Биотехнологическое получение аминокислоты лизин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Украины

Национальный технический университет

«Харьковский политехнический институт»

Кафедра Биотехнологии и аналитической химии

Реферат

На тему «Биотехнологическое получение аминокислоты лизин»

Харьков 2014



ВВЕДЕНИЕ

Амиокислоты - основные структурные единицы белковых молекул. В организме человека синтезируеться только 10 из 20 известных аминокислот. Это так называемые заминимые аминокислоты (аланин, аспарагин, глицин, глутамин, пролин, серин, тирозин, цистеин, аспарагинова кислота, глутаминова кислота). Эти аминокислоты могут быть синтезированы из продуктов обмена углеводов и липидов. Остальные 10 аминокислот не синтезируються в огрганизме, поэтому они названы жизнено необходимыми, или незаменимыми аминокислотами (аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, метионин, лизин, триптофан, фенилаланин, трнонин).

Незаменимые аминокислоты должны поступать с пищей. Значение растительных белков в пище человека не возможно переоценить, поскольку именно белки растений содержат незаменимые аминокислоты, которых нет в животных продуктах и которые люди неспособны синтезировать. Необходимо отметить, что ряд аминокислот, таких как аргинин, триптофан, тирозин, лизин, цистеин и другие, синтезируеться микрофлорой кишечника.

При дефеците в организме ряда аминокислот,связанного с патологическими процессами, в арсенале врачей присуствуют препараты, содержащие индивидуальные аминокислоты или их смеси.

Аминокислоты широко применяют в медицине для терапии послеоперационных юольных, при лечении заболеваний ЦНС, язвенной болезни желудка, печени (серотонин, аспарагин, валин, глицин).

Применение аминокислот в медицинской практике основано на их способности принимать участие в синтезе белков, пептидов, ферментов, гормонов, в азотистом обмене, создании конечных его продуктов (аммиака, мочевины) и других жизнено важных процессах.

Ежегодно в мире выпучкаеться более 800 000 тонн аминокислот (пищевые добавки, кормовые добавки, косметические средства)[1].



РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Незаменимая аминокислота лизин

Лизин входит в триаду незаменимых аминокислот и жизненно необходим для полноценного питания как человека, так и сельскохозяйственных животных. Эта незаменимая аминокислота жизненно важна для построения критических белков организма. И используется организмом в ряде физиологических процессов в иммунной, мышечной и нервной системах человека и животных. Недостаток лизина в организме вызывает негативные последствия, такие как слабость, повреждение сосудов глаз, выпадение волос, снижение мышечной массы, потерю кальция, снижение иммунитета к вирусным инфекциям, а также анемию и проблемы в репродуктивной сфере. Суточная потребность человека в лизине составляет около 5 г. Большинство населения нашей страны из-за нарушения качественных и количественных параметров питания не получает оптимального количества лизина с пищей. Это определяет необходимость использования пищевых добавок, включающих лизин, как в рационе человека, так и сельскохозяйственных животных. Получение аминокислот производится посредством гидролиза естественных продуктов, содержащих белки (например, отходов птицеперерабатывающих производств), а также путем химического, энзиматического и микробиологического синтеза. Наиболее распространенным в настоящее время является микробиологический синтез аминокислот.

Современные тенденции развития науки в биотехнологическом направлении предполагают разработку новых ресурсосберегающих технологий, позволяющих увеличить объём производимой продукции при сохранении её высокого качества. Повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции может быть обеспечено совершенствованием технологий, играющих важнейшую роль в обеспечении ключевых биотехнологических процессов.

1.2 Получение лизина

Лизин - незаменимая аминокислота. Это значит, что она постоянно должна поступать в организм человека с пищей, так как сам он её синтезировать не может. Лизин входит в состав практически всех белков, необходим организму человека для нормального роста, производства гормонов, антител, ферментов, а также для восстановления тканей. Эта аминокислота оказывает противовирусное действие, особенно в отношении вирусов, вызывающих герпес и острые респираторные инфекции. Рекомендуется сочетать лизин с витамином С при вирусных заболеваниях.

Научные эксперименты показали, что при длительном применении лизин обладает мягким антидепрессантным эффектом, также на фоне приёма лизина у некоторых людей прошли мучающие их головные боли, мигрени. Лизин не вызывает сонливости, снижения концентрации внимания и работоспособности, психической или физической зависимости.

Общий объём производства лизина в мире - около 1 миллиона тонн в год. Лидеры производства лизина Китай (40 %) и США (30%).

Среди ведущих компаний на мировом рынке l-лизина лидируют японская AjinomotoCo и американская ArcherDaniels&Midlands (ADM), которые контролируют по 33% мирового производства каждая. Другими крупными игроками на рынке являются Degussa-Huels (Германия), BASF (Германия), KyowaHokko (Япония) и CheilJedangCorporation (Южная Корея). Большинство этих компаний не считают производство лизина своим приоритетным бизнесом. В основном, это диверсифицированные пищевые или химические концерны, в обороте которых на лизин приходится максимум 5-7%.

аминокислота лизин биосинтез

Расположение производственных мощностей привязано к регионам его потребления. Прирост производственных мощностей лизина составляет 7-10% в год. В частности ADM (США) и Ajinomoto (Япония) уже ведут строительство дополнительных производственных блоков на своих заводах по всему миру, что позволит каждому из них нарастить мощности с 200 до 300 тысяч тонн в год. Оптимизм производителей поддерживают показатели роста в отраслях-потребителях лизина: на китайском рынке, одном из крупнейших в мире, темпы роста в свиноводстве и птицеводстве превышают 10% в год.

Синтез L-лизина у микроорганизмов осуществляется разными путями. Дрожжи, грибы и микроводоросли синтезируют лизин из a-кетоглутаровой кислоты через a-аминоадипиновую кислоту. Вследствие малой изученности этого биосинтетического пути получение мутантов - суперпродуцентов лизина через аминоадипиновый путь представляется проблематичным. Высшие растения и бактерии синтезируют лизин по другой схеме через a-диаминопемелиновую кислоту. По этой разветвленной схеме биосинтеза лизина (диаминопимелиновый путь) синтез начинается с аспарагиновой кислоты и проходит через диаминопимелиновую кислоту.

Наиболее дешевым и освоенным способом получения лизина является микробиологический метод. Впервые такое производство налажено в Японии в середине 50-х гг.; затем в Голландии и США. В СССР лизиновая промышленность родилась в 70-х гг. ХХ в.Учитывая стремительный рост населения во всем мире и постоянно возрастающую потребность в L-лизине, особенно для изготовления кормов для животных, назрела необходимость разработки новых, более эффективных методов получения L-лизина с использованием бактериальных штаммов Escherichia.



РАЗДЕЛ 2. ОСНОВНЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ НЕЗАМЕНИМОЙ АМИНОКИСЛОТЫ - ЛИЗИНА

2.1 Продуценты лизина

Для биосинтеза лизина используют гомосерин дефецитные мутанты ауксотрофных бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacteriym и др. Продуценты лизина культивируються на средах, содержащих углеводы или уксусную кислоту, источники азота и кислород. В клетках бактерии лизин синтезируеться из пировиноградной, аспарагиновой и янтарной кислот о схеме, показаной на рис. 1.

Рис.1 Модель клетки - продуцента лизина

Химизм образования молекулы лизина показан на рис. 2. При получении лизина необходимо исключить нежелательные побочные процессы. Так как при недостаточной аэрации может идти образование аланина или молочной кислоты вместо синтеза лизина. Очень важным фактором являеться концентрация аминокислот - гомосерина, метионина и теронина в среде[4].

Рис. 2 Химизм биосинтеза лизина

Проводя патентный поиск, я выбрала перспективный штамм продуцент, так как, к настоящему времени открыто, что L-лизин можно производить с высоким выходом с использованием бактерии Escherichia, содержащей дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis.

Escherichia coli - один из наиболее изученных организмов. За последние пятьдесят лет удалось получить исчерпывающую информацию о генетике, молекулярной биологии, биохимии, физиологии и общей биологии Escherichia coli. Это грамотрицательная, подвижная полочка длиной менее 10 мкм. Средой ее обитания является кишечник человека и животных, но она также может обитать в почве и в воде. Обычно, кишечная палочка не патогенна, но при определенных условиях может вызывать заболевание человека и животных.

Благодаря способности размножаться простым делением на средах, содержащих только ионы Na+, K+, Mg2+, Ca2+,NH4+, Cl-, HPO42- и SO42-, микроэлементы и источник углерода (например, глюкозу), E. coli стала излюбленным объектом научных исследований.

Трансформированная бактерия Escherichia производит L-лизин в достаточно больших количествах (не менее 25, 50, 75, 100, 125 или 150 г/л).

2.2 Основные способы получения аминокислот

Коммерческие препараты аминокислот получают в осноном, при помощи четырех методов:

1. Биологическим - экстракцией из белковых гидролизатов (растений, животных, микроорганизмов);

2. Микробиологическим - биосинтезом или очисткой продуктов метаболизма бактерий;

3. Химимко-энзиматическим - энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием активных L - изомеров;

4. Химическим синтезом - использование тонкого органического синтеза.

Биотехнологическое получение аминокислот включает в себя как прямую микробную ферментацию так и микробиологический или ферментативный синтез из предшественников. Промышленные штаммы, как правило, несут несколько мутаций, затрагивающих механизмы регуляции целевой аминокислоты и её предшественников.

Наиболее дешевым и освоенным способом получения лизина является микробиологический метод. Впервые такое производство налажено в Японии в середине 50-х гг.; затем в Голландии и США. В СССР лизиновая промышленность родилась в 70-х гг. ХХ в. Учитывая стремительный рост населения во всем мире и постоянно возрастающую потребность в L-лизине, особенно для изготовления кормов для животных, назрела необходимость разработки новых, более эффективных методов получения L-лизина с использованием бактериальных штаммов Escherichia.

2.3 Обоснование выбора способа получения незаменимой аминокислоты - лизина

Для получения новых эффективных штаммов - продуцентов аминокислот применяют методы биотехнологии. Наиболее перспективным направлением являются методы генетической инженерии - введение в клетку продуцента многокопейных плазмид, содержащие гены, контролирующие биосинтез аминокислот в ущерб синтезу биомассы и других клеточных компонентов. Методы генетической позволяют повышать количество генов биосинтеза путем их клонирования в плазмидах. Это приводит к увеличению количества ферментов, ответственных за синтез аминокислот, следовательно, повышает выход целевого продукта. Клонирование генов системы синтеза аминокислот в клетках микроорганизмов с иным, по сравнению с донорским организмом, типом питания позволяет расширить сырьевую базу и заменить дорогостоящие сахаросодержащие субстраты, более дешевыми. Кроме того, применение гибридных плазмид в биосинтезе аминокислот позволяет: увеличить рост продуктивности биомассы; уменьшить примеси в целом продукте; увеличить коэффициент использования субстратов[1].

Было выдвинуто предположение, что значительного увеличения биосинтеза лизина можно добиться, используя штаммы Е. coli или В. subtilis, имеющие мутации в природных генах, задействованных в процессе биосинтеза лизина, чтобы десенсибилизировать ингибирование по типу обратной связи, производимое лизином или диаминопимелатом[6].

2.4 Характеристика питательной среды для культивирования лизина

Питательные среды, на которых выращивают микроорганизмы, должны отвечать следующим минимальным требованиям: в них должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка, причем в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать.Удачный выбор питательной среды и благоприятных условий для размножения и роста исследуемого микроба является основой, обеспечивающей успешность исследований. Показателем качества питательной среды является успешность роста на ней исследуемого микроба с сохранением всех присущих этому штамму свойств. Для процессов роста и размножения микроорганизмы должны получать все вещества, которые необходимы для биосинтеза клеточных компонентов и получения энергии. Эти вещества, называемые питательными, должны содержаться в культуральной (питательной) среде, при этом в количествах, соответствующих специфическим потребностям данного микроорганизма.

Элементы, которые в первую очередь необходимы для роста микроорганизмов и должны включаться в состав питательной среды, определенные из химического состава микробных клеток, который, в принципе, одинаков у всех живых организмов.Состав питательной среды для культивирования бактерии Escherichia, содержащей дикий dapA ген бактерии В. subtilis следующий, который приведен в таблице 3.2 [5].



Табл. Состав питательной среды

Компоненты питательной среды	Масса г/л
((NH4)2SO4	16
KH2PO4,	1
MgSO4·7H2O	1
FeSO4·7H2O	0,01
MnSO4·5H2O	0,01
дрожжевой экстракт	2
L-метионин	0,5
L-треонин	0,1
г/л L-изолейцин	0,05

Также желательно добавлять в среду антибиотики (например, ампициллин) для поддержания селективности и стабильности трансформированных бактерий Escherichia.Для получения среды для культивирования стерилизованный раствор (содержащий, при рН 7,0) смешивают со стерилизованным 20%-ным раствором глюкозы в соотношении 4 к 1. Также можно добавить глюкозу для улучшения производства L-лизина.

Затем к смеси добавляют стерилизованный фармакопейный СаСО₃ и разводят до конечной концентрации 30 г/л.



РАЗДЕЛ 3. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

3.1 Общая характеристика конечного продукта

Лизин (2,6-диаминогексановая кислота) - это незаменимая аминокислота, входящая в состав практически любых белков, необходима для роста, восстановления тканей, производства антител, гормонов, ферментов, альбуминов. Алифатическая аминокислота с выраженными свойствами основания. Лизин известен в виде двух оптически активных D- и L-форм. Бесцветные кристаллы. Природный L-лизин (tпл 224--225°С, с разложением) хорошо растворим в воде, кислотах и основаниях, плохо - в спирте.

В настоящее время установлено, что лизин в организме является не только структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимических функций - является предшественником карнитина и оксилизина, способствует транспорту кальция и стронция в клетки и др.

Лизинсодержащие препараты могут использоваться в растениеводстве. Применение таких препаратов, содержащих кроме аминокислот и другие биостимуляторы, дает значительное увеличение урожая тепличных и полевых сельскохозяйственных культур.

Отсутствие лизина в пище замедляет рост у детей, у взрослых приводит к отрицательному балансу азота и нарушению нормальной жизнедеятельности организма. Суточная потребность в лизине у взрослых составляет 23 мг/кг массы тела, у младенцев -170 мг/кг.

К основным свойствам лизина в организме можно отнести то, что L-лизин:

· участвует в синтезе белков, в основном, в мышцах и костях

· играет важную роль в образовании коллагена - структурного белка соединительной ткани, выступающего в коже, сухожилиях, хрящах, костях, стенках кровеносных сосудов и придающего эластичность и упругость клеткам

· играет важную роль в формировании ферментов, гормонов и антител

· улучшает усвояемость кальция

· играет ключевую роль в синтезе L- карнитина, вещества, необходимого для липидного обмена и участвующего в производстве энергии

· снимает симптомы простуды, гриппа и герпеса

· способствует восстановлению мышц после различного рода травм

· в сочетании с высокими дозами антиоксидантов, L- лизин является одним из факторов, оказывающих противораковое действие

L-лизин в качестве добавок рекомендуется тем, кто:

· является приверженцем вегетарианства

· находится в процессе диеты, в том числе низкобелковой

· является работником тяжелого физического труда

· часто подвержен стрессу

· проходит восстановление после хирургических вмешательств

· имеет слабый иммунитет, проблемы с костями

Также показан L-лизин детям в период интенсивного роста. Не рекомендуется применять лизин в качестве добавки беременным и кормящим женщинам, а также страдающим от аллергии на яйца и молочные продукты.

Действие L-Лизина: антигерпетические свойства лизина связаны с тем, что аминокислота лизин по строению и свойствам очень похожа на другую аминокислоту - аргинин. И при попадании в организм аминокислоты лизина, вирус герпеса не может отличить ее от аргинина, которую он обычно с успехом использует для синтеза дочерних вирусов, и встраивает лизин в свою ДНК для размножения. Но при этом получаются бракованные копии вируса, которые нежизнеспособны. И таким образом, размножение вируса в организме быстро прекращается.

Кроме того, во время стресса, который часто приводит к появлению рецидивов высыпаний герпеса, в организме резко сокращается количество лизина. А ведь именно с помощью этой важной аминокислоты строятся клетки иммунной защиты организма, которые борются с вирусом герпеса. Поэтому применение L-лизина для устранения высыпаний герпеса оправдано вдвойне. Кроме этих важных характеристик, лизин обладает еще и свойствами легкого антидепрессанта. В некоторых случаях при применении лизина отмечается прекращение головных болей. Его значительным преимуществом является то, что он не вызывает сонливости или зависимости, а также не снижает способность к концентрации внимания, наоборот, повышая ее.

Химическая формула: C6H14N2O2

Внешний вид: бесцветные кристаллы или белый порошок. Температура плавления: 224 °С. Лизин относится к числу соединений, которые живые организмы не производят самостоятельно, и должны получать в готовом виде для синтеза собственных структурных и функциональных белков. Источником лизина являются микроорганизмы и растения. При недостатке лизина наблюдается замедление роста и развития живых организмов[4].

3.2 Характеристика биологического объекта

Бактерия Escherichia coli, содержащая dapA ген бактерии B.subtilis, продуцирующая L-лизин, где dapA ген имеет последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует белок, имеющий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:2, в которой аминокислотный остаток гистидин в положении 119 заменен на тирозин.

Морфологические признаки штамма - Escherichia coli (кишечные палочки) - грам-отрицательные палочковидные бактерии, принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, род Escherichia (эшерихия), короткие (длина 1-3 мкм, ширина - 0,5-0,8 мкм), полиморфные подвижные и неподвижные, спор не образуют. К бактериям группы кишечных палочек относят роды Escherichia (типичный представитель Е. coli), Citrobacter (типичный представитель Citr. coli citrovorum), Enterobacter (типичный представитель Ent. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности морфологических и культуральных свойств.

Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E.aerogenes).

Устойчивость во внешней среде:Е. coli не устойчивы к высокой температуре. Бактерии группы кишечных палочек обезвреживаются обычными методами пастеризации (65 - 75° С). При 60° С кишечная палочка погибает через 15 минут. 1% раствор фенола вызывает гибель микроба через 5-15 минут, устойчивы к действию многих анилиновых красителей. Сохраняемость кишечной палочки при низких температурах и в различных субстратах внешней среды изучена недостаточно. По некоторым данным в воде и почве кишечная палочка может сохраняться несколько месяцев.

3.3 Описание технологического процесса производства незаменимой аминокислоты L - лизина

Стадии получения незаменимой аминокислоты L - лизина, представлена на рис. 3.3.2. Для промышленного производства, сначала нужно сконструировать плазмиду, которая будет отвечать за синтез аминокислоты с большим выходом и подобрать штамм продуцент, в нашем случае это E. Coli. Перед началом культивирования этой бактерии, нужно нарастить в лабораторных условиях достаточное количество нужной биомассы. Провести контроль продуцента, и проверить морфологию на наличие патогенных организмов. Питательные среды, которые используются для наращивания продуцента в лабораторных условиях, должны быть идентичны в промышленном культивировании. Это нужно для того, чтобы штамм успел адаптироваться к этим условиям и смог производить большое количество нашей аминокислоты.

3.4 Описание технологического процесса получения L - лизина

1. Конструирование рекомбинантной ДНК

Рекомбинантная ДНК несет в себе дикий или вариантный dapA ген штамма В. subtilis, и автономно реплицирует его в бактериальном штамме Escherichia. Рекомбинантная ДНК может быть получена путем вставки фрагмента ДНК, содержащего dapA ген бактерии В. subtilis, в экспрессионный вектор воспроизводимого (реплицируемого) бактериального штамма Escherichia.

DapA ген экспрессируют из штамма В. subtilis, и соответствующая DDPS (дигидродипиколинатсинтаза )не испытывает существенного ингибирования по типу обратной связи L-лизином. Выбранный штамм В. subtilis сам по себе может быть производителем L-лизина или не быть им. Предпочтительным штаммом В. subtilis является штамм W168, который не производит лизин.

Фрагмент ДНК, содержащий dapA ген дикого типа бактерии В.subtilis (BsdapA ген) может быть получен из хромосомной ДНК штамма В.subtilis дикого типа. Фрагмент ДНК может быть получен путем амплификации dapA гена дикого типа бактерии В. subtilis из хромосомной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Последовательности нуклеиновых кислот праймеров SEQ ID NO 3 и NO 4 представлены ниже:

SEQ ID NO:3 (DapA-F)	CGGCGATCGTTTCTGTTGGCA
SEQ ID NO:4 (DapA-R)	ATCTGGGCCATATCACGCGCT

Фрагмент ДНК, содержащий дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis, может быть впоследствии дотирован (замкнут) с подходящим экспрессионным вектором для получения рекомбинантной ДНК, содержащей dapA ген. Подходящий экспрессионный вектор ДНК автономно реплицируется в бактериальном штамме Escherichia и содержит селектируемый генетический маркер. Селектируемый генетический маркер может продемонстрировать устойчивость к антибиотикам, изменение цвета или любых других характеристик, по которым можно отличить трансформированные участки от нетрансформированных.

Примеры подходящих векторов включают экспрессионные векторы Е. coli, такие как pTrc99A, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 и pSTV28. Желательно, чтобы фрагмент ДНК внедрялся в экспрессионный вектор ДНК так, чтобы dapA ген находился под контролем сильного промотора Е. coli. Примеры подходящих промоторов включают trc, tac, lac и Т7, лучше всего trc.

2. Трансформирмация бактерии Escherichia

Бактерия Escherichia может быть трансформирована при помощи рекомбинантной ДНК, содержащей дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis, с использованием стандартных методов. Родительская (нетрансформированная) бактерия Escherichia может нести дикий или мутантный природный dapA ген, и экспрессировать соответствующую DDPS дикого или мутантного природного типа. Ферментативная активность природных DDPS может испытывать ингибирование по типу обратной связи L-лизином.

Родительская бактерия Escherichia может быть производителем L-лизина. Активность другого природного фермента, участвующего в биосинтезе лизина, может быть повышена. Например, можно использовать штамм Е. coli, содержащий ДНК, кодирующую природную аспартокиназу III и имеющую мутации, для десенсибилизации к ингибированию L-лизином по типу обратной святи .Предпочтительно использовать такой штамм бактерии Escherichia, как Е. coli.

После преобразования, бактерия Escherichia получает дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis. Наличие dapA гена бактерии В. subtilis в преобразованной бактерии определяется с помощью стандартных методов, известных специалистам в данной области. DapA ген бактерии В. subtilis может быть перенесен на плазмиду. Он также может быть интегрирован в хромосому трансформированной бактерии Escherichia. Трансформированная бактерия Escherichia производит L-лизин в достаточно больших количествах (не менее 25, 50, 75, 100, 125 или 150 г/л).

В одном варианте, штамм Е. coli B-3996 (доступен в Исследовательском институте генетики и промышленного скрещивания микроорганизмов, регистрационный номер RIA 1867) трансформируют с помощью рекомбинантной ДНК, содержащей dapA ген дикого типа (напр., pTrc99A-BsdapA), после удаления одиночной плазмиды pVIC40 (Патент США № 6,040,160), и получают трансформированный бактериальный штамм B-399/pTrc99A-BsdapA. Контрольный штамм В-399/pTrc99A получают таким же образом, с помощью трансформации соответствующей рекомбинантной ДНК без BsdapA (напр., pTrc99A).

В другом варианте, штамм бактерии Е. coli DC037, взятый в компании Global Bio-Chem Technology Group Company Limited, используется для приготовления рекомбинантной бактерии Е. coli, содержащей dapA ген дикого типа бактерии В. subtilis (DC051), рекомбинантной бактерии Е. coli, содержащей H119Y вариантный dapA ген бактерии В. subtilis (DC231) и контрольной рекомбинантной бактерии Е. coli (DC073), которые производят L-лизин в количествах 150, 180 и 20 г/л, соответственно. Процессы приготовления и тестирования этих рекомбинантных штаммов Е. coli описаны в Примерах 3 и 4.

Бактериальные штаммы DC051 и DC231 были зарегистрированы 26 февраля 2009 г. Китайским центром хранения культур общей микробиологии (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC) согласно Будапештскому договору и получили номера CGMCC № 2923 и CGMCC № 2924, соответственно.

Активность DDPS у бактерий измеряется по методу, описанному у Yugari, Y. и Gilvarg С. в J. Biol. Chem., 1965, 240(12):4710-16, или по любому другому приемлемому методу. Например, экстракт с бактериями добавляют в реакционный раствор, содержащий 50 µм имидазола-HCl (рН 7,4), 20 µм L-аспарагинового полуальдегида и 20 µм пирувата натрия, и инкубируют при 37°С в течение 10 мин. Реакционный раствор без пирувата натрия может быть использован как бланковый. Активность DDPS измеряется по количеству дигидродипиколината, образованного в ходе реакции, который отслеживается с помощью спектрофотометра при длине волны 270 нм. Различные количества L-лизина добавлялись к реакционной смеси для оценивания чувствительности к нему со стороны активности DDPS.

3. Способ получения L-лизина

L-лизин может быть получен при выращивании бактерий Escherichia, содержащих дикий или вариантный dapA ген бактерии В. subtilis, в среде для культивирования. Желательно использовать среду, подходящую для оптимального роста бактерий Escherichia (Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24). Также желательно добавлять в среду антибиотики (например, ампициллин) для поддержания селективности и стабильности трансформированных бактерий Escherichia.

Желательно соблюдать оптимальные для Escherichia условия культивирования. Культивацию предпочтительно осуществлять в аэробных условиях при температуре между 25°С и 45°С и уровне рН между 5 и 8. Концентрация L-лизина достигает максимума через 2-10 дней после начала культивации. Рост бактерий отслеживается на основании плотности клеток в среде для культивирования, которая измеряется спектрофотометром.

Перед сбором L-лизину дают накопиться в среде для культивирования трансформированной бактерии Escherichia, выращиваемой в соответствии с настоящим изобретением. Сбор L-лизина осуществляется с использованием различных методов (например, ионообменных хроматографических методов) для получения L-лизин-HCl до или после сепарации клеток путем центрифугирования и фильтрации культивационной среды; также можно собирать L-лизиновый бульон, из которого получают L-лизин сульфат в процессе пеллетизации (гранулирования).

Собирать L-лизин из среды для культивирования разрешается, когда его концентрация достигает как минимум 5-10 г/л, либо - в крупномасштабных ферментационных процессах - не менее 25, 50, 75, 100, 125 или 150 г/л, лучше всего 50 г/л. Количество полученного L-лизина определяется с использованием общепринятых аналитических методов (напр., ВЭЖХ).

4. Проблемы и перспективы получения незаменимой аминокислоты L - лизина

Лизиновое производство - несет в себе необходимость создания сырьевой базы, оборудования, отработка с потребителем наиболее эффективных товарных форм продукта и способов его применения. Кроме того, индустриальное производство может быть устойчивым в том случае, если не только строго регламентируется технологический режим, но и обеспечивается необходимая стандартность сырья. В микробиологическом производстве это особенно важно, т.к. в данном случае одним из основных факторов служит адаптация микроорганизмов к питательной среде.

Вопросам увеличения выхода лизина и интенсификации процесса его получения посвящено значительное количество работ. Производительность промышленного биореактора существенно зависит от соотношения длительности стадий наращивания биомассы продуцента и биосинтеза целевого продукта. Сокращение длительности первой стадии процесса может быть достигнуто путем увеличения исходной плотности культуры.

Достижение максимально возможной плотности посевного материала желательно было обеспечить при минимальном приборном оснащении и не значительных дополнительных трудозатратах. Однократное увеличение содержания питательных веществ в исходной среде не дает положительных результатов, поскольку концентрация редуцирующих веществ более 2,0% уже частично ингибирует процесс роста продуцента.

Эффек ингибирования при этом обусловлен, по-видимому, интенсивным образованием побочных продуктов в условиях избытка сахаров относительно, количества, потребляемого системами транспорта кислорода. Поэтому начальная концентрация редуцирующих веществ в культуральной жидкости продуцентов лизина не должна превышать 1,9 %. Однако такой низкий запас питательных веществ не позволяет получить желаемую плотность биомассы без дополнительных подпиток, которые так же не выгодно использовать в производстве. С другой стороны при реализации подпиток происходит постепенное снижение рН культуральной жидкости, приводящее к угнетению роста культуры. Снижение рН культурально жидкости при производстве лизина может быть связано со способностью продуцентов выделять молочную кислоту, что в условиях происходит лимитирования кислорода. В этом случае наблюдается неполное окисление субстрата с образованием кислот, которое может быть предотвращено или уменьшено на стадии приготовления инокулята и посевного материала рядом способов[1].

Проводя патентный поиск, проблемами получения лизина были:

1. Правильный подбор штаммов - продуцентов

2. Конструирование плазмиды

3. Приготовление питательной среды

4. Условия культивирования штамма - продуцента

5. Увеличение синтеза лизина

6. Получение большого выхода готового продукта

Единственный способ улучшить производство L-лизина бактерией Escherichia - преодолеть ингибирование DDPS L-лизином по типу обратной связи. Чтобы уменьшить восприимчивость DDPS к L-лизину, была предпринята попытка создать мутацию в гене dapA дикого типа у Escherichia bacterium [8].При получении лизина необходимо исключить нежелательные побочные процессы. Так, при недостаточной аэрации может идти образование аланина или молочной кислоты вместо синтеза лизина. Очень важным фактором является концентрация дефицитных аминокислот -- гомосерина, метионина и треонина в среде.



ВЫВОД

В данной курсовой работе были рассмотрены основные пути получения незаменимой аминокислоты - L - лизина, ее роль для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Были предложены пути решения проблем промышленного производства лизина на основе патентного поиска.

А так же рассмотрен перспективный метод получения незаменимой кислоты, основываясь на патенте РФ№ 2451748рекомбинантная ДНК и способ получения l-лизина.

Отталкиваясь от формулы изобретения патента, сделана технологическая и гидропневматическая схема производства L - лизина.



СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Краснопольский Ю. М. Фармацевтическая биотехнология: производство биологически активных веществ: учебное пособие часть 2 / Ю. М. Краснопольский, Н. Ф. Клещев - Харьков НТУ «ХПИ»: 2013 - 191с.

2. Гурина С.В. Микробиология продуцентов биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Гурина С.В., Потехина Т.С., Елинова Н.Н. - СПб.:1997 - 202с.

3. Егорова Н.С. Биотехнология в 8-ми томах/Егорова Н.С., Самуилова В.Д. - М.: 1988 - 308с.

4. Беккер М. Е. Введение в биотехнологию / Беккер М. Е - К: 1979 - 231с

5. Процеси і апарати мікробіологічної та фармацевтичної промисловості. Технологічні розрахунки. Приклади і задачі. Основи проектування: Навчальний посібник.- Львів: “Інтелект-Захід”, 2008, - 736 с.

6. ЯН Шен (CN), ХУАН Хэ (CN), ВАН Дэхуэй (CN) Рекомбинантная днк и способ получения l-лизина (РФ № 2451748) / ЯН Шен (CN), ХУАН Хэ (CN), ВАН Дэхуэй (CN), публикация патента:27.05.2012

7. Патент КНР № 20 200410050017.4

8. Патент США № 6,040,160

9. Патент США № 6,878,533

Размещено на Allbest.ru

...