования чужеродной ДНК в мужские гаметы: липофекция, использование диметилсульфоксида и др (Кузнецов, Кузнецова, 1995)

Главное преимущество данного метода состоит в том, что он не требует дорогого оборудования и специальных знаний в эмбриологии.Также очевидным преимуществом является возможность использования сперматозоидов после криоконсервации и длительного культивирования.

Но существующая частота трансгенеза пока не достаточна для интенсивного использования данного метода при трансформации морских животных. Основные неудачи в экспериментах по получению трансгенных животных с помощью подвижных векторов связаны с низкой копийностью (Nakanishi, Iritani, 1993) и деградацией привнесенной спермиями чужеродной ДНК в ранних эмбрионах (Hochi et al., 1990), а также с отсутствием в подавляющем числе случаев условий, необходимых для интеграции рекомбинантной ДНК в геном зародыша. Также недостатком метода трансформации с помощью сперматозоидов является то, что работать можно только с половыми продуктами (яйцеклетками и сперматозоидами), нельзя использовать соматические ткани.

Связывание ДНК сперматозоидами при различных условиях.

Отмытые от семенной жидкости спермии кролика через 30 мин инкубирования связывали 65 5% радиоактивной ДНК (табл. 2). В присутствии сыворотки крови кролика эта величина составляла 30 3%. Прогрев спермиев в течение 5 мин при 60њС вызывал некроспермию, с клетками связывалось 28 3% ДНК. Добавление семенной жидкости кролика или человека до 50% (об/об) уменьшало количество связанной меченой ДНК соответственно до 17 2 и 16 2%. В присутствии 1 мг/мл хлороквина сперматозоиды сохраняли двигательную активность и связывали 14 2% ДНК. Напротив, 15 мМ азид натрия приводил к обездвиживанию спермиев и связыванию 10 2% горячей ДНК. В присутствии 2,5% глутарового альдегида спермии кролика теряли подвижность и связывали 5 1% ДНК. Когда в суспензию добавляли гепарин (1000 Ед/мл) связывалось 1 1% ДНК. В 3% ДМСО сперматозоиды связывали 78 4% ДНК, а в присутствии 15 мг/ мл БСА доля связанной ДНК составляла 97 2%.

7. Использование ретровирусов

Перенос генов с использованием ретровирусных векторов - достаточно результативный способ передачи ДНК в эмбриональные клетки. Ретровирусы - семейство эукариотических РНК-содержащих вирусов. Наиболее часто используются ретровирусные вектора на основе ретровирусов мыши типа C (вирус лейкемии мыши). Такие векторные системы состоят из двух компонентов: векторной конструкции и линии клеток-упаковщиц. В векторной конструкции (провирусная ДНК) гены, кодирующие структурные белки ретровируса (gag, pol, env), замещают интересующими генами. Источником структурных белков, необходимых для формирования новых инфекционных вирусных частиц, является клеточная линия, содержащая интегрированный в геном провирус.

Преимуществом применения такого подхода является тот факт, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусом. К недостаткам относят ограниченную емкость таких систем (размер вставки - не более 8 т.п.н.), а также возможное подавление экспрессии трансгенов и вероятность активации клеточных онкогенов (Эрнст, Зиновьева, 2002). Кроме того, ограничения на использование ретровирусных векторов накладывает их низкий титр (105 - 106 КОЕ/мл). Поэтому для успешной инфекции требуется культивировать эмбрионы, лишенные zona pellucida, в кондиционированных средах, содержащих ретровирус (Kim et al., 1993; цит. по: Эрнст, Зиновьева, 2002).

8.Трансформация с помощью агробактерий

В современном сельском хозяйстве уже давно с успехом используются ГМО: новые более продуктивные сорта кукурузы, сои, риса и др. Более массовое распределение трасгенных растений объясняется простыми и доступными методами получения ГМО. Большинство трансгенных растений получены с помощью агробактерий: почвенных патогеннов растений, которые с древности выработали довольно эффективный механизм получения ГМО с заведомо полезным им свойствами (). Генные инженеры растений сегодня используют механизм агробактерий для переноса своих генов. Так у группы ученых под руководством Булгакова В.П. возникла идея применить агробактерий для решения своих проблем в области морской биотехнологии (Bulgakov et al., 2006), поскольку ранее было известно, что морские ежи содержат ряд генов, которые встречаются только у агробактерий и морских беспозвоночных. Значит, такой перенос генов от агробактерий мог уже происходить при эволюционном развитии морских ежей, например как перенос генов от агробактерий к растениям на примере табака (Intrieri, Buiatti, 2001). В свое время возникла гипотеза о возможности агробактериальной трансформации морских беспозвоночных агробактериями (Hochachka, 1988).

К эмбриональным клеткам морских ежей добавляли суспензию агробактерий, культивировали 1-2 суток и спустя 1-2 недели определяли экспрессию перенесенных генов. Экспрессия генов была и сохранялась на протяжении всего эксперимента (Bulgakov et al., 2006). Т.е. трансгенные клетки морских ежей были получены.

Недостатки: к сожалению, пока не известно об эффективности данного метода по сравнению с другими методами и поведение трансгена при длительном культивировании трансгенных клеток.

4. Факторы, влияющие на эффективность трансгенеза

Одной из центральных задач, связанных с совершенствованием метода микроинъекции, является оптимизация условий с целью увеличения выхода трансгенного потомства. Степень интеграции (отношение числа трансгенных особей к общему числу родившихся особей) при использовании метода микроинъекции варьирует в незначительных пределах в зависимости от вида животных и у мышей составляет в среднем не более 15%. Общая эффективность трансгенеза (отношение числа полученных трансгенных особей к общему числу пересаженных эмбрионов) также характеризуется относительно постоянной величиной и у мышей составляет не более 2% (Brem et al., 1995; цит. по: Эрнст, Зиновьева, 2002).

Успех трансгенеза в общем случае зависит от того, насколько приближены условия извлечения эмбрионов, условия проведения процедуры микроинъекции и, если требуется, условия культивирования эмбриона к физиологически нормальным. Важную роль здесь играют как состав инъекционного буфера, с которым экзогенная ДНК вносится в пронуклеус, и среды для культивирования зародышей, так и сама методика микроинъекции. С другой стороны, буферные системы и культуральные среды должны быть подобраны таким образом, чтобы концентрации солей и pH были не только наиболее приближены к физиологическим значениям, но и облегчали (или хотя бы не затрудняли) доступ к зиготе (и к мужскому пронуклеусу зиготы).

Выход трансгенеза, очевидно, зависит не только от эффектов, обусловленных средой, но и от эффектов генетического фона. Поэтому следует внимательно отнестись и к выбору линии мышей (обзор линий лабораторных животных приведен в работе Auerbach et al., 2003).

Размещено на Allbest.ru