Задачи биотехнологии. Генетическая инженерия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

1. Основные направления и задачи современной биотехнологии

2. Принципы и методы генетической инженерии

Список литературы

1. Основные направления и задачи современной биотехнологии

Биотехнология -- это сознательное производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов и биологических процессов.

С незапамятных времен биотехнология применялась преимущественно в пищевой и легкой промышленности: в виноделии, хлебопечении, сбраживании молочных продуктов, при обработке льна и кож, основанных на применении микроорганизмов. В последние десятилетия возможности биотехнологии необычайно расширились. Это связано с тем, что ее методы выгоднее обычных по той простой причине, что в живых организмах биохимические реакции, катализируемые ферментами, идут при оптимальных условиях (температуре и давлении), более производительны, экологически чисты и не требуют химических реактивов, отравляющих среду.

Объектами биотехнологии являются многочисленные представители групп живых организмов -- микроорганизмы (вирусы, бактерии, простейшие, дрожжевые грибы), растения, животные, а также изолированные из них клетки и субклеточные компоненты (органеллы) и даже ферменты. Биотехнология базируется на протекающих в живых системах физиолого-биохимических процессах, в результате которых осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов метаболизма, формирование химических и структурных компонентов клетки.

Главным направлением биотехнологии является производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферменты, витамины, гормоны), лекарственных препаратов (антибиотики, вакцины, сыворотки, высокоспецифичные антитела и др.), а также ценных соединений (кормовые добавки, например, незаменимые аминокислоты, кормовые белки и т. д.). Методы генетической инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения генетических болезней человека.

Одним из важнейших направлений современной биотехнологии является также использование биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязненной почвы и т. п.).

Так, для извлечения металлов из сточных вод могут широко использоваться штаммы бактерий, способные накапливать уран, медь, кобальт. Другие бактерии родов Rhodococcus и Nocardia с успехом применяют для эмульгирования и сорбции углеводородов нефти из водной среды. Они способны разделять водную и нефтяную фазы, концентрировать нефть, очищать сточные воды от примесей нефти. Ассимилируя углеводороды нефти, такие микроорганизмы преобразуют их в белки, витамины из группы В и каротины.

Некоторые из штаммов галобактерий с успехом применяют для удаления мазута с песчаных пляжей. Получены также генно-инженерные штаммы, способные расщеплять октан, камфару, нафталин, ксилол, эффективно утилизировать сырую нефть.

Большое значение имеет использование методов биотехнологии для защиты растений от вредителей и болезней.

Биотехнология проникает в тяжелую промышленность, где микроорганизмы используются для добычи, превращения и переработки природных ископаемых. Уже в древности первые металлурги получали железо из болотных руд, производимых железобактериями, которые способны концентрировать железо. Теперь разработаны способы бактериальной концентрации ряда других ценных металлов: марганца, цинка, меди, хрома и др. Эти методы используются для разработки отвалов старых рудников и бедных месторождений, где традиционные методы добычи экономически невыгодны.

Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача -- она расширяет и ускоряет масштабы воздействия человека на живую природу и способствует адаптации живых систем к условиям существования человека, т. е. к ноосфере. Биотехнология, таким образом, выступает в роли мощного фактора антропогенной адаптивной эволюции.

У биотехнологии, генетической и клеточной инженерии многообещающие перспективы. При появлении все новых и новых векторов человек с их помощью будет внедрять нужные гены в клетки растений, животных и человека. Это позволит постепенно избавиться от многих наследственных болезней человека, заставить клетки синтезировать необходимые лекарства и биологически активные соединения, а затем -- непосредственно белки и незаменимые аминокислоты, употребляемые в пищу. Используя методы, уже освоенные природой, биотехнологи надеются получать с помощью фотосинтеза водород -- самое экологически чистое топливо будущего, электроэнергию, превращать в аммиак атмосферный азот при обычных условиях.

Задачи, методы и достижения биотехнологии: главной задачей селекционеров в наше время стало решение проблемы создания новых форм растений, животных и микроорганизмов, хорошо приспособленных к индустриальным способам производства, устойчиво переносящих неблагоприятные условия, эффективно использующих солнечную энергию и, что особенно важно, позволяющих получать биологически чистую продукцию без чрезмерного загрязнения окружающей среды. Принципиально новыми подходами к решению этой фундаментальной проблемы является использование в селекции генной (генетической) и клеточной инженерии.

Генная инженерия -- это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных реплицироваться в клетке-хозяине и осуществлять контроль за синтезом необходимых метаболитов. Генная инженерия занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов или вновь синтезированных генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их наследственных свойств.

Для осуществления переноса генов (или трансгенеза) от одного вида организмов в другой, часто очень далекий по своему происхождению, необходимо выполнить несколько сложных операций:

- выделение генов (отдельных фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных. В отдельных случаях эту операцию заменяют искусственным синтезом нужных генов;

- соединение (сшивание) отдельных фрагментов ДНК любого происхождения в единую молекулу в составе плазмиды;

- введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген, в клетки хозяина;

- копирование (клонирование) этого гена в новом хозяине с обеспечением его работы

Клонированный ген путем микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающего или протопласт растения (изолированная клетка, лишенная клеточной стенки) и выращивают из них целое животное или растение. Растения и животные, геном которых изменен путем генно-инженерных операций, получили название трансгенных растений и трансгенных животных.

Уже получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы, в геноме которых работают чужеродные гены различного происхождения, в том числе гены бактерий, дрожжей, млекопитающих, человека, а также трансгенные растения с генами других, неродственных видов.

На сегодняшний день методы генной инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин, интерферон и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения генетических болезней человека -- сахарного диабета, некоторых видов злокачественных опухолей и карликовости соответственно.

Клеточная инженерия -- метод, позволяющий конструировать клетки нового типа. Метод заключается в культивировании изолированных клеток и тканей на искусственной питательной среде в регулируемых условиях, что стало возможным благодаря способности растительных клеток в результате регенерации формировать целое растение из единичной клетки. Условия регенерации разработаны для многих культурных растений, таких как картофель, пшеница, ячмень, кукуруза, томат и др. Работа с этими объектами делает возможным использование в селекции нетрадиционных методов клеточной инженерии, таких как соматическая гибридизация, гаплоидия, клеточная селекция, преодоление нескрещиваемости в культуре и др.

Соматическая гибридизация -- это слияние двух различных клеток в культуре тканей. Сливаться могут разные виды клеток одного организма и клетки разных, иногда очень далеких видов, например, мыши и крысы, кошки и собаки, человека и мыши.

Культивирование клеток растений стало возможным, когда научились с помощью ферментов избавляться от толстой клеточной стенки и получать изолированный протопласт. Протопласты можно культивировать так же, как и клетки животных, обеспечивать слияние их с протопластами других видов растений и получать в соответствующих условиях новые гибридные растения.

Важное направление клеточной инженерии связано с ранними стадиями эмбриогенеза. Например, оплодотворение яйцеклеток в пробирке уже сейчас позволяет преодолевать некоторые распространенные формы бесплодия у человека. У сельскохозяйственных животных с помощью инъекции гормонов удается получить от одной коровы-рекордистки десятки яйцеклеток, оплодотворить их в пробирке спермой породистого быка, а затем имплантировать в матку других коров и таким путем получить от одного ценного экземпляра в 10 раз большее потомства, чем это было бы возможно обычным путем. Культуру растительных клеток выгодно использовать для быстрого размножения медленно растущих растений -- женьшеня, маслинной пальмы, малины, персика и др. Так, при обычном разведении куст малины может дать не более 50 отростков в год, в то время как с помощью культуры клеток можно получить более 50 тыс. растений. При таком разведении иногда возникают растения более продуктивные, чем исходный сорт.

У биотехнологии, генетической и клеточной инженерии многообещающие перспективы. Внедрение нужных генов в клетки растений, животных и человека позволит постепенно избавиться от многих наследственных болезней человека, заставить клетки синтезировать необходимые лекарства и биологически активные соединения, а затем -- непосредственно белки и незаменимые аминокислоты, употребляемые в пищу. Используя методы, уже освоенные природой, биотехнологи надеются получать с помощью фотосинтеза водород -- самое экологически чистое топливо будущего, электроэнергию, превращать в аммиак атмосферный азот при обычных условиях.

Биотехнология -- это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Основными направлениями биотехнологии являются: производство биологически активных соединений (витаминов, гормонов, ферментов), лекарственных препаратов и других ценных соединений, разработка и использование биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды, создание новых полезных штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород животных и т.д. Решению этих сложных задач способствуют методы генной и клеточной инженерии.

2. Принципы и методы генетической инженерии

биотехнология генетический инженерия клеточный

Задачей генетической инженерии является выделение отдельных генов, их молекулярное клонирование и создание рекомбинантной ДНК - искусственной комбинации из генов и различных промоторов. Далее обычно пытаются обнаружить экспрессию этих генов, т. е. транскрипцию и трансляцию. Рассмотрим сначала первый этап этой работы - выделение и клонирование генов. Инструментами в этой работе, как уже говорилось, служат особые ферменты, которые получают из самых различных источников - бактерий, клеток млекопитающих и птиц, выращиваемых в культуре и зараженных разными вирусами, и т.д. В основном используют три вида ферментов: рестриктазы, лигазу и обратную транскриптазу.

Рестриктазы - это разновидность дезоксирибонуклеаз, ферментов, разрезающих ДНК на короткие или длинные отрезки или даже на отдельные нуклеотиды. Особенность рестриктаз состоит в том, что они разрезают ДНК не в любом месте, а только между определенными нуклеотидами в участке со строго характерной для каждой рестриктазы последовательностью нуклеотидов. Обычно это 4-6 пар нуклеотидов, но разные рестриктазы отличаются именно порядком нуклеотидов в месте разреза. Например, рестриктаза ЕcoR1 расщепляет-ДНК в участке ГААТТЦ, а рестриктаза BamH1 - в участке ГГАТЦЦ. Сейчас известно более сотни различных последовательностей, которые "узнаются" различными рестрнктазами. При случайном распределении нуклеотидов вдоль ДНК вероятность нахождения последовательности из четырех определенных нуклеотидов составляет 1/256, а из шести - 1/4096. Поэтому рестриктазы разрезают ДНК на куски, состоящие из нескольких сотен или тысяч пар нуклеотидов.

Лигаза - фермент, сшивающий свободные концы ДНК между собой. Этот фермент в нормальных клетках участвует в синтезе ДНК и в процессах ее репарации, т. е. восстановления нормальной структуры ДНК после ее частичного повреждения.

Обратная транскриптаза - фермент, аналогичный ДНК-полимеразе, но синтезирующий ДНК не на ДНК, а на РНК. Этот фермент по сравнению с РНК-полимеразой работает как бы в обратном направлении, т. е. не от ДНК к РНК, а от РНК к ДНК. Есть ли обратная транскриптаза в нормальных клетках и происходит ли в них синтез ДНК на РНК - вопрос спорный и пока еще окончательно не решенный. Но этот фермент появляется в клетках эукариот при заражении их вирусами, содержащими РНК и размножающимися через ДНК. Геном этих вирусов кодирует обратную транскриптазу, с помощью которой образуется вирусная ДНК-матрица, на которой затем происходит синтез многих молекул вирусных РНК.

Первый этап клонирования какого-либо гена - получение "библиотеки" генов и отыскание в ее составе нужного нам гена, например гена человека, кодирующего один из глобинов - белков, образующих в эритроцитах гемоглобин. Получение "библиотеки" генов начинается с разрезания изучаемой ДНК (в нашем примере ДНК человека) на множество фрагментов. Число таких фрагментов зависит от выбранной рестриктазы. Для того, чтобы получить фрагменты, содержащие отдельные гены, нужно разрезать ДНК на несколько десятков или даже сотен тысяч фрагментов. Чтобы отделить гены друг от друга, используют плазмиды, в составе которых фрагменты ДНК вводятся в другие клетки, обычно бактериальные. Такую плазмиду-переносчик называют вектором.

В качестве вектора обычно выбирают плазмиду, в которой содержится ген устойчивости к антибиотику, например ампицилину, к которому очень чувствительна кишечная палочка Е. coli. Такую плазмиду разрезают с помощью рестриктазы в одном определенном месте, смешивают со смесью фрагментов ДНК человека и добавляют лигазу, которая вновь сшивает разрезанные концы. Во многих случаях лигаза просто замыкает плазмиду снова в кольцо, но достаточно часто она сшивает свободные концы фрагментов ДНК со свободными концами ДНК плазмиды. В результате возникает множество кольцевых плазмид, в которые встроены различные фрагменты ДНК человека. Где-то среди них окажется и нужный нам ген одного из глобинов.

Затем этими плазмидами "заражают" кишечную палочку или другой вид клеток. Клетки высевают на питательную среду так, чтобы каждая бактериальная клетка лежала отдельно от других и могла образовать собственную колонию. Такие колонии не образуют бактерии, в которых не оказалось плазмиды, так как в среду добавляют тот самый антибиотик (ампицилин), от которого плазмида защищает. Но в некоторых бактериях окажутся те плазмиды, в которые никакой фрагмент ДНК не встроился. Такие колонии тоже удается исключить, так как включение чужих генов уменьшает устойчивость к другому антибиотику (тетрациклину), и далее выращивают только эти чувствительные колонии.

Каждая колония, образованная из одной бактериальной клетки, будет содержать только один вариант плазмид с каким-то одним фрагментом ДНК человека - тем, который случайно оказался в составе плазмиды, попавшей в исходную бактерию. Но так как колоний образуется очень много (обычно десятки тысяч), то в них в принципе должны быть представлены по отдельности все фрагменты ДНК, т. е. в нашем случае все гены человека. Конечно, такая "библиотека" получается в идеале. На самом же деле во многих плазмидах будут только фрагменты участков, не содержащие генов, в некоторых окажется только часть гена или два гена (это зависит от выбора рестриктазы). Но есть основания ожидать, что одна или несколько колоний будут содержать как раз ту плазмпду, в которую попал нужный нам ген в целом виде.

Хотя из такой "библиотеки" в принципе можно получить все гены человека, для этого нужно уметь их выделить, т. е. каждый раз отличить нужную нам колонию от всех остальных. Существуют различные способы выявления. Рассмотрим самый простой, пригодный как раз для глобиновых генов. Не очень сложно получить молодые клетки крови, будущие эритроциты, в которых очень интенсивно идет синтез глобинов, и глобиновая мРНК составляет более 80% всей мРНК. Если молекулы этой мРНК гибридизовать с ДНК бактерий, она образует гибрид только с той колонией, в которой оказался фрагмент ДНК, содержащий ген глобина. Гораздо чаще это делают иначе, через радиоактивно-меченую ДНК. Для этого мРНК глобина выдерживают вместе с обратной транскриптазой и радиоактивными нуклеотидами, так что синтезируется радиоактивная ДНК, являющаяся комплементарной копией мРНК. Такую ДНК называют кДНК. Радиоактивную глобиновую кДНК гибридизуют с разрушенными бактериями. В результате те очень немногие колонии, в которых гибридизация произойдет, легко обнаружить по их радиоактивности. Это и есть нужная нам колония, содержащая ген глобина человека.

После того как обнаружат колонию бактерий, содержащих плазмиду с нужным нам геном, его можно неограниченно клонировать. Для этого штамм бактерий размножают, выделяют из них плазмидную ДНК, а из нее (опять с помощью рестриктаз) - встроенный ген. Первую и еще не самую трудную часть работы на этом можно считать выполненной. Оставшуюся "библиотеку" можно использовать для выделения из нее других генов. Клонированный ген можно затем использовать в различных целях, например для его подробного изучения. Во многих работах гены подвергают секвенированию, т.е. изучению в них последовательности нуклеотидов. Такие данные очень нужны для сравнения с последовательностью нуклеотидов в аналогичных генах других животных или с другими генами, чтобы обнаружить их общее эволюционное происхождение.

Нам сейчас важнее рассмотреть другое - попытки заставить клонированный ген работать в бактериальной клетке. Работа гена, называемая экспрессией, состоит из транскрипции и трансляции. В самом простом случае фрагмент ДНК, содержащий ген, включает также и его регуляторную часть. Казалось бы, теперь можно ожидать, что транскрипция такого гена окажется возможной. Однако для генов эукариот такая возможность маловероятна, так как в бактериях нет тех регуляторных белков, которые способны включать эукариотические гены. Поэтому нужно удалить весь регуляторный участок эукариотического гена и заменить его на регуляторный участок бактериального гена или проще разрезать бактериальную ДНК на границе гена и промотора и вставить туда ген эукариот. Все эти манипуляции осуществляются также с помощью рестриктазы, способной разрезать ДНК в нужном месте, и лигазы, сшивающей места разреза. Так создают кольцевую ДНК, в которой соседствуют участки ДНК разного происхождения - плазмидного и человеческого. Такие ДНК называют рекомбинантными.

Конструирование хорошего промотора обеспечивает только первую часть экспрессии гена - его транскрипцию, т. е. синтез РНК. Но не менее важно обеспечить и вторую часть экспрессии - трансляцию, т. е. синтез белка. Здесь препятствием может оказаться отличие бактериальных рибосом от эукариотических. Дело в том, что не вся молекула мРНК кодирует последовательность аминокислот в белке. Ее начальный короткий участок служит для прикрепления к рибосоме, и для этого в нем имеется особая последовательность из нескольких нуклеотидов. Эта последовательность оказалась различной у эукарнот и у прокариот. Поэтому приходится помещать ген эукариот, который мы изучаем, после того участка бактериального гена, который важен для начала трансляции. Наконец, есть еще одно важное препятствие - неспособность бактерий к сплайсингу, т. е. вырезанию из только что синтезированной РНК эукариот тех некодирующих участков, которые были считаны с интронов. Один из путей преодоления этого препятствия - использование не настоящего гена, а его кДНК. Как уже говорилось, если взять мРНК, прошедшую сплайсинг, т.е. уже без интронов, и подвергнуть ее действию обратной транскриптазы, то синтезируется кДНК (копия гена эукарнот, но лишенная интронов). Экспрессия такого гена не нуждается в сплайсинге.

Предлагается также использовать для экспрессии клетки не бактерий, а эукариот, например дрожжей. Действительно можно поместить клонированный ген в плазмиду дрожжей и ввести его в эти простейшие, но все же эукариотические клетки, обладающие, в частности, ферментами сплайсинга. Однако пока попытки такого рода оказались неудачными - сплайсинг у дрожжей действительно есть, но он, очевидно, происходит иначе, чем у высших эукариот. Поэтому РНК, считанная с генов млекопитающих, в дрожжах правильного сплайсинга не проходит.

Все эти опыты легче вести тогда, когда существует способ отбора бактериальных клеток, в которых встроенный ген экспрессируется, от тех, в которых такой экспрессии почему-либо не происходит. Примером такого исследования служат опыты, в которых использовали фермент человека - дегидрофолатредуктазу. Этот фермент необходим для нормального синтеза нуклеиновых кислот. Однако существует ингибитор метотрексат, который этот фермент подавляет. Оказалось, что если взять кДНК с мРНК этого фермента и ввести его с плазмидой в бактериальную клетку, а в среду добавить немного ингибитора, то расти и делиться будут только те клетки, где синтез фермента так активен, что малые дозы ингибитора его подавить не могут. В результате отобрались лишь те клетки бактерий, где экспрессия гена человека была особенно интенсивной.

Трудности, связанные с экспрессией эукариотических генов в бактериальных клетках, заставляют исследователей искать иные пути и среди них - использование клеток млекопитающих в культуре ткани. Конечно, работать с ними намного сложнее, и первоначально клонировать гены все равно приходится в кишечной палочке с использованием бактериальных векторов - плазмид. Но зато потом удается ввести клонированный ген в клетки млекопитающих, например, путем микроинъекций. В другом варианте клонированные гены тоже путем микроинъекций вводят в яйцеклетки млекопитающих и из них выращивают целых животных, в геном которых встроены (интегрированы) клонированные гены. До сих пор это были только мыши, но сейчас уже получены кролики, свинки, овцы, в геном которых интегрированы чужеродные гены. Таких животных называют "трансгенными". Ниже мы расскажем о тех опытах, в которых удалось успешно интегрировать в геноме мыши ген гормона роста крысы и получить синтез больших количеств гормона, который заметно увеличивал рост мышей. Экспериментаторам удалось найти для растений несколько плазмид, которые могут проникать из клеток особых бактерий в растительные клетки. Кроме плазмид, используют и другие векторы - переносчики генов. Иногда это вирусы эукариот или фаги бактерий. Есть попытки использовать для этой цели ДНК из митохондрий или хлоропластов - клеточных частиц, ответственных за энергетику и фотосинтез и имеющих собственную кольцевую ДНК.

Мы рассмотрели здесь только основные принципы методов генетической инженерии. Эти методы имеют множество вариантов, которые разрабатываются в десятках и сотнях лабораторий во многих странах мира и в нашей стране. Задача этих исследований - изучение строения генов и механизмов регуляции их экспрессии. Но многие из приемов генетической инженерии нашли свое применение и в практических целях для разработки новой биотехнологии.

Список литературы

1. Общая биология: Учебное пособие для 11-го класса

2. Сельскохозяйственная биотехнология (учебник). Под редакцией В.С. Шевелухи. М.Высшая школа, 2002; Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Миронова О.Ю. и др.

Электронные источники:

1. http://bonoesse.ru/blizzard/A/Posobie/Genetik/principy_i_metody_geneticheskoj_inzhenerii.html

2. http://jbio.ru/biotexnologiya-osnovnye-napravleniya-i-dostizheniya

3. http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article715

Размещено на Allbest.ru