Генетические механизмы эволюции прокариот

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭВОЛЮЦИИ ПРОКАРИОТ

Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизведение этих признаков в процессе размножения организма, так как возникающие дочерние особи обнаруживают в большинстве случаев полное сходство с родительскими формами. Это говорит о том, что генетический аппарат обладает высокой стабильностью и точностью механизмов, обеспечивающих его функционирование. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна, так как это исключало бы всякую возможность его изменений и, следовательно, эволюционных преобразований, приведших в конечном итоге к возникновению разнообразных форм жизни, свидетелями (и представителями) которых мы являемся. Таким образом, генетический аппарат должен быть организован так, чтобы, с одной стороны, обеспечивать свою стабильность, с другой -- быть достаточно пластичным, т. е. обладать способностью к изменчивости.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ ПРОКАРИОТ

генетический прокариотный наследственность эволюция

Как это ни кажется в настоящее время парадоксальным, но до 40-х гг. нашего столетия немногие микробиологи думали, что бактерии обладают наследственностью, основанной на тех же принципах, которые установлены для высших организмов. Прокариоты не имеют ни оформленного ядра, ни хромосом, аналогичных таковым эукариотных клеток, поэтому считали, что бактерии в генетическом отношении представляют собой неупорядоченную форму жизни. Одним из первых к пониманию того, что бактерии и высшие организмы подчиняются общим генетическим законам, подошел М. Бейеринк, описавший у прокариот стабильные, легко распознаваемые и наследуемые изменения.

Генетический материал любой клетки представлен ДНК, информационные свойства которой определяются специфической последовательностью четырех нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Полуконсервативный механизм репликации ДНК, в результате которого из одной родительской двухцепочной молекулы образуются две дочерние молекулы, содержащие по одной родительской и одной вновь синтезированной комплементарной полинуклеотидной цепи, наилучшим образом обеспечивает идентичность исходной и синтезированных молекул и, следовательно, сохранность видоспецифической наследственной информации в ряду поколений клеток и организмов (см. гл. 4). Частота ошибок, возникающих в процессе репликации, порядка 10^-7.

Реализация наследственной информации в процессе жизненного цикла (онтогенеза) организма -- двухступенчатый процесс. Сначала с определенных участков ДНК информация подписывается (транскрибируется) в виде комплементарных нулеотидных последовательностей молекул иРНК, которая перемещается в цитоплазму, связывается с рибосомами и в рибосоме с иРНК осуществляется перевод (трансляция) генетической информации в определенную последовательность аминокислотных остатков молекулы белка.

Процесс транскрипции находится в клетке под строгим контролем, поэтому имеет место как неодинаковое транскрибирование во времени разных участков ДНК (генов), так и неодинаковая скорость, с которой гены могут транскрибироваться. В результате количество молекул иРНК в клетке, комплементарных разным генам, сильно различается. Хотя в целом механизмы синтеза ДНК и РНК сходны, процесс транскрипции не обладает той степенью точности, которая характерна для репликации ДНК. Однако поскольку иРНК не способна к самовоспроизведению, возникающие при ее синтезе ошибки в последующих клеточных генерациях не воспроизводятся и, следовательно, не могут наследоваться.

Информационные РНК служат матрицами для синтеза различных белковых молекул. Перевод генетической информации с "языка" нуклеотидов на "язык" аминокислот--сложный многостадийный процесс, включающий активацию аминокислот, образование ими комплексов с особым видом РНК (транспортными РНК, или тРНК), взаимодействие этих комплексов с иРНК, связанной с рибосомой, приводящее в конечном итоге к формированию полипептидной цепи, аминокислотный состав которой изначально запрограммирован в определенном участке ДНК. В осуществлении каждой из стадий, ведущих к синтезу молекулы белка, участвует несколько различных ферментов.

Хотя механизм трансляции отличается высокой точностью, вероятность ошибки в целом выше, чем в случае синтеза молекул ДНК и РНК. Наиболее уязвимый этап -- "узнавание" с помощью фермента аминокислоты соответствующей молекулой тРНК. По имеющимся данным, частота возникновения ошибок на этом этапе порядка 10^-4, что и определяет, возможно, уровень точности процесса синтеза белка в целом. Однако, как и в случае синтеза РНК, ошибки в процессе трансляции, приводящие к синтезу измененной молекулы белка, не воспроизводятся, если они не закодированы исходно в генетическом материале.

Таким образом, процессы транскрипции и трансляции, служащие для выражения в онтогенезе генетической информации, не приводят к наследованию изменений, возникающих при их функционировании. Только изменения, происходящие в молекулах ДНК, могут сохраняться в ряду поколений, поскольку они воспроизводятся в процессе репликации. Следовательно, в основе эволюции прокариот лежит способность к изменению только их генетического материала. У прокариот весь генетический материал, необходимый для жизнедеятельности, локализован в одной хромосоме, т. е. бактериальная клетка гаплоидна. В определенных условиях в клетках бактерий может содержаться по нескольку копий хромосомы.

У многих бактерий обнаружены нехромосомные генетические элементы: плазмиды, умеренные фаги и мигрирующие элементы (транспозоны и IS-элементы)²⁶. Для плазмид характерно стабильное существование в нехромосомном состоянии. Транспозоны и IS-элементы входят, как правило, в состав хромосом, но способны переходить из хромосомы в плазмиду, поэтому также могут быть отнесены к нехромосомным генетическим элементам.

Изучение нехромосомных генетических элементов обнаружило, что общий объем ДНК, входящий в их состав, превышает объем генома каждой особи. Таким образом, у прокариот большой объем генетической информации оказывается рассредоточенным в нехромосомных элементах. Это заставляет по-новому подходить к вопросу об организации генетической информации в мире прокариот. В бактериальной хромосоме локализована генетическая информация, необходимая для существования конкретного вида бактерий в определенном диапазоне условий внешней среды: при наличии используемых источников углерода, азота, доступности или отсутствии молекулярного кислорода и т. д. Особенностью генетической информации, содержащейся в нехромосомных элементах, является ее необязательность для жизнедеятельности бактерий, т. е. в ее отсутствие бактериальная клетка жизнеспособна, но, как видно из дальнейшего материала, важная роль нехромосомных генетических элементов заключается в том, что они расширяют возможности существования бактериального вида, обеспечивают обмен генетическим материалом на большие расстояния по горизонтали и играют определенную роль в эволюции прокариот.

Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке составляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а число плазмид колеблется от 1 до 38. Плазмиды -- это линейные или кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 40 000 пар нуклеотидов. Большинство плазмид состоит из трех групп генов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина. Отличительная особенность плазмид -- способность к автономной репликации, поэтому минимальное количество ДНК, которое может быть названо плазмидой, -- это фрагмент, обеспечивающий автономную репликацию плазмидной ДНК в клетке как единого целого.

Обычно о присутствии плазмид в бактериальной клетке судят по проявлению определенных признаков, к которым относится устойчивость к отдельным лекарственным препаратам, способность к переносу генов при конъюгации, синтез веществ антибиотической природы, способность использовать некоторые сахара или обеспечивать деградацию ряда веществ. Из перечисленного выше видно, что плазмиды делают возможным существование организмов в более широком диапазоне условий внешней среды, т. е. действуют как факторы адаптации. Большую группу составляют плазмиды с нерасшифрованными функциями; такие плазмиды выявляют с использованием физико-химических методов.

Мигрирующие элементы, представленные транспозонами и IS-элементами, -- это линейные молекулы двухнитевой ДНК, размеры которых колеблются от 200 до 6000 пар нуклеотидов. Отличительная особенность мигрирующих элементов -- их неспособность к автономной репликации. Мигрирующие элементы могут встраиваться в разные участки бактериальной хромосомы или мигрировать с бактериальной хромосомы на плазмиду; их репликация осуществляется под контролем тех же механизмов, что и у соответствующей хромосомы или плазмиды. Частота переносов (транспозиции) мигрирующих элементов колеблется от 10^-4 до 10^-7. IS-элементы содержат информацию, необходимую только для их переноса внутри клетки, никаких выявляемых признаков в них не закодировано. Транспозоны устроены более сложно: в них включены некоторые гены, не имеющие отношения к процессу транспозиции. Известны транспозоны, содержащие гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов и другим ингибиторам.

Для переноса мигрирующих элементов между клетками нужен переносчик, которым могут быть определенные плазмиды или фаги. Встраивание мигрирующих элементов в бактериальную хромосому оказывает мутагенное действие, так как при этом происходит включение фрагмента ДНК, приводящее к изменению порядка расположения нуклеотидов в триплете и, как следствие этого, нарушению процесса транскрипции.

ИЗМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Первое, что поразило исследователей, когда они поближе познакомились с миром прокариот, -- огромное разнообразие присущих им признаков. Это послужило в свое время основанием для дискуссии о том, существуют ли у прокариот реально очерченные виды, между которыми нет переходов, или же имеет место почти бесконечная вариабельность одного вида, так что в конечном итоге само понятие "вид" применительно к этим организмам теряет тот смысл, который в него вкладывается. Спор был разрешен после разработки Р. Кохом метода чистых культур. Было доказано, что и у бактерий вид -- это реальность. Представления о простоте переходов между родами и видами оказались неверными.

В процессе экспериментальной работы с прокариотами исследователи часто наблюдали, что популяция одного вида при культивировании в течение длительного времени или в разных условиях подвержена изменениям. Накопилось огромное количество фактов, иллюстрирующих эти изменения, однако механизмы, лежащие в основе наблюдаемых явлений, были непонятны. И только успехи, достигнутые за последние десятилетия в области изучения строения и функционирования генетического аппарата прокариот, позволили разобраться в этом вопросе.

Прежде чем переходить к дальнейшему изложению материала, целесообразно ввести некоторые понятия. Генотипом, или геномом, называют совокупность всех генов, присущих данному организму, т. е. его генетическую конституцию. Под фенотипом понимают совокупность признаков, присущих данному организму. Оказалось, что все наблюдаемые изменения можно разделить на два типа. К первому относят те из них, которые, как правило, проявляются у подавляющего большинства особей в популяции при изменении внешних условий и наблюдаются до тех пор, пока действует фактор, вызвавший эти изменения. Такой тип изменчивости получил название не наследственного, или модификационного, а само явление названо модификацией.

Ко второму типу относятся изменения признаков, которые первоначально возникают как редкие события в популяции особей (с частотой 1 на 104--1011 клеток). Если измененные особи имеют некоторое преимущество перед неизмененными, выражающееся в повышенной скорости роста или жизнеспособности, они постепенно накапливаются в популяции и вытесняют исходные особи. Изучение особенностей второго типа изменений привело к заключению, что последние возникают случайно. И наконец, эти изменения постоянны, т. е. передаются из поколения в поколение при размножении организма. Такой тип изменчивости был назван наследственным.

Долгое время не было ясно, каков механизм модификационных изменений, могут ли они наследоваться и какова их роль в эволюции организмов. В настоящее время показано, что модификация -- изменение, происходящее на уровне фенотипа и не затрагивающее клеточный генотип. Все признаки клетки определяются ее генотипом, но в определенных условиях она пользуется не всей заложенной в ней генетической информацией, количество которой гораздо больше, чем необходимо клетке для существования в конкретных условиях. Реакция клетки на изменение внешних условий приводит к проявлению какихто новых признаков, свойств, которые не обнаруживались в исходной культуре. Однако информация, необходимая для проявления этих признаков, обязательно содержится в клеточном Геноме. Модификация есть результат пластичности клеточного метаболизма, приводящего к фенотипическому проявлению "молчащих" генов в конкретных условиях. Таким образом, модификационные изменения имеют место в рамках неизменного клеточного генотипа.

Существует несколько типов модификационных изменений. Наиболее известны адаптивные модификации, т. е. ненаследственные изменения, полезные для организма и способствующие его выживанию в изменившихся условиях. Причины адаптивных. модификаций кроются в механизмах регуляции действия генов. Адаптивной модификацией является адаптация клеток Е. coli к лактозе как новому субстрату (см. гл. 8). У ряда бактерий обнаружена универсальная адаптивная реакция в ответ на различные стрессовые воздействия (высокие и низкие температуры, резкий сдвиг pH и др.), проявляющаяся в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков. Такие белки получили название белков теплового шока, а само явление -- синдром теплового шока. Стрессовое воздействие на бактериальную" клетку вызывает ингибирование синтеза обычных белков, но индуцирует синтез небольшой группы белков, функция которых предположительно заключается в противодействии стрессовому воздействию путем защиты важнейших клеточных структур, в первую очередь нуклеоида и мембран. Еще не ясны те регуляторные механизмы, которые запускаются в клетке при воздействиях, вызывающих синдром теплового шока, но очевидно, что это универсальный механизм неспецифических адаптивных модификаций. Не все модификации обязательно адаптивны. При интенсивном действии многих агентов наблюдаются ненаследуемые изменения, случайные по отношению к вызвавшему их воздействию. Они проявляются только в условиях, которые их вызывают. Причины появления таких фенотипически измененных клеток связаны с ошибками процесса трансляции, вызванными этими агентами.

Таким образом, модификационная изменчивость не затрагивает генетической конституции организма, т. е. не является наследственной. В то же время она вносит определенный вклад в процесс эволюции. Адаптивные модификации расширяют возможности организма к выживанию и размножению в более широком диапазоне условий внешней среды. Возникающие в этих условиях наследственные изменения подхватываются естественным отбором и таким путем происходит более активное освоение новых экологических ниш и достигается более эффективная приспособляемость к ним.

Наследственные изменения можно подразделить на изменения, возникающие в результате мутаций и рекомбинаций генетического материала. Скачкообразные изменения в генетическом материале клетки, приводящие к появлению новых признаков, получили название мутаций. Мутации возникают в популяции особей всегда, часто без видимых воздействий на популяцию. Такие мутации, причины возникновения которых нам неизвестны, называются спонтанными. Повышать частоту мутаций по сравнению со спонтанным фоном, т. е. индуцировать их, могут физические, химические и биологические факторы, действующие на генетический материал клетки. Физические факторы -- это прежде всего коротковолновое излучение (ультрафиолетовые и рентгеновские лучи). К химическим мутагенам относятся аналоги оснований, производные акридина, алкилирующие и дезаминирующие агенты. Биологические факторы -- это в первую очередь мигрирующие элементы (транспозоны и IS-элементы).

Мутации, независимо от того, имеют ли они спонтанное происхождение или индуцированы какимлибо мутагеном, по характеру перестроек, происшедших в ДНК, можно разделить на мутации, состоящие в изменении одного нуклеотидного остатка молекулы ДНК, так называемые точковые мутации, и мутации, при которых наблюдается изменение участка молекулы ДНК размером больше одного нуклеотида. Точковые мутации в свою очередь могут быть разделены на несколько классов в зависимости от того, какие конкретно химические перестройки происходят в молекуле ДНК в рамках одного нуклеотидного остатка: замена, вставка или выпадение. К мутациям, затрагивающим сегмент бактериальной хромосомы, ведут выпадение нескольких оснований или даже генов, перемещение их в пределах одной хромосомы, умножение или удвоение части хромосомы.

Частым типом структурных повреждений ДНК, вызываемых УФизлучением, является образование пиримидиновых димеров в результате ковалентного связывания соседних пиримидиновых оснований. Реже УФ вызывает разрыв водородных связей, образование межцепочечных поперечных сшивок и поперечных сшивок между ДНК и белком. Ионизирующие излучения всех видов вызывают главным образом одноцепочечные разрывы в ДНК; разрывов, поражающих обе цепи, обычно на порядок меньше. Различные химические мутагены индуцируют образование внутрицепочечных и межцепочечных поперечных сшивок и одноцепочечные разрывы ДНК.

В процессе эволюции прокариоты выработали способы защиты генетического материала от повреждающего воздействия облучения и различных химических факторов. В клетках прокариот обнаружены эффективные системы репарации мутационных повреждений.

Наиболее изученными механизмами восстановления повреждений ДНК являются фотореактивация, вырезание повреждений и пострепликационное, или рекомбинационное, восстановление. Фотореактивация -- наиболее простой механизм, восстанавливающий лишь индуцированные УФизлучением повреждения ДНК, сопровождающиеся образованием пиримидиновых димеров. Особенность фотореактивации в том, что ее действие распространяется только на одну цепь ДНК и не зависит от того, является ли молекул" В ДНК одно или двухцепочечной. Осуществляется фотореактивация светозависимым фотореактивирующим ферментом, обеспечивающим специфическое расщепление пиримидиновых димеров (рис. 1, А).

Рис. 1. Механизмы восстановления повреждений ДНК. А --фотореактивация пиримидиновых димеров; 1 --фотореактивирующий фермент + видимый свет. Б -- вырезание одноцепочечных повреждений: 1 -- сегмент интактной ДНК; 2 --повреждение в одной из цепей ДНК; 3 -- вырезание короткого сегмента, содержащего поврежденный участок; 4 -- заполнение образовавшейся бреши нуклеотидами, комплементарными к интактной цепи, функционирующей в качестве матрицы; сшивание их с помощью ДНКполимеразы и ДНКлигазы; В --пострепликационное восстановление ДНК; -- сегмент двухцепочечной молекулы ДНК, содержащей повреждение; 2 --репликация молекулы, приводящая к образованию двух молекул, одна из которых содержит повреждение и брешь в разных цепях;3 -- обмен генетическим материалом между идентичными цепями сестринских молекул; 4 -- образование молекул, каждая из которых содержит одну интактную цепь, а в другой -- повреждение или брешь. Крестиком обозначено повреждение; точками -- восстановительный синтез; волнистой линией -- синтезированные цепи дочерних молекул ДНК

Вырезание повреждений -- основной темновой механизм восстановления различных одноцепочечных повреждений ДНК, в том числе и пиримидиновых димеров. Особенность этого механизма репарации в том, что восстановление одноцепочечных повреждений происходит только тогда, когда неповреждена комплементарная цепь молекулы ДНК. В процессе темновой репарации происходит вырезание в одной из цепей молекулы ДНК коротких сегментов (длиной около 30 нуклеотидов), содержащих поврежденный участок, и последующее заполнение образовавшейся бреши комплементарными нуклеотидами с использованием неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы (рис. 1, Б).

Механизмы, обеспечивающие восстановление повреждений в обеих цепях молекулы ДНК, зависят от характера повреждений. Принципиальная схема заключается в следующем (рис. 1, В). ДНКполимераза, катализирующая репликацию ДНК, "встретив" на своем пути повреждение, "перескакивает" через него, и процесс репликации продолжается. Образуются две дочерние молекулы, одна из которых содержит в одной цепи первичное повреждение, в другой -- брешь, возникшую при репликации и располагающуюся напротив повреждения.

Заделывание бреши происходит путем генетического обмена между идентичными цепями сестринских двухцепочечных молекул. В результате каждая из них имеет теперь по одной неповрежденной цепи, которая может служить матрицей в процессе репарации повреждений разного типа, как это изображено на схеме Бтого же рисунка.

Фенотипическое проявление мутаций. Поскольку мутация -- это стабильное изменение наследственного материала клетки, она реализуется по тем же каналам, что и любая другая генетическая информация. На этом пути судьба мутаций различна. Некоторые из них не влияют на признаки организма, оставаясь "молчащими". Такие мутации могут не проявляться в процессе трансляции, т. е. не приводить к изменению аминокислотной последовательности синтезируемого белка. В другом случае изменение может происходить вдали от активного центра фермента и потому не сказываться на его функции. Если же мутация приводит к изменению в активном центре или резко влияет на его структуру, это сразу сказывается на функциях фермента. Диапазон изменения функциональной активности фермента в этом случае велик: от незначительного понижения активности до полной ее потери. В последнем случае это часто приводит к гибели организма.

Для проявления мутации необходимо, чтобы прошел по крайней мере один цикл репликации ДНК, в которой исходно имело место изменение нуклеотидной последовательности (премутация). Только если это исходное изменение закрепится после репликации в дочерней молекуле ДНК, оно становится стабильным, а отсюда и наследственным. Для выражения мутации в фенотипе необходимо прохождение этапов транскрипции и трансляции. Иногда для проявления мутационно измененного признака, т. е. фенотипического выражения мутации, необходимо несколько клеточных делений. Так, если мутация привела к нарушению способности синтезировать какойлибо витамин, например тиамин, то в течение нескольких генераций потребность в тиамине у мутантных клеток не обнаруживается. В этот период мутантные клетки доиспользуют тиамин, содержащийся в исходной немутантной клетке. Когда же запасы витамина иссякнут, мутанты смогут размножаться только при добавлении экзогенного тиамина.

На проявление мутантных признаков влияет также количество копий хромосомы, содержащихся в клетке. Все прокариоты гаплоидны, имеют набор генов, локализованных в одной хромосоме. В определенных условиях в клетке можно обнаружить несколько копий одной хромосомы. Если в такой клетке произошла мутация, приведшая к нарушению синтеза определенного метаболита, то она сразу (после одного цикла репликации--транскрипции--трансляции) не проявится, поскольку синтез необходимого клетке метаболита будет осуществляться в результате функционирования неповрежденных генов, содержащихся в остальных хромосомных копиях. Для фенотипического выражения мутантного гена необходимо, чтобы он содержался в клетке в "чистом" виде, т. е. клетка имела одну копию хромосомы с мутантным геном, или чтобы все копии хромосомы в клетке имели одинаковый генотип. Это происходит через несколько клеточных делений (рис. 2).

Рис. 2. Проявление мутаций в прокариотной клетке, имеющей четыре копии хромосомы (по Schlegel, 1972)

Ко второму типу наследственной изменчивости относятся изменения, возникающие у прокариот в результате рекомбинации генетического материала, при которой происходит частичное объединение геномов двух клеток. Известны три основных способа, приводящих к рекомбинации генетического материала прокариот (конъюгация, трансформация и трансдукция), различающихся механизмами передачи хромосомной ДНК.

При конъюгации, для которой необходим непосредственный контакт между бактериальными клетками, осуществляется направленный перенос генетического материала от клеткидонора

в клеткуреципиент. Как правило, в клеткуреципиент переносится только часть генетического материала клеткидонора, в результате чего образуется неполная зигота, или мерозигота, содержащая часть генома донора и полный геном клеткиреципиента. Участки перенесенной от донора ДНК находят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен (рис. 3, А). В результате часть донорной ДНК встраивается (интегрируется) в геном реципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК из него исключается.

Рис. 3. Рекомбинация между гомологичными (А) и негомологичными (Б) фрагментами ДНК. Объяснения см. в тексте

Трансформация бактерий заключается в переносе ДНК, выделенной из одних клеток, в другие. Для трансформации не требуется непосредственного контакта между двумя клетками. Способность ДНК проникать в клеткуреципиент зависит как от природы самой ДНК, так и от физиологического состояния клеткиреципиента. Трансформирующей ДНК могут быть только высокомолекулярные двухцепочечные фрагменты, при этом проникать в бактериальную клетку может ДНК, выделенная из разных биологических источников, но включаться в геном -- только ДНК с определенной степенью гомологичности. После того как экзогенный фрагмент ДНК, проникший в клетку, нашел гомологичный фрагмент ДНК клеткиреципиента, между ними происходит генетический обмен аналогично тому, как это имеет место на последнем этапе конъюгации (рис. 40, А).

Конъюгация и трансформация -- не единственные способы передачи генетического материала. Гены могут переноситься из одной бактериальной клетки в другую с помощью умеренных фагов. Такой перенос бактериальных генов получил название трансдукции. Трансдукция оказывается возможной, если в процессе размножения фага одна из частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, как правило, содержащий очень небольшое число генов. Когда такая фаговая частица заражает бактериюреципиент, бактериальная ДНК проникает в клетку таким же путем, как фаговая. Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен, и как следствие его возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генетического материала клеткидонора (рис. 4, А). Передача признаков с помощью фагов показана для бактерий, принадлежащих к разным родам.

Наконец, еще один путь переноса генетического материала у прокариот осуществляется с помощью плазмид определенного типа, обладающих генами, обеспечивающими эту возможность. Такие плазмиды помимо переноса собственного генетического материала могут обеспечивать перенос хромосомных генов, плазмид, не обладающих способностью к самостоятельному переносу, а также осуществлять передачу транспозонов из плазмиды в хромосому или другую плазмиду.

Все известные способы передачи генетической информации с помощью плазмид создают огромные возможности для интенсивных генетических обменов между клетками различных бактерий. Плазмидам и другим нехромосомным генетическим элементам принадлежит основная роль в передаче генетической информации "по горизонтали". Можно предположить, что в природе любая генетическая информация может быть перенесена в любую клетку прокариот, если не прямо, то через посредников. Подтверждением этого могут служить данные по введению с помощью сконструированной плазмиды в бактериальную клетку эукариотной ДНК и ее репродукции там.

Как редкое событие, происходящее с частотой 10-⁴--10-⁷, плазмиды или отдельные гены, входящие в их состав, могут включаться в бактериальную хромосому. Поскольку ДНК плазмиды и бактериальной клетки не имеют одинаковых нуклеотидных последовательностей, т. е. не являются гомологичными, рекомбинация между ними происходит не по механизму обмена, а по механизму встраивания (рис. 4, Б). Рекомбинации такого типа происходят также с участием транспозонов и IS-элементов при их перемещении (транспозиции) в пределах хромосомы. Встраивание плазмид и мигрирующих элементов помимо того, что приводит к введению в хромосому дополнительного генетического материала, может вызывать перестройку бактериального генома: нарушать целостность генов или регуляцию их функционирования, т. е. вызывать мутации.

ВКЛАД ОТДЕЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В ЭВОЛЮЦИЮ ПРОКАРИОТ

Выше мы рассмотрели организацию генетического аппарата прокариот, осуществляющего передачу генетической информации от одного поколения к следующему, т. е. по "вертикали", обратив внимание на такие его черты, как стабильность и точность функционирования. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна и при всей надежности изменения являются его неотъемлемым свойством. Для прокариот характерна большая способность к генетическим изменениям, являющимся результатом мутаций, а также развития путей "горизонтального" переноса генов между бактериальными клетками.

Закономерности и вклад различных процессов в эволюцию прокариот проще представить, если рассматривать их применительно к некой достаточно генетически однородной популяции организмов. Генетический состав такой популяции называется генофондом и по отношению к ней эволюцию можно определить как изменения в генофонде, происходящие в результате действия определенных генетических механизмов и отбора.

Новые наследственные признаки возникают в генофонде в результате генных мутаций. Последние создают фонд наследственных изменений, служащих исходным материалом (сырьем) для эволюции. Вероятно, мутации являются и самым первым видом наследственной изменчивости, возникшим одновременно с началом функционирования ДНК как информационной молекулы, поскольку для них не нужно никаких дополнительных структур и механизмов. Способность к мутированию заложена в химическом строении молекулы ДНК, а проявление мутационных изменений идет по тем же каналам, что и обычная генетическая информация клетки. Возможно, в течение длительного времени мутационные изменения были единственной формой изменчивости. На протяжении миллионов лет мутации в сочетании с естественным отбором сыграли решающую роль в появлении тех видов бактерий, которые известны сейчас.

Скорость эволюции определялась частотой возникновения мутаций. Можно только предполагать, что в начале биологической эволюции частота мутаций была значительно выше, чем в настоящее время, а соотношение "полезных" для организма мутаций к "вредным" сдвинуто в сторону первых. В пользу повышенной частоты мутирования на раннем этапе эволюции говорит тот факт, что в тот период значительно интенсивнее было действие на прокариотную клетку коротковолнового излучения при отсутствии у нее защитных приспособлений в виде соответствующих репарационных механизмов.

Следующее важное приобретение -- сформирование механизмов обмена генетическим материалом, принадлежащим разным особям, "по горизонтали", и возникновение на базе этого особей с рекомбинантным геномом. При генетических рекомбинациях новых генов в генофонде, как правило, не появляется. В этом их принципиальное отличие от мутаций. Значение генетических рекомбинаций в том, что в результате этого обеспечивается возможность объединения разных генов и создание разных вариантов генных сочетаний в геноме прокариотной клетки. Поскольку отбор действует на всю совокупность признаков организма, генетическая рекомбинация поставляет дополнительный материал для действия отбора, ускоряя таким образом процесс эволюции.

Особенность организации генетической информации в мире прокариот -- рассредоточение большого ее объема в нехромосомных элементах. Из этого следуют две существенно различающиеся возможности "горизонтального" обмена генетической информацией: первая связана с хромосомной, вторая -- нехромосомной ДНК. Из трех основных процессов, приводящих у прокариот к обмену хромосомной ДНК, наиболее совершенным является процесс конъюгации, так как он обеспечивает возможность более полного обмена генетическим материалом двух клеток. (При благоприятных условиях возможно вхождение в реципиентную клетку всей донорной ДНК.) Однако эффективность механизмов генетической рекомбинации в этих процессах высока для близкородственных прокариотных организмов. Обмен участками хромосомной ДНК у бактерий в большинстве случаев ограничен пределами одного вида. Возможность "горизонтальной" передачи генетической информации на большие таксономические расстояния реализуется при переносе нехромосомных молекул ДНК, способных к автономной репликации.

1. Организация прокариотической клетки. Размножение прокариот Прокариоты - это организмы, в клетках которых отсутствует оформленное ядро. Функции ядра выполняет нуклеоид (то есть «подобный ядру»); в отличие от ядра, нуклеоид не имеет собственной оболочки. Одним из представителей эубактерий является кишечная палочка (Escherichia coli). Кишечная палочка составляет значительную часть содержимого толстого кишечника человека, а также кишечника других животных. Эти бактерии вырабатывают некоторые витамины и препятствуют развитию патогенных бактерий. Однако некоторые формы кишечной палочки вызывают воспаления кишечника - энтериты. Кишечная палочка встречается и вне организма человека: в воде и почве. Кишечная палочка широко используется в биотехнологии. Общая характеристика прокариот Тело прокариот, как правило, состоит из одной клетки. Размеры прокариотических клеток изменяются от 0,1-0,15 мкм (микоплазмы) до 30 мкм и более. Большинство бактерий имеет размеры 0,2-10 мкм. Однако при неполном расхождении делящихся клеток возникают нитчатые, колониальные и полинуклеоидные формы (бактероиды). В прокариотических клетках отсутствуют постоянные двумембранные и одномембранные органоиды: пластиды и митохондрии, эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи и их производные. Их функции выполняют мезосомы - складки плазматической мембраны. В цитоплазме фотоавтотрофных прокариот имеются разнообразные мембранные структуры, на которых протекают реакции фотосинтеза. Иногда их называют бактериальными хроматофорами. Специфическим веществом клеточной стенки прокариот является муреин, однако у некоторых прокариот муреин отсутствует. Поверх клеточной стенки часто имеется слизистая капсула. Пространство между мембраной и клеточной стенкой служит резервуаром протонов при фотосинтезе и аэробном дыхании. У подвижных бактерий имеются жгутики, основой которых служит белки флагеллины. В естественных условиях мутанты, лишенные клеточной стенки, нежизнеспособны. Поэтому такие мутанты широко используются в биотехнологии, поскольку не могут существовать вне лабораторных условий (это один из аспектов генетической безопасности). Специфика строения прокариотической клетки позволяет выделить прокариот в отдельное надцарство (или доминион) живой природы. Изучено около 3 тысяч видов прокариотических организмов: эубактерии, архебактерии, спирохеты, риккетсии, микоплазмы, миксобактерии, актиномицеты, цианобактерии, а также организмы с неопределенным систематическим положением. Это виды, которые культивируются в лабораторных условиях. Однако существуют прокариоты, которые не выделены в виде чистых культур. Поэтому истинное их видовое разнообразие может достигать 10...100 тысяч видов, а, может быть, и намного больше. Для оценки уровня биоразнообразия прокариот используются методы метагеномики. Метагеномика - раздел систематики микроорганизмов, основанный на выделении фрагментов ДНК не отдельных биологических видов, а микробоценозов (сообществ микроорганизмов). Экология прокариот определяется типами обмена веществ. Свободноживущие гетеротрофные прокариоты (сапротрофы) должны полностью обеспечивать себя всеми необходимыми веществами. Такие организмы называются прототрофными. Однако вследствие мутаций (включая делеции протяженных участков ДНК; у кишечной палочки возможна потеря 15% генома) возникают ауксотрофные биотипы. Например, ауксотрофы по лейцину не могут самостоятельно синтезировать лейцин, а ауксотрофы по биотину не могут синтезировать биотин. Двойные и множественные ауксотрофы нуждаются в поступлении двух и более необходимых органических веществ извне. В естественных условиях мутанты-ауксотрофы могут существовать только при наличии недостающих веществ во внешней среде (например, при переходе к комменсализму или паразитизму). Ауксотрофы широко используются в биотехнологии, поскольку не могут существовать вне лабораторных условий (это один из аспектов генетической безопасности). В природных условиях прокариоты образуют популяции (генетические неоднородные множества организмов одного вида) и сообщества из разных видов (микробоценозы). Тогда возможно явление протокооперации: мутант-ауксотроф может восполнять дефицит необходимых веществ за счет взаимодействия с прототрофами по данному веществу. Размножение прокариот Бесполое (вегетативное) размножение прокариот происходит путем деления клеток, которое называется дроблением. У некоторых прокариот (актиномицеты) бесполое размножение происходит с помощью спор (конидий).

При размножении бактерий в искусственных условиях (в ограниченном объеме питательной среды) в развитии культуры выделяется 4 периода, или фазы. 1 фаза - лаг-фаза. Численность бактерий увеличивается очень медленно (иногда даже снижается). Бактерии как бы осваивают новую среду. 2 фаза - фаза экспоненциального роста. Численность бактерий увеличивается лавинообразно, в геометрической прогрессии. 3 фаза - стационарная фаза. Численность бактерий стабилизируется. 4 фаза - фаза отмирания. Численность бактерий начинает уменьшаться и вскоре активных бактерий не остается. Наличие стационарной фазы и фазы отмирания связано с уменьшением концентрации питательных веществ и накоплением вредных продуктов обмена. У некоторых видов известен половой процесс (конъюгация). При конъюгации одна из клеток передает генетическую информацию другой клетке. При этом увеличения числа особей не происходит. Перенос генетической информации может происходить с помощью вирусов (трансдукция) или путем прямого переноса ДНК через мембрану (трансформация).

2. Геномика прокариот (на примере кишечной палочки Escherichia coli) Основу генома кишечной палочки составляют кольцевые молекулы ДНК: прокариотические хромосомы и плазмиды. Множество молекул ДНК образует две взаимосвязанные подсистемы: хромосомную и плазмидную. Хромосомная подсистема прокариотического генома Основу хромосомной подсистемы прокариотического генома составляет прокариотическая (бактериальная) хромосома (генофор), входящая в состав нуклеоида - ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название сайта OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки. Репликация ДНК идет в две стороны от сайта OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны. В прокариотических хромосомах число сайтов OriC может быть увеличено, например, у сенной палочки Bacillus subtilis их не менее двух. Длина прокариотической хромосомы составляет несколько миллионов нуклеотидных пар (мпн); например, минимальная длина ДНК прокариотической хромосомы E. coli штамма MG1655 составляет 4639221 пн (физическая длина около 1,5 мм). У разных прокариот размер генома изменяется от до 0,5 до 6 мпн: Примерно 11% ДНК прокариотической хромосомы E. coli представлено «некодирующими» (нетранскрибируемыми) последовательностями. Остальные 89% ДНК транскрибируются или могут транскрибироваться с образованием РНК. Примерно 75% транскрипционных единиц ДНК (участок ДНК от промотора до терминатора) содержит 1 ген (обычно это гены «домашнего хозяйства», то есть гены, необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки), остальные 25% представляют собой опероны (геном E. coli содержит 600…700 оперонов). У типичных прокариот (например, у кишечной палочки) в неделящейся клетке имеется одна бактериальная хромосома. Поэтому прокариоты в целом являются гаплоидами (гаплобионтами). У гаплоидов каждый ген представлен одним аллелем, поэтому в целом к прокариотам неприменимы понятия «доминантности» и «рецессивности»: любой аллель проявляется в фенотипе, если данный ген экспрессируется (наблюдается моноаллельное наследование). В лаг-фазе в клетке имеется одна бактериальная хромосома, но в фазе экспоненциального роста ДНК реплицируется быстрее, чем происходит деление клетки; тогда число бактериальных хромосом на клетку увеличивается до 2...4...8. Такое состояние генетического аппарата называется полигаплоидностью. При делении клетки сестринские копии бактериальной хромосомы равномерно распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы. Механизм сегрегации хромосомной подсистемы прокариотического генома обеспечивает полное сохранение объема и качества генетической информации, содержащейся в бактериальной хромосоме. В результате происходит прямое наследование признаков Например, если в популяции нормальных прокариот (прототрофных, «дикого типа») в одной из клеток возникает мутация, определяющая неспособность синтезировать аминокислоту лейцин, то все потомство (клон, штамм) этой клетки не может существовать на среде, лишенной лейцина (сохраняет ауксотрофность по лейцину). Из генетически гетерогенной популяции прокариот возможно выделение штаммов (клонов, генетически однородных чистых линий), сохраняющих гаплотип бактериальной хромосомы исходной клетки. В чистых линиях прокариот рекомбинация не происходит. Поэтому невозможно появление новых гаплотипов, новых сочетаний признаков. Например, существуют устойчивые двойные ауксотрофы по биотину и метионину. В некоторых случаях один и тот же ген прокариотической хромосомы может быть представлен двумя копиями. Такие клетки (гетерогеноты) могут нести доминантные и рецессивные аллели одного гена. Тогда наблюдается диаллельное наследование, например, нормальный аллель прототрофности по лейцину доминирует над мутантным аллелем ауксотрофности. Плазмидная подсистема прокариотического генома Кроме бактериальной хромосомы в состав генома прокариот входят плазмиды - кольцевые молекулы ДНК длиной в тысячи п.н. Плазмиды такого размера содержат несколько десятков генов. Обычно это «гены роскоши», обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, кодирующие специфические токсины, а также гены конъюгации и обмена генетическим материалом с другими особями. Известны также мелкие плазмиды длиной 2...3 тпн, кодирующие не более 2 белков. У многих бактерий открыты мегаплазмиды длиной порядка миллиона пн, то есть немногим меньше бактериальной хромосомы. Существуют плазмиды, представленные одной копией - они реплицируются синхронно с ДНК бактериальной хромосомы. Другие плазмиды могут быть представлены многими копиями, и их репликация происходит независимо от репликации бактериальной хромосомы. Репликация свободных плазмид часто протекает по принципу «катящегося кольца» - с одной кольцевой матрицы ДНК считывается «бесконечная» копия. Репликация плазмид может быть синхронизирована с репликацией бактериальной хромосомы, но может быть и независимой. Соответственно, распределение плазмид по дочерним клеткам может быть точным или статистическим. Точная сегрегация характерна для крупных малокопийных плазмид, а статистическая сегрегация - для мелких мультикопийных. В последнем случае одна дочерняя клетка получает избыточную (дублированную) генетическую информацию, а другая клетка может вообще утратить некоторые плазмидные гены Единство хромосомной и плазмидной подсистем прокариотического генома.

Некоторые плазмиды могут находиться в автономном и в интегрированном состоянии. В последнем случае плазмида включается в состав бактериальной хромосомы в определенных точках attB. Таким образом, одна и та же плазмида может включаться в состав хромосомы и может вырезаться из нее. Это обеспечивает обмен генетической информацией между разными подсистемами прокариотического генома: хромосомной и плазмидной.

3. Вирусы. Геномика вирусов. Разнообразие форм и жизненных циклов вирусов. Рекомбинация в разных группах вирусов Вирусы - это особая форма жизни, объединяющая организмы с неклеточным строением. Вирусы способны существовать в двух формах: вне клеток (свободные вирусы, или вирионы) и внутри клеток. Вирионы состоят из нуклеиновых кислот, заключенных в белковую оболочку - капсид. Вирионы не проявляют свойств биологических систем: у них отсутствует обмен веществ, и они неспособны к самовоспроизведению. В состав капсида входит строго определенное количество повторяющихся белковых субъединиц - капсомеров. Например, у вируса полиомиелита в состав капсида входит 60 капсомеров, у аденовируса - 252, у вируса табачной мозаики - 2000. Размеры вирусов колеблются от 20 до 350 нм. По морфологии различают следующие формы вирусов: сферическую, палочковидную, кубоидальную, сперматозоидную. По характеру симметрии капсида различают вирусы со спиральным, кубическим (икосаэдрическим) и комбинированным типом симметрии. Степень сложности вириона может быть различной. У простых вирусов в состав вириона входит только нуклеиновая кислота и белки, которые связаны в единую нуклеопротеиновую структуру - нуклеокапсид. У сложных вирусов имеется дополнительная липопротеиновая оболочка - суперкапсид. В состав сложных вирионов могут входить углеводы и некоторые ферменты. Однако вирусы никогда не содержат метаболических систем, обеспечивающих обмен веществ. Для собственного воспроизведения вирусы должны проникнуть в клетку. Сначала происходит адсорбция (фиксация) вирионов на поверхности клетки, а затем внутрь клетки проникает или весь вирион или только вирусная нуклеиновая кислота. В большинстве случаев вирусы проникают в клетку путем виропексиса (этот механизм проникновения вирусов в клетку сходен с фагоцитозом). После проникновения в клетку вирусы вступают в вегетативно-репродуктивную фазу, то есть приобретают способность к обмену веществ и воспроизведению, причем, метаболизм вирусов неразрывно связан с метаболизмом клетки-хозяина. Таким образом, вирусы являются облигатными (обязательными) внутриклеточными паразитами. По типам клеток-хозяев различают: вирусы бактерий (бактериофаги), растений, животных и человека. В ряде случаев нуклеиновые кислоты вирусов встраиваются (интегрируются) в состав хромосом хозяина. В интегрированном состоянии вирус называется провирусом. Провирусы неотличимы от генетического материала хозяина и воспроизводится вместе с ним. В интегрированном (вирогенном) состоянии вирусы могут находиться долгое время. Но в ряде случаев (при изменении физиологического состояния клетки, например, при облучении) начинается репродукция вируса. С помощью ферментов и пластических веществ клетки идет репликация вирусных нуклеиновых кислот и вирусных белков. Путем самосборки из этих молекул формируется множество вирионов, которые покидают клетку. При этом клетка может погибнуть или сохраниться. Значение вирусов. Вирусы - возбудители многих инфекционных заболеваний растений, животных и человека. В то же время, вирусы - возбудители заболеваний у нежелательных для человека организмов («враги наших врагов»). Вирусы широко используются как объекты молекулярно-генетических исследований. В генной инженерии вирусы применяются для переноса генетического материала. Происхождение вирусов. Существует ряд теорий происхождения вирусов. Согласно одной из теорий, вирусы - крайне упрощенные прокариотические организмы, утратившие цитоплазму. Противоположные теории рассматривают вирусы как часть генетического материала клетки, вынесенного за ее пределы. Значение вирусов в первую очередь связывается с их патогенностью - способностью вызывать заболевания. Различают острые вирусные заболевания (например, грипп), хронические и латентные (скрытые). Борьба с вирусными заболеваниями человека и животных ведется с использованием неспецифических препаратов (например, интерферона), специфических сывороток и препаратов, подавляющих репродукцию вирусов. Для профилактики вирусных заболеваний применяют различные вакцины. Антибактериальные препараты (сульфаниламиды, антибиотики) на вирусы не действуют. Геномика вирусов Геном вирусов может быть представлен различными типами ДНК или РНК. На этом основании различают: ДНК-содержащие вирусы, геном которых представлен различными типами ДНК, и РНК-содержащие вирусы, геном которых представлен различными типами РНК. Нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) представляют собой вирусные хромосомы ДНК-содержащие вирусы 1 тип: геном представлен кольцевой двухцепочечной ДНК длиной около 5 тпн. Представители: - обезьяний вирус SV 40 - мелкий эукариотический вирус (кодирует 5 белков), используется в генной инженерии как вектор переноса генов. - вирусы бородавок человека. 2 тип: геном представлен кольцевой одноцепочечной ДНК длиной около 5 тпн, которая может быть как кодирующей (+), так и антикодирующей (-). Представители: - мелкие бактериофаги типа М13; не разрушают клетку; плюс-цепь кодирует 8 белков - вирус золотистой мозаики фасоли. 3 тип: геном представлен линейной двухцепочечной ДНК длиной 30-150 тпн. Представители: - крупные бактериофаги (типа Т4, в капсиде 130 белков) ; - бактериофаги средних размеров (типа «лямбда», в капсиде 38 белков); - аденовирусы млекопитающих и человека; средних размеров; - вирусы оспы, герпеса и им подобные; вирионы крупные, есть липопротеиновая оболочка. 4 тип: геном представлен линейной одноцепочечной ДНК длиной около 5 тпн, которая может быть как кодирующей (+), так и антикодирующей (-). Представители: - спутники аденовирусов человека 5 тип: геном представлен двухцепочечной ДНК длиной 3-8 тпн, которая замкнута в кольцо из перекрывающихся сегментов. Представители: - вирус гепатита В; кодирует 5 белков; имеется суперкапсид, включающий вирусные и клеточные белки; - вирус мозаики цветной капусты. РНК-содержащие вирусы 1 тип: геном представлен линейной двухцепочечной РНК длиной около 10 тн, которая может быть сплошной или фрагментированной. Представители: - мелкие бактериофаги; - вирусы полиэдроза насекомых; - реовирусы птиц, млекопитающих и человека (РНК фрагментированная) 2 тип: геном представлен одноцепочечной плюс-РНК, которая может быть сразу использована для трансляции белков. Представители: - вирус табачной мозаики; - арбовирусы (вирусы клещевого энцефалита, желтой лихорадки) ; - вирус бешенства; - некоторые бактериофаги 3 тип: геном представлен одноцепочечной минус-РНК, которая используется для синтеза плюс-цепи РНК. Представители: - вирусы гриппа (А, В, С); - вирус кори; - вирус чумы; - вирус паротита (свинки); - вирус чумы плотоядных животных (чумки) 4 тип: ретровирусы - геном представлен одноцепочечной плюс-РНК, которая используется для синтеза ДНК и её интеграции в хромосомы хозяина. Представитель: - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) Жизненные (вегетативно-репродуктивные) циклы и особенности рекомбинации у некоторых бактериофагов Вегетативно-репродуктивный цикл и особенности рекомбинации у вирулентных фагов (на примере фага Т4) Фаги фиксируются на поверхности бактериальных клеток и впрыскивают свою ДНК в цитоплазму. Происходит репликация фаговой ДНК и синтез фаговых белков. После достижения определенной концентрации компонентов фагов происходит самосборка новых фагов. После окончания сборки фаговых частиц происходит лизис клетки, поэтому такой жизненный цикл называется литическим. Клетка может быть заражена одновременно двумя и более штаммами вируса, различающимися по некоторым признакам, например, по устойчивости к повышенной или пониженной температуре. Тогда в зараженной клетке синтезируется два типа вирусной ДНК. Эти два типа вирусной ДНК способны к рекомбинации с образованием новых типов ДНК: AB + ab > Ab + aB. При самосборке вирионов из общего пула ДНК образуется четыре типа фагов: исходные: - чувствительные к повышенной температуре - чувствительные к пониженной температуре и рекомбинантные - чувствительные к любым изменениям температуры - устойчивые к любым изменениям температуры. В результате рекомбинации происходит изменение наследственно обусловленных свойств фагов. Вегетативно-репродуктивный цикл и особенности рекомбинации у умеренных фагов (на примере фага «лямбда») Умеренные фаги имеют два цикла развития: - литический (как у вирулентных фагов) и - лизогенный, при котором ДНК фага интегрируется в прокариотический геном Лизогенный цикл умеренных фагов включает: - фиксацию вирионов на поверхности бактериальной клетки; введение вирусной ДНК в клетку бактерии; - встраивание (интеграцию) вирусной ДНК в прокариотический геном; - размножение вирусной ДНК в составе прокариотического генома; - при определенных условиях фаг активируется: синтезируется свободная вирусная ДНК и происходит синтез вирусных белков, а затем самосборка вирионов; - вирионы выходят во внешнюю среду и заражают новые бактериальные клетки. При вырезании фаговой ДНК из прокариотического генома фаг ведет себя подобно плазмиде. В некоторых случаях происходит рекомбинация фаговой и прокариотической ДНК: обмен генами фага и бактерии. Тогда фаг будет содержать часть генов прокариотической клетки. Фаг, содержащий рекомбинантную ДНК, включающую часть генов прокариотической клетки, способен инфицировать новые клетки, но не способен к интеграции в прокариотическую ДНК. Для интеграции прокариотических генов в геном другой клетки необходим фаг-помощник «дикого типа». Умеренные фаги, несущие прокариотическую ДНК, способны осуществлять трансдукцию - перенос генетической информации от одного прокариотического штамма к другому. 4. Рекомбинация у прокариот. Трансформация, конъюгация, трансдукция Рекомбинация - совокупность процессов, связанных с замещением участка исходной нуклеиновой кислоты на гомологичный (сходный) участок. При этом степень гомологии может быть различной: от полной идентичности исходной и новой нуклеотидных последовательностей до заметных расхождений, приводящих к изменению фенотипа. В результате рекомбинации образуются новые сочетания аллелей, например: AB + ab > Ab + aB. У прокариот существует три способа включения в геном чужеродной ДНК: трансформация, конъюгация и трансдукция. Трансформация Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов: S- и R-формы. S-форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии; эта форма патогенна для мышей. R-форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии; эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые S-клетки и живые R-клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма. В 1944 г. О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти доказали, что изменение наследственных свойств клеток связано с переносом ДНК. Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы: стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены - факторы компетентности (в частности, специфические белки с низкой молекулярной массой). В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот. Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация. Процесс трансформации включает следующие стадии: 1. Присоединение трансформирующей двунитевой ДНК к рецепторам на поверхности клетки-реципиента. 2. Превращение двунитевой ДНК в однонитевую. 3. Проникновение однонитевой ДНК в клетку. 4. Интеграция трансформирующей ДНК в хромосому реципиента и рекомбинация генетического материала. Длина трансформирующей ДНК должна быть от 500 до 200 тысяч пн. Энергия, выделяющаяся при деградации одной из нитей ДНК, используется для активного транспорта оставшейся нити вовнутрь клетки. Первые три стадии трансформации не зависят от нуклеотидного состава ДНК. Однако процесс интеграции трансформирующей ДНК в хромосому реципиента более вероятен при высокой гомологичности этой ДНК по отношению к ДНК реципиента. Процесс трансформации изображен на схеме. Каждый отрезок прямой соответствует одной цепи ДНК. Трансформирующая ДНК обозначена черным цветом, а ДНК клетки-реципиента - серым цветом. На первой стадии трансформирующая ДНК присоединяется к рецепторным сайтам на поверхности клетки-реципиента. На втором этапе двунитевая ДНК на поверхности клетки превращается в однонитевую за счет расщепления одной из нитей бактериальными нуклеазами. На третьем этапе оставшаяся нить ДНК транспортируется через мембрану в цитоплазму. При этом используется энергия, выделившаяся при деградации комплементарной цепи. При репликации бактериальной хромосомы трансформирующая нить ДНК присоединяется к гомологичному (частично комплементарному) участку ДНК клетки-реципиента. При этом из-за отсутствия полной комплементарности образуется гетеродуплекс («молекулярная гетерозигота») - участок двунитевой ДНК, на котором не во всех нуклеотидных парах азотистые основания связаны водородными связями. Остальная часть ДНК реплицируется нормальным образом. После окончания репликации ДНК клетка-реципиент делится с образованием двух клеток: частично трансформированной клетки с хромосомой, включающей гетеродуплексный участок ДНК, и нетрансформированной клетки. При репликации ДНК в частично трансформированной клетке на обеих цепях ДНК происходит достраивание комплементарных цепей. Одна цепь сохраняет исходные последовательности нуклеотидов, а другая становится полностью трансформированной. После деления частично трансформированной клетки образуется одна нетрансформированная клетка и одна полностью трансформированная, у которой исходная последовательность нуклеотидов замещена на последовательность нуклеотидов трансформирующей ДНК. Таким образом, при трансформации происходит замещение генов реципиента на гомологичные нуклеотидные последовательности. Чем выше степень гомологии, тем успешнее протекает трансформация. Частота трансформации у прокариот зависит от свойств трансформирующей ДНК, от ее концентрации, от состояния клетки-реципиента, от вида бактерий. Максимальная частота трансформированных клеток не превышает 1 на 100 клеток. Трансформация известна и для эукариот. Однако на поверхности эукариотических клеток отсутствуют рецепторные сайты, и трансформирующую ДНК вводят в клетки искусственно. Например, в яйцеклетки животных ДНК вводят путем прямой микроинъекции, а в яйцеклетки растений - путем микроинъекции в пыльцевую трубку. Широко используются методы биобаллистики (биолистики), позволяющие вводить любые фрагменты ДНК в культуры тканей растении. Конъюгация Конъюгацией у прокариот называется прямой контакт двух разнокачественных клеток, сопровождаемый хотя бы частичным переносом генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту. (Процесс конъюгации был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Э. Татумом). У кишечной палочки клетка-донор («мужская») имеет продолговатую форму, клетка-реципиент («женская») - изодиаметрическую. Клетка-донор образует половые ворсинки (пили), которые притягивают ее к клетке-реципиенту и образуют цитоплазматические каналы. По этим каналам ДНК из клетки-донора переходит в клетку-реципиент. Существует три типа клеток-доноров: F+ (эф-плюс), Hfr (эйч-эф-а) и F? (эф-прим). F+ -доноры содержат в цитоплазме половой фактор - специфическую F-плазмиду. F-плазмида - это автономный репликон длиной около 100 тпн. В составе F-плазмиды изучено более 20 генов. Примерно половина из них образует гигантский оперон tra (длиной около 30 тпн); продукты этого оперона контролируют образов...