Методы биотестирования токсичности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Поверхностно-активные вещества (ПАВ) применяют для самых различных целей в химической, нефтехимической, пищевой промышленности, при производстве косметических препаратов и других технологических процессах (в качестве моющих агентов, для стабилизации дисперсных систем -- эмульсий, пен, суспензий, для понижения прочности поверхности обрабатываемых материалов, и т. д.). Но несмотря на широкий спектр применения, ПАВ оказывают негативное воздействие на окружающую среду. Попадая в водоёмы, ПАВ активно участвуют в процессах перераспределения и трансформации других загрязняющих веществ (таких как железо, канцерогенные вещества, пестициды, нефтепродукты, тяжёлые металлы и др.), активизируя их токсическое действие.

Большинство ПАВ и продукты их распада токсичны для различных групп гидробионтов: микроорганизмов (0,8-4,0 мг/дм³), водорослей (0,5-6,0 мг/дм³), беспозвоночных (0,01-0,9 мг/дм³) даже в малых концентрациях, особенно при хроническом воздействии.

Существуют методы биотестирования - установление токсичности среды с помощью тест-объектов. Методы позволяют судить о присутствии какого-либо вещества или его количественном содержании по характеру и величине его воздействия на определенный организм, взятый как индикаторный. Аналитическим сигналом при этом является изменение состояния жизнедеятельности этого организма, то есть его реакция на раздражитель, которым, например, могут быть токсиканты среды обитания или какие-либо другие биологически активные соединения, вызывающие нарушение жизненных функций индикаторного организма или его гибель.

Для определения токсичности природных пресных вод применяют «Методику биотестирования по снижению уровня биолюминесценции бактерий Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford». Методика основана на установлении различия между уровнем люминесценции бактерий, помещенных в анализируемую пробу (опыт), и уровнем люминесценции бактерий, помещенных в 3%-ный раствор натрия хлористого без токсических веществ (контроль). Критерием токсичности является снижение уровня люминесценции бактерий на 50% и более в опыте по сравнению с контролем в течение 30 мин. Люминесценцию бактерий измеряют при помощи специального прибора - биолюминометра и выражают в условных единицах.

Цель: Изучить влияние поверхностно-активных веществ на микроорганизмы, феноменологию и механизм.

Задачи данного исследования:

1. изучить характеристики поверхностно-активных веществ;

2. описать механизмы воздействия ПАВ на микроорганизмы;

3. изучить методы биотестирования токсичности по снижению уровня биолюминесценции бактерий.

1. Поверхностно-активные вещества

Поверхностно-активные вещества (ПАВ) - это вещества, адсорбирующиеся на поверхности раздела двух фаз и образующие на ней слой повышенной концентрации. Однако в понятие «поверхностно-активные вещества» обычно вкладывают более узкий смысл, относя его лишь к группе органических соединений, адсорбция которых из их растворов даже очень малой концентрации приводит к резкому снижению поверхностного (межфазного) натяжения на поверхности раздела раствора с газом (паром), др. жидкостью или твердым телом.

Термин «поверхностное натяжение» принято употреблять по отношению к поверхности раздела конденсированной фазы с газом, а термин «межфазное натяжение» - по отношению к поверхности раздела двух конденсированных фаз. Накопление и ориентация в адсорбционном слое молекул или ионов ПАВ - следствие их дифильности (двойственности свойств). Каждая молекула типичных ПАВ имеет олеофильную, или липофильную, часть (один или несколько углеводородных радикалов) и гидрофильную часть (одну или несколько полярных групп). Т.е. поверхностная активность ПАВ, растворенных в углеводородных жидкостях, обусловлена гидрофильными группами, а растворенных в воде - олеофильными (гидрофобными) радикалами. [5]

1.1 Классификация ПАВ

По типу гидрофильных групп ПАВ делят на ионные, или ионогенные, и неионные, или неионогенные.

Ионогенные ПАВ диссоциируют в растворе на ионы, одни из которых обладают адсорбционной активностью, другие (противоионы) - адсорбционно не активны. Если адсорбционно активны анионы, ПАВ называют анионными, или анионоактивными, в противоположном случае - катионными, или катионо-активными. Некоторые ПАВ содержат как кислотные, так и основные группы; такие ПАВ обладают амфотерными свойствами, их называют амфотерными, или анфолитными ПАВ.

Неионогенные ПАВ не диссоциируют при растворении на ионы; носителями гидрофильности в них обычно являются гидроксильные группы и полигликолевые цепи различной длины.

Существуют также ПАВ, в которых наряду с неионогенными гидрофильными атомными группами присутствуют ионогенные.

В отдельный класс выделяют фторуглеродные ПАВ - соединения с полным или частичным замещением атомов водорода в гидрофобных радикалах на атомы фтора. Кроме того, как отдельную группу следует рассматривать высокомолекулярные ПАВ - адсорбционно активные водорастворимые полимеры ионогенного (полиэлектролиты) и неионогенного типов.

Все ПАВ можно разделить на две категории по типу систем, образуемых ими при взаимодействии с растворителем. К одной категории относятся мицеллообразующие (полуколлоидные, мылоподобные) ПАВ, к другой - не образующие мицелл.

ПАВ первой категории в растворе выше некоторой (определенной для каждого вещества) «критической» концентрации образуют мицеллы, т. е. молекулярные или ионные ассоциаты с числом молекул (ионов) от нескольких десятков до нескольких сотен.

Ниже критической концентрации мицеллообразования (ККМ) вещество находится в истинно растворенном состоянии, а выше ККМ - как в истинно растворенном, так и в мицеллярном.

Мицеллы ПАВ находятся в обратимом термодинамическом равновесии с молекулами; при разбавлении раствора они распадаются, а при увеличении концентрации вновь возникают. Обычно такие растворы обладают моющей способностью. ПАВ второй категории не образуют мицелл ни в растворах, ни в адсорбционных слоях. При любой концентрации они находятся в истинно растворенном состоянии. [5]

1.2 Молекулярное строение и получение поверхностно-активных веществ

1.2.1 Ионогенные ПАВ

Анионоактивные вещества составляют большую часть мирового производства ПАВ. Промышленные ПАВ этого типа можно разделить на следующие основные группы: карбоновые кислоты и их соли (мыла), алкилсульфаты (сульфоэфиры), алкилсульфонаты и алкиларилсульфонаты, прочие продукты.

В производстве мыл и многих ионов и неионогенных мылоподобных ПАВ используют карбоновые кислоты, получаемые гидролизом из растительных и животных жиров, и синтетические жирные кислоты. Промышленное значение имеют также смоляные и жирные кислоты таллового масла - побочного продукта целлюлозного производства - смоляные кислоты канифоли, среди которых преобладает абиетиновая.

Наибольшее значение как ПАВ из солей монокарбоновых кислот имеют мыла (натриевые, калиевые и аммонийные) жирных кислот RСООН, где R - насыщенный или ненасыщенный нормальный алифатический радикал с числом атомов углерода 12-18, и мыла (натриевые, реже калиевые) смоляных кислот. Практическое значение имеют также дикарбоновые кислоты, например алкенилянтарные, получаемые в промышленности конденсацией непредельных углеводородов с малеиновым ангидридом.

Алкилсульфаты синтезируют обычно сульфоэтерификацией высших жирных спиртов или - олефинов с последующей нейтрализацией соответственно первичных или вторичных алкилсерных кислот.

Алкиларилсульфонаты, главным образом моно- и диалкилбензолсульфонаты, а также моно- и диалкилнафталинсульфонаты составляют большую часть синтетических анионоактивных ПАВ.

Алкилсульфонаты обычно получают из насыщенных углеводородов С12 - С18 нормального строения, которые сульфохлорируют или сульфоокисляют с последующим омылением или нейтрализацией продукта. [5]

1.2.2 Катионоактивные ПАВ

Катионоактивные ПАВ можно разделить на следующие основные группы: амины различной степени замещения и четвертичные аммониевые основания, др. азотсодержащие основания (гуанидины, гидрозины, гетероциклические соединении и т. д.), четвертичные фосфониевые и третичные сульфониевые основания.

Сырьем для катионоактвных ПАВ, имеющих хозяйственное значение, служат амины, получаемые из жирных кислот и спиртов, алкгалогенидов, а также алкилфенолов. Четвертичные аммониевые соли синтезируют из соответствующих длинноцепочечных галоидных алкилов реакцией с третичными аминами, из аминов хлоралкилированием или др. путями из синтетических спиртов, фенолов и фенольных смесей.

Большее значение как катионоактивные ПАВ и как исходные продукты в синтезе неионогенных ПАВ имеют не только моно- , но и диамины, полиамины и их производные.

1.2.3 Амфотерные ПАВ

Амфотерные ПАВ могут быть получены из анионоактивных введением в них аминогрупп или из катионоактивных введением кислотных промышленностью амфотерные ПАВ выпускаются в небольшом количестве, и их потребление расширяется медленно.

1.2.4 Неионогенные ПАВ

Это наиболее перспективный и быстро развивающийся класс ПАВ. Не менее 80-90% таких ПАВ получают присоединением окиси этилена к спиртам, алкилфенолам, карбоновым кислотам, аминам и другим соединениям с реакционноспособными атомами водорода. Полиоксиатиленовые эфиры алкилфенолов - самая многочисленная и распространенная группа неионогенных ПАВ, включающая более сотни торговых названий наиболее известны препараты ОП-4, ОП-7 и ОП-10. Типичное сырье - октил-, ионил- и додецилфенолы; кр. того, используют крезолы, крезоловую кислоту, -нафтол и др. Если в реакцию взят индивидуальный алкилфенол, готовый продукт представляет собой смесь ПАВ общей формулы RC₆H₄O(CH₂O)mH, где т - степень оксиэтилирования, зависящая от молярного соотношения исходных компонентов.

Полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот RСОО(СН₂СН₂О)mН синтезируют прямым оксиэтилированием кислот или этерификацией кислот предварительно полученным полиэтиленгликолем.

Полиоксиэтиленовые эфиры спиртов RО(СН₂СН₂О)mН приобрели важное промышленное значение, т. к. они легко поддаются биохимическому разложению в природных условиях. Их получают оксиэтилированием высших жирных спиртов, реакцией алкилбромида с мононатриевой солью полиэтиленгликоля и др. путями.

Полиоксиэтиленовые эфиры меркаптанов, как и спиртов, получают обычно оксиэтилированием третичных алкилмеркаптанов, а также первичных н-алкилмеркаптанов и нек-рых алкилбензолмеркаптанов.

Полиоксиэтиленовые производные алкиламинов составляют весьма разнообразную группу ПАВ, многие из которых выпускают в промышленности. Эти ПАВ, будучи по своей природе катионоактивными, с увеличением длины полиоксиэтиленовой цепи приобретают ярко выраженные свойства неионогенных веществ. Наиболее важны в практическом отношении продукты оксиэтилирования первичных н-алкиламинов, трет-алкиламинов и дегидроабиетиламинов.

Выпускают также продукты на основе полиэтиленполиаминов, например диэтилентриамина, но они не имеют широкого применения. В промышленном или полупромышленном масштабе производят ПАВ с третичным алифатич. радикалом RС(СН₃)₂NН (СН₂СН₂О)mН, содержащим 12-22 атома углерода, и т = 1 - 25; полиоксиэтилендегидроабиетиламины (на основе кислот канифоли и таллового масла); полиоксипропиленовые производные аминов - «пропомины».

Полиоксиэтиленалкиламиды обычно получают оксиэтилированием амидов или предварительно полученных моно- или диэтилоламидов жирных кислот (лауриновой, пальмитиновой, олеиновой).

Ряд неионогенных ПАВ получают на основе полиатомных спиртов, частично этерифицированных жирными кислотами. Используют спирты, содержащие от 2 до 6 гидроксильных групп, пентаэритрит, полиглицерины, углеводы. При оксиэтилировании к свободным гидроксильным группам исходного продукта присоединяются полиоксиэтиленовые цепи разной длины.

Другой путь получения ПАВ из полиатомных спиртов - сначала оксиэтилирование, а затем этерификация.

Практическое значение блоксополимеров окиси этилена и окиси пропилена как ПАВ постоянно возрастает. Их получают ступенчатой полимеризацией, используя в качестве «затравки» соединения, содержащие реакционноспособные атомы водорода.

Монофункциональные исходные соединения для синтеза таких ПАВ - одноатомные спирты, кислоты, меркаптаны, вторичные амины, N-замещенные амиды и др. Гидрофобной частью молекулы служит остаток исходного вещества, если оно имеет достаточно длинный алифатич. радикал, и полипропиленоксидный блок

Неионогенные ПАВ различных типа используют как исходные продукты для получения ряда ионогенных ПАВ. На основе оксиэтилированных алифатич. спиртов, алкилфенолов и др. рассмотренных выше веществ синтезируют поверхностно-активные сульфаты, фосфаты, карбоксилаты и четвертичные аммониевые соединения.

К большинству оксиэтилированньх продуктов можно присоединить акрилонитрил с последующим переводом полученного амина в четвертичное аммониевое основание обычными методами.

Высокомолекулярные ПАВ - растворимые карбо- или гетероцепные полимеры ионогенного или неионогеного типа с молекулярной массой от нескольких тысяч до нескольких сотен тысяч. Среди них есть природные соединения (белки, альгенаты, пектиновые вещества и т. д.), продукты химической обработки природных полимеров (например, производные целлюлозы) и синтетические полимеры.

В структуре типичных высокомолекулярных ПАВ должно быть четкое разграничение гидрофильных и гидрофобных участков. ПАВ являются сополимеры или гомополимеры, в которых вдоль длинной гидрофобной основной цепи расположены через определенные интервалы гидрофильные боковые цепи или группы. Типичные представители анионоактивных ПАВ этой группы - полиакриловая и полиметакриловая кислоты, их соли и некоторые производные, а также карбоксилсодержащие полимеры на основе поливинилового спирта, полиакриламида, сополимеров малеинового ангидрида с другими непредельными соединениями. Поверхностной активностью обладают сульфированные и сульфоэтерифицированные полимеры (полистирол, поливиниловый спирт, оксиэтилированный поликонденсат п-алкилфенола с формальдегидом и др.).

Катионоактивные полимерные ПАВ получают хлорметилированием, а затем аминированием полистирола, поливинилтолуола и др. виниловых полимеров. Особенно высока поверхностная активность солей полимерных четвертичных аммониевых оснований, в том числе солей поливинилпиридиния. для получения высокомолекулярных ионогенных ПАВ - растворимых полиэлектролитов - пригодно большинство методов и исходных продуктов, которые применяют при синтезе ионообменных смол.

Неиноногенные высокомолекулярные ПАВ можно получить оксиэтвлированием практически из любого полимера, содержащего гидроксильные или другие функциональные группы с реакционноспособными атомами водорода.

1.3 Свойства поверхностно-активных веществ

Поверхностную активность удобно оценивать по наибольшему понижению поверхностного натяжения деленному на соответствующую концентрацию - ККМ в случае мицеллообразующих ПАВ. Поверхностная активность обратно пропорциональна ККМ:

Образование мицелл происходит в узком интервале концентраций, который становится уже и определенней по мере удлинения гидрофобных радикалов. Простейшие мицеллы типичных полуколлоидпых ПАВ, например солей жирных кислот, при концентрациях, не слишком превышающих ККМ, имеют сфероидальную форму.

С ростом концентрации ПАВ анизометричных мицелл сопровождается резким возрастанием структурной вязкости, приводящей в нек-рых случаях к гелеебреаованию, т.е. полной потере текучести.

ККМ - важный технологический показатель. Его можно определять различными методами, т.к. в области ККМ более или менее резко меняются многие физико-химические свойства системы, ККМ находят по характерным изменениям поверхностного натяжения, светорассеяния, электропроводности, вязкости, диффузии, солюбилизации, спектральных характеристик раствора и т.д.

Очень специфичны по свойствам фтортензиды, неполярная часть молекулы которых образована фторуглеродными цепями. Вследствие слабого межмолекулярного взаимодействия низкомолекулярные фторуглероды обладают чрезвычайно малой поверхностной энергией.

Особенность фторуглеводородных ПАВ - соединений с фторуглеродными и углеводородными радикалами - высокая поверхностная активность в неполярных органических жидкостях с низкой поверхностной энергией. Адсорбционный слой перфторированных ПАВ на твердой поверхности, ориентированный фторуглеродными радикалами наружу, снижает критическое поверхностное натяжение смачивания до значений меньших, чем поверхностное натяжение углеводородных жидкостей. Это значит, что такая поверхность становится не только гидрофобной, но и олеофобной, то есть не смачиваемой маслами и другими жидкими углеводородами. Фторуглеродные цепи, вследствие высокой энергии межатомной (внутримолекулярной) связи, химически инертны и термостойки.

1.4 Применение поверхностно-активных веществ

поверхностный активный микроорганизм биотестирование

ПАВ находят широкое применение в промышленности, в сельском хозяйстве, медицине и быту. Мировое производство ПАВ растет с каждым годом, причем в общем выпуске продукции постоянно возрастает доля неионогенных веществ. Широко используют все виды ПАВ при получении и применении синтетических полимеров. Важнейшая область потребления мицеллообразующих ПАВ - производство полимеров методом эмульсионной полимеризации. От типа и концентрации выбранных ПАВ (эмульгаторов) во многом зависят технологические и физико-химические свойства получаемых латексов. ПАВ используют также при суспензионной полимеризации. Обычно применяют высокомолекулярные ПАВ - водорастворимые полимеры (воливиниловый спирт, производные целлюлозы, растительные клеи и т.п.). Смешиванием лаков или жидких масляносмоляных композиций с водой в присутствии эмульгаторов получают эмульсии, применяемые при изготовлении пластмасс, кожзаменителей, нетканых материалов, импрегированных тканей, водоразбавляемых красок и т.д.

В производстве лакокрасочных материалов и пластмасс. ПАВ добавляют для регулирования их реологических характеристик.

Разнообразные ПАВ применяют для поверхностной обработки волокнистых (тканых и нетканых) и пленочных материалов (как антистатики, модификаторы прядильных растворов, моющие средства). Среди ПАВ, применяемых как гидрофобизаторы, наиболее перспективны кремнийорганические и фторуглеродные соединения. Последние при соответствующей ориентации молекул в поверхностном слое способны предотвратить смачивание материала не только водой, но и углеводородными жидкостями.

В производстве губчатых резин и пенопластов ПАВ применяют как стабилизаторы пен. Высокомолекулярные водорастворимые ПАВ, помимо использования в указанных выше технологических процессах, применяют как флокулянты в различных видах водоочистки. С их помощью из сточных и технологических вод, а также из питьевой воды удаляют загрязнения, находящиеся во взвешенном состоянии.

2. Механизмы воздействия ПАВ на микроорганизмы

Один из основных негативных эффектов ПАВ в окружающей среде -- понижение поверхностного натяжения. Например в океане изменение поверхностного натяжения приводит к снижению показателя удерживания CO₂ и кислорода в массе воды. Только немногие ПАВ считаются безопасными (алкилполиглюкозиды), так как продуктами их деградации являются углеводы.

Многими исследователями отмечается зависимость степени и характера влияния ПАВ на водные организмы от химической структуры веществ. Наиболее сильное отрицательное влияние оказывают алкиларилсульфонаты, т.е. вещества, имеющие в своей молекуле бензольное кольцо, и некоторые неионогенные вещества. Менее всего токсичны ПАВ на основе полимеров, несколько токсичнее алкилсульфаты и алкилсульфонаты. Соединения, имеющие прямую боковую цепь, более токсичны, чем вещества с сильно разветвлённой углеродной цепью.

Одним из основных физико-химических свойств ПАВ является высокая пенообразующая способность, причём в сравнительно низких концентрациях (порядка 0,1 - 0,5 мг/дм³). Возникновение на поверхности воды слоя пены затрудняет тепломассообмен водоёма с атмосферой, снижает поступление кислорода из воздуха в воду (на 15-20 %).

Токсичность ПАВ в водной среде в значительной степени уменьшается за счёт их способности к биодеградации. ПАВ, в той или иной степени, поглощаются всей флорой и фауной водных объектов.

В литературе имеется много данных о действии поверхностно-активных веществ (ПАВ) на микроорганизмы. По свидетельству некоторых авторов детергенты солюбилизируют н-алканы и тем самым оказывают стимулирующее действие на процесс их микробиологического окисления [4], повышают активность некоторых ферментов [2,3], изменяют проницаемость клеточных мембран [5], повышают скорость дыхания [10], увеличивают концентрацию растворенного кислорода и улучшают его транспорт в клетку [8]. Таким образом, в каждом отдельном случае действие ПАВ на микроорганизмы рассматривается изолированно и в литературе нет единого мнения о комплексном влиянии ПАВ на процесс микробиологического окисления [6]. Солюбилизация н-алканов в присутствии различных эмульгаторов, а также увеличение концентрации растворимого кислорода при микробиологическом окислении изучены ранее [4, 8]. Многие синтетические поверхностно-активные вещества обладают антимикробными свойствами. (Ставская, 1981).

Кроме природной устойчивости некоторых микроорганизмов к биоцидным препаратам, микроорганизмы быстро адаптируются к неблагоприятным факторам, в том числе и к воздействию антимикробных средств. Антимикробное действие ПАВ зависит, прежде всего, от типа соединения. Наиболее высокое бактерицидное действие проявляют катионные вещества, неионогенные - слабое, анионактивные занимают промежуточное положение.

Анионные ПАВ влияют главным образом на грамположительные бактерии (Ставская, 1981, цит. Kaminski, 1963). Антимикробный эффект АПАВ зависит от их химического строения. Чем больше атомов углерода, тем сильнее действие соединения. Активность анионных соединений усиливается при снижении рН среды (Ставская, 1981, цит. Flett, 1945).

Неионогенные вещества характеризуются более слабым антимикробным действием; некоторые из них совсем не обладают активностью. Характер влияния на микроорганизмы зависит от химического строения НПАВ. Твины не только не угнетают микроорганизмы, но даже стимулируют их рост (Ставская, 1981, цит. Stinson, 1971). В присутствии неионогенных ПАВ в значительных концентрациях не наблюдается спороношения у мицелиальных грибов, хотя и происходит их рост (Ставская, 1981, цит. Furuta 1945).

Катионные ПАВ активны по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам. По отношению к грибам катионные вещества наиболее активны (Ставская, 1981, цит. Furuta, 1945). В присутствии полисахаридов (агар-агара, крахмала, целлюлозы) и белковых веществ (казеина, сыворотки крови, пептона, желатины, альбумина) снижается антимикробная активность ряда катионных и амфотерных ПАВ. Причем бактериостатическое действие на грамотрицательные бактерии снижается в большей степени, чем на грамположительные, в то время как бактерицидное действие уменьшается одинаково (Ставская, 1981, цит. Koppensteiner, 1974).

Для катионных ПАВ мишенями являются карбоксильные группы аминокислот и кислых полисахаридов бактерий, а для анионных ПАВ - кетонные группы белков, аминогруппы соответствующих углеводов и липидов, а также фосфатные группы тейхоевых кислот.

В естественных условиях микробные клетки обладают общим отрицательным зарядом, поэтому наиболее широкое практическое применение нашли катионные ПАВ, которые губительно действуют на грамположительные и грамотрицательные бактерии, дрожжевые и нитчатые грибы. Но в клетке также имеются молекулы, несущие положительные заряды, поэтому и анионные ПАВ губительно действуют на микроорганизмы, но при более высоких концентрациях.

Сильное дестабилизирующее действие на мембраны клеток оказывают низкомолекулярные катионные ПАВ (хлоргексидин, алкилдиметил бензил аммоний хлорид) (Поликарпов, 2005).

Много исследований посвящено изучению механизма антимикробного действия ПАВ. Известно, что химические вещества могут влиять на микроорганизмы специфически и неспецифически. Специфически - при очень низких концентрациях антимикробного соединения, которое может реагировать с определенными компонентами клетки, нарушая их нормальное функционирование. Неспецифическое действие на клетку обычно проявляется при достаточно высоких концентрациях веществ. Оно может быть связано с неблагоприятным для микроорганизма изменением поверхностного натяжения, рН, с установлением высокого осмотического давления и т.д. Что касается ПАВ, то до сих пор не существует единого мнения, как - специфически или неспецифически - влияют они на микроорганизмы.

Большинство исследователей предполагают, что ПАВ действуют на микроорганизмы специфически. Эту мысль подтверждает тот факт, что неионогенные ПАВ, которые понижают поверхностное натяжение, почти не обладают антимикробной активностью (Ставская, 1981).

2.1 Действие ПАВ на цитоплазматическую мембрану

Адсорбцию ПАВ на поверхности микробной клетки считают первым этапом взаимодействия микроорганизмов с химическим соединением.

Методом микроэлектрофореза показано, что ионные ПАВ, адсорбируясь на клеточной поверхности бактерий, изменяют ее заряд. При этом катионактивные вещества уменьшают отрицательный заряд и даже могут изменять его на положительный, тогда как анионные соединения, как правило увеличивают отрицательный заряд (Ставская, 1981, цит. Dyar 1946).

В результате взаимодействия ПАВ с компонентами поверхности микробной клетки изменяются ее свойства. Некоторые ПАВ вызывают удлинение, утолщение и искривление бактериальных клеток (Ставская, 1981, цит. Schweisfurth, 1959).

ПАВ связываются с компонентами ЦПМ и нарушают ее нормальное функционирование, в том числе свойство полупроницаемости. Показано, что под влиянием этих веществ из клеток в окружающую среду выделяются низкомолекулярные метаболиты. Под влиянием ПАВ может происходить потеря плазмид бактериальными клетками (Ставская, 1981).

Возможно, именно нарушением проницаемости объясняется повышение чувствительности резистентных штаммов бактерий к антибиотикам в присутствии ПАВ. Так, некоторые ПАВ при их совместном использовании с антибиотиками, в 2-3 раза увеличивает активность хлортетрациклина в отношении устойчивых штаммов бактерий (Ставская, 1981, цит. Suling, 1966).

Об изменении проницаемости мембран можно косвенно судить на основе различий в скорости протекания ферментативной дегидрогеназной активности в присутствии 2,3, 5-трифенилтетразолийхлорида [1, 7].

Данные исследования показали, что время начала ферментативной реакции в присутствии эмульгаторов сокращается по сравнению с контрольным опытом примерно в 2 раза. Причем природа ПАВ значительно влияет на время появления окраски. Максимальная скорость образования формазана накблюдается в присутствии анионных (лаурилсульфата натрия, алкилпирофосфата аммония ) и неионогенных ПАВ (твин-85, синтанола) - от 15 до 60 мин, а в опыте без ПАВ за 108 мин. В присутствии 2-алкалимидазолина - катионного детергента - реакция длится 84 мин. Таким образом, оценивая скорость образования формазана (время появления окраски), можно косвенно судить об изменении проницаемости клеточных мембран и о транспорте углеводородов в клетку.

Конечным результатом действия ПАВ на микробную клетку является деструктуризация клеточной оболочки. Механизм этого действия изучил Цапф (Ставская, 1981), который с помощью электронной микроскопии показал, что ПАВ проникают внутрь клетки, нарушая деятельность протеаз, что приводит к автолизу клеточного содержимого (Ставская, 1981).

2.2 Влияние ПАВ на физиологические процессы внутри микробной клетки

Некоторые авторы наблюдали угнетение некоторых физиологических процессов и ферментативной активности микроорганизмов (Ставская, 1981, цит. Sevcik, 1957). В то же время имеются сообщения о стимуляции активности дыхания и некоторых ферментов в присутствии ПАВ. Исследователи предполагают, что ферментные системы клеток повреждаются вторично, в то время как первично изменяются поверхностные и внутренние мембранные структуры, с которыми связано много ферментов. Одновременно может наблюдаться непродолжительная стимуляция активности ферментов, растворенных в жидкой части цитоплазмы. При этом клетка как бы пытается заменить поврежденную ферментную систему неповрежденной (Ставская, 1981).

Согласно имеющимся литературным данным, микроорганизмы могут приобрести резистентность, как к катионным, так и к анионным ПАВ.

Можно предположить, что некоторые из резистентных к ПАВ микроорганизмов в процессе адаптации приобретают способность трансформировать эти соединения, а потом использовать их как источник энергии и углерода. Сведения о механизме антимикробного действия ПАВ, и в особенности о характере приобретения устойчивости к этим веществам, могут пролить свет на проблему изучения биологических особенностей микроорганизмов, осуществляющих в природе трансформацию и деструкцию синтетических соединений - загрязнителей окружающей среды (Ставская, 1981).

2.3 Микробиологическая деструкция поверхностно-активных веществ

Большой интерес представляют исследования разложения ПАВ чистыми культурами микроорганизмов. Первые работы на эту тему проводились в 50-х годах. Так, Ризен (Ротмистров, 1978, цит. Risen, 1956) показал, что Ps. aeruginosa, Serratia marcescens, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella enteritidis, Paracolobactrum aerogenoides при выращивании на синтетической среде могут использовать различные анионные ПАВ в качестве единственного источника углерода. Обнаружено, что на скорость биоразложения влияет минеральный состав питательной среды.

Пейн с сотрудниками (Ротмистров, 1978, цит. Payne, 1963) из почвы, взятой, в районе очистного сооружения методом накопительных культур выделил 2 штамма Pseudomonas - С12 и С12В, которые активно разрушали АПАВ. Представители рода Pseudomonas особенно часто выделяются из накопительных культур на средах с АПАВ. Методом накопления, ими также были получены один штамм Ps. fluorescens и два штамма Nocardia sp., способные использовать в качестве единственного источника углерода линейные АПАВ. В процессе исследования Пейн с сотрудниками установили, что способность разрушать ПАВ широко варьирует у микроорганизмов, даже среди представителей одного рода.

О биоразлагаемости неионогенных ПАВ, применяемых в качестве деэмульгатаров эмульсий нефти с водой есть сведения в работе В.В. Булатникова с соавт. Большинство этих соединений плохо поддаются биохимическому окислению. Авторы показывают, что деэмульгаторы - блок-сополимеры окиси этилена и пропилена относятся к «биологически жестким». Легко и быстро разрушаются НПАВ, полученные на основе первичных жирных спиртов и сахаров (Ротмистров, 1978).

Работы по изучению деструкции НПАВ чистыми культурами микроорганизмов немногочисленны. Показано, что твины могут служить питательным субстратом для бактерий, а так же способствовать использованию других соединений, облегчая их транспорт в клетку (Ротмистров, 1978, цит. Ксандопуло, 1971). Ps. aeruginosa, Aspergillus niger и Penicillium notatum способны расти в растворах сложных эфиров жирных кислот (Ротмистров, 1978). Образуя эстеразы, эти микроорганизмы расщепляют эфирные связи с освобождением жирных кислот. Способностью разлагать полиоксиэтиленолеат обладают некоторые штаммы непатогенных микобактерий, которые окисляют его до углекислоты и воды. Микобактерии используют данное соединение в качестве единственного источника углерода.

Работами проводимыми в Институте коллоидной химии и химии воды АН УССР канд. Биол. Наук В.М. Удодом (Ставская, 1978), показано, что додециловый эфир полиэтиленгликоля в концентрации 50-100 мг/л полностью разрушается микроорганизмами родов Pseudomonas, Bacillus и Candida в течение 18 ч. Увеличение концентрации приводит к замедлению деструкции, и разложение наступает на 2-7 сутки.

Известно, что чем больше ксенобиотик отличается от природных субстратов и метаболитов основного обмена, тем меньше вероятность широкого распространения штаммов, способных к его утилизации. Лишь там, где имеет место длительный контакт микроорганизмов, обладающих высокой гибкостью метаболических реакций, с соответствующим веществом, возможно формирование штаммов деструкторов (Ставская, 1978). Такими объектами являются загрязненные почвы, сточные воды и активные илы очистных сооружений. Тем не менее, даже из таких источников не всегда удается выделить интересующий микроорганизм.

3. Биотестирование, основанное на снижении уровня биолюминесценции микроорганизмов

Химической основой свечения бактерий является ферментативное окисление восстановленного флавинмононуклеотида FМN-H₂ и длинноцепочечного альдегида RCHO кислородом воздуха. Суммарное уравнение процесса может быть записано так:

FМN·H₂ + RCHO +O₂ ЇЇ> FМN + RCOOH + H2·Люцифераза·О + hv

где FMN и RCOOH - флавинмононуклеотид и карбоновая кислота соответственно.

Биолюминесцентные биотесты с использованием природных светящихся бактерий основаны на исключительной чувствительности этих микроорганизмов к разнообразным веществам. При действии этих веществ на целые живые бактерии исключается их прямое влияние на люциферазу, так как клеточные мембраны препятствуют проникновению ксенобиотиков в клетку. Тем не менее, токсичные вещества влияют на важные жизненные процессы клетки, такие как, например, дыхание, которые тем или иным образом связаны с биолюминесценцией. Как следствие, были разработаны биолюминесцентные методы исследования кислородзависимых процессов и явлений.

Существующая «Методика биотестирования по снижению уровня биолюминесценции бактерий Photobacterium phosphoreum» устанавливает процедуру определения токсичности сточных, поверхностных, подземных и морских вод, донных отложений (водных вытяжек), водных растворов отдельных веществ и их смесей.

Методика основана на установлении различия между уровнем люминесценции бактерий, помещенных в анализируемую пробу (опыт), и уровнем люминесценции бактерий, помещенных в 3%-ный раствор натрия хлористого для биотестирования пресных вод или в морскую воду без токсических веществ (природную или искусственную) для биотестирования морских вод (контроль). Критерием токсичности является снижение уровня люминесценции бактерий на 50% и более в опыте по сравнению с контролем в течение 30 мин. Люминесценцию бактерий измеряют при помощи специального прибора - биолюминометра и выражают в условных единицах.

Для биотестирования используют лиофилизированную культуру светящихся бактерий - Photobacterium phosphoreum.

3.1 Характеристика P. phosphoreum

Биолюминесценция - ферментативный процесс, сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света. У микроорганизмов центральным звеном подобной реакции является люцифераза - флавинзависимая монооксигеназа, катализирующая окисление FМN-H₂ и длинноцепочечного альдегида в присутствии кислорода до FМN, H₂O и соответствующей жирной кислоты с испусканием кванта света в видимой сине-зеленой области спектра.

Психрофильные фотобактерии P. phosphoreum отличаются, кроме морфологических и физиологических признаков, наиболее длительным и интенсивным свечением [1, 7]. Удельная активность описанных штаммов P. phosphoreum, наивысшая среди видов, достигает значений 5Ч10⁴-10⁵квант/(с кл), в то время как у большинства мезофильных штаммов Vibrio harveyi и V. fischeri на порядок ниже [8, 9].

Непосредственное воздействие на эмиссионную активность оказывают температура, рН, ионы Na. Вместе с тем данные по оптимальным значениям рН, солевой и температурной зависимости свечения различаются не только для разных видов, но и штаммов фотобактерий [5-7]. Для большинства штаммов P. phosphoreum температурный диапазон свечения 2-30°С, с максимумом при 15-18°С [7, 9]. При температурах, превышающих на 10-15°С оптимальные, происходит частичная или полная утрата свечения бактериями [12].

У разных штаммов P. phosphoreum рН-оптимум свечения варьирует от 7,0 до 8,5 [7, 11, 13]. Наряду со штаммовыми особенностями, эти расхождения могут быть также связаны с композицией буферной системы и физико-химическими условиями процедуры определения. Солевая зависимость люминесцентной активности в целом проявляется в диапазоне концентраций от 0,5 до 6,0% NaCl [7, 11, 13] и также варьирует у разных штаммов бактерий P. phosphoreum.

В комплексе перечисленные факторы влияют на люминесцентный цикл, длительность и интенсивность которого специфичны для каждого вида бактерий.

Заключение

Известно, что детергенты способны стимулировать активность ферментов, однако допускают, что стимулирующий эффект может быть достигнут не прямым действием их на фермент, а на проницаемость клеточной мембраны, благодаря чему субстрат становится более доступным действию фермента. Проанализированные данные свидетельствуют о том, что ПАВ комплексно влияют на процесс микробиологического окисления н-алканов. Это влияние приводит к улучшению проницаемости клеточных мембран, увеличению активности дегидрогеназы, солюбилизации углеводородов и увеличению концентрации растворимого кислорода. Все эти параметры имеют большое значение для процессов биосинтеза белковых веществ.

Проанализировав теоретический материал можно сделать вывод, что поверхностно-активные вещества несут серьезную угрозу загрязнения окружающей среды, так как многие из них имеют сложное химическое строение, что затрудняет разрушение их в природе. Накапливаясь в почве, воде такие вещества могут оказывать неблагоприятное воздействие на живые организмы, в том числе и человека. Также, анализ литературных данных показал, что в природе довольно часто встречаются микроорганизмы, способные разрушать биологически «мягкие» поверхностно-активные вещества, в том числе неионогенные, такие как оксиэтилированные спирты и кислоты, и гораздо реже - «жесткие», например оксиэтилированные алкилфенолы. Поэтому, на мой взгляд, поиск и изучение таких микроорганизмов в настоящее время является важной задачей.

Список литературы

Будников Г. К. Биосенсоры как новый тип аналитических / Казанский государственный университет

Джо Дж. Шоу, Питер Роговский, Тимоти Дж. Близко и Кларенс Кадо/Отдел Патологии Завода, Университет Калифорнии. Дэвис, Калифорния 95616

Журнал сибирского Федерального Университета. Биология 4 (2009 2) 418-452

И. Е. Суковатая, В. А. Кратасюк, В. В. Межевикин и др. Ф74 Фотобиофизика. [Электронный ресурс]: электронное учебное пособие / Красноярск: ИПК СФУ, 2008.

К.Р. Ланге; под науч. ред. Л.П. Зайченко Профессия /Санкт-Петербург, 2004.

Медведева, С.E.; Тюлькова, Н.А.; Кузнецов, А.М.; Родичева, Э.К. Журнал: Серия «Биология». Декабрь 2009 (том 2, номер 4)

Рогожева И. И. Биоразложение ПАВ и расчет удельной адсорбции / И. И. Рогожева, Д. С. Шадрина, Л.В. Боровская

Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений загрязняющих веществ и буровых растворов // РЭФИА, НИА-Природа, - Москва, 2002.

Ю.А. Лабас, А.В. Гордеева, А.Ф. Фрадков; Белки, которые потрясли мир

Cline T. W. Isolation and characterization of luminescence system mutants in bacteria // Meth. Enzymol. 1978. V. 57. P. 166-171.

Hastings J. W., Nealson K. H. Bacterial bioluminescence // Ann. Rev. Microbiol. 1977. V. 31. P. 549-595.

Hendrie M. S., Hodgkiss W., Shewan J. M. Identification, taxonomy and classification of luminous bacteria // J. Gen. Microbiol. 1970. V. 64. P. 157-169.

Johnson F. N., Eyring H., Steblye R.., Chaplin H., Huber C., Gherardi G. The nature and control of reactions in bioluminescence // J. Gen. Phisiol. 1945. V. 57. №5. P. 463-537.

Nealson K.H. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance // Microbiol. Rev. 1979. v.v 43. № 4. P. 406-518.

Ruby E.G., Greenberg E.P., Hasting J.W. Planctonic marin luminous bacteria: species distribution in the water colump // Appl. Environ. Microbiol. 1980. V. 39. №2. P. 302-306.

Shilo M., Yetinson T. Physiological characteristics underlying the distribution patterns of luminous bacteria in the Mediterranean sea and the gulf of Elat // Appl. Environ. Microbiol. 1979. V. 38. №4. P. 577-584.

Waters P., Lloyd D. Salt, PH and temperature dependencies of growth and bioluminescence of three species of luminous bacteria analysed on gradient plates // J. Gen. Microbiol. 1985. V. 11. №131. P. 2865-2869.

Wilson Th., Hastings J. W. Bioluminescence // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. V. 14. P. 197-230.

Размещено на Allbest.ru

...