Біологічні та фізичні методи аналізу в біотехнології

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

КИЇВСЬКИЙ ПОЛІТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ

Методичні вказівки для виконання лабораторних робіт

Біологічні та фізичні методи аналізу в біотехнології

Мікроскопія

Київ - 2014



Список скорочень

СЗМ - Скануюча зондова мікроскопія

СТМ - Скануючий тунельний мікроскоп

АСМ - Атомно-силова мікроскопія

МСМ - Магнітно-силова мікроскопія

МРТ - Магнітно-резонансна томографія

SQUID - superconducting quantum interference device

РЕМ - Растровий електронний мікроскоп

ФЕП - фотоелектричний помножувач



Вступ

біомембрана графітовий наночастинка магнітний

Курс ”Біологічні та фізичні методи аналізу в біотехнології. 2 Оптичні методи аналізу” є одним з важливих інженерно-біологічних складових навчального процесу, що відіграє значну роль у підготовці фахівців. Оптичні методи аналізу, особливо мікроскопія, є однією із актуальних і широко використовуваних в різних галузях науки та техніки груп інструментальних методів аналізу.

Скануюча зондова мікроскопія, яка об'єднує широкий спектр сучасних методів дослідження поверхні, нараховує більше двадцяти років своєї історії - з моменту свого створення Біннігом та Рорером скануючого тунельного мікроскопу (СТМ). За останні роки використання зондової мікроскопії дозволило досягти унікальних наукових результатів в різних областях фізики, хімії та біології.

Нові можливості даного методу на ряду з традиційними методами дослідження поверхні роблять особливо перспективним використання методу зондової мікроскопії (атомно-силової мікроскопії та магнітно-силової мікроскопії) для дослідження біологічних та органічних матеріалів та об'єктів. Наприклад, даний метод використовують для дослідження нуклеїнових кислот, зміну їх конформації у рідкому середовищі, вимірювання сил взаємодії комплементарних нукліотидів, візуалізація в реальному масштабі часу процесів взаємодії ДНК з білками.

Також важливо вміти користуватись прикладними програмами по обробці отриманих даних та зображень для того, щоб отримати повні та реальні данні. Кожна фірма, розробник СЗМ, пропонує власний пакет програм, які одночасно керують роботою мікроскопа та дають змогу оброблювати отримані зображення.

В курсі заплановано лабораторний практикум, який складається з 7 робіт, які спрямовано на набуття навичок при роботі з програмними пакетами NOVA та Gwiddion, що розповсюджуються на правах вільного доступу.

Метою даної дисципліни є вивчення принципів роботи та визначення можливостей використання оптичних методів аналізу складу, структури та властивостей різних біологічних об'єктів та систем, явищ та процесів які відбуваються на різних стадіях їх метаболізму.

Основні знання, які отримує студент по закінченню курсу: поняття і характеристики сучасного аналізу оптичними методами, зокрема, стосовно скануючої зондової мікроскопії.

Основні вміння, які отримує студент по закінченню курсу:

- робота на растровому електронному мікроскопі з різними об'єктами;

- візуалізація об'єктів та обробка отриманих результатів за допомогою сучасних програм.

Основними завданнями засвоєння дисципліни є:

- отримання та закріплення теоретичних та практичних знань в області фізичних та оптичних явищ та процесів;

- розуміння принципів побудови та роботи типових приладів та апаратури, яка використовується, способів приготування та підготовки зразків;

- обробки та аналізу експериментальних результатів та джерел можливих помилок, визначення точності експериментів та їх обмежень;

- набуття знань та навичок по оцінці отриманих результатів їх інтерпретація.

Лабораторна робота 1. Обробка та аналіз АСМ та МСМ зображень біологічних об'єктів у пакеті Nova 1.026

Мета роботи - аналіз АСМ та МСМ зображення біологічних об'єктів отриманих за допомогою скануючого зондового мікроскопу Solver Pro-M за допомогою вбудованих програмних засобів пакету Nova 1.026.

Теоретичні відомості

Основні принципи АСМ та МСМ та їх застосування у дослідженні біологічних об'єктів

Атомно-силова та магнітно-силова мікроскопії є потужними засобами вивчення властивостей біологічних об'єктів оскільки дають змогу дослідити морфологію поверхні клітин з високою роздільною здатністю. Використання АСМ та МСМ не потребують введення додаткових маркерів та фарбування клітин або інших підготовчих кроків, що призводять до виникнення артефактів у структурі. При наявності додаткового обладнання можливим є вивчення біологічного зразка безпосередньо у фізіологічних умовах. Це є важливою перевагою методів оскільки дозволяє проводити дослідження живих у культуральному середовищі протягом тривалого періоду часу.

Дослідження клітин методами АСМ та МСМ потребує їх міцної фіксації на поверхні для уникнення зміщення об'єкту при скануванні. Клітини з високою адгезивною здатністю, такі як фібробласти або епітеліальні клітини, можуть бути безпосередньо досліджені на скляних предметних поверхнях. Клітини з слабкою адгезивною здатністю, такі як бактеріальні клітини та клітини дріжджів можуть бути іммобілізовані на мембранах з пористою структурою.

Методи АСМ та МСМ можуть бути використані для вивчення адгезивної здатності клітин, механічних властивостей клітинних структур, а також динамічних параметрів утворення бімолекулярних комплексів. МСМ крім того є унікальним інструментом у вивченні магнітних структур на субмікронному рівні, що дозволяє отримувати зображення компонентів клітини на основі різниці у магнітній взаємодії зонд-зразок. Такий підхід може бути використаний для вивчення механізмів взаємодії магнітних наночастинок з біологічними об'єктами.

Принцип дії АСМ базується на визначені міжатомних взаємодій між зондом та поверхнею. При наближенні зонда до зразка він спочатку притягується до поверхні завдяки наявності найбільш діючих сил Ван-дер-Ваальса. При подальшому зменшенні відстані виникають сили відштовхування.

Розрізняють контактний, безконтактний та напівконтактний способи проведення силової мікроскопії. При контактному способі зонд перебуває у безпосередньому контакті з поверхнею і механічно взаємодіє з нею, при цьому силова взаємодія між ними знаходиться в області сил відштовхування. При такому підході детектування сил взаємодії є найбільш зручним, проте існує велика вірогідність деформації поверхні або зонда. Цей метод є неприйнятним для візуалізації біологічних об'єктів, оскільки завдає значних пошкоджень. При безконтактному способі вимірювань руйнування зразка відсутнє, однак вимірювані сигнали малі. Найбільш часто для візуалізації поверхонь, у тому числі і біологічних, використовують напівконтактний спосіб детектування взаємодії. Під час проходження у цьому режимі зонд, що коливається, перебуває у контакті з поверхнею протягом малого часу, знаходячись по черзі як в області притягання так і в області відштовхування. Внаслідок короткотривалого контакту дія зонда на поверхню є мінімальною, а вимірювані сили достатні для надійного детектування.

Зображення, одержані за допомогою МСМ, відображають просторовий розподіл деяких параметрів, що характеризують магнітну взаємодію зонд-зразок, тобто силу взаємодії, фазу та амплітуду коливань магнітного зонда. Датчик МСМ є звичайним кремнієвим датчиком АСМ, покритим тонкою магнітної плівкою. Найбільш важливою проблемою МСМ є відділення магнітного зображення від зображення рельєфу. Для вирішення цієї проблеми магнітні вимірювання проводяться з використанням двопрохідної методики. На першому проході визначається рельєф поверхні з використанням контактного або напівконтактного методу АСМ. На другому проході зонд відводиться і на нього діють тепер тільки дальнодіючі магнітні сили.

На другому проході можливе використання двох методів:

1. Статична МСМ. При використанні цього методу МСМ реєструється відхилення статичного кантилевера, що обумовлене магнітною взаємодією між зондом і зразком.

2. Динамічна МСМ. На другому проході для визначення параметрів магнітної сили використовуються резонансні коливання кантилевера (як у напівконтактному методі). У цьому методі МСМ реєструється похідна сили магнітної взаємодії.

Робота з АСМ та МСМ зображеннями у пакеті Nova 1.026

При роботі з скануючим зондовим мікроскопом Solver Pro-M отримані зображення зберігаються у файли з розширенням *.mdt. Файл можна відкрити та проаналізувати у програмному пакеті Nova 1.026, що містить спеціальний модуль обробки та аналізу СЗМ зображень. Кожне зображення являє собою двомірний масив даних. Фізичний зміст даних чисел визначається тією величиною, що оцифровувалась у процесі сканування. Для АСМ, це висота поверхні у кожній індивідуальній точці, що відображається у мікрометрах або нанометрах (координата z). Для МСМ відображається величина зсуву фази кантилевера, яка залежить від градієнту магнітної взаємодії зонд-зразок і відображається у градусах.

Отримання зображень та їх обробка здійснюється у програмі Nova 1.026. Для аналізу зображень у програмі передбачений спеціальний модуль обробки. Для запуску модулю обробки зображень необхідно:

1. Запустити програму Nova 1.026

2. Відкрити вікно Data, вибравши на панелі основних операцій вкладку Data.

3. Завантажити файл з розширенням *. mdt.

4. У лівій частині екрану знаходиться вікно зі списком конкретних зображень - фреймів. В залежності від режиму сканування атомно-силового чи магнітно-силового, під кожним фреймом буде міститись напис Height для АСМ, та Phase для МСМ. Для роботи з конкретним фреймом необхідно обрати його зі списку за допомогою миші.

5. У панелі інструментів вікна перегляду і редагування фрейму натиснути кнопку “Analysis” . Панель інструментів дозволяє здійснювати базову обробку та редагування зображення як у модулі обробки зображень так і без його запуску.

За допомогою панелі інструментів у модулі обробки зображень

можна здійснювати наступні операції:

Save image - збереження зображення у форматі *.jpg.

Select Region - виділення фрагменту зображення для якого буде здійснюватись перетворення. Для того щоб зняти виділення необхідно натиснути праву кнопку миші на виділенному фрагменті та вибрати Delete.

Move Visible Area - дозволяє переміщати видиму область за допомогою миші;

Zoom In - інструмент збільшення. Після натискання цієї кнопки необхідно вибрати об'єкт, що цікавить або область за допомогою миші;

Zoom Out - інструмент зменшення. Дозволяє зменшувати раніше збільшену область.

Інструменти візуалізації

Coloration - ручне настроювання рівня світлого - темного

3D/2D Image Representation - перемикання між двомірним і тривимірним поданням даних

Інструменти для геометричної оцінки розмірів зображень

Point Instrument - відображення координат точки, вибраної курсором на зображенні;

Length Instrument - дозволяє виміряти відстань між двома виділеними точками. Після натискання цієї кнопки необхідно кліком миші зафіксувати на зображенні першу крапку. Після цього при пересуванні курсору від однієї точки до іншої, в інформаційному рядку-панелі виводиться відстань від зафіксованої точки до поточної;

Angle Instrument - дозволяє вимірювати кут між двома обраними напрямками на зображенні. Після натискання цієї кнопки необхідно кліком миші зафіксувати першу крапку. Потім, другим кліком миші зафіксувати другу точку - вершину кута. Після цього при пересуванні курсору від однієї точки зображення до іншої в рядку стану виводиться значення кута, утвореного двома виділеними раніше точками та поточної.

Інструменти для побудови перерізу

Arbitrary L - довільний перетин фіксованої довжини та орієнтації;

X Section - перетин по осі X;

Y Section - перетин по осі Y;

Center Section - перетин з центру 2D зображення;

Arbitrary - перетин з будь-якого відрізку.

При роботі з перерізом відкривається вікно аналізу 1-D даних, у якому переріз може бути проаналізованим, як показано на рисунку 1.



Рис. 1. Ілюстрація вікна аналізу 1-D даних

У разі необхідності нове активоване вікно може бути видалене кнопкою Close selected.

Максимуми та мінімуми профілю поверхні зручно аналізувати за допомогою маркерів - одиночних та парних , що розташовані на панелі інструментів аналізу 1-D даних. Для нанесення групи маркерів використовують ліву кнопку миші утримуючи клавішу Ctrl. На кожному з маркерів міститься інформація про X та Y координати досліджуваної точки.

У Головному меню контейнеру зображень методи обробки та аналізу СЗМ-даних (2D-і 1D-даних) розділені на чотири групи:

Image Analysis - об'єднує методи пов'язані з аналізом 2D-даних;

Curve Analysis - об'єднує методи пов'язані з аналізом 1D-даних;

Transform - об'єднує методи пов'язані з перетвореннями 2D-і 1D-даних;

Filters - об'єднує методи пов'язані з перетвореннями типу «фільтрації».

Іншим зручним способом доступу до цих методів є дерево методів у лівій частині вікна.

Відомо, що на вихідному зображенні присутні шуми до яких належить:

нахил поверхні в результаті термодрейфу, за рахунок температурного розширення зразка та складових частин СЗМ.

викривлення на краях зображення внаслідок нелінійних ефектів у п'єзокреаміці.

зсуви спричинені низькочастотними шумами.

випадкові викиди спричинені високочастотними шумами.

Для видалення шумів різних частот використовується фільтрація з меню Filters. Наприклад, медіанна фільтрація Median можлива у варіаціях у околі 3x3, 5x5, 7x7 точок.

Для видалення ефекту термодрейфу використовують видалення площини з меню Transform > Flatten Correction 2D > Subtract Plane… У списку Transform > Flatten Correction 2D існує можливість віднімання кривих другого і третього порядку (Subtract 2 Order curve, Subtract 3 Order curve) для усунення нелінійних викривлень.

Статистична обробка зображення - Image analysis > Statistics > Roughness analysis… Для проведення даного виду обробки необхідно вибрати відповідний пункт меню та натиснути кнопку Apply під деревом методів, задавши крок побудови гістограми Z.

У методі Roughness Analysis обчислюються основні статистичні параметри для вихідного об'єкта (2D-функції) і будується гістограма щільності розподілу значень функції.

Відповідно, у результаті дії Roughness Analysis виникають два нових елемента Контейнера зображень: таблиця статистичних параметрів і гістограма густини розподілу функції.

У таблиці статистичних параметрів відображені такі елементи як:

Amount of sampling - загальна кількість точок

Max - максимальна висота, нм.

Min - мінімальна висота, нм.

Peak-to-peak, Sy розмах висот, нм.

Average середнє арифметичне значення висоти, нм

Average Roughness, Sa середня арифметична шорсткість поверхні, нм.

та інші параметри.

Обладнання

Комп'ютер з файлами, що містять експериментальні дані та встановленою програмою Nova 1.026.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи

1. Відкрити програму Nova 1.026 у режимі перегляду файлів.

2. Обрати файли, що підлягають аналізу.

3. Роздивитися та зберегти АСМ зображення у 3D та 2D режимах, здійснити настройку рівня світлого та темного кольорів.

4. Завантажити контейнер зображень для аналізу АСМ зображення.

5. Визначити характер та природу шумів та усунути за допомогою фільтрації, видалення площини або віднімання поверхні 2-го або 3-го порядку. Зберегти зображення та додати його у звіт.

6. Визначити лінійні розміри досліджуваних об'єктів (об'єкту).

7. Побудувати переріз зображення у області максимальної висоти об'єктів.

8. Позначити маркерами максимальні (мінімальні) значення функції на поперечному зрізі поверхні. Обчислити значення висот найбільших піків (впадин). Занести дані у звіт.

9. Здійснити Roughness Analysis досліджуваної ділянки поверхні. Знайти максимальні на мінімальні значення на поверхні та середнє значення висоти. Порівняти з даними отриманими при аналізі за допомогою поперечного зрізу. Отримані дані та гістограми додати у звіт.

10. Відкрити МСМ зображення на панелі фреймів.

11. Роздивитися та зберегти МСМ зображення у 3D та 2D режимах, здійснити настройку рівня світлого та темного кольорів. Додати зображення у звіт.

12. Завантажити контейнер зображень для аналізу МСМ зображення.

13. Побудувати поперечні перерізи для всіх перетинів, що містять області з локальними мінімумами фазового сигналу (від'ємні піки, мають вигляд чорних точок на МСМ зображенні). За допомогою маркерів визначити абсолютне значення для кожного з піків по відношенню до поверхні рівня у градусах. Дані зафіксувати у звіті.

Оформлення звіту результатів роботи

Скласти звіт у форматі Word. У звіті навести 2D та 3D зображення досліджуваних АСМ та МСМ фреймів, до і після фільтрації.

Для АСМ зображень навести лінійні розміри досліджуваних об'єктів, зображення перерізів та значення максимальних висот об'єктів. Навести результати статистичного аналізу Roughness Analysis та гістограми. Зробити відповідні висновки.

Для МСМ зображень навести зображення перерізів для всіх локальних мінімумів фазового сигналу та відповідні обчисленні абсолютні значення піків у градусах. Навести результати статистичного аналізу Roughness Analysis та гістограми.

Контрольні питання

1. Які переваги АСМ та МСМ у дослідженні біологічних об'єктів?

2. Які основні принципи АСМ та МСМ, та їх особливості при дослідженні біологічних об'єктів?

3. У чому полягає основна відмінність у зображеннях отриманих методами АСМ та МСМ?

4. Які основні типи шумів АСМ та МСМ та програмні методи їх усунення?

5. Які параметри можуть бути отримані з профілю поперечного перерізу для АСМ та МСМ?

6. Які параметри можуть бути отримані в результаті аналізу Roughness Analysis. Що відображає гістограма у даному виді аналізу?



Лабораторна робота 2. Визначення місця локалізації магнітної фази в біомембрані

Мета роботи - використовуючи методи АСМ та МСМ визначити місце локалізації магнітної фази в біомембрані

Теоретичні відомості

На сьогоднішній день для розв'язання однієї із найгостріших проблем медицини - діагностики та лікування захворювань, в тому числі онкологічних, широкого розповсюдження набули магнітокеровані нанокомпозити - носії ліків. Як правило, такий нанокомпозит представляє собою магнітну наночастинку (наприклад наночастинку магнетиту), вкриту біосумісним полімером і зв'язаною з ним специфічною речовиною біомедичного призначення. Основною перевагою магнітокерованих нанокомпозитів є можливість їх цілеспрямованої доставки в орган-мішень за допомогою зовнішніх неоднорідних магнітних полів. В зв'язку з їх використанням постали супутні проблеми: 1) проблема впливу магнітокерованих нанокомпозитів на організм людини; 2) перегляд норм безпечних діапазонів магнітних полів, що використовуються в діагностичній медичній техніці (ядерно-магнітний резонанс, томографи тощо); 3) проблема розповсюдження в організмі та біодеструкція магнітокерованих нанокомпозитів по завершенню процесу діагностики або лікування. В найбільш загальному підході ці проблеми мають два аспекти. Перший пов'язаний із застосуванням вищеописаних штучних магнітокерованих нанокомпозитів (так званих магнітних нанокомпозитів екзогенного походження), другий аспект сучасних досліджень взаємодії магнітних нанокомпозитів з організмом має більш фундаментальний характер, оскільки більше трьох десятиріч тому були відкриті магніточутливі структури, які синтезуються самим організмом, звідки набули назву магніточутливих структур ендогенного походження. Дані структури вперше були знайдені в бактеріях, а пізніше в викопних залишках організмів, що датуються, починаючи з Прекамбійської ери, молюсках, членистоногих, рибах, тваринах, в тканинах мозку та інших органах людини. Зокрема, біогенний магнетит знайдено в тканинах і органах акул, дельфінів, багатьох перелітних птахів, равликів, шершнів, бджіл та ін. Тому вищеописані проблеми співіснування екзо- та ендогенних магнітних нанокомпозитів і організму та впливу на них магнітних полів є комплексними. Так регулярно проводяться міжнародні конференції, наприклад, Drug Delivery and Formulation America 2011 (США), Drug Delivery Devices 2011 (Данія) та багато інших. Але незважаючи на інтенсивні дослідження питання про функції ендогенних магніточутливих структур залишається відкритим, хоча існують дані про зв'язок між наявністю даних структур та певних захворювань, наприклад, хворобою Альцгеймера та деякими пухлинними утворюваннями.

Основними методами детекції є кріогенні МРТ сканери, SQUID, популярні флуоресцентні мітки. Особливостями цих методів є принципова можливість використання in vivo, але при цьому вони мають обмежену роздільну здатність (долі міліметра). В той час, як СЗМ дозволяє виявити також структурну організацію магніточутливої фази в клітині на нанорівні.

Згідно з даними представленими на офіційному сайті виробника скануючого зондового мікроскопу SOLVER PRO-M [http://www.ntmdt.ru/] похідна по координаті z від z-компоненти сили взаємодії магнітного зонду з кластером магнітних наночастинок пов'язана із зсувом фази коливань кантилевера , який безпосередньо визначається в МСМ режимі сканування об'єкту, і який вимірюється у градусах, за формулою:

, (1)

де С = см/дін = 10 м/Н - коефіцієнт жорсткості кантилевера; = 200 - добротність кантилевера.

Якщо процес МСМ сканування однієї і тієї ж області зразка провести при двох різних значеннях z (, ), то безпосередньо з цих МСМ зображень можна знайти в скільки разів зменшується при збільшенні відстані від зонда до поверхні сканування, дане співвідношення позначимо .

Використовуючи модель дипольного магнітного поля для сили взаємодії робочої зони магнітного зонда з кластером магнітних наночастинок в зразку, можна знайти відстань z між центрами робочої зони магнітного зонда та кластерами магнітних наночастинок в біомембрані:

. (2),

де z - це відстань між центрами робочої зони магнітного зонду та кластером магнітних наночастинок в біооб'єкті; r0 - це радіус робочої зони зонда (r0=40 нм); h1,2 - це відстань між робочої зоною зонда та поверхнею зразка (встановлюється під час процесу сканування)

В даній роботі методами атомно-силової (АСМ) та магнітної силової мікроскопії (МСМ) досліджувалась локалізація магніточутливої (далі магнітної) фази за допомогою скануючого зондового мікроскопу (СЗМ) SOLVER PRO-M. В SOLVER PRO-M використовується двохпрохідна напівконтактна методика вивчення зразка. При першому проході магнітного зонда над поверхнею зразка (АСМ режим) отримується АСМ зображення рельєфу поверхні. Цей рельєф запам'ятовується, і при другому проході (МСМ режим) вимірюється зсув фази коливань кантилевера, що характеризує силу магніто-дипольної взаємодії робочої зони магнітного зонда з магнітною фазою в складі досліджуваного зразка, при постійній відстані між зондом та поверхнею. Магнітна фаза може представляти собою, зокрема, магнітовпорядковані наночастинки і/або їх кластери. Внаслідок обмеженості роздільної здатності скануючого зондового мікроскопу в МСМ режимі неможливо відрізнити окрему магнітну наночастинку від кластеру декількох магнітних наночастинок з розмірами порядку 100 нм. Це обумовлено тим, що характерний розмір магнітного відгуку в МСМ режимі, який відрізняється від фонового значення, складає величину порядку 100 нм, що пов'язано з розміром робочої зони магнітного зонда (80 нм). Тому далі будемо називати кластером магнітних наночастинок відокремлену локалізовану магніточутливу область на МСМ зображенні зразка з розмірами близько 100 нм. При цьому зазначений кластер може складатися із одної, двох та більшої кількості магнітних наночастинок.

Для встановлення відстані z між центрами робочої зони магнітного зонда та кластерами магнітних наночастинок в біомембрані використовували модель (2), для якої в якості вхідних даних використовували значення , отримане в МСМ режимі сканування при двох різних значеннях z.

Обладнання

АСМ та МСМ зображення біологічних об'єктів (клітини асцитної карциноми Ерліха та хлібопекарські дріжджі), MathCAD, NOVA.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи

Запустити програму NOVA та відкрити *.mdt-файл.

Обрати перше МСМ-зображення (вони підписуються Phase) отримане при заданій відстані між зондом та поверхнею зразка, як показано на рисунку 2.

Рис. 2. Типове МСМ-зображення



Відкрити перше з них та використовуючи функцію Analyze перейти в режим аналізу зображення.

Обрати ділянку та збільшити її за допомогою функції Zoom in, як показано на рисунку 3.

Рис. 3. Типове МСМ-зображення збільшеної ділянки за допомогою функції Zoom in

Використовуючи функцію Y cross section можна отримати горизонтальний зріз поверхні (рис. 4.). Кожній темній точці з певними координатами на МСМ-зображенні буде відповідати впадина на зрізі з тим ж координатами. Різниця між початковим та кінцевим значенням зрізу буде відповідати значенню даної магнітної частинки.

Рис.4. Типове МСМ-зображення зрізу поверхні

Дану процедуру провести для 20 точок першого зображення.

Аналогічну роботу провести з другим зображенням, яке отримане за іншої відстані зонду від поверхні зразка та визначити для тих самих точок, що були дослідженні на першому МСМ зображенні.

Використовуючи отримані значення та , знайти .

Використовуючи програму MathCAD та формулу 2, розрахувати відстань між робочою зоною зонда та кластером магнітних наночастинок.

Зробити висновки щодо місця та характеру розташування кластерів магнітних наночастинок у зразку.

Оформлення звіту результатів роботи

Скласти звіт у форматі Word. У звіті навести таблицю наступного вигляду

№				Д	Дср	у
1.
2.
…
20.

У висновках вказати місце локалізації структурованої магнітної фази в околі мембрани за результатами розрахунків.

Контрольні питання

Що представляє собою магнітна фаза у зразку?

Які методи детекції магнітної фази в біооб'єктах Ви знаєте?

Яка основна формула зв'язку між зсувом фази коливань кантилевера та робочою зоною магнітного зонду?

Яку модель магнітного поля використовували для розрахунку?



Лабораторна робота 3. Оцінка розмірів кластерів магнітних наночастинок в біомембрані

Мета роботи - використовуючи методи АСМ та МСМ оцінити розміри кластерів магнітних наночастинок в біомембрані

Теоретичні відомості

Локалізація та структурні фазові переходи в ансамблях магнітних мікро- та наночастинок на міжфазній поверхні з твердим тілом або рідиною представляють значний інтерес. З фундаментальної точки зору інтерес до таких систем пов'язаний з тим, що магніто-дипольна взаємодія в кластерах магнітних мікро- та наночастинок може призводити до явищ просторової самоорганізації, які проявляються в формуванні на поверхні твердого тіла або рідини просторових структур із кластерів магнітних частинок в вигляді окремих ланцюгів, систем смуг, гексагональних граток і т.д. Особливу увагу дослідників в цій галузі привертають структурні фазові переходи в ансамблях магнітних частинок під впливом зовнішнього магнітного поля, зокрема перехід від розташування магнітних частинок в одному суперкластері до смугової кластерної структури, а потім до гексагональної гратки кластерів магнітних мікрочастинок. Проблема просторової локалізації магнітних наночастинок та їх кластерів в клітині є особливо актуальною у зв'язку з сучасними розробками та вивченням впливу на біологічні системи нанокомпозитів для цілеспрямованої доставки протипухлинних препаратів на основі фери- та феромагнітних матеріалів.

Для отримання інформації про розташування кластерів магнітних наночастинок в клітині, про характерні розміри кластерів магнітних наночастинок, їх магнітний момент розглянемо більш детально процес сканування поверхні клітини в МСМ режимі.

Як відомо, дипольне магнітне поле створюється однорідно намагніченою робочою зоною магнітного зонду в місці розташування кластеру магнітних наночастинок:

, (1)

де , r - радіус робочої зони зонду

Енергія взаємодії робочої області магнітного зонда, що представляє собою намагнічену кулю з моментом з кластером магнітних наночастинок має вигляд:

. (2)

де - магнітний момент кластеру магнітних наночастинок.

Підставивши формулу (1) у (2) отримуємо:

. (3)

Так як зонд намагнічений вздовж осі OZ, то , і скалярний добуток , де - проекція магнітного моменту кластеру магнітних наночастинок на вісь OZ, то вираз для енергії взаємодії буде мати наступний вигляд:

, (4)

де z - відстань між центрами робочої зони зонда та кластеру магнітних наночастинок.

Силу взаємодії магнітного зонду з кластером магнітних наночастинок можна записати, як:

. (5)



Розраховуючи силу взаємодії магнітного зонду з кластером магнітних наночастинок по формулі (5) та використовуючи формулу (3), отримуємо наступний вираз:

, (6)

а похідна по координаті z від z-компоненти сили має вигляд:

. (7)

Згідно з даними представленими на офіційному сайті виробника скануючого зондового мікроскопу SOLVER PRO-M [http://www.ntmdt.ru/] - похідна по координаті z від z-компоненти сили взаємодії магнітного зонду з кластером магнітних наночастинок пов'язана із зсувом фази коливань кантилевера , який безпосередньо визначається в МСМ режимі сканування об'єкту, і який вимірюється у градусах, за формулою:

, (8)

де С = см/дін = 10 м/Н - коефіцієнт жорсткості кантилевера; = 200 - добротність кантилевера.

Підставляючи (7) у (8), можна отримати:

. (9)

Як відомо, магнітний момент виражається через намагніченість матеріалу за формулою:



, (10)

де - намагніченість зонду, яка для кобальтового зонду, що намагнічується до насичення, дорівнює = 1447 Гс; - об'єм робочої зони зонду.

Аналогічно для проекції магнітного моменту магнітної кластеру магнітних наночастинок на вісь 0Z запишемо: , де - об'єм кластеру магнітних наночастинок, - z-компонента намагніченості кластеру магнітних наночастинок, при цьому в моделі про сферичну форму кластеру магнітних наночастинок - радіус кластеру.

Якщо процес МСМ сканування однієї і тієї ж області зразка провести при двох різних значеннях z (, ) та співставити значення отриманих даних щодо величини в МСМ режимі сканування одного і того ж кластеру магнітних наночастинок, то можна знайти в скільки разів змінюється в залежності від відстані від зонда до поверхні сканування. Дане співвідношення отримаємо, використавши (7) та (9) та позначимо його .

(11)

Отже,

(12)

З формул (11)-(12) можна отримати, що

.

З останньої формули та виразу (12) можна знайти відстань z між центрами робочої зони магнітного зонда та кластерами магнітних наночастинок в біомембрані

. (13)

Можна розрахувати магнітний момент кластеру магнітних наночастинок в проекції на вісь . Для цього використаємо формулу (9):

, (14)

, (15)

де z розраховується за формулою (13).

Якщо магнітний момент кластер магнітних наночастинок намагнічений до насичення вздовж 0Z,і якщо припустити, що відома намагніченість насичення матеріалу магнітної частинки , то на основі формул (10), (13), (15) приблизний радіус кластеру магнітних наночастинок можна оцінити як:

. (16)

Обладнання

АСМ та МСМ зображення біологічних об'єктів (клітини асцитної карциноми Ерліха та хлібопекарські дріжджі), MathCAD, NOVA.

Порядок виконання роботи

Розрахувати середнє значення радіусу кластеру магнітних наночастинок використовуючи формулу (16), взяти з попередньої лабораторної роботи. Розрахувати середнє квадратичне відхилення.

Використовуючи вбудовані функції програми NOVA, а саме “Length” Instrument, оцінити середній радіус кластеру магнітних наночастинок методом прямих геометричних вимірів відстані між центрами сусідніх кластерів магнітних наночастинок в ланцюгу на їх МСМ зображенні.

Оформити результати

Зробити висновки.

Оформлення звіту результатів роботи

Скласти звіт у форматі Word. У звіті навести таблицю наступного вигляду

№	rm	rm ср	у	rm	rm ср	у
	1 метод	2 метод
1.
2.
…
20.

У висновках порівняти отримані значення радіусів. Визначити який метод є більш точним.

Контрольні питання

Який принцип методу визначення місця локалізації структурованої магнітної фази в біооб'єкті?

Яка основна формула зв'язку зсуву фази коливань кантилевера з похідною сили по координаті z?

Якими функціями програми NOVA, Ви користувались?

Як розраховується значення Z?

Як розраховується г ?



Лабораторна робота 4. Обробка та аналіз даних за допомогою програми Gwyddion

Мета роботи - освоїти основи аналізу зображень біологічних об'єктів за допомогою базових дій, зчитування даних, інтерполяцією за допомогою програмного пакету Gwyddion.

Теоретичні відомості

Кількість і широта функцій обробки та аналізу даних - це найбільше цінна характеристика Gwyddion.

Базові дії

Проводиться зчитування значень та базові геометричні операції, саме це лежить в основі програми оброки даних.

Базові дії з двохмірними даними

За допомогою модулей проводять наступні операції:

Перемаштабування даних, застосовуючи метод інтерполяції (Обробка даних>Базові дії>Маштабування);

Кадрування даних;

Поворот даних на кут, що кратний прямому або ж на довільно заданий (Обробка даних>Базові дії>Повернути по часовій стрілці, Повернути проти часової стрілки, Повернути на кут) та ін.

Дана програма може підтримувати велику кількість файлових форматів, певні з них використовуються у скануючій зондовій мікроскопії. У Gwyddion можуть імпортуватись графічні файли (PNG, JPEG, TIFF, TARGA) а також і двоїчні та текстові данні.

Програма Gwyddion використовує свій власний формат даних (.Gwy) для зберігання даних. Цей формат має наступні переваги:

можливість зберегти повний стан окремих даних, включаючи виділені ділянки та інше;

має довільну кількість каналів, графіків та наборів спектрів, з довільними розмірами та одиницями вимірювань, як для просторових координат, так і для значень;

представлення всіх даних з подвійною точністю, попереджаючи втрати даних в результаті округлення.

Даний формат рекомендується для збереження файлів після обробки.

1. Зчитування значень

Один із простих способів зчитування даних - розмістити курсор поверх точки, з якої потрібно зчитати данні. Як результат ми маємо демонстрацію координат в стрічці стану вікна даних або вікна графіка.

Інструмент зчитування

За допомогою даного інструмента є більше можливостей зчитування даних. Серед них: показ координати та значень в останній точці вікна даних, де було зафіксовано мишку; усереднення значення в околі вибраної точки, це можна зробити за допомогою опції «Радіус усереднення».

Зчитування значення також представляє нахил локальної грані. Радіус усереднення визначає радіус ділянки, що використовують для апроксимації площини.

Нахили

Представлення нахилів та площин представляють в сферичних кутах () вектора нормалі до площини.

Кут - це кут між напрямком вверх і нормаллю, це означає, що для горизонтальних граней і збільшується з нахилом. Цей кут завжди більше нуля.

Кут - відраховується проти часової кут між віссю inlineequation>xx



Орієнтація граней (синій колір) вимірюється як кут проти часової стрілки від осі х до проекції вектора нормалі до грані на площину xy.

Інструмент вимірювання відстані

Відстані і різниці можна виміряти за допомогою «Відстанні». Фіксується горизонтальне (), вертикальне () і сумарні відстані на площині ; азимут та різниця значень кінцевої точки для набору вибраних даних.

Відстані копіюються в буфер обміну або зберігається в текстовому файлі, як показано на рисунку нижче.

Отримання профілю

Даний інструмент присутній на панелі інструментів. Для зображення декількох профілів на зображені застосовують мишку. Наступним кроком може бути переміщування і вирівнювання цих профілів. Є можливість за допомогою ділового вікна отримати миттєво перегляд графіка.

Профілі мають різну «товщину», яка залежить від використання великої кількості точок даних в напрямку перпендикуляру до напрямку профілю, це використовується для розрахунку точки профілю. Ця процедура зменшує шум підчас вимірювання об'єктів правильної форми.

Після отримання профілів їх можна представити у вигляді графіків, як показано на рисунку 5 (окремий профіль та згруповані в одному вікні декілька профілів на одному графіку).

Рис. 5. Побудовані криві профілів

Крива профілю будується за допомогою даних, які отримані через регулярні інтервали вздовж вибраної лінії. Значення в точках, які не потрапляють точно в центр пікселя (зазвичай це притаманне лініям з нахилом) проходять інтерполяцію. Це відбувається при використанні спеціального режиму - інтерполяція. Якщо не зазначено певне число точок за допомогою опції «Фиксировать размер» , то число точок буде відповідати довжині лінії в пік селі. Це означає, що для повністю горизонтальних і вертикальних ліній інтерполяція не використовується.

2. Інтерполяція

Більшість геометричних перетворень, таких як поворот, маштабування або компенсація дрейфу застосовують інтерполяційні дані. Також інші операції, наприклад, отримання профілів, це робота із значеннями між окремими пік селями і, відповідно, використовувати інтерполяцію.

В програмі Gwyddion реалізовано декілька методів інтерполяції.

Представимо принципи та властивості методів одновимірної інтерполяції. Що ж стосується методів двовимірної інтерполяції, то вони підтримуються розділенням змінних і як результат зводяться до методів одновимірної інтерполяції.

До методів інтерполяції належать:

Округлення (інтерполяція округленням, або її ще називають - інтерполяцією до найближчого сусіда) - простий метод, значення поточного місцезнаходження округлюють до цілих і, таким чином, визначається найблище значення в точці з цілим координатами. ЇЇ степінь багаточлена дорівнює нулю, регулярність і порядок 1.

Лінійна (лінійна інтерполяція) - між двома найближчими значеннями. Значення в точці з відносними координатами отримуємо за допомогою рівняння

де - значення в попередній та наступних точках. Степінь багаточлена 1, регулюється , порядок 2. Ідентично сплайну другого порядку.

Кубічна (кубічна інтерполяція) (точніше інтерполяція Кея (Key) з який має найбільш високий порядок інтерполяції) також використовують значення в точках перед попередньою та після наступної і . Іншими словами воно має довжину 4. Значення отримують по формулі

,

Де

ваги інтерполяції.

Шум (інтерполяція шуму, точніше інтерполяція Шуму четвертого порядку) Носій довжини 4. Вага інтерполяції -

Ступень полінома =3, регулярність і порядок 4.

АНС (апроксимація найблищим сусідом), розраховується із найблищих чотирьох значень даних, але на відміну від інших, не є частино- поліноміальною. Вага інтерполяції:

,

для , де , , , . Її порядок дорівнює 1.

В-сплайн Ваги -

Однак, вони застосовуються не напряму до значень функції, як вище, а до коефіцієнтів інтерполяції, розрахованим із значень функції. Ступень полінома 3, регулярність і порядок4.

О-МОМS Вага інтерполяції:

Знову, вони застосовуються не напряму до значень функції, як раніше це було, а до коефіцієнтів інтерполяції, що розраховані із значень функції. Степінь полінома 3, регулярність і порядок 4.

Приклад доступних видів інтерполяції (початкові пік селі очевидні на інтерполяції округленням.) Всі зображення мають ідентичний діапазон псевдокольору.

Робота з зображеннями у пакеті Gwyddion

Файл відкрити та проаналізувати у програмному пакеті Gwyddion, що містить спеціальний модуль обробки та аналізу - «Базові дії» та «Інтерполяція». Кожне зображення являє собою двомірний масив даних.

Обробка здійснюється у програмі Gwyddion. Для аналізу зображень у програмі передбачений спеціальний модуль обробки. Для початку роботи загружаємо фай з будь-яким розширенням. Іншими словами ми проводимо імпортування даних. На даному етапі проводиться фіксування реальних фізичних розмірів. Так, як спочатку у верхньому вікні фіксується роздільна здатність зображення, яку потрібно представити у розмірах (наприклад ).

Для цього необхідно:

1. Запустити програму Gwyddion

2. З головного меню дістати вкладку «Файл» > «Відкрити файл»> «Імпортувати BMP (JPG та ін.)».

3. Завантажити файл з розширенням *. BMP (або інше).

4. У лівій частині екрану знаходиться вікно зі списком конкретних зображень - фреймів.. Для роботи з конкретним фреймом необхідно обрати його зі списку за допомогою миші.

5. На вкладці «Імпортувати BMP» фіксувати значення горизонтальних та вертикальних розмірів роздільної здатності для вибраного малюнку.

6. За допомогою вкладки «Фізичні розміри» вказується ширина і висота зображення, робиться (або не робиться) відмітка про однаковість масштабу. Всі проведені результати фіксуються мишкою, натискаючи кнопку «ОК», як показано на рисунку 6.

Рис. 6. Типове зображення роботи в панелі «Фізичні розміри»\

7. Отримуємо вікна перегляду і редагування фрейму. Панель інструментів дозволяє здійснювати базову обробку зображення.

Робота з обробкою даних.

Перемаштабування даних, застосовуючи метод інтерполяції (Обробка даних>Базові дії>Маштабування)

Поворот даних на кут, що кратний прямому або ж на довільно заданий (Обробка даних>Базові дії>Повернути по часовій стрілці, Повернути проти часової стрілки, Повернути на кут), як показано на рисунку 7.

Рис.7. Ілюстрація роботи в панелі «Обробка даних»

Зчитування значень.

Проводиться зчитування значень висот і глибин, як показано на рисунку 8.

Рис.8. Ілюстрація роботи в панелі «Зчитування значень висоти і глибини»

Проводиться віднімання площини, опція викликається правою кнопкою мишки на зображені, як показано на рисунку 9.

Рис. 9. Ілюстрація роботи в панелі «Віднімання площини»

Вимірювання відстаней проілюстровано на рисунку 10.

Рис. 10. Ілюстрація роботи в панелі «Вимірювання відстаней»

Отримання профілів поверхні проілюстровано на рисунку 11.



Рис.11. Ілюстрація роботи в панелі «Отримання профілів»

Інтерполяція зображення проілюстровано на рисунку 12.

Рис.12. Ілюстрація роботи в панелі «Інтерполяція»



Обладнання

Комп'ютер з файлами, що містять експериментальні дані та встановленою програмою Gwyddion.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи

Відкрити програму Gwyddion у режимі перегляду файлів.

Обрати файли, що підлягають аналізу.

Роздивитися та зберегти вихідне зображення.

Завантажити зображень для аналізу у Gwyddion.

Провести роботу з Обробкою даних за допомогою: (зберегти зображення та додати його до звіту)

Перемаштабування даних, застосовуючи метод інтерполяції

Поворот даних на кут.

Визначити характер найглибших і найвищих місць на зображені, використовуючи Зчитування значень (зберегти зображення та додати його до звіту).

Провести Віднімання площини від зображення, що аналізується (зберегти зображення та додати його до звіту).

Провести Вимірювання відстаней між об'єктами на зображенні, зберегти зображення з даними вимірюваннями та за допомогою таблиці зафіксувати виміряні значення. (зберегти зображення та додати його до звіту).

Отримати 4 профілі поверхні в різних місцях зображення по х та y. (зберегти зображення та додати його до звіту).

При обробці даних ознайомитись з видами інтерполяції, навести один із видів(зберегти зображення та додати його до звіту).

Оформлення звіту результатів роботи

Скласти звіт у форматі Word. У звіті навести всі значення та зображення, що отримані в ході проведення роботи. Порівняти зміни на зображеннях із вихідним зображенням.

Зробити відповідні висновки.

Контрольні питання

1. Які базові дії є в пакеті Gwyddion при обробці зображень?

2. Які основні методи інтерполяції?

3. У чому полягає основна відмінність у при обробці типом інтерполяції лінійним і кубічним?

4. Вкажіть основні типи текстових форматів, які може підтримувати Gwyddion?

5. При імпортуванні даних які параметри можна змінити в Gwyddion?

6. Які параметри можуть бути отримані в результаті вимірювання відстаней? Що відображає кожна колонка у таблиці, що з'являється підчас вимірювання відстаней?

Лабораторна робота 5. Застосування методу вирівнювання даних та методу віднімання фону на прикладі отриманих зображень, застосовуючи програму gwyddion

Мета роботи - освоїти основи застосування методу вирівнювання даних та методу віднімання фону на прикладі отриманих зображень, застосовуючи програму Gwyddion .

Теоретичні відомості

Дані, отримані із скануючих зондських мікроскопів нерідко взагалі ніяк не вирівняні; мікроскоп безпосередньо виводить сирі дані, перераховані з напруги на пьезоськанере, виміру деформації, даних інтерферометра або значень іншої системи виявлення. Такий спосіб експорту даних дозволяє вибрати користувачеві йог власний метод вирівнювання даних.

Вибір методу вирівнювання лежить в основі конфігурації СЗМ. В основному, для систем з незалежними сканерами для кожної осі, звичай досить віднімання плоскості. Для систем з сканером, що рухається по всіх трьох осях (сканер на пєзотрубці) потрібно використовувати вирівнювання вирахуванням полінома другого порядку.

Виправити нуль і обнулити середнє значення.

Обробка даних > Вирівнювання > Виправити нуль.

Обробка даних > Вирівнювання > Обнулити середнє значення.

Найпростіші модулі з тих, що зв'язані із вирівнюванням даних - Виправлення нуля та Обнулити середнє значення.

Вирівнювання площини

Обробка даних > Вирівнювання > Вирівняти площину

Вирівнювання плоскості зазвичай є однією з перших функцій, що використовується до необроблених даних СЗМ. Плоскість розраховується по всіх точках зображення і потім віднімається з даних. Якщо на зображення накладена маска, вирівнювання плоскості пропонує або використовувати дані під маскою для апроксимації плоскістю, виключити дані під маскою або ігнорувати маску і використовувати повний набір даних.

Інструмент вирівнювання по трьом точкам

Інструмент Вирівнювання по трьох точкам може використовуватися для вирівнювання дуже складних структур поверхні. Користувач просто вибирає три точкам на зображенні, які мають бути на одному рівні, і потім натискує Застосувати. Плоскість розраховується по цих трьох точкам і віднімається з даних.



Вирівнювання граней

Обробка даних > Вирівнювання > Вирівнювання граней.

Вирівнювання граней вирівнює дані віднімання плоскості подібно до звичайної функції Вирівнювання плоскості. Проте, плоскість визначається по іншому: вона намагається зробити грані на поверхні максимально горизонтальними. Таким чином, для поверхонь з великими горизонтальними областями, це веде до набагато кращих результатів, чим звичайне вирівнювання плоскістю, особливо якщо на поверхні присутні крупні об'єкти. З іншого боку, воно не завжди підходить для деяких типів поверхонь. Сюди входять випадкові поверхні. Дані з помітним тонким шумом і нетопографічекие зображення оскільки метод не працює нормально якщо характерні просторові розміри і „висоти“ розрізняються на багато порядків.

Подібно до вирівнювання площиною, вирівнювання граней може включати або виключати дані під маскою (Рис.13). Цей вибір надається лише якщо маска є. Визначення орієнтації граней - це ітераційний процес, що працює таким чином. Спочатку визначається розкид значень локальних нормалей:

де - вектор нормалі до локальної грані.

Рис. 13. Приклад вирівнювання граней: (a) нескоректовані дані з нахилом; (b) дані, вирівняні стандартним вирахуванням плоскості (Вирівнювання плоскості); (c) дані, вирівняні вирівнюванням граней.

Вирівнювання поворотом

Обробка даних > Вирівнювання > Вирівнювання поворотом.

Рис.14. Ілюстрація роботи в панелі «Обробка даних»

Вирівнювання поворотом (Рис. 14.) проводять подібно до Вирівнювання площиною, проте, в даному випадку апроксимуюча площина не віднімається із даних. Замість цього, цей модуль бере параметри апроксимуючої плоскості і повертає дані зображення на обчислену величину так, щоб дані лежали в плоскості. Таким чином, на відміну від вирівнювання площиною, цей модуль зберігає дані про кути на зображенні.

Віднімання фону

Gwyddion містить декілька спеціальних модулів для вирахування фону. Всі вони дозволяють віднімати фон, в окреме вікно даних.

Поліноміальний фон

Обробка даних > Вирівнювання > Поліноміальний фон.

Апроксимує дані поліномом заданого порядку і віднімає цей поліном. У режимі Незалежні степені порядки для поліномів по горизонталі і вертикалі можуть бути в загальному випадку задані різними, тобто апроксимуючий поліном буде

Де та - вибрані степені поліномів по горизонталі та вертикалі відповідно. В режимі Обмежена загальна степінь апроксимуючий поліном буде:

де - вибрана загальна степінь.

Обертання дуги.

Обробка даних > Вирівнювання > Обертання дуги.

Рис.15. Ілюстрація роботи в панелі «Поворот дуги»

Обертає віртуальну „дугу“ заданого радіусу горизонтально або вертикально над (або під) даними. Що огинає цієї дуги вважається фоном, що веде до видалення деталей приблизно більше, ніж радіус дуги.

Кривизна

Обробка даних > Вирівнювання > Кривизна (Рис. 14).



Рис.16. Ілюстрація роботи в панелі «Кривизна»

Глобальні параметри кривизни поверхні розраховуються апроксимацією квадратичним поліномом і визначенням його головних осей. Додатні знаки радіусів кривизни відповідають увігнутій (чашкоподібною) поверхні, відємні опуклою (куполоподобной), змішані знаки позначають сідловидну поверхню. Окрім таблиці параметрів, можна задати вибрані лінії на даних уздовж осей апроксимуючої квадратичної поверхні і безпосередньо рахувати профілі уздовж них.

Нульове значення абсциси поміщається в пересічення осей. Подібно до функцій віднімання фону, якщо на даних присутня маска, модуль пропонує включити або виключити дані під маскою.

Рис.17. Знімок екрану діалогового вікна кривизни



Знімок екрану діалогового вікна кривизни, що показує сильне відхилення скляної пластинки з тонкою плівкою із стискуючою внутрішньою напругою (Рис. 17).

Робота з зображеннями у пакеті Gwyddion

Файл відкрити та проаналізувати у програмному пакеті Gwyddion, що містить спеціальний модуль обробки та аналізу - «Базові дії» та «Інтерполяція». Кожне зображення являє собою двомірний масив даних.

Обробка здійснюється у програмі Gwyddion. Для аналізу зображень у програмі передбачений спеціальний модуль обробки. Для початку роботи загружаємо фай з будь-яким розширенням. Іншими словами ми проводимо імпортування даних. На даному етапі проводиться фіксування реальних фізичних розмірів. Так, як спочатку у верхньому вікні фіксується роздільна здатність зображення, яку потрібно представити у розмірах (наприклад ).

Для цього необхідно:

1. Запустити програму Gwyddion

2. З головного меню дістати вкладку «Файл» > «Відкрити файл»> «Імпортувати BMP (JPG та ін.)».

3. Завантажити файл з розширенням *. BMP (або інше).

4. У лівій частині екрану знаходиться вікно зі списком конкретних зображень - фреймів.. Для роботи з конкретним фреймом необхідно обрати його зі списку за допомогою миші.

5. На вкладці «Імпортувати BMP» фіксувати значення горизонтальних та вертикальних розмірів роздільної здатності для вибраного малюнку.

Обладнання

Комп'ютер з файлами, що містять експериментальні дані та встановленою програмою Gwyddion.

Порядок і рекомендації щодо виконання роботи

Відкрити програму Gwyddion у режимі перегляду файлів.

Обрати файли, що підлягають аналізу.

Роздивитися та зберегти вихідне зображення.

Завантажити зображень для аналізу у Gwyddion.

Провести роботу із зображенням за допомогою функції «Виправити нул» (зберегти зображення та додати його до звіту).

Провести роботу із зображенням за допомогою функції «Обнулити середнє значення».

Провести роботу із зображенням «Вирівнювання площини» (зберегти зображення та додати його до звіту).

Провести роботу із зображенням за допомогою функції «Вирівнювання по трьом точкам» (зберегти зображення та додати його до звіту).

...