Система HLA-антигенов и их роль в иммунитете человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

Классы HLA

Структурная организация генов и молекул HLA

Строение системы генов HLA

Аллельный полиморфизм некоторых генов системы HLA класса II

Биологическая роль системы HLA

Антигены HLA: серологические методы определения

Антигены HLA: молекулярно-генетические методы определения

Антигены HLA: клеточные методы определения

Определение HLA-фенотипа

Заключение

Список литературы



Введение

Человеческие лейкоцитарные антигены, Система генов тканевой совместимости человека (англ. HLA, Human Leucocyte Antigens) -- группа антигенов гистосовместимости, главный комплекс гистосовместимости (далее MHC) у людей. Представлены более, чем 150 антигенами. Локус, расположенный на 6-й хромосоме содержит большое количество генов, связанных с иммунной системой человека. Этими генами кодируются в том числе и антигенпредставляющие белки, расположенные на поверхности клетки. Гены HLA являются человеческой версией генов MHC многих позвоночных (на них проводилось множество исследований MHC генов).

Открыты в 1952 году Жаном Доссе, Барухом Бенасеррафом и Джорджем Снеллом. (Нобелевская премия по медицине 1980 года.)



Классы HLA

Молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса (A, B, C) представляют пептиды из цитоплазмы на поверхности клетки (включая вирусные пептиды при их наличии). Эти пептиды представляют собой фрагменты белков, разрушенных в протеасомах. Длина пептидов в среднем около 9 аминокислот. Чужеродные антигены привлекают клетки Т-киллеры (также называемые CD8 положительные или цитотоксические Т-клетки), которые уничтожают клетку-носитель антигена. Молекулы этого класса присутствуют на поверхности всех типов клеток, кроме эритроцитов и клеток трофобласта.

Молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса (DP, DM, DOA, DOB, DQ, DR) представляют антигены из пространства вне клетки в нее, в частности в T-лимфоциты. Некоторые антигены стимулируют деление клеток Т-хелперов, которые затем стимулируют B-клетки для производства антител к данному антигену. Молекулы этого класса находятся на поверхности антигенпредставляющих клеток: дендритных клеток, макрофагов, B-лимфоцитов.

Молекулы главного комплекса гистосовместимости III класса кодируют компоненты системы комплемента, белков, присутствующих в крови.

У HLA есть также и другие роли. Они важны в защите от болезней, могут быть причиной отторжения органов после пересадки, могут защищать от рака или увеличивать его вероятность (если разрегулированы из-за частых инфекций). Они могут влиять на развитие аутоиммунных заболеваний (например, сахарный диабет 1-го типа, целиакию). HLA могут быть связаны с некоторыми индивидуальными запахами, играющими роль при выборе половых партнеров.

Кроме генов, кодирующих 6 основных антигенов, существует много других генов, сильно вовлеченных в функционирование иммунной системы, которые также находятся в комплексе HLA. Разнообразие HLA в человеческой популяции является одним из аспектов обороны от болезней, и, следовательно, шансы совпадения всех генов HLA на всех локусах очень невелики. Изначально HLA гены были идентифицированы при успешных трансплантациях органов между людьми с похожими HLA.

Структурная организация генов и молекул HLA

Классические гены HLA I класса имеют следующую экзонную организацию: экзон, кодирующий сигнальный пептид1 , экзоны, кодирующие 3 внешних и трансмембранные домены, и 3 экзона, кодирующие небольшой цитоплазматический домен.

Молекулы MHC I класса представляют собой димер, образованный б- и в-цепями.

Pис.1 Строение молекул MHC I и II классов. Греческими буквами обозначены домены, черными кружками - локализация углеводных групп (из учебника А.А. Ярилина "Основы иммунологии").

Цепь a кодируют гены HLA-A, B или C. Эта цепь состоит из трех внеклеточных доменов б-1, б-2 и б-3, содержащих по 90 аминокислотных остатков. Кроме того, в состав молекулы HLA I класса входят трансмембранная и цитоплазматическая части (25 и 30 остатков соответственно). Полиморфными являются домены б-1 и б-2. Самая высокая степень полиморфизма выявлена на участке 68 - 80, а также около позиций 110 и 135.

С доменом a-3 нековалентно связана в-цепь, представляющая собой в2-микроглобулин и являющаяся продуктом гена, не связанного с MHC (15 хромосома). Домен б-3 и в2-микроглобулин гомологичны доменам иммуноглобулинов и имеют сходную пространственную организацию: два антипараллельные в-слоя, образованные 3 и 4 отрезками полипептидной цепи и скрепленные дисульфидной связью. Над ними расположены домены б-1 и б-2, не относящиеся к суперсемейству иммуноглобулинов. N-концевая часть этих доменов формирует в-слой - дно антигенсвязывающей бороздки (щели Бъоркмана). Стенки щели образованы внутренними поверхностями a-спиральных участков, сформированных С-концевыми участками доменов разной длины. Со стенками антигенсвязывающей бороздки связаны практически все гипервариабельные участки молекул HLA.

Рис.2 Белковые продукты генов суперсемейства иммуноглобулинов: 1- молекулы МНС I класса; 2- молекулы МНС II класса; 3- Т-клеточный рецептор; 4- молекула мембранного иммуноглобулина (из монографии K. Bender "The HLA system", 1991).



Рис.3 Антигенсвязывающая щель молекул MHC I и II классов. b-слой образует дно щели, б-спирали формируют стенки (из учебника А.А. Ярилина "Основы иммунологии").

Было установлено, что молекула HLA-B272 может образовывать гомодимерную тяжелую цепь in vitro путем дисульфидного связывания через цистеин в положении 67 (мутация в этом участке подавляет образование гомодимеров). Подобные гомодимеры могут играть патогенную роль в развитии аутоимунных реакций. "Неклассическая" молекула HLA-F также ассоциирована с b2-микроглобулином, но антигенных фрагментов в ее составе выявлено не было. Судя по составу углеводного компонента, эта молекула локализуется не на поверхности, а внутри клеток (В-лимфоцитов и В-клеточных линий). Как и другие внутриклеточные продукты MHC класса I, HLA-F ассоциирован с молекулами TAP и кальциневрином. Возможно, что молекула HLA-F предназначена для экспрессии очень ограниченного числа пептидов.

Мономерные молекулы MIC схожи по строению с молекулами HLA I класса (три экстрацеллюлярных домена - б-1, -2, -3, трансмембранный участок и цитоплазматический "хвост", однако полиморфные области a-цепи находятся в пределах доменов б-2 и б-3. Кроме того, полиморфным является также трансмембранный участок молекулы MICA. Полиморфизм этого участка заключается в разном количестве аланиновых остатков, что является результатом различного количества микросателлитных повторов3 в 5 экзоне гена MICA (ген состоит из 6 экзонов). Так, установлены 5 аллелей с 4, 5, 6 и 9 GCT-повторами и аллель с 5 повторами, но со вставкой дополнительного нуклеотида (GGCT). Вставка G приводит к сдвигу рамки считывания и формированию стоп-кодона, в результате чего у молекулы MICA A5.1 терминируется цитоплазматический "хвост". Такие молекулы содержат длинный гидрофобный богатый лейцином трансмембранный регион, а во 2 позиции цитоплазматического домена происходит терминация. Динуклеотидные повторы гена MICB (13 аллелей) расположены в 1 интроне.

Строение молекул HLA класса II принципиально сходно с таковым молекул I класса, несмотря на различие в составе образующих их субъединиц.

ТМ - трансмембранный домен, ЦИТ - цитоплазматический домен, ВК - внеклеточный домен (данные для отдельных доменов разделены дефисами).

Гены, кодирующие различные полипептидные цепи молекул II класса, имеют сходную экзон-интронную организацию. Первый экзон кодирует 5,-нетранслируемую и лидерную последовательности. Второй и третий экзоны - первые (б-1 или b-1) и вторые (б-2 или в-2) внешние домены соответственно. Четвертый экзон кодирует трансмембранную часть, пятый - цитоплазматический "хвост".

Молекулы HLA II класса - это мембранные гликопротеины, состоящие из двух цепей (б и в), каждая из которых содержит по два домена. Цепи молекул II класса очень сходны между собой. N-концевые домены (б-1 и вb-1) в значительной степени полиморфны, в то время как вторые домены (б-2 и в-2) более консервативны и структурно гомологичны константным участкам иммуноглобулинов. Размер доменов около 90 остатков. В доменах в-1, б-2 и в-2 имеются дисульфидные связи. Между аминокислотной последовательностью домена в-2 антигенов II класса и a-1 антигенов I класса D. Larhammer et al. выявили гомологию, а последовательность аминокислотных остатков с 92 по 192 b-цепей молекул II класса также схожа с b2-микроглобулинами и иммуноглобулиноподобными доменами тяжелых цепей антигенов I класса.

Возможно, что наличие общих участков в структуре антигенов I и II классов является отражением их общей эволюции. Каждая из цепей молекул II класса имеет трансмембранный участок длиной около 25 гидрофобных аминокислотных остатков и короткую С-концевую цитоплазматическую область длиной примерно в 10 - 20 аминокислотных остатков. На аминокислотном уровне наиболее полиморфными являются внешние альфа-1 и бета-1 домены, которые образуют пептид-связывающую бороздку и отвечают за презентацию антигенов.

Трехмерная структура молекулы II класса была установлена в 1993 году Brown et.al. на основе рентгеноструктурного анализа. Антигенсвязывающую бороздку молекул II класса образуют наиболее экспонированные внешние домены, б-1 и в-1. Дно бороздки сформировано b-складчатой структурой, состоящей из восьми антипараллельных участков, а стенки образованы a-спиралями. Отличие антигенсвязывающей бороздки молекул II класса от таковой молекул I класса заключается в том, что в молекулах II класса она образована двумя разными цепями. Домены, образующие бороздку, и в особенности первый домен b-цепи, чрезвычайно полиморфны. Области полиморфизма собраны в несколько дискретных гипервариабельных участков (например, в b-цепи HLA-DQ они соответствуют аминокислотным остаткам в положениях 52 - 58, 70 - 77, 84 - 90).

Предполагали, что одни из этих участков расположены в пределах бороздки в положении, оптимальном для связывания антигена, а другие образуют детерминанты, вовлекаемые во взаимодействие с Т-клеточными рецепторами. В частности, было показано, что некоторые аминокислотные замены в полиморфных участках молекул HLA могут влиять на структурные изменения, значимые для образования "карманов", в которых связываются определенные презентируемые пептиды. Эти изменения могут даже полностью нарушать правильное связывание конкретного пептида, препятствуя его успешной презентации, а также влиять на корректное физиологическое распознавание комплекса "пептид-молекула HLA" Т-клетками. Исследуя мутантные I-A(d) молекулы (молекулы I-A - молекулы главного комплекса гистосовместимости у мышей), Bryant et al. пришли к выводу, что корректное связывание пептидов в бороздке обеспечивается консервативным участком b-цепи (положения 80 - 82). Было также установлено, что исчезновение единственной водородной связи в положении 81 или двух водородных связей в положении 82 достаточно для того, чтобы молекула класса II I-A(d) стала неспособна к стабильному взаимодействию с пептидами, хотя процесс сборки молекулы в присутствии интактной инвариантной цепи при этом не нарушается. На основании полученных данных Bryant et al. предположили, что стабильное взаимодействие молекул MHC (major histocompability complex) II класса с пептидами зависит также и от плотности сети водородных связей между аминокислотными остатками альфа-спиралей молекулы MHC и связываемым пептидом. С другой стороны, Gaubin et al установили, что с CD4-рецепторами могут взаимодействовать и неполиморфные участки вторых доменов молекулы HLA (в данном случае HLA-DR). Таким образом, структура генов и молекул HLA обусловлена их биологическим предназначением.



Строение системы генов HLA

Комплекс генов HLA компактно расположен на коротком плече 6 аутосомной хромосомы, занимает 3500 kb (тысяч пар оснований) и содержит более 220 генов. В состав HLA входят три группы генов.

Наиболее удаленные от центромеры гены кодируют молекулы I класса HLA -B, -C, и -A. Следует отметить, что молекулы антигенов HLA обеспечивают презентацию иммунодоминантных пептидов, против которых будет развиваться иммунный ответ. Однако физиологическая функция аллелей и кодируемых ими HLA-антигенов, относящихся к различным классам HLA, в значительной степени различается. Антигены HLA класса I осуществляют взаимодействие с Т-эффектором-киллером при помощи корецептора CD8. В результате этого взаимодействия происходит индукция Т-киллера против иммунодоминантного пептида, экспонированного на поверхности клеток-мишеней. При этом антигенный пептид распознается в комплексе с HLA-антигеном класса I, идентичным локализованному на Т-киллере. В итоге клетки-мишени Т-киллером уничтожаются. Кроме того, классические молекулы HLA I класса взаимодействуют c KIR и некоторыми ILT рецепторами NK-клеток1. Молекулам HLA I класса принадлежит также и физиологическая функция обеспечения взаимодействия между всеми другими ядросодержащими клетками организма, вплоть до взаимодействия нейрон-синапс. Для всех вышеуказанных локусов HLA класса I установлен выраженный аллельный полиморфизм.

В последние годы в пределах I класса системы HLA открыты новые (неклассические) локусы - E, F, G, H (псевдоген, экспрессируется на уровне РНК), J (псевдоген), для большинства из которых пока не выявлено наличие аллельного полиморфизма и не определены биологические функции. Предполагается, что молекулы HLA-G экспрессируются на экстраворсинчатом трофобласте, клетках фетального происхождения, инвазирующих материнскую ткань плаценты, и взаимодействуют с KIR и некоторыми ILT рецепторами NK-клеток. Молекулы HLA-E являются лигандами для рецепторов NK-клеток, представляющих собой гетеродимеры CD94, ковалентно связанные с NKG2D2. Лигандами для NKG2D являются также молекулы MICA и MICB. Гены MICA и MICB расположены рядом с генами MHC I класса, но отличаются от них экзон-интронной организацией. Кроме того, молекулы MICA экспрессируются в основном на фибробластах и эпителиальных клетках. Тем не менее предполагают, что цепь молекулы MICA сходна с цепями молекул MHC I класса и способна связывать пептиды и другие короткие лиганды. Молекулы MICA и MICB распознаются интестинальными межэпителиальными T-клетками, несущими на поверхности TCRG и TCRD3. В этом взаимодействии участвуют альфа-1/альфа-2 домены молекул MIC, причем процессинг антигена для этого не является необходимым. Таким образом, молекулы MICA и MICB способны регулировать протективную функцию интестинальных межэпителиальных Т-клеток. Взаимодействие MIC с NKG2D стимулирует цитолитическую активность естественных киллеров и г/д Т-клеток4 против трансфектантов и эпителиальных опухолевых клеток, экспрессирующих МICA.

Между генами HLA I и II классов расположены гены, кодирующие молекулы III класса. Среди них выделяют суперсемейства C (факторы комплемента, которые вовлечены в процессы элиминации чужеродных антигенов) и G (функции окончательно не выяснены, но предполагается, что продукты экспрессии отдельных генов данного семейства участвуют в процессе созревания лейкоцитов). MHC кластер генов комплемента (MCGC) состоит из 13 структурных генов, псевдогенов и генных сегментов. Между генами комплемента Bf и C4 расположены гены RD, SK12W, DOM3Z и RP1. Продукты экспрессии этих генов (за исключением RP1) участвуют в метаболизме РНК. Ген RD кодирует субъединицу фактора элонгации транскрипции, необходимого для регуляции генной экспрессии, SK12W - ген РНК-геликазы. DOM3Z представляет собой ген ядерного протеина, гомолог которого у дрожжей образует комплекс с экзорибонуклеазой, RP1 (или STK19) кодирует одну из ядерных киназ. Поскольку потенциальной функцией протеинов DOM3Z и SK12W является утилизация деградированной ядерной и цитоплазматической РНК, предполагают, что эти гены могут быть связаны с предрасположенностью к системной красной волчанке (при этом заболевании нарушен процесс удаления продуктов апоптоза).

Молекулы II класса кодируют ближайшие к центромере гены локуса HLA -DP, -DQ и -DR. Антигены HLA класса II (альфа-бета гетеродимеры) обеспечивают взаимодействие антиген-презентирующей клетки с Т-хелпером при помощи корецептора CD4, что ведет к формированию популяции Th1- и Th2-клеток, одни из которых индуцируют развитие гуморального иммунного ответа, а другие являются необходимым компонентом в индукции Т-киллеров. Kelly et. al. обнаружили еще два гена - DMA и DMB, расположенные между HLA-DP и HLA-DQ. Функция генов локуса DM заключается в обеспечении корректного транспорта молекул II класса из эндоплазматического ретикулума и стабильного связывания альфа-бета гетеродимеров со специфическими пептидами. Morris et al. и Fling et al. предположили, что HLA-DMB и DMA кодируют субъединицу функционального гетеродимера, необходимого для презентации антигена. Weber et al. в 1996 году установили, что молекулы DM играют очень важную роль в освобождении антигенсвязывающей щели от Ii, так как обладают сродством к CLIP5.

Среди генов II класса также установлены локусы DNA, DOA и DOB. Предполагают, что молекулы HLA - DO совместно с молекулами HLA - DM принимают участие в генетической рестрикции6 при распознавании антигена. Liljedahl et al. обнаружили, что молекулы DO находятся в лизосомах B-клеток и образуют стабильные комплексы с молекулами DM. Транспорт молекул DO из эндоплазматического ретикулума возможен только в составе таких комплексов. В 1984 году Spielman et al. обнаружили ген DZA (DNA). Предполагают, что ген DZA может быть связан с DOB. Между локусами DNA и DO располагаются важные в функциональном отношении гены. Одни из них - TAP 1 и TAP 2 - являются генами со сравнительно низким уровнем экспрессии. Они кодируют молекулы, которые вовлечены в транспорт антигенных пептидов в эндоплазматический ретикулум. Другие локусы - LMP 2 и LMP 7 содержат гены, кодирующие низкомолекулярные белки протеосом, участвующие в процессинге и деградации антигенов. Исследования van Endert et al. продемонстрировали высокую степень неравновесия по сцеплению между TAP1 и LMP7. За последние годы границы системы HLA расширились также и в сторону центромеры. Например, открыт ранее неизвестный псевдоген локуса HLA-DP, названный DPA 3.

Как говорилось ранее, система HLA является чрезвычайно полиморфной. Благодаря применению современных молекулярно - генетических подходов к изучению системы HLA, помимо открытия новых локусов происходит также определение все большего количества аллельных вариантов генов ранее известных участков хромосом.

Результатом разнообразия аллелей HLA на генетическом уровне является образование молекул, различающихся по структурным и функциональным характеристикам. В следующей статье мы попробуем рассмотреть в целом строение и распределение на разных клетках организма человека молекул MHC.

Аллельный полиморфизм некоторых генов системы HLA класса II

Гены системы HLA	Количество известных аллелей
DRA	2
DRB1	316
DRB2	1
DRB3	38
DRB4	12
DRB5	17
DRB6	3
DRB7	2
DRB8	1
DRB9	1
DQA1	23
DQB1	54
DPA1	21
DPB1	101
DOA	8
DMA	4
DMB	6
TAP1	6
TAP2	4
MICA	54

Самыми полиморфными участками аллелей HLA I класса являются 2-й и 3-й экзоны, но наиболее значимо (особенно для HLA-B) аллельное разнообразие 1-го экзона. Остальные экзоны и интроны сравнительно менее полиморфны. Что касается локусов HLA класса II, то в данном случае более полиморфен 2-й экзон, хотя некоторый полиморфизм обнаружен также в других экзонах (например, для локуса DQA1) и интронах.

Cведения, полученные в результате изучения полиморфизма главного комплекса гистосовместимости в популяциях различной этнической принадлежности создают основу для развития ряда направлений клинической трансплантологии, диагностического направления (определение предрасположенности к различным заболеваниям), криминалистики (идентификация личности) и могут рассматриваться также с антропологической точки зрения.

Данные о распределении специфичностей генов HLA и их сочетаний у здоровых представителей различных популяций могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний в этнических группах. Это послужит теоретической базой для практических рекомендаций в клинической трансплантологии для поиска доноров аллогенного костного мозга в пределах одной национальности. Так, благодаря переходу селекции пар "донор-реципиент" на HLA ДНК-типирование и созданию "банка" HLA-генотипированных доноров, включающего не менее 1,5 миллиона человек, годовую выживаемость пересаженного костного мозга удалось повысить с 10-20% до 70-80%. При этом, средняя эффективность (по тем же параметрам) при пересадке "родственного" костного мозга составила по международным данным не более 40%. В США, где в настоящее время наибольшее количество генотипированных доноров и реципиентов, число проводимых трансплантаций костного мозга от неродственных доноров за период 1993 - 1997 гг. возросло более чем в 8 раз. Подобные результаты были достигнуты исключительно за счет подбора полностью HLA-совместимых пар "донор-реципиент". Популяционные данные также могут быть использованы и в судебно-медицинской практике для идентификации личности.

В последние годы в иммуногенетике появилось новое направление, обозначенное как "качество" иммунного ответа. Суть этого направления состоит в изучении и конкретизации вопроса о вкладе в иммунный ответ (а точнее, в его конечный эффект) находящейся под ассоциированным с HLA контролем активности различных компонентов иммунного статуса человека. Так, в процессе анализа результатов эпидемии брюшного тифа в Суринаме в 80-х годах ХХ века было установлено, что среди выживших европеоидов были практически только HLA-DR3, A1 и B8 положительные индивиды. Позднее был отмечен факт положительной ассоциации этих аллелей и гаплотипов с высокой активностью Т-хелперов, ЕКК клеток и фагоцитоза. Недавно эти данные получили подтверждение уже на молекулярно-генетическом уровне, когда было установлено, что мишенями воздействия естественных киллеров являются мономорфные детерминанты HLA класса I, а их активность определяется так называемыми киллер-ингибирующими рецепторами клеток, ассоциированными с определенными аллелями HLA.

Таким образом, исследования строения и функций системы HLA в настоящее время еще не завершены и, возможно, результатом этих исследований станут новые данные о роли главного комплекса гистосовместимости для обеспечения нормального гомеостаза в организме человека.

Биологическая роль системы HLA

Система HLA обеспечивает регуляцию иммунного ответа, осуществляя важнейшие функции:

* презентацию антигена Т-лимфоцитам;

* селекцию и обучение Т- и В-лимфоцитов в отношении «своего» и «не своего»;

* взаимодействие клеток иммунной системы организма;

* распознавание «своего» и «не своего», в том числе измененных «своих» клеток;

* участие в реакциях «хозяин против трансплантата» и «трансплантат против хозяина»;

* запуск, реализацию и генетический контроль иммунного ответа;

* формирование иммунной толерантности, в том числе в период беременности, к полуаллогенному плоду;

* обеспечение выживания человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии.

Всё многообразие указанных функций обеспечивается строением главного комплекса гистосовместимости, в первую очередь генетическим и популяционным разнообразием или полиморфизмом данной генетической системы и ее продуктов -- антигенов HLA.

Биологическая роль антигенов HLA, помимо их значения для тканевой совместимости, изучена далеко не полностью. Гены системы HLA локализуются на 6-й хромосоме в тесной близости с целым рядом генных локусов, которые, как известно, играют важную роль в иммунной системе. Среди них следует отметить локусы, детерминирующие синтез различных компонентов комплемента, и, по-видимому, локусы, детерминирующие иммунную реактивность. Поскольку антигены HLA являются генетически обусловленными признаками, которые поддаются точной идентификации, их можно использовать для получения информации как об ассоциации с болезнями (связь определенных болезней с определенными антигенами HLA), так и о сцепленности с болезнями (передача патологического признака в сочетании с определенными антигенами HLA от поколения к поколению в одной семье). Последнее возможно из-за близкого соседства на 6-й хромосоме генов, детерминирующих патологический признак, и генов системы HLA. антиген молекула полиморфизм аллельный

У человека наиболее ярким примером ассоциации заболеваний с антигенами системы HLA является сочетание антигена HLA-B27 с анкилозирующим спондилитом; 95% больных анкилозирующим спондилитом имеют антиген HLA-B27, тогда как в контрольной группе белого населения Северной Америки его частота составляет лишь 6%. Относительный риск развития анкйлозирующего спондилита у носителей антигена HLA-B27 в 90 раз выше, чем при отсутствии этого антигена. По оценкам, от 8 до 20% носителей антигена HLA-B27 действительно страдают анкилозирующим спондилитом или родственными заболеваниями. С антигеном HLA-B27 ассоциированы синдром Рейтера, спондилит, сопутствующий колиту и псориазу, острый иридоциклит, олигоартрит у подростков и взрослых, а также «реактивный» артрит при инфекциях, вызванных сальмонеллами, шигеллами и иерсиниями. До сих пор неясно, связана ли склонность к этим заболеваниям непосредственно с самим антигеном HLA-B27 или она обусловлена сцепленным генетическим признаком, возможно, иммунной природы. Ассоциация перечисленных «спондилоартропатических» заболеваний с антигеном HLA-B27 наблюдается в разных этнических группах населения. Каких-либо ассоциаций перечисленных заболеваний с антигенами HLA-D не обнаружено.

Антиген HLA-B27 связан лишь с одной подгруппой артрита у детей -- с поздним артритом, при котором поражается небольшое ЧИСЛО суставов (тип II); следует отметить, что у этой группы детей вполне может иметь место начальная стадия анкйлозирующего спондилита или какой-либо другой спондилоартропатии. Антигены DRW6, DRW8 и DRW5 могут сочетаться с ювенильпым ревматоидным артритом, характеризующимся поражением небольшого числа суставов (тип I), и хроническим иридоциклитом, а DRW4 -- с положительным по ревматоидному фактору поли-арт-ритом.

Среди населения Северной Америки и Европы с антигенами HLA-B8 и HLA-DW3/DR3 ассоциируется другая группа заболеваний. К ней относятся хронический активный гепатит, целиакия, герпетиформный дерматит, сочетающийся с нарушениями всасывания, инсулинзависимый сахарный диабет, тиреоидит, болезнь Грейвса, болезнь Аддисона, тяжелая миастения, синдром Шегрена, дерматомиозит у детей и, возможно, системная красная волчанка. Общей чертой всех этих болезней является хронический воспалительный процесс, часто сопровождающийся образованием антител, реагирующих с тканями человека («аутоантитела»), и воспалительное поражение эндокринных органов. Для носителей антигенов В8 -- DW3/DR3 риск возникновения любого из этих заболеваний относительно невысок, причем антигены локуса D в большей степени связаны с этими болезнями, чем антигены локуса В. Исследование гистосовместимости позволило выявить гетерогенные подгруппы некоторых из этих заболеваний: например, сахарного диабета (только инсулинзависимая форма сахарного диабета связана с В8 -- DW3/DR3) и герпетиформного дерматита (только герпетиформный дерматит, которому способствует нарушение всасывания, связан с В8 -- DW3/DR3). В разных популяциях эти заболевания могут быть ассоциированы с разными антигенами HLA.

Другие болезни человека, в частности рассеянный склероз и псориаз, имеют иную связь с антигенами локусов HLA-B и HLA-D. Небольшое число болезней, например гемохроматоз, связано в основном с антигенами локуса А. Ревматоидный артрит взрослых ассоциирован только с антигенами HLA-D (DW4/DR4) и не связан с антигенами локусов А, В и С.

Среди болезней человека, которые сцеплены с системой HLA, т. е. наследуются вместе с антигенами системы гистосовместимости из поколения в поколение, следует отметить врожденную недостаточность компонентов комплемента С1 и С4, врожденную гиперплазию надпочечников и, возможно, предрасположенность к сенной лихорадке с гиперчувствительностью к пыльце амброзии.

Фенотип HLA в настоящее время не является диагностическим критерием какого-либо заболевания, и его определение имеет небольшое практическое значение для клинической медицины. Исключение составляет титрование HLA для подбора доноров и реципиентов при трансплантации. Потенциально типирование HLA можно использовать для пренатальной диагностики сцепленных с HLA болезней, таких как недостаточность С4. Изучение гистосовместимости чрезвычайно важно для классификации болезней и поисков возможных генетических факторов, предрасполагающих человека к различным болезням. Причины ассоциаций антигенов гистосовместимости с некоторыми болезнями человека еще предстоит объяснить.

Антигены HLA: серологические методы определения

Основной серологический метод типирования антигенов HLA - лимфоцитотоксический тест. Метод заключается в следующем:

- К сывороткам против разных антигенов HLA добавляют по 2000 исследуемых лимфоцитов.

- После инкубации добавляют комплемент (его источником может служить кроличья сыворотка).

- Лимфоциты, несущие антиген, против которого направлена сыворотка, под действием комплемента разрушаются.

- Затем к лимфоцитам добавляют краситель, который окрашивает только живые клетки.

Результат оценивают по относительному числу погибших лимфоцитов. Резко положительный результат свидетельствует о том, что лимфоциты несут исследуемый антиген.

Недостатки серологических методов типирования антигенов HLA. Для типирования антигенов класса I необходимо не менее 15 мл, а для типирования антигенов класса II - не менее 30 мл крови. Жизнеспособность выделенных лимфоцитов должна составлять не менее 80%. Загрязнение, длительное и неправильное хранение приводят к снижению качества сывороток и комплемента, используемых для исследования. Получение диагностических сывороток - трудоемкий и дорогостоящий процесс. Он сводится к исследованию большого количества проб сывороток от многорожавших женщин с помощью панелей лимфоцитов, типированных по антигенам HLA. Особенно трудно получить сыворотки к редким антигенам HLA. При оценке результата серологического типирования антигенов HLA необходимо учитывать, какая лаборатория его проводила и каково качество используемых сывороток. Наименее доступны сыворотки к антигенам HLA класса II, особенно к антигенам HLA-DP.

Антигены HLA: молекулярно-генетические методы определения

Эти методы основаны на исследовании ДНК. Они лишены недостатков серологических методов. Генетическое типирование стало возможным после расшифровки нуклеотидной последовательности генов HLA и выявления различий между аллелями этих генов. В настоящее время молекулярно- генетические методы используются только для типирования генов HLA класса II.

I. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. В целом последовательность нуклеотидов во всех аллелях одного гена HLA класса II однотипна, уникальны лишь замены нуклеотидов в тех областях, которые отвечают за синтез вариабельных участков. Метод основан на способности бактериальных эндонуклеаз расщеплять ДНК в тех участках, в которых сосредоточены специфические для определенной эндонуклеазы последовательности нуклеотидов - сайты рестрикции. Сайты рестрикции для данной эндонуклеазы в разных аллелях одного гена располагаются на разном расстоянии друг от друга, поэтому длина рестрикционных фрагментов у разных аллелей разная. Применение эндонуклеаз позволило выявить полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК, подобный полиморфизму HLA, определяемому серологически. Чаще всего одновременно используют несколько разных эндонуклеаз. Длину рестрикционных фрагментов оценивают методом гибридизации ДНК на твердой подложке.

Метод состоит в следующем. Фрагменты ДНК, полученные после ее обработки эндонуклеазами, разделяют с помощью электрофореза в геле. После этого их переносят на нитроцеллюлозную мембрану и инкубируют с мечеными фрагментами ДНК, комплементарными уникальным нуклеотидным последовательностям какого-либо аллеля гена HLA. Затем с помощью авторадиографии выявляют фрагменты, с которыми связались меченые фрагменты ДНК, и их длину, которую вычисляют по длине пробега фрагментов ДНК в геле. По длине фрагментов судят о присутствии тех или иных аллелей HLA у исследуемого. Если у донора и реципиента выявляются фрагменты одинаковой длины, считается, что они несут один и тот же аллель HLA.

Недостатки метода:

- большие затраты времени (обычно 2-3 нед);

- невозможность различить аллели, сайты рестрикции в которых расположены в одних и тех же участках;

- большое количество клеток для исследования (для получения достаточного количества ДНК необходимо по крайней мере 10-15 млн клеток);

- отсутствие эндонуклеаз, специфичных для определенных аллелей.

II. Определение специфических олигонуклеотидных последовательностей лишено недостатков описанного выше метода. Аллели генов HLA иногда отличаются друг от друга лишь по одной паре нуклеотидов. Синтезированы одноцепочечные олигонуклеотидные зонды, состоящие из 19-24 нуклеотидов, полностью комплементарные уникальным последовательностям каждого известного аллеля гена HLA. Созданы также зонды, комплементарные общим для нескольких аллелей последовательностям. Таким образом, для определения неизвестного аллеля можно последовательно использовать серию зондов разной специфичности. Для гибридизации с олигонуклеотидными зондами можно использовать как рестрикционные фрагменты ДНК, полученные с помощью эндонуклеаз, так и фрагменты ДНК, полученные с помощью полимеразной цепной реакции.

III. Полимеразная цепная реакция - метод, предназначенный для получения большого количества копий фрагментов ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью. Основное достоинство метода - высокая чувствительность, он позволяет создать множество копий фрагмента ДНК при минимальном исходном ее количестве. Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо синтезировать два олигонуклеотида, комплементарных 5'-концевым участкам цепей исследуемого фрагмента ДНК. Реакция включает следующие стадии:

- денатурация ДНК с получением двух однонитевых фрагментов;

- гибридизация олигонуклеотидов с 5'-концевыми участками этих фрагментов;

- синтез комплементарной последовательности нуклеотидов.

Реакцию проводят циклично, последовательно повторяя все ее стадии до получения достаточного количества копий исходного фрагмента ДНК. Количество копий ДНК увеличивается экспоненциально и после 20-го цикла реакции возрастает более чем в 1000000 раз. Полученные копии исследуют с помощью набора олигонуклеотидных зондов. Гибридизация зонда, который кодирует последовательность известного аллеля гена HLA, с исследуемым фрагментом ДНК свидетельствует о том, что в геноме исследуемого содержится данный аллель. Если гибридизации не происходит, данный аллель отсутствует.

Отсутствие гибридизации со всеми олигонуклеотидными зондами не служит доказательством открытия нового аллеля, поскольку может быть обусловлено неполнотой использованного набора зондов.

Разрабатывается молекулярно-генетическое типирование генов HLA класса I

Высокая точность и специфичность цепной полимеразной реакции позволяет с успехом использовать этот метод в других областях медицины, например в судебно-медицинской экспертизе. Разрабатываются и другие молекулярно-генетические методы типирования HLA.

Антигены HLA: клеточные методы определения

После распознавания чужеродного антигена начинается пролиферация Т-лимфоцитов. Этот процесс можно воспроизвести in vitro в смешанной культуре лимфоцитов, состоящей из лимфоцитов донора и реципиента. Если донор и реципиент несут разные антигены HLA класса II, в смешанной культуре отмечается пролиферация. Чтобы оценить иммунный ответ лимфоцитов только одного из исследуемых (отвечающих клеток), лимфоциты другого (стимулирующие клетки) инактивируют облучением или митомицином. Смешанная культура лимфоцитов позволяет выявить различия по антигенам HLA, которые нельзя обнаружить серологическими методами, например различия по антигенам HLA-DP и HLA-DQ.

Смешанная культура лимфоцитов. Равное количество лимфоцитов донора и реципиента смешивают и инкубируют в течение 5 суток при температуре 37 градусов по Цельсию, затем добавляют 3Н-тимидин, который встраивается в ДНК пролиферирующих клеток. В присутствии 3Н-тимидина лимфоциты инкубируют еще 1сутки, после чего определяют радиоактивность отвечающих клеток. В качестве отрицательного контроля используются культуры, состоящие только из отвечающих клеток, в качестве положительного - культура отвечающих клеток, стимулированных смесью лимфоцитов от разных доноров. Если радиоактивность в смешанной культуре превышает радиоактивность в отрицательном контроле не более чем на 20% или составляет не более 20% от радиоактивности в положительном контроле, считают, что донор и реципиент совместимы по антигенам HLA класса II.

Для определения одновременно 3 антигенов HLA класса II (HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DR) с помощью смешанной культуры лимфоцитов в качестве стимулирующих клеток используют лимфоциты, несущие известные антигены HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR от гомозиготных по ним доноров. Обычно эти доноры рождаются от близкородственных браков. Если гомозиготные стимулирующие клетки не вызывают пролиферацию отвечающих клеток в смешанной культуре лимфоцитов, значит, отвечающие клетки несут те же антигены HLA класса II. Таким образом, смешанная культура лимфоцитов позволяет оценить совместимость донора и реципиента без анализа антигенов HLA (с применением стимулирующих клеток неизвестного фенотипа) и определить одновременно 3 антигена HLA класса II (с применением гомозиготных стимулирующих клеток).

Реакция клеточной цитотоксичности. При совместном культивировании лимфоцитов реципиента (отвечающих клеток) и отличающихся от них по антигенам HLA класса II стимулирующих клеток среди отвечающих клеток появляются цитотксические Т-лимфоциты. Они способны разрушать клетки-мишени, несущие антигены, которые присутствуют на стимулирующих клетках. Изучение клеточной цитотоксичности в смешанной культуре лимфоцитов в ряде случаев позволяет предсказать, будет трансплантат стимулировать образование цитотоксических Т-лимфоцитов или нет. Для этого готовится смешанная культура лимфоцитов, где отвечающими клетками служат лимфоциты реципиента, а стимулирующими - инактивированные лимфоциты донора. После 6 суток инкубации смешанной культуре лимфоцитов к отвечающим клеткам добавляют свежие клетки того же донора, меченные 51Cr. Клетки реципиента и меченые клетки донора смешиваются в соотношениях 100:1, 50:1 и 10:1. После инкубации в течение 4 ч отбирают надосадочную жидкость и измеряют в ней содержание радиоактивной метки, вышедшей из разрушенных клеток донора. Отрицательным контролем служат меченые клетки донора. Метод можно использовать как до, так и после трансплантации. В последнем случае повышении активности цитотоксических Т-лимфоцитов свидетельствует об отторжении трансплантата.

Основной недостаток методов, основанных на смешанной культуре лимфоцитов, - большие затраты времени (около недели). Для более быстрого получения результатов отвечающие клетки в смешанной культуре лимфоцитов предварительно активируют известными антигенами HLA класса II. Для этого необходима панель лимфоцитов с разными антигенами HLA класса II. Кроме того, методы, основанные на применении смешанной культуры лимфоцитов, плохо воспроизводимы, поэтому, если необходимо выбрать одного из нескольких доноров, смешанные культуры с лимфоцитами, полученными от всех доноров, готовят одновременно. Если использовать гомозиготные стимулирующие клетки, они должны быть выделены непосредственно перед исследованием. Уже отмечалось, что доноров гомозиготных клеток очень мало, поэтому исследования с использованием этих клеток проводятся только в специализированных лабораториях. С помощью реакции клеточной цитотоксичности предсказать отторжение трансплантата можно далеко не во всех случаях, поэтому этот метод не получил широкого распространения.

Определение HLA-фенотипа

На мембране клеток организма присутствуют продукты генов всех локусов, размещенных на обеих нитях 6-й хромосомы. Это означает, Что HLA-гены наследуются по кодоминантному типу, т. е. одну хромосому ребенок наследует от матери, а другую -- от отца. Как уже упоминалось, совокупность генов, расположенных на одной хромосоме, составляет генотип. Таким образом, у человека два генотипа и каждая клетка организма несет на себе диплоидный набор антигенов системы один из которых кодируется матери, а другой-- отца. Исключение составляют половые клетки (яйцеклетка и сперматозоид), каждая из которых содержит в своем ядре только по одному генотипу.

Антигены гистосовместимости, выявляемые на клетках конкретного человека, составляют HLA-фенотип. Для его определения необходимо произвести фенотипирование клеток индивида. Как правило, "типируются" лимфоциты периферической крови. В данном случае не известно, какие именно HLA-антигены каким из двух генотипов родителей кодируются. Чтобы это определить, необходимо произвести типирование родителей, после чего можно установить генотипы обследуемого и, соответственно, его генотип -- последовательность расположения генов на хромосоме. На практике HLA-фенотип записывают, соблюдая числовой порядок HLA-антигенов, согласно номенклатуре. Например: HLA-фенотип субъекта -- Al,2; В5,12; DR2,5; DQ3,4.

В данном случае можно предположить 100 вариантов генотипов родителей, 50 из которых принадлежат матери, а 50 -- отцу. Определить их, как уже указывалось, можно только посредством типирования.

Если в результате типирования определяется только один антиген по какому-либо локусу, то это является следствием гомозиготности индивида по данному гену. Следовательно, от отца и матери унаследована аллель одинаковой специфичности.

До настоящего времени в большинстве лабораторий HLA-A, В, С И DR-антигены определяют при помощи серологических методов, в частности, лимфоцитотоксического теста. Этот тест основан на способности HLA-антител в присутствии комплемента разрушать лимоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты. Гибель клеток демонстрируется при помощи добавления трипанового синего.

При этом мертвые поврежденные клетки окрашиваются, и под микроскопом учитывается их количество. Применяется также микрометод, являющийся модификацией лимфоцитотоксического теста. Для его постановки используют всего лишь 1 мкл типирующих сывороток, а также небольшое количество клеток. Микролимфоцитотоксический тест является стандартным и используется во всех типирующих лабораториях мира. Набор типирующих сывороток (типирующая панель) создается в результате кропотливых исследований из образцов сывороток,

Содержащих НLА-антитела. Эти антитела могут индуцироваться во время беременности, а также в результате пересадки аллотрансплантатов. Основными продуцентами типирующих сывороток являются многорожавшие женщины, которые иммунируются HLA-продуктами мужа во время вынашивания плода.

Представления о строении системы HLA развивались и развиваются в течение всего периода ее изучения, однако за последние годы произошел качественный скачок в развитии этой проблемы. Ранее, когда основным объектом исследования служили только антигены системы HLA, представления о комплексе генов могли формироваться в основном на анализе косвенных данных, включающих изучение антигенов системы HLA в популяциях, семейном анализе, реакциях, субстратом которых были HLA-антигены. Теперь, благодаря развитию молекулярной генетики и иммунохимии, появилась возможность не только проводить тонкий анализ HLA-антигенов, но и изучить сами гены HLA. Особый прогресс в этом направлении был достигнут после открытия и внедрения в исследования в области изучения системы HLA метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего анализировать необходимые для исследований участки ДНК, что, в свою очередь, открыло широкие возможности для быстрого и точного анализа молекулярного полиморфизма HLA.

Реакция амплификации ДНК in vitro основана на способности молекул нуклеотидтрифосфатов в присутствии ДНК-полимеразы при соответствующих условиях (рН, ионная сила раствора, температура) образовывать на матрице (одноцепочечной ДНК) комплементарную цепь. Необходимым условием синтеза является наличие праймера -- олигонуклеотида, который синтезируется искусственно.

Для повышения точности реакции и увеличения чувствительности, как правило, используют пару праймеров. Управление ходом реакции идет с помощью изменения температурных условий. При определенной температуре (зависит от нуклеотидного состава ДНК) идет расхождение двойной цепи ДНК -- плавление. Снижение температуры приводит к обратному процессу -- соединению комплементарных цепей -- отжигу. При избытке праймеров в растворе вероятность отжига на ДНК-матрице праймера гораздо выше, чем присоединение полной цепи. И, поскольку праймер меньше матрицы, начинается активное достраивание (синтез) комплементарной цепи. Скорость достройки достигает нескольких сотен (иногда более тысячи) нуклеотидов в секунду. Таким образом, в конце цикла имеется удвоенный набор ДНК (точнее не всей ДНК, а участка, ограниченного праймерами).

Снова повышается температура -- плавление -- отжиг -- синтез -- и в растворе уже 4 копии исходной матрицы. Количество копий (ампли-фикатов) растет в геометрической прогрессии, и после 30--40 циклов в растворе находится от 10 млн до 10 млрд копий исходной матрицы. Причем, поскольку имеется пара праймеров, амплификаты будут строго определенного размера. Такое количество ДНК можно визуально обнаружить, например, при электрофорезе на агарозном геле с бромидом.

Существует несколько методик проведения полимеразной цепной реакции.

· SSO (sequence specific oligonucleotide) -- неспецифическая амплификация исследуемого участка (локуса) ДНК с последующей специфической гибридизацией с мечеными ДНК-зондами.

· RFLP (restriction fragment length polymorphism) -- неспецифическая амплификация с последующим переваром продуктов амплификации набором рестриктаз. По длине полученных продуктов судят о нуклеотидном составе.

· SSCP (single-strand conformation ро1утофЫзт) -- различие аллелей по электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК, обусловленной характерными элементами вторичной структуры.

· SSP (sequence specific primer) -- наиболее распространенная и технически простая методика, когда каждому аллельному варианту либо группе аллелей соответствует своя пара праймеров. Разработана но­вая модификация этой методики -- MSSP (mixture of sequence specific Primer) -- позволяющая за счет более рационального выбора прайме-ров и режимов амплификации выявить сразу несколько специфичностей, используя одну пробирку и одну дорожку на геле. Длительность определения -- около часа.

Как было сказано выше, для выявления классических антигенов системы HLA локусов А, В, С и DR используется серологическая реакция микролимфоцитотоксичности, в которой применяются специальные антисыворотки, содержащие антитела к указанным антигенам. Молекулярное же типирование позволяет с s помощью метода ПЦР выявлять различные аллели HLA на уровне ДНК. Это дает возможность выявлять те аллели генов HLA класса II, которые трудно выявляются с помощью серологического типирования, либо вовсе не выявляются. Так, например, с помощью серологической техники в локусе DR выявлено 14 антигенов, а с помощью ДНК-типирования - более 100 аллелей.

Установление новых, реально функционирующих аллелей заставило пересмотреть ранее существовавшую номенклатуру HLA, и теперь принято четырехзначное обозначение (например А0101 вместо А1). В тех же случаях, когда установлено несколько аллелей, которые по прежним представлениям кодировали различные субтипы одного антигена (например в HLA-A2 было установлено 12 таких субтипов), то теперь их обозначают как различные аллели, имеющие общие первые цифры. Например от HLA0201 до HLA0212 или от HLAB2701 до HLAB2707.

Вышесказанное прямо относится только к классу I HLA, где полиморфной является только одна цепь. В классе II из-за возможного полиморфизма как бета, так и альфа генов, установленные аллели обозначают в зависимости от цепи, несущей вариабельный участок ДНК, определяющий специфичности, например DQA1-0501 и DQB1-0501.

В настоящее время селекция донора и реципиента по HLA-антигенам с использованием ДНК-типирования стала рутинным методом в типирующих лабораториях трансплантационных центров. Данные последних лет показывают, что выживаемость трупного почечного аллотрансплантата в течение 1 года при подборе пары донор-реципиент с помощью ДНК-типирования составила 90%. В то же время при подборе пары с помощью серологического типирования эта же цифра оказалась равной 68%.

Не менее важным является определение HLA-фенотипа с помощью ДНК-типирования при решении вопроса о спорном отцовстве. В этом довольно ответственном и деликатном вопросе использование ПЦР также повышает точность анализа.

Наконец, немаловажным является практическое применение ПЦР для идентификации ДНК микроорганизмов при проведении диагностики инфекционной патологии. Опыт, накопленный за последнее время, показывает огромные перспективы использования ПЦР в этой области.

Заключение

Система HLA - наиболее сложная из всех известных систем антигенов. Генетически HLA-антигены принадлежат к четырем локусам (А, В, С, D), каждый из которых объединяет аллельные антигены.

Иммунологическое исследование, позволяющее определить антигены гистосовместимости, называют тканевым типированием. HLA-система имеет большое значение при трансплантации тканей. Аллоантигены системы HLA локусов А, В, С, D, а также агглютиногены классических групп крови системы АВО представляют собой единственно достоверно известные антигены гистосовместимости.

Для предупреждения быстрого отторжения пересаженных органов и тканей необходимо, чтобы реципиент имел ту же, что и донор, группу крови системы АВО и не имел антител к аллоантигенам HLA-генных локусов А, В, С, D донорского организма.

HLA-антигены имеют значение также при переливании крови, лейкоцитов и тромбоцитов. Различие матери и плода по антигенам HLA-си-стемы при повторных беременностях могут привести к выкидышу или гибели плода.



Список литературы

1. Акопян А.В., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Иммунологические и иммуногенетические аспекты периодической болезни // Иммунология - 1998 - N1. - С.4 - 6.

2. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Система генов HLA и регуляция иммунного ответа. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2000 г. - № 8 - С.7 - 16.

3. Ярилин А.А. Основы иммунологии. // Москва "Медицина" - 1999 - стр.52-53, 216-217, 223-225.

4. http://ru.wikipedia.org/wiki/Человеческий_лейкоцитарный_антиген

...