Основы микробиологии и вирусологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

Высшего профессионально образования

«Забайкальский аграрный институт - филиал ФГБОУ ВПО»

«Иркутская государственная сельскохозяйственная академия»

(ЗабАИ - филиал ФГБОУ ВПО «ИрГСХА»)

Кафедра биологии

Контрольная работа

по дисциплине: «Микробиология и вирусология»

Выполнил: Молостов А.С.

Специальность: Биология

Шифр 102511

Курс 5

Проверил: Доцент Савельева Л.Н.

Чита 2015

Содержание

1. Генетика вирусов

2. Вирус болезни бешенства

1. Генетика вирусов

Величайшие достижения середины XX века -- открытие дискретных единиц наследственности (генов), разработка хромосомной теории наследственности, 6 развитие биохимической генетики микроорганизмов и установление принципа «один ген -- один белок», открытие регуляции активности генов прокариотов Ф. Жакобом и Ж. Моно, открытие двойной спирали ДНК Дж. Уотсоном и Ф. Криком и др. создали основу для превращения генетики классической в генетику молекулярную, где законы наследственности и изменчивости изучаются на молекулярном и субмолекулярном уровнях.

За последние несколько лет наблюдался взрывообразный рост числа опубликованных сообщений по различным аспектам генетики эукариотических систем вообще, и системы клетка -- вирус животных в частности.

Вирусы являются одним из излюбленных объектов молекулярной генетики благодаря простому строению и малой молекулярной массе их геномов, которая в 106 раз меньше массы генома эукариотической клетки. Организация генетического аппарата у ряда вирусов, например у sv40, настолько сходна с таковой генов эукариотической клетки, что пблучила название минихромосомы. Минихромосома широко используется для изучения организации и репликации ДНК.

Структурная организация генома клетки

В составе генома имеются структурные гены, кодирующие определенные биополимеры (белки или РНК), и регуляторные гены, которые контролируют функцию структурных генов. Регуляция происходит с помощью белковых продуктов регуляторных генов -- репрессоров, подавляющих активность структурных генов. Регуляторными участками генов, контролирующих транскрипцию, являются усилитель транскрипции (enhancer) и промотор -- область, предшествующая структурным генам и определяющая место специфического связывания РНК-полимеразы.

Характерной особенностью генов эукариотической клетки является их мозаичная структура, т. е. прерывистость гена. В составе гена, кодирующего один белок, кодирующие участки прерываются вставочными последовательностями, которые не несут никакой кодирующей информации и не транслируются. Кодирующие участки гена называются экзонами, а вставки -- нитронами.

При транскрипции считывается весь ген, включая экзоны и интроны. Впоследствии происходит созревание (процессинг) иРНК: из образовавшегося длинного первичного транскрипта удаляются участки, соответствующие интронам, а участки, соответствующие экзонам, «сшиваются». В результате подобной модификации из первичного транскрипта образуется зрелая иРНК. Этот процесс вырезания интронов и сшивания экзонов называется сплайсингом (от английского слова splice -- соединять, сращивать концы каната). Сплайсинг был впервые описан на модели ДНК-со-держащих вирусов животных -- 8У40 и аденовирусов.

Строение эукариотического гена и его транскрипция: а - строение эукариотического гена 8У40: 1--усилитель транскрипции; 2 -- промотор; 3-- инициация репликации ДНК вируса (origin); 4-- интроны; 5-- экзоны (кодирующие области гена); 6-- терминирующая последовательность ААТААА; стрелка обозначает участок начала транскрипции, б -- схема сплайсинга при созревании иРНК: 1--экзоны, 2--интроны, 3--зрелая иРНК.

Основной особенностью вирусного генома является то, что наследственная информация у вирусов может быть записана как на ДНК, так и на РНК. Геном ДНК-содержащих вирусов двухнитевой (исключение составляют парвовирусы, имеющие однонитевую ДНК), несегментированный и проявляет инфекционные свойства. У вирусов, принадлежащих к родам Poxvirus и Hepadnavirus геном представлен двумя цепочками ДНК разной длины. Геном большинства РНК-содержащих вирусов однонитевой (исключение составляют реовирусы и ретровирусы, обладающие двунитевыми геномами) и может быть сегментированным (представители родов Retrovirus , Orthomyxovirus , Arenavirus и Reovirus ) или несегментированным.

Вирусные РНК в зависимости от выполняемых функций подразделяются на две группы. К первой группе относятся РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомы чувствительной клетки, т.е. выполнять функции иРНК и мРНК. Их называют плюс-нити РНК и обозначают как +РНК (позитивный геном). Они имеют характерные окончания (`шапочки') для специфического распознавания рибосом.

У другой группы вирусов РНК не способна транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомы и функционировать как иРНК. Такие РНК служат матрицей для образования иРНК, т.е. при репликации первоначально синтезируется матрица (+РНК) для синтеза -РНК. Такой тип РНК определяют как минус-нить и обозначают -РНК (негативный геном). У вирусов этой группы репликация РНК отличается от транскрипции по длине образующихся молекул: при репликации длина РНК соответствует материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК. Молекулы +РНК проявляют инфекционность, а -РНК не проявляют инфекционные свойства и для воспроизведения должны транскрибироваться в +РНК.

Исключение составляют ретровирусы, которые содержат однонитевую +РНК, служащую матрицей для вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При помощи этого фермента информация переписывается с РНК на ДНК, в результате чего образуется ДНК-провирус, интегрирующийся в клеточный геном.

Методы исследования генетики вирусов

На раннем этапе генетические исследования вирусов животных сдерживались из-за отсутствия подходящих методов исследования индивидуального потомства при смешанном заражении. Решение этой проблемы было найдено Дульбекко [32, 33], который разработал метод бляшек для цитоцидных вирусов. Использование метода бляшек позволило точно определять количество потомства, получать чистые клональные штаммы вируса и очищать вирусы от других примесных вирусов и дефектных интерферирующих частиц того же типа вируса. С помощью этого метода была получена система, пригодная для анализа условно-летальных мутаций. Таким образом, в значительной степени генетика вирусов животных началась с введения в практику метода бляшек. В настоящее время применимость метода бляшек рассматривают как необходимое условие для начала исследований генетики новой группы вирусов подобно тому, как разработка метода фокусов трансформации для нецитолитических, трансформирующих вирусов [151] послужила ключом к развитию генетических исследований этих вирусов.

При изучении регуляции синтеза вирусных нуклеиновых кислот и белков во многих системах, например у герпесвирусов, с успехом использовали ингибиторы белкового синтеза, такие как пуромицин или циклогексимид, а также ингибиторы синтеза РНК, например актиномицин Е) Разработка электрофоретических систем с высоким разрешением для анализа белков и нуклеиновых кислот позволила провести генетические исследования вирусов с сегментированным РНК-геномом, используя в качестве маркеров полиморфизм электрофоретической подвижности РНК-сегментов и белков Применение рестрикционных эндонуклеаз сыграло аналогичную роль для ДНК-содержащих вирусов с использованием в качестве генетических маркеров полиморфизма подвижности фрагментов ДНК и белков.

Методы исследования транскрипции и трансляции in vitro вирусов доказали свою эффективность при построении физических карт, особенно в системах, где отсутствует генетическая рекомбинация. В последнее время генетические приемы используют для изучения вирусного патогенеза и иммунного ответа хозяина на вирусную инфекцию, если хотят сопоставить специфические свойства вируса с индивидуальными вирусными генами и генными продуктами. Иными словами, современный генетик, изучающий вирусы животных, охотно заимствует методы у биохимика и применяет их в генетическом анализе. Наряду с этим генетики и другие специалисты используют генетический анализ для ответа на вопросы, которым традиционно не уделялось должного внимания. Такое слияние дисциплин очень помогло генетикам и в значительной мере определило быстрый прогресс этой науки в последние несколько лет.

Мутации.

Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. На раннем этапе исследования генетики вирусов животных в основном заключались в сборе и последующей генетической и физиологической характеризации вирусных мутантов. В последнее время вирусные мутанты стали использовать в качестве специфических инструментов для исследования генетических и биохимических событий, происходящих в зараженной клетке. Работы такого рода с вирусами животных в целом запаздывали по сравнению с аналогичными работами на прокариотических системах.

Спонтанная мутация

Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствие каких-либо известных мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменчивости фенотипа, которая является объектом селективного давления в ходе эволюции вируса.

Скорость спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах значительно ниже (10 -8 - 10 -11 на каждый включенный нуклеотид), чем у РНК-геномных (10 -3 - 10 -4 на каждый включенный нуклеотид). Более высокая частота спонтанных мутаций связана с низкой точностью репликации РНК-геномов, которая вероятно связана с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, свойственной ферментам, реплицирующим ДНК. Наиболее часто спонтанные мутации наблюдаются у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции, не способных к самокоррекции.

Таким образом, в то время как геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны, этого нельзя сказать об РНК-содержащих вирусах, К сожалению для генетиков, ряд факторов стимулирует неравновесие в популяции геномов, и эти факторы часто способствуют накоплению мутантов в популяции. Из-за спонтанного мутагенеза трудно поддерживать гомогенность популяции вируса. Для того чтобы обойти эту трудность, вирусы периодически реклонируют, однако мутанты часто возникают и в ходе образования бляшки, и в ходе роста вируса, поэтому бывает трудно получить генетически однородные препараты вируса с высоким титром.

Индуцированные мутации

Индуцированные мутации у вирусов получают при действии различных химических и физических мутагенов, которые подразделяют на действующие in vivo и in vitro .

Большая часть мутантов, выделенных в ходе исследования вирусов животных, получена из популяций дикого типа, обработанных мутагенами. Мутагены обычно применяют для того, чтобы увеличить частоту мутаций в популяции, после чего мутанты подвергают скринингу с помощью подходящего селективного давления. Основной проблемой, связанной с использованием мутагенов, является подбор подходящей дозы. Как правило, желательно получить мутанты, которые отличаются от дикого типа только одной мутацией. Для этого отбор ведут при наиболее низкой дозе мутагена, дающей достаточную частоту мутаций с желаемым фенотипом.

В системах с вирусами животных было использовано множество различных мутагенов, но все они входят в небольшое число классов, определяемых по механизму мутагенеза.

Мутагены одного класса, обычно называемые мутагенами in vitro, действуют путем химической модификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусной частице. Азотистая кислота дезаминирует основания, в первую очередь аденин, с образованием гипоксантина, который при последующей репликации спаривается с цитозином. В результате действия азотистой кислоты на аденин происходит транзиция от АТ-пары к GС-паре. Азотистая кислота дезаминирует также цитозин, приводя к транзиции CG-->-ТА. Другим мутагеном in vitro является гидроксиламин; он реагирует специфически только с цитозином и вызывает транзицию СG-->-ТА. Большой класс мутагенов in vitro представлен алкилирующими агентами, которые действуют на многие позиции в основаниях. Алкилирующие агенты -- нитрозогуанидин, этанметансульфонат и ме-тилметансульфонат -- являются мощными мутагенами.

Во второй класс входят мутагены in vivo, которые требуют для своего действия метаболически активной нуклеиновой кислоты.

Одна группа мутагенов in vivo содержит аналоги оснований, которые включаются в нуклеиновую кислоту в ходе синтеза по правилам нормального спаривания. Включившись, эти аналоги способны претерпевать таутомерные переходы, которые приводят их к спариванию с различными основаниями, вызывая таким образом транзиции и трансверсии. Часто используют аналоги: 2-аминопу-рин, 5-бромдезоксиуридин и 5-азацитидин.

В другую группу мутагенов in vivo включены интеркалирующие агенты, которые внедряются в стопку оснований, что при последующей репликации нуклеиновой кислоты приводит к вставкам или делециям.

Примерами интеркалирующих агентов являются акридиновые красители, такие как профлавин.

Ультрафиолет также иногда используют в качестве мутагена. Основным продуктом действия ультрафиолета являются димеры пиримидинов. В ДНК пиримидиновые димеры вырезаются. Для РНК механизм ультрафиолетового мутагенеза неизвестен.

Большинству мутаций присуще свойство возврата (реверсии) к дикому типу. Каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить.

Классификация вирусных мутаций.

Вирусные мутации классифицируют по изменениям фенотипа и генотипа. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов разделяют на четыре группы:

· Мутации, не имеющие фенотипического проявления.

· Летальные мутации, т.е. полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков и приводящие к утрате способности к репродукции. Мутация является летальной, если вследствие ее нарушается, например, синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

· Условно летальные мутации, т.е. мутации с потерей способности синтезировать определенный белок или с нарушением его функции только в определенных условиях. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (temperature sensitive) - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39--42° С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36--37° С).

· Мутации, имеющие фенотипическое проявление, например изменение размеров бляшек под агаровым покрытием или термостабильности, по изменению спектра хозяев, устойчивости к ингибиторам и химиопрепаратам.

Генетические взаимодействия между вирусами

Основным методом исследования генетических взаимодействий между вирусами служит смешанное заражение клеток куль туры тканей.

Заражение вирусами чувствительных клеток носит множественный характер, т.е. в клетку проникает сразу несколько вирионов. При этом вирусные геномы в процессе репликации могут кооперироваться или интерферировать. Кооперативные взаимодействия между вирусами представлены генетическими рекомбинациями, генетической реактивацией, комплементацией и фенотипическим смешиванием.

Тесты на комплементацию и рекомбинацию являются двумя наиболее полезными приемами, доступными генетикам.

Эти исследования позволили, во-первых, осуществить функциональное группирование мутантов, во-вторых, обозначить мутации на линейных картах или поместить их в группы рекомбинации (рекомбинация).

Генетическая рекомбинация

Рекомбинация -- это физическое взаимодействие между вирусными геномами в смешанно-зараженной клетке приводящее к обмену генетическим материалом между родительскими вирусами. Возможен как обмен полными генами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). У вирусов животных это взаимодействие может происходить двумя различными способами в зависимости от физической организации вирусного генома. У вирусов, имеющих одну геномную молекулу, включая все ДНК-содержащие вирусы и часть РНК-содержащих вирусов, рекомбинация включает разрыв и воссоединение ковалентной связи в нуклеиновой кислоте с образованием дочерних геномов неродительского типа (внутримолекулярная рекомбинация).

Образующийся вирус-рекомбинант обладает свойствами, унаследованными от разных родителей.

Обычно рекомбинируемые штаммы обладают характерными признаками, которые обозначаются как маркеры. Например, были получены рекомбинанты между вирусами полиомиелита, обладающие повышенной устойчивостью и повышенной чувствительностью к гуанидину, разной ней-ровирулентностью, разной устойчивостью к повышенной температуре, разной чувствительностью к ингибиторам сывороток лошадей и коров и т. п. Для получения рекомбинантов используют штаммы, содержащие два или большее число маркеров.

Тест рекомбинации применяют для генетических исследований вирусов. С его помощью возможно построение генетических карт вирусов, в которых определяется, в каких участках генома произошли мутации, а также в условных единицах измеряется расстояние между разными мутациями.

Пересортировка генов наблюдается при генетических взаимодействиях между вирусами, имеющими сегментированный геном.. У вирусов с сегментированным геномом, включая вирусы гриппа, в ходе рекомбинационного процесса ковалентные связи не разрываются. Вместо этого сегменты генома перемешиваются случайным образом при помощи механизма, называемого перетасовыванием, или реассортацией. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты.

Существуют определенные группировки (констелляции или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.

Сходные процессы пересортировки генов имеют место у вирусов гриппа типов А, В и С и у других вирусов с фрагментарным геном -- у буньявирусов, аренавирусов (однонитчатые РНК) и реовирусов (ротавирусов) (двунит-чатая РНК). Однако эти процессы не столь интенсивны и доступны изучению, как у вирусов гриппа.

Генетическая реактивация

Генетическая реактивация представляет собой частный случай рекомбинации или обмена сегментами, когда один или оба партнера неинфекционны, однако при смешанном заражении дают потомство, которое несет признаки обоих родителей. Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов с мутациями в разных генах. При перераспределении генетического материала формируется полноценный геном.

Это инфекционное потомство представляет собой рекомбинанты, в которых инактивирующие повреждения неинфекционного родителя элиминированы. Реактивацию между инфекционным и неинфекционным родителями называют кросс-реактивацией, или спасением маркера. Кросс-реактивация у вирусов животных была использована в различных ситуациях. Например, у вируса гриппа скрещивание между небляшкообразующим, но инфекционным вирусом с бляшкообразующим, но ивактивированным облучением вирусом облегчало получение бляшкообразующих рекомбинантов, содержащих маркеры от небляшкообразующего родителя [139]. Кросс-реактивация показана также для ДНК-содержащих вирусов, ре-комбинирующих по механизму разрыв -- воссоединение

В условиях, когда оба партнера неинфекционны, реактивацию называют «множественной». Множественная реактивация может осуществляться только в том случае, если инактивирующие повреждения локализованы в различных участках генома, так что обмен сегментами или рекомбинация могут дать жизнеспособное потомство.

Множественная реактивация обнаружена в ряде вирусных систем Обычно она происходит между вирусами, инактивированными УФ-светом. Множественная реактивация наблюдалась как между различными штаммами одного и того же вируса, так и между вирусами различных серотипов [90], а также между неродственными вирусами, например аденовирусом типа 12 и SV40.

Комплементация.

Комплементацией называют взаимодействие генных продуктов вируса в смешанно-инфицированных клетках, которое приводит к увеличению выхода одного или обоих вирусов, в то время как их генотип остается неизменным. Это определение отражает тот факт, что один или оба вируса (мутанта) предоставляют белковый продукт, по которому другой партнер дефектен, что позволяет одному или обоим мутантам расти в смешанно-инфицированных клетках. Принцип комплементации заключается в том, что вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными.

Следовательно, если оба «родителя» дефектны по одному и тому же генному продукту (функции), то ни один из них не способен обеспечить недостающую функцию, и комплементации не происходит. Таким образом, тест на комплементацию можно использовать для классификации и объединения вирусных мутантов в различные функциональные группы. Полагают, что два мутанта, неспособные комплементировать друг друга, имеют дефект в одном и том же гене и генном продукте, тогда как мутанты, способные ко взаимной комплементации, имеют дефект в различных генах и генных продуктах. Теоретически возможно столько же комплементационных групп, сколько и генов. Однако абсолютная летальность некоторых мутаций или несущественная функция других часто приводит к тому, что число комплементационных групп меньше числа генов.

Комплементация может быть односторонней и двусторонней. Двусторонняя комплементация заключается в репродукции обоих партнеров, каждый из которых не способен к самостоятельной репродукции. При односторонней комплементации один из партнеров обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Вирус, стимулирующий репродукцию другого вируса, называется «вирус-помощник», а вирус, репродуцирующийся только в присутствии помощника, называется «вирус-сателлит».

Существуют два типа комплементации.

Наиболее типична - неаллелъная, или межгенная, комплементация, при которой мутанты, дефектные по различным функциям, помогают друг другу в репликации, предоставляя функцию, дефектную у другого вируса.

Аллельная, или внутригенная, комплементация наблюдается намного реже и происходит в том случае, если генный продукт, дефектный у обоих партнеров, образует мультимерный белок. В этом случае различные партнеры имеют дефект в разных доменах одного и того же белка. Если мультимерный белок состоит из субъединиц одного партнера, то он функционально неактивен. Однако, если мультимер состоит из субъединиц от обоих партнеров, он может принять функционально активную конформацию, и будет наблюдаться комплементация.

Комплементация встречается и у неродственных вирусов, принадлежащих к разным семействам. Одним из семейств, вирусы которого наиболее часто участвуют в комплементации, является семейство аденовирусов. В одних системах аденовирусы могут действовать как дефектные вирусы, в других -- как помощники. Например, в культуре клеток почек макак резусов аденовирусы могут репродуцироваться только в присутствии 8У40, который является в данном случае вирусом-помощником.

Тест на комплементацию легче всего проводить с мутантами условно-летального типа. Для постановки такого теста клетки заражают совместно двумя мутантами, а в качестве контроля используют клетки, зараженные этими мутантами по отдельности. Зараженные клетки инкубируют в непермиссивных условиях (при высокой температуре в случае ts-мутантов). По истечении времени, достаточного для роста вируса, определяют суммарный выход при смешанной и раздельной инфекции, титруя вирус при пермиссивных условиях (низкой температуре в случае ts-мутаций) . Индекс комплементации рассчитывают как отношение урожая вируса при смешанном заражении к сумме урожаев в раздельно зараженных контролях. Комплементацию измеряют по увеличению урожая при смешанной инфекции. Индекс комплементации >2,0 указывает на комплементацию.

Комплементация наблюдается в ряде природных ситуаций в системах с вирусами животных. При пассировании ряда вирусов при высокой множественности заражения спонтанно возникают делеционные мутанты. Такие мутанты характерны для препаратов вирусов, которые интерферируют с диким типом и другими мутантами. Делеционные мутанты не способны расти самостоятельно, но поддерживаются в популяции благодаря комплементации, которую обеспечивает небольшое 'количество вируса с полноценным геномом, присутствующее в популяции (вирус-помощник). Комплементация была обнаружена также у РНК-со-держащих трансформирующих опухолеродных вирусов.

Генная инженерия

Разработка новых приемов для манипуляции с нуклеиновыми кислотами, обычно называемых «генной инженерией», открыла новые возможности для генетических исследований вирусов животных. В отличие от классической и молекулярной генетики, генная инженерия имеет своим объектом не клетки, не вирусы, а гены или их группы, оперируя с ними не как с биологическими объектами, а как с молекулами или фракциями молекул. Целью генной инженерии является пересадка генов в гетерогенные системы, их экспрессия для получения кодируемых генами белков -- гормонов, ферментов, антигенов и других биологически активных веществ.

Основным инструментом генноинженерных работ являются некоторые ферменты и в первую очередь рестрик-тазы. С их помощью удается получить необходимые фрагменты геномов или отдельные гены. В большинстве случаев рестриктазы образуют «липкие концы» в местах разреза молекул ДНК, что дает возможность соединять концы разных генов или генетических элементов. В тех же случаях, когда «липкие концы» не образуются, их создают искусственно, используя ферменты -- концевые нуклеотидил-трансферазы. Для ковалентных сшивок нитей ДНК применяются ферменты ДНК-лигазы. Для переноса в клетку вновь образованной генетической структуры в принципе могут быть использованы следующие методы: гибридизация соматических клеток, пересадка ядер и хромосом, трансформация клеток с помощью ДНК путем введения чужеродной ДНК в зародышевые и соматические клетки животных и прямая микроинъекция ДНК в ядро клетки. Чужеродный генетический материал можно вводить в клетку с помощью вектора. Вектор -- это молекула ДНК, способная к автономной репликации и используемая для переноса чужеродной генетической информации в клетку. Векторами могут быть бактериальные плазмиды либо искусственные образования (би- и тривалентные плазмиды, космиды -- производные фагов и плазмид). Удобными векторами для эукариотических клеток являются некоторые ДНК- и РНК-содержащие вирусы животных благодаря их способности к репродукции и существенному накоплению продуктов транскрипции и трансляции. К ним относятся вирусы полиомы, папилломы, 8У40, герпеса, аденовирусы, а среди РНК-со-держащих -- ретровирусы. Одной из наиболее перспективных векторных систем является крупный ДНК-содержащий вирус -- вирус осповакцины.

Генная инженерия создает новые возможности для получения вирусных вакцин, и эти возможности заключаются в создании вакцин, состоящих из протективных (вызывающих образование защитных антител) белков. Такие вакцины могут быть получены в прокариотических (бактериальных) системах и в системах низших эукариотов (например, в дрожжах). Однако большинство протективных антигенов вирусов человека являются продуктами сложных внутриклеточных модификаций, которые обычно не могут осуществить клетки прокариотов и низших эукариотов (антигены вирусов полиомиелита, гепатита А, гриппа и др.), и в этом случае для получения вакцин необходимо использовать клетки высших эукариотов, что делает генноинженерные вакцины против ряда инфекций нерентабельными. Однако для вирусов, которые плохо культивируются в лабораторных условиях (например, вирус гепатита А и ряд кишечных вирусов -- возбудителей гастроэнтеритов) этот путь остается единственно приемлемым.

Среди новых направлений по созданию генноинженерных вакцин весьма перспективным является использование крупных вирусов животных для введения в их геном генов протективных белков вирусов. Наиболее удачной моделью для этих манипуляций является вирус осповакцины. Этот вирус имеет громадный геном (187 кб), в который без ущерба для репродукции вируса можно встроить до 25 ко чужеродного генетического материала, т. е. несколько генов, кодирующих протективные белки вирусов. Получены штаммы вируса осповакцины со встроенным в область ранних генов гена НВ8-антигена. При внутрикожной прививке такой вакцины происходит размножение вируса осповакцины и развитие вакцинального процесса, : характерного для осповакцины. Одновременно происходят синтез НВ8-антигена вируса гепатита В, секреция его из очага вакцинации и индукция специфического иммунитета к гепатиту В. При этом реактогенность рекомбинантного штамма вируса осповакцины не только не повышается, но даже снижается по сравнению с исходным вакцинным штаммом.

Несмотря на большие успехи генной инженерии, трудности, стоящие перед ней, далеко еще не преодолены. Если принять за 100% путь от начала исследований до промышленного, коммерчески выгодного продукта, будь то вакцина, интерферон или гормон, то можно следующим образом оценить каждый из трех основных этапов этой задачи: получение рекомбинантных молекул на основе прокариотного или эукариотного вектора--10%, получение экспрессии интересующего исследователей гена -- 30 %, выход на экономически выгодную технологию--60%. И тем не менее, несмотря на все эти трудности, генная инженерия стала ядром современной биотехнологии и с каждым годом вклад ее в производсто будет возрастать.

2. Вирус болезни бешенства

Определение болезни.

Бешенство - особо опасная, остро протекающая, вирусная инфекционная болезнь теплокровных животных всех видов, а также человека, передающаяся главным образом через укус больного животного и характеризующаяся признаками поражения ЦНС (необычное поведение, непровоцируемая агрессивность, парезы и параличи) и заканчивающаяся смертью.

Историческая справка.

Бешенство было описано древними врачами Востока еще за 3000, Демокритом за 500 и Аристотелем более чем за 300 лет до нашей эры. Начиная с XVIII в. появляется интерес к изучению возбудителя бешенства. В России Данила Самойлович (1730) высказал мнение о том, что бешенство - заразное заболевание. В 1804 г. Цинке подтвердил заразность слюны бешеной собаки и экспериментально доказал возможность передачи возбудителя другим животным. В 1887 г. В. Бабеш обнаружил внутри нервных клеток головного мозга больных бешенством животных специфические включения, а А. Негри (1903) описал их формы, размеры и строение. Эти включения получили название телец Бабеша- Негри. Фильтруемость вируса бешенства установлена в 1903 г. П. Ремлен же и Рифоратбеем. Крупным шагом в изучении бешенства являются исследования Л. Пастера. В 1885 г. он впервые применил мальчику Жозефу Мейстеру мозговую вакцину против бешенства. Второй после Франции страной, где были открыты станции по прививке людей против бешенства, стала Россия (Одесса, Петербург, Москва, Самара). Новым этапом в развитии специфической профилактики бешенства является производство свободной от мозговой ткани вакцины с использованием культуры клеток. В начале 80-х гг. в США была создана субъединичная вакцина, которая обладает более высокими иммуногенными свойствами, чем из цельного вируса. Получена также высокоэффективная рекомбинантная антирабическая вакцина на основе вируса осповакцины. Достижения рабиологии не исчерпываются только разработкой вакцин. В СССР, в том числе в Беларуси и за рубежом нашли разрешение также многие вопросы эпизоотологии, диагностики и иммунологии бешенства, которые позволили обосновать систему мер его профилактики. геном вирус бешенство эукариотический

Распространение.

Бешенство регистрируется на всех континентах земного шара (за исключением Антарктиды, Австралии и Новой Зеландии) и установлено у животных, относящихся более чем к 30 видам. Ежегодно в мире погибает от бешенства свыше 50 тыс. человек и более 1 млн животных. Бешенство широко распространено и в Республике Беларусь. В последние годы ежегодно регистрируется до 0,5-1,5 тыс. случаев заболевания животных. Ежегодно до 28 тыс. человек в республике подвергается антирабическим прививкам. В 2000-2006 гг. в республике отмечено 6 случаев гибели от бешенства людей.

Экономический ущерб.

Наносимый бешенством ущерб в неблагополучных регионах превышает 400 млн долларов. Он складывается из прямых потерь от гибели, уничтожения больных и подозреваемых в заражении животных, недополучения продукции, затрат на проведение диагностических исследований, карантинирование, вакцинацию людей И ЖИВОТНЫХ, борьбу с природным бешенством путем пероральной вакцинации диких плотоядных.

Этиология.

Вирус бешенства относится к семейству Rabdoviridae, роду Lyssavirus, РНК-содержащий. Большинство частиц вируса (вирионов) имеет форму пули с одним круглым и одним плоским концом. Длина и диаметр вирусных частиц вариабельны и имеют размеры в среднем 180 х 75 нм. Поверхность вириона имеет небольшие выступы диаметром 4,5-5,5 нм и длиной 6-7 нм. По биологическим свойствам вирус бешенства относится к нейротропным. Вне организма животного вирус не размножается. В организме больного животного вирус накапливается главным образом в сером веществе центральной нервной системы, преимущественно в отделах головного мозга. Вирион вируса бешенства содержит два главных антигена, один из которых представляет собой гликопротеин вирусной оболочки, второй - внутренний нуклеопротеин вириона. Гликопротеин способен индуцировать образование вируснейтрализующих антител и защищать животных от заражения. Нуклеопротеин индуцирует образование комплементсвязывающих и преципитирующих антител, не обладающих вируснейтрализующей способностью и не оказывающих защиты против бешенства. Ранее все штаммы вируса бешенства рассматривались как единые в антигенном отношении. В настоящее время установлены 4 серотипа вируса бешенства: первый, второй, третий и четвертый. Наибольшее распространение имеет первый серотип. Все серотипы вируса бешенства в иммунобиологическом отношении родственны, поэтому любой штамм и его гликопротеин могут быть использованы для вакцинации животных И людей во всем мире. Экспериментально болезнь легко воспроизводится на теплокровных животных всех видов. В лабораторных условиях вирус культивируется путем интрацеребральных пассажей чаще всего на белых мышах и кроликах, а также на культурах клеток фибробластов куриных эмбрионов, почки сайги, Vero, ВНК-21 и др. На культурах клеток вирус размножается без цитопатогенного эффекта. Вирус не устойчив во внешней среде. Лучшими консервантами, при которых вирус сохраняется длительное время (до года и более), является 50%-й глицерин и низкие температуры (-20 °С). При + 23 °С вирус погибает через 28-53 дня, +50 °С - через 1 ч, при +70 °С - мгновенно. Высушивание убивает вирус через 10-14 дней, гниение через 15 дней. Дезинфицирующие средства - 1-5%-й раствор формалина, 5%-й раствор фенола, 3-5%-й раствор соляной кислоты инактивируют вирус через 5-10 мин.

Эпизоотологические данные.

В естественных условиях бешенством болеют главным образом представители семейства собачьих (волки, енотовидные собаки, лисицы, песцы), летучие мыши и грызуны. Из домашних животных чаще поражаются собаки (до 70 %), несколько реже - крупный рогатый скот (до 20 %), еще реже кошки, лошади, мелкий рогатый скот, свиньи. Источником возбудителя инфекции являются больные животные, выделяющие вирус главным образом со слюной. При этом вирус со слюной выделяется уже за 3-8 дней до появления клинических признаков болезни у животного. Вирус от больного животного здоровому передается путем прямого их контакта, в основном через укус, однако заражение возможно и при ослюнении пораженной кожи или слизистых оболочек. Алиментарный и аэрогенный пути заражения в принципе возможны, но не играют существенной роли. Наиболее опасны укусы диких плотоядных животных: волков, лисиц и др. Дикие плотоядные, особенно волки, наносят обычно тяжелые укусы, при которых через слюну происходит инфицирование животных вирусом бешенства. На заражение животных вирусом бешенства влияет и место укуса. Чаще и с более коротким инкубационным периодом заболевают люди, укушенные в область головы, лица и шеи, что объясняется обилием нервных окончаний в этих местах и близостью их от центральной нервной системы. Большую опасность представляют укусы в области кистей рук, а у животных - в кончик хвоста, где также много нервных окончаний. Вирус выделяется в основном со слюной и может отсутствовать в крови, моче, молоке больного животного. Спектр патогенности вируса бешенства тесно связан с его экологией. Различают два типа эпизоотии бешенства: городской и лесной. Бешенство городского типа наблюдается среди собак и других домашних животных в населенных пунктах. Его распространение в значительной степени зависит от наличия достаточного количества безнадзорных собак. При втором типе эпизоотии бешенства возбудитель циркулирует среди диких плотоядных по типу природноочаговой болезни. В последние годы бешенство диких плотоядных стало преобладающим. Основным резервуаром и источником возбудителя инфекции являются рыжие лисицы. Чрезмерному увеличению численности лисиц способствовало истребление их естественных врагов (волков, рысей и др.), увеличение кормовой базы (грызунов) и сокращение объемов охоты на них. Установлено, что средняя плотность популяции лисиц 5 голов и более на 250 га обеспечивает высокий уровень поддержания и распространения эпизоотии бешенства. Крупный рогатый скот и другие сельскохозяйственные животные заражаются в основном на пастбищах, при укусе их бешеными лисицами. Резервуаром возбудителя инфекции при бешенстве следует считать диких плотоядных животных, а в условиях республики ими являются лисы. Быстрая смена их поколений, длительный инкубационный период бешенства у этих животных обеспечивает непрерывность эпизоотического процесса. Весенне-зимние сезонные подъемы заболеваемости бешенством тесно связаны с биологическими циклами активности лис. Первый сезонный подъем совпадает с периодом гона лисиц (как правило, ранняя весна); второй (осень-зима) - связан с расселением молодняка. Возбудитель бешенства иногда выделяется от грызунов, белок, крыс, зайцев, ондатр, хомяков, мышей. Однако роль этих животных в возникновении бешенства окончательно не установлена. Бешенству свойственна цикличность, которая объясняется увеличением, а затем снижением популяции диких плотоядных, особенно лис в течение трех летнего срока. В Америке природные очаги бешенства поддерживаются кровососущими и насекомоядными летучими мышами. В последние годы установлена роль насекомоядных летучих мышей в передаче бешенства и в Европе. Бешенство в последнее время протекает в виде спорадических случаев. Летальность 100 %.

Патогенез. При попадании в организм восприимчивого животного, вирус непродолжительное время находится на месте внедрения, где, по-видимому, не всегда происходит его размножение. Он распространяется центростремительно по нервам, в крови обнаруживается только в экспериментальных условиях, при введении больших доз. По центростремительным нервным волокнам вирус проникает в спинной мозг, а затем в головной. В центральной нервной системе репликация вируса происходит почти исключительно в нейронах. Затем вирус из мозга передвигается по центробежным нервным путям в слюнные железы, где и размножается в нервных узлах. После дегенерации нервных клеток вирус выходит в проток слюнных желез и на поверхность слизистой оболочки рта, контаминирует слюну. Он транспортируется также в ретину и роговую оболочку глаз, парафолликулярные нервные окончания, кожу, легкие, почки, надпочечники, скелетные мышцы, поджелудочную железу, молочные железы и выделяется с молоком. Симптомы заболевания бешенством появляются лишь после распространения вируса по всему организму. Накапливаясь в значительном количестве в ЦНС, вирус повышает ее возбудимость и происходит развитие симптомокомплекса болезни (не-обычное поведение, возбуждение, парезы, параличи). При сильных поражениях ЦНС наступают паралич органов дыхания или сердца и смерть.

Течение и симптомы.

Инкубационный период при бешенстве продолжается от 2-3 недель до нескольких месяцев. У собак бешенство проявляется в двух формах - буйной, которая встречается наиболее часто, и тихой. Первым признаком заболевания является изменение в поведении животного. Собака становится скучной, раздражительной, прячется в темные места или же, наоборот, проявляет неестественную веселость и оживление. Иногда начинает с ожесточением лизать и даже разгрызать место бывшего укуса. Заболевшая собака отказывается от обычного корма, но поедает разные несъедобные предметы (щепки, бумагу, солому и др.). Кроме того, наблюдаются затруднение дыхания, расширение зрачков, судороги мускулатуры глотки и гортани. Глотает животное с трудом, вытягивая шею, лай становится хриплым. В результате расстройства акта глотания отмечается обильное слюнотечение. При буйной форме бешенства резко выражены признаки возбуждения. Собака с неистовством грызет цепь, пол, стены, прутья, норовит сорваться с привязи и убежать. Если собаке удается освободиться, она убегает и во время бродяжничества набрасывается на других собак, животных, человека. При этом кусает молча, без лая и урчания. Период возбуждения сменяется стадией параличей. Наряду с параличом нижней челюсти, глазных мышц и языка развиваются параличи задних конечностей и хвоста. Постепенно параличи распространяются на передние конечности и туловище. При полном истощении и упадке сил собака погибает. Общая продолжительность болезни - 8-11 дней. При тихой, или паралитической, форме бешенства уже в начале болезни у собаки развиваются параличи нижней челюсти, глотки, задних конечностей. Собака не может глотать, и создается впечатление, что она подавилась. Течение болезни быстрое. Смерть обычно наступает через 3-4 суток. В отдельных случаях бешенство у собак может протекать при явлениях острого воспаления желудочно-кишечного тракта (желудочно-кишечная форма). Бешенство диких плотоядных животных протекает почти так же, как и у собак. Волки и лисицы становятся агрессивными, безбоязненными. Даже в дневное время забегают в населенные пункты, набрасываются на людей и животных, нанося им укусы. В конце болезни у них развиваются параличи нижней челюсти и задних конечностей. Бешенство кошек протекает в основном в буйной форме. Кошки прячутся в темное место, постоянно мяукают, очень злы, бросаются на людей и животных, норовя искусать и исцарапать. Аппетит у них извращается, они поедают несъедобные предметы. С развитием болезни наблюдается слюнотечение, появляются параличи глотки, гортани, нижней челюсти, голос становится слабым и хриплым. В дальнейшем развиваются парезы и параличи задних, а также передних конечностей, водобоязнь. Длительность болезни - от 2 до 5 дней. У сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы и козы) бешенство также чаще протекает в буйной форме и характеризуется возбуждением, извращением аппетита, расширением зрачков, обильным слюнотечением. Агрессивность по отношению к чело-веку и животным наблюдается редко. К концу болезни развиваются параличи - сначала гортани и глотки, затем задних и передних конечностей. Смерть наступает на 3-6-й день. При тихой форме бешенства симптомы возбуждения выражены в не-значительной степени, но очень рано развиваются параличи.бешенство этиология патогенез профилактика

Патологоанатомические изменения.

При вскрытии трупов собак, павших от бешенства, обнаруживают: пустой желудок или инородные предметы в нем; венозную гиперемию, кровоизлияния и эрозии в слизистой оболочке желудка; сгущение крови (ангидремия), сухость серозных покровов, подкожной клетчатки и кожи; общий венозный застой: цианоз слизистых оболочек, острую венозную гиперемию печени, легких, селезенки, головного мозга; гисто: негнойный лимфоцитарный энцефалит в стволовой части головного мозга (четверохолмие, варолиев мост, продолговатый мозг); узелки бешенства в стволовой части головного мозга и вегетативных ганглиях; тельца Бабеша-Негри в нервных клетках аммоновых рогов.

Диагностика.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни и главным образом результатов лабораторных исследований головного мозга животных. Наиболее достоверными методами лабораторной диагностики являются обнаружение телец Бабеша- Негри, метод иммунофлуоресценции и биопроба. Одним из основных тестов при диагностике бешенства является метод иммунофлуоресценции (99-100 % совпадение с биопробой). Обычно в практике используют прямой метод иммунофлуоресценции, который проводят с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина. Фиксацию препаратов проводят в течение 4 ч в охлажденном до +8...+10 °С ацетоне. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микроскопе. Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках или вне их. Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают не менее 10 типичных гранул или множество мельчайших точек. Биологическая проба основана на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, главным образом белых мышей. Для биопробы отбирают молодых белых мышей массой 6-8 г. Заражают не менее 5-6 мы-шей. Суспензию исследуемого мозга 1:10 вводят в мозг в объеме 0,02 мл или внутримышечно в объеме 0,2-0,3 мл. Исследуемый материал можно вводить также в кончик носа или в волярную поверхность передней лапки в объеме 0,05 мл. Инкубационный период заболевания при заражении в мозг колеблется от 8 до 14 дней и более. При других способах заражения он несколько длиннее. Заболевание протекает в основном в паралитической форме. Биопроба является самым достоверным методом лабораторной диагностики бешенства. С помощью этого теста удается поставить диагноз в 5-10 % случаев при отсутствии телец Бабеша-Негри. Для обнаружения телец Бабеша-Негри мазки - отпечатки мозга (ам- монов рог) окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие при окраске по Селлерсу четко очерченных овальных или продолговатых гранулярных образований розово-красного цвета, при окраске по Муром-цеву - светло-фиолетовых с темно-синими включениями телец, которые располагаются в протоплазме или вне нервных клеток.

Дифференциальная диагностика.

Необходимо исключить болезнь Ауески, при которой больные животные не агрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломиелите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство.

Иммунитет и специфическая профилактика.

Эффективные методы лечения при бешенстве отсутствуют, поэтому первостепенное значение приобретает специфическая профилактика. Для изготовления антирабических вакцин в настоящее время в различных странах используются следующие аттенуированные штаммы: Парижский штамм Пастера, PV-11 или РМ, CVS, Flury Lep, Flury Hep, Kelev, Era, Sad B-19, Внуково, Щелково-51, C-80,71 БелНИИЭВ-ВГНКИ, КМИЭВ- 94 и др. Репродукцию вируса производят в основном на культурах клеток роллер- ным или суспензионным способами. Чаще используют перевиваемые куль¬туры клеток ВНК-21, Wj-38, MRC-5, Vero, MDBK, почка сайги и др. Все применяемые в профилактике бешенства антирабические вакцины делятся на живые и инактивированные. Инактивированные вакцины - это вакцины, содержащие в своем составе вирус бешенства, инфекционные свойства которого инактивированы одним из химических или физических способов. В качестве адъюванта используют в основном соли алюминия. При введении животным или человеку вакцинный вирус лишен возможности размножаться и действует в организме только как антиген. Эти вакцины наиболее безопасны. Механизм действия живых вакцин основан на том, что ослабленный вирус, размножаясь в организме, воздействует на иммунокомпетентные системы, индуцируя формирование иммунитета.

В настоящее время для парентеральной вакцинации животных в основ-ном применяются инактивированные вакцины. С целью профилактики вакцины вводятся 1-2 раза, в вынужденных случаях после произошедшего инфицирования количество инъекций увеличивается до 5 и более. Про-изводятся они по определенным схемам. Иммунитет наступает через 25-30 дней и сохраняется до года и больше. В странах СНГ для профилактической и вынужденной вакцинации животных применяют отечественные вакцины из штаммов вируса ГЦелково- 51, С-80, 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ, а также вакцины производства Голландии, Франции и других стран. Живые вакцины применяют в основном для оральной вакцинации диких плотоядных против бешенства. Помимо цельновирионных антирабических вакцин в настоящее время применяются высокоэффективная генно-инженерная вакцина, содержащая поверхностный гликопротеин вируса бешенства, и рекомбинантная вакцина на основе вируса оспы. Механизм поствакцинального иммунитета при бешенстве окончательно не расшифрован. Однако доказано, что его напряженность коррелирует с титром вируснейтрализующих антител в крови, для определения которых используется реакция нейтрализации вируса на белых мышах или в культуре клеток, а также метод ELISA.

Мероприятия по профилактике и ликвидации.

Борьба с бешенством осуществляется объединенными усилиями ветеринарной, медицинской и коммунальной служб, органов милиции, лесного хозяйства, охраны при-роды, охотничьих и хозяйственных организаций, местных советов. В систему мероприятий по профилактике бешенства у животных и людей в республике включены следующие основные мероприятия (они изложены по степени важности): 1.Специфическая профилактика сельватического бешенства путем расширения объема пероральной иммунизации диких плотоядных и улучшения качества используемых для этой цели вакцин. Эти мероприятия являются ведущими в профилактике бешенства и используются во всех странах мира. В отдельных государствах мира осуществляют контроль иммунного ответа у диких плотоядных, вакцинированных против бешенства перорально. Оральные вакцины в съедобных приманках распределяют в неблагополучных и угрожаемых по бешенству местностях из расчета 15-20 штук на 1 км2. Опыт ряда стран (Чехия, Швейцария, Франция, Германия) показывает, что при массовом применении в течение ряда лет это мероприятие позволяет значительно снизить или даже ликвидировать заболеваемость животных бешенством. В настоящее время оральная вакцинация диких плотоядных против бешенства начала широко применяться и в Беларуси с использованием вакцин, разработанных и изготавливаемых в БелНИИЭВ из штаммов 71 Бел- НИИЭВ - ВГНКИ и КМИЭВ-94. 2. Уменьшение популяции диких плотоядных, особенно лис, путем их отстрела, обеспечивающее сохранение вида (1-2 особи на 1000 га). Регулирование численности диких плотоядных животных производится путем отстрела, истребления молодняка в логовах, применения приманок со снотворными или отравляющими веществами (люминал, фторацетат бария и др.) и осуществляется охотничьими организациями. Волки должны уничтожаться круглый год. Охота на лисиц, енотовидных собак и других пушных зверей разрешается в определенный сезон. Однако в местностях, где начала распространяться болезнь, на этих животных может разрешаться круглогодичная охота. 3. Борьба с бездомными собаками и кошками путем создания для последних приютов, стерилизации самок и т. д. Отлов и уничтожение безнадзорных собак и кошек, являющихся основными распространителями бешенства в населенных пунктах, осуществляется городскими отделами коммунального хозяйства, при которых организуются специальные бригады. На территории хозяйств эта работа должна проводиться силами и средствами самих хозяйств. Вне населенных пунктов уничтожение безнадзорных собак и кошек производится путем отстрела.