Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України ЛУК'ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, м. Луганськ, завідувач кафедри фармакології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор ЯРОШ Олександр Кузьмич, Державна установа «Інститут фармакології та токсикології» АМН України, м. Київ, керівник відділу фармакокінетики

доктор медичних наук, професор СТЕПАНЮК Георгій Іванович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри фармакології

Захист дисертації відбудеться “19” грудня 2007 р. о 15⁰⁰ годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Державній установі «Інституті фармакології та токсикології» АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Державної установи «Інституті фармакології та токсикології» АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Данова І.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В XX1 столітті проблема закритої черепно-мозкової травми (ЗЧМТ) набуває свого нового медико-соціального значення. В загальній структурі травматизму пошкодження центральної нервової системи складають до 30-40%, а серед причин інвалідізації населення - 25-30% (И.А. Кустов, 2002, И.В. Куршакова и соавт., 2003). ЗЧМТ, як найбільш поширена форма травматичної хвороби головного мозку (ТХГМ), є однією з основних причин смертності та інвалідізації, особливо людей у віці до 35 років (Ю.В. Зотов, В.И. Сидоренко, 1996, А.Н. Коновалов и соавт., 2001).

Клінічна і соціальна значимість ЗЧМТ визначається не тільки частотою, але і різноманіттям посттравматичних ускладнень різної тяжкості, що призводять до інвалідізації більше 100 тисяч населення щорічно, причому 40-60% з них визнаються інвалідами I і II груп (Н.С. Немченко, 2001, В.Т. Квасов, Н.А. Кудрина, 2004, А.П. Энглези и соавт., 2005).

Дуже важливо, що ЗЧМТ є однією з провідних причин травматизації дитячого населення. За даними епідеміологічних досліджень, проведених в США, Ізраїлі, Норвегії і Франції число випадків ЗЧМТ серед дітей у віці до 14 років щорічно складає 180 на 100 тис. населення (Е.К. Гуманенко и соавт., 2004, В.С. Сухоруков, 2002).

Рішення проблеми ЗЧМТ особливо актуальне для промислового регіону Донбасу, де нерідко мають місце виробничі аварії та катастрофи на вугледобувних підприємствах, на яких частота травматизму із смертельним результатом в 7 разів вище, ніж в інших галузях промисловості (М.К. Штатнов и соавт., 2000, Т.П. Бойко и соавт., 2002, Б.В. Задорожна, 2004, В.С. Мякотных и соавт., 2005).

В інтенсивній фармакотерапії ТХГМ використовується безліч ліків з різних фармакологічних груп. Разом з тим, не дивлячись на величезний медикаментозний арсенал, що застосовується в інтенсивній терапії ЗЧМТ, смертність хворих при даному екстремальному стані, як і раніше, залишається вельми високою (A.I.Qureshi et al., 1999, С.Ю. Мамчур и соавт., 2001, И.В. Молчанов, 2002, J.B. Redell et al., 2003, А.А. Шандра, Л.С. Годлевский, 2005). Слід підкреслити, що всі вживані при ЗЧМТ препарати застосовуються в комбінованій терапії, що свідчить про їх недостатню монотерапевтичну ефективність, з одного боку, а з іншого - про наявність певних побічних ефектів, що обмежують їх використання, особливо в умовах поліпрагмазії, коли різко зростає небезпека розвитку синдрому взаємодії ліків, що може привести до зниження ефективності лікування (R.Bauer, H.Fritz, 2004, D.K. Menon et al., 2005).

У зв'язку з цим, доцільність розробки нових методичних підходів з оптимізації інтенсивної фармакотерапії ЗЧМТ представляється необхідною і своєчасною. Найбільш раціональним в цьому плані слід вважати пошук та вивчення засобів фармакокорекції порушень при ЗЧМТ серед ліків, що відрізняються багатогранністю фармакодинамічних ефектів та відносною нешкідливістю.

До такого роду препаратів відноситься б-ліпоєва кислота, яка володіє багатовекторністю фармакодинаміки й унікальністю фармакокінетичних характеристик, що сприяє одночасному впливу на декілька різних клінічно вагомих ланок патогенезу ТХГМ.

Політропність фармакологічних ефектів б-ліпоєвої кислоти обумовлена, головним чином, її впливом на такі основні види обміну речовин як енергетичний (Л.В. Козлова, И.Л. Алимова, 2004), вуглеводний (S. Jacob, 1999, S. Ramrath, 1999), ліпідний (Aruvazhagan P. et al., 2000), білковий (Y. Kishi et al., 1999). Разом з тим, вельми цінними фармакологічними властивостями б-ліпоєвої кислоти, в плані реалізації її церебропротекторної активності при ЗЧМТ, є здатність проявляти антирадикальну (A. Marmarou et al., 2000), антиоксидантну (D. Bonnefont-Rousselot, 2001, В.М. Хворостінка та співавт., 2004), протигіпоксичну і протиішемічну (M. Pander , S.J. Flora, 2002) дії.

Таким чином, наявний широкий спектр фармакологічних ефектів б-ліпоєвої кислоти повною мірою узгоджується з основними ланками патогенезу ЗЧМТ, що і слугувало теоретичним обґрунтуванням доцільності вивчення даного препарату в якості потенційного засобу фармакологічного церебрального захисту в умовах цього екстремального стану.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках запланованої НДР кафедри фармакології Луганського державного медичного університету (ЛугДМУ) за темою: «Пошук та розробка засобів фармакокорекції екстремальних киснедефіцитних станів» (№ держ. реєстрації 0103U005539, 2004-2008 рр.).

Мета та задачі дослідження. Мета дослідження - обґрунтувати патогенетичну доцільність застосування б-ліпоєвої кислоти та з'ясувати нові сторони її фармакодинаміки і особливості фармакокінетики на моделі ЗЧМТ.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1. Вивчити в динаміці вплив б-ліпоєвої кислоти на стан антирадикальної та антиоксидантної систем захисту організму у тварин із ЗЧМТ.

2. Оцінити здатність б-ліпоєвої кислоти регулювати енергетичний гомеостаз, зокрема, баланс аденілових нуклеотидів, а також вуглеводний обмін у тварин за умов ЗЧМТ.

3. Дослідити детоксикуючу активність б-ліпоєвої кислоти при ендогенній інтоксикації в умовах форми травматичного пошкодження головного мозку, що моделюється.

4. Вивчити фармакокінетику б-ліпоєвої кислоти у інтактних щурів та на моделі ЗЧМТ в умовах інтраперітонеального введення.

Об'єкт дослідження - б-ліпоєва кислота в умовах травматичного пошкодження головного мозку.

Предмет дослідження - фармакодинаміка й -кінетика б-ліпоєвої кислоти при ЗЧМТ.

Методи дослідження - комплексний методичний підхід з використанням фармакологічних, біохімічних, біофізичних, фізико-хімічних та статистичних досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше теоретично обгрунтовано та експериментально доведено доцільність застосування і фармакотерапевтичну ефективність засобу з політропними фармакологічними властивостями в ранньому посттравматичному періоді ЗЧМТ. На оригінальній експериментальній моделі ТХГМ вперше встановлено, що ключовим механізмом цереброзахисної дії б-ліпоєвої кислоти є її здатність більш ефективно, ніж референтний препарат - пірацетам, регулювати прооксидантно-антиоксидантну рівновагу, в основі чого лежить реалізація антиоксидантної активності у поєднанні з виразним антирадикальним ефектом.

Отримані нові дані щодо впливу потенційного церебропротектора, що застосовується з лікувальною метою, на енергетичний гомеостаз, зокрема на стан пулу аденілових нуклеотидів, обміну вуглеводів у тварин з травматичним пошкодженням головного мозку.

Вперше проведено фармакокінетичний аналіз б-ліпоєвої кислоти у щурів із ЗЧМТ у порівнянні з інтактною серією на всіх етапах проходження препарату в організмі: абсорбції, біотранспорту, розподілу по органах і тканинах, біотрансформації та екскреції.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обгрунтований підхід до лікування посттравматичних пошкоджень за умов ЗЧМТ за допомогою засобу метаболічної дії з багатовекторною фармакодинамікою - б-ліпоєвої кислоти.

За матеріалами дисертації отримано 2 деклараційні патенти України на корисну модель: № 13678 «Спосіб моделювання черепно-мозкової травми», №18120 «Спосіб фармакокорекції закритої черепно-мозкової травми -ліпоєвою кислотою», також видано інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я № 10 (Луганський ЦНТЕІ, 2007 р.).

Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Івано-Франківського, Одеського і Тернопільського державних медичних університетів.

Отримані дані можуть слугувати експериментальним обґрунтуванням для клінічних досліджень з оптимізації фармакотерапії ТХГМ.

Особистий внесок дисертанта. Автором самостійно сформульовані мета та задачі, визначені напрямки, об'єм та методичні підходи дослідження, проведений патентно-інформаційний пошук з використанням серверів Yandex, Alta Vista, Rambler, Google, а також медичної бази даних Medline мережі Інтернет.

Всі етапи експериментального дослідження, включаючи аналіз і узагальнення даних, статистичну обробку отриманих результатів, розробку основних положень роботи, її висновків, а також написання огляду літератури автором проведено особисто.

Співавтори опублікованих робіт надавали консультативну допомогу з методичних і теоретичних питань.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися й одержали позитивну оцінку на: ІІ Науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів «Актуальні проблеми фармакології та токсикології» (Київ, 2005); All-Ukrainian scientific-applied conference for students, young scientists and interns «Actual problems of fundamental medicine». (Lugansk, 2005); Всеукраїнській науково-практичній конференції «Актуальные вопросы биологии, медицины и фармации» (Луганськ, 2006); XI Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Полтава-Київ-Чикаго, 2006); ІІІ Національному з'їзді фармакологів України «Фармакологія 2006 - крок у майбутнє» (Одеса, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, молодих вчених та інтернів «Досягнення фундаментальної та прикладної медицини» (англійською мовою) (Луганськ, 2007), VI Всеукраїнській науково-практичній конференції «Клиническая фармация в Украине» (Харків, 2007), 76 Міжвузівській науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю “Працюємо, творимо, презентуємо” (Івано-Франківськ, 2007), Межнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Актуальні проблеми клінічної, експериментальної та профілактичної медицини» (Донецьк, 2007), Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання фармакології» (Вінниця, 2007), Міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених “Актуальні питання в сучасній медицині” (Харків, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 18 наукових робіт, з них 4 статті в наукових спеціалізованих журналах, затверджених ВАК України, а також 11 тез доповідей на наукових форумах різних рівнів. Отримано 2 деклараційні патенти України на корисну модель, а також видано 1 інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я.

Об'єм та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження», 4 розділів власних досліджень, розділу «Аналіз та узагальнення отриманих даних», висновків, списку використаних джерел, який включає 206 вітчизняних та 176 закордонних джерел. Робота викладена на 206 сторінках машинописного тексту (141 стор. основного тексту), ілюстрована 29 рисунками і 21 таблицею.

енергетичний гомеостаз черепний травма

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження виконані на 776 білих безпородних статевозрілих щурах обох статей масою 160-200 г в лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 41 від 30.05.2002 р. та № 07 від 29.09.2005 р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ЛугДМУ (протокол № 11 від 28.03.07).

В експериментах використовувались тварини після проходження 14-денного карантину в умовах віварію ЛугДМУ. Всі щури знаходилися на стандартному харчовому раціоні (гранульований корм) із вільним доступом до води.

Методичні принципи і методи, які використано в роботі, виконані згідно рекомендацій та вказівок ДФЦ МОЗ України.

Експериментальною моделлю слугував патологічний процес, що розвивається на тлі ЗЧМТ, відтвореної за допомогою спеціального пристрою за модифікованим на кафедрі фармакології способом, який полягає в нанесенні дозованого за силою та орієнтованого за локалізацією удару вантажем масою 45 г, що вільно падає з висоти 80 см на тім'яну область черепа щура, зафіксованого в удосконаленій камері Когана.

Досліди проводилися на 4-х групах тварин: інтактній, контрольній, дослідній та референтній. Щурам дослідної серії через 30 хвилин після травматичного пошкодження головного мозку та щоденно на протязі всього експерименту (6 діб) 1 раз на добу в ранкові години внутрішньоочеревинно вводили потенційний церебропротектор - б-ліпоєву кислоту (виробництво Одеського ДП «Біостимулятор») в дозі 100 мг/кг у вигляді 0,5% водного розчину. В якості препарату порівняння використовували пірацетам (виробництво «Фармак», Україна), який тварини референтної групи отримували у вигляді 20% водного розчину в дозовому режимі, аналогічному б-ліпоєвій кислоті. Контрольній серії щурів вводили в вищезазначеному режимі дозування еквіоб'ємну кількість фізіологічного розчину натрію хлориду.

Всі дослідження проводили в динаміці: через 1, 3 та 6 діб від початку нанесення дозованого удару в наступних біосубстратах: цільній крові, сироватці крові та корі головного мозку.

Антирадикальну активність б-ліпоєвої кислоти на моделі ЗЧМТ вивчали за допомогою біохемілюмінісценції (БХЛ), яку реєстрували на люмінометрі “Emillite-1105” спільного австро-німецько-російського виробництва в сироватці крові та в гомогенаті кори головного мозку щурів. Кінетику БХЛ оцінювали за амплітудою швидкого спалаху (I₁), амплітудою повільного спалаху (I₂), часом індукції повільного спалаху (ф), амплітудою кінцевого значення інтенсивності надслабкого світіння (I_k), а також загальною світлосумою реакції (S). Розрахунок досліджуваних параметрів проводили з використанням спеціально розробленої на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп'ютерної програми на базі процесора Intel Pentium-IV - 450 MHz⁾.

Стан окисного гомеостазу в умовах форми ТХГМ, що моделюється, оцінювали за активністю основних компонентів ферментативної (супероксиддисмутази (СОД) (В.А.Костюк та співавт., 1990) і каталази (М.А.Королюк та співавт., 1988) та вмістом компонентів неферментативної (вільних SH-груп (G.L. Ellman, 1959) і глутатіону відновленого (J.Sedluk, H. Lindsay, 1969) ланок антиоксидантної системи (АОС) захисту організму. Ступінь забезпеченості організму ендогенними антиоксидантами аналізували шляхом дослідження перекисної резистентності еритроцитів (О.Г. Архипова, 1988), а також визначали фактор антиоксидантної активності, який розраховували як частку від добутку активності СОД та каталази на рівень кінцевих продуктів ліпідпереокислення, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою - ТБК-реактантів (Л.П. Купраш та співав., 2000).

Інтенсивність процесів перекисного окислення білків (ПОБ) визначали за рівнем ранніх - альдегідфенілгідразонів (АФГ) при л=270 нм та пізніх - кетондинітрофенілгідразонів (КФГ) при л=363 нм маркерів ПОБ, здатних кількісно реагувати з 2,4-динітрофенілгідразином, утворюючи 2,4-динітрофенілгідразони (І.В. Сидорова та співавт., 2005).

Вміст нітритів визначали за реакцією Гріса (С. Chiueh, 1994).

Оцінку стану енергетичного гомеостазу в досліджуваних умовах експерименту проводили шляхом визначення концентрації АТФ, АДФ і АМФ в еритроцитах методом тонкошарової хроматографії на силікагелевих пластинах фірми «Merk» (Німеччина) (Н.Б. Захарова, В.И. Рубин, 1980). На підставі отриманих даних розраховували показники, що характеризують стан енергетичного обміну при застосуванні б-ліпоєвої кислоти за умов ЗЧМТ: енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), порівняльний коефіцієнт (К_пор), індекс фосфорилювання (ІФ), термодинамічний контроль дихання (ТКД) та ступінь фосфорилювання (СФ) (Д. Мецлер, 1980, В.Д. Лук'янчук, Л.В. Савченкова, 2000).

Концентрацію фосфора неорганічного (Ф_н) ідентифікували за допомогою біохімічного набору «Філісіт-діагностика», Україна.

Активність ферментів енергетичного обміну (лактатдегідрогенази, креатинкінази) оцінювали в сироватці крові за допомогою біохімічних наборів фірми «Філісіт-діагностика», Україна.

Рівень глюкози визначали за допомогою біохімічних наборів фірми «Філісіт-діагностика». Вміст глікогену оцінювали колориметричним методом з орцином (А.А. Покровский, 1964). Концентрацію лактату та пірувату ідентифікували за допомогою неферментативної методики в одній пробі (И.Г. Герасимов, Е.Н. Плаксина, 2000). При цьому розраховували окислювально-відновний потенціал (ОВП) системи молочна-піровіноградна кіслоти (М.Е. Райскина, 1974).

Вплив б-ліпоєвої кислоти на процеси стомлюваності та тривожності у щурів з ТХГМ оцінювали в момент встановленого піка розвитку синдрому ендогенної інтоксикації (В.Д. Лук'янчук та співавт., 2006) за наступними функціональними тестами: біг на тредбані (А.В. Фомичев, 2004) і тест «підвішування за хвіст» (L. Stern та співавт., 1985, А.В. Калуев, 1998).

Порівняльну клінічну оцінку перебігу посттравматичного періоду на тлі застосування б-ліпоєвої кислоти та референтного засобу здійснювали за модифікованим методом S. Irvin (Л.И. Бугаева и соавт., 2000).

З метою оцінки ступеня виразності посттравматичної ендогенної інтоксикації визначали концентрацію її основних маркерів - молекул середньої маси (МСМ) з використанням спектрофотометричного аналізу (Ю.В. Первушин, Т.П. Бондар, 1993).

Про стан детоксикуючої системи печінки у досліджуваних умовах експерименту судили за активністю НАДФ·Н-залежної монооксигеназної системи печінки. Для цього вивчали процеси метаболізму амідопірину, інтенсивність яких аналізували за екскрецією його основних метаболітів (4-аміноантипірину (4-ААП), N-ацетил-4-аміноантипірину (N-ацетил-4-ААП) нирками з сечею (О.В. Леоненко, Т.А. Попов, 1981), а також визначали тривалість тіопенталового сну, при внутрішньоочеревинному введенні вказаного барбітурату у вигляді 1% водного розчину в дозі 35 мг/кг (І.Я. Коцюмбас, 2006).

Фармакокінетику б-ліпоєвої кислоти вивчали шляхом визначення її концентрації (В.Д. Лук'янчук та співав., 2005) у сироватці крові, корі головного мозку, печінці, нирках, сальнику, серці і м'язах щурів, які отримували препарат на тлі травматичного пошкодження головного мозку. Фармакокінетичні параметри вивчали в динаміці: через 15, 30, 60 і 80 хвилин з моменту одноразового введення б-ліпоєвої кислоти в дозі 100 мг/кг.

На підставі одержаних в експерименті даних, за допомогою затвердженої ДФЦ МОЗ України комп'ютерної програми (Н.Я. Головенко та співавт., 1999) розраховували параметри, що характеризують різні етапи проходження б-ліпоєвої кислоти в організмі: константу швидкості абсорбції (К₀₁), константу швидкості масопереносу з центральної камери в периферичну (К_1i), період напівабсорбції (t_1/2,а)_, максимальну концентрацію (С_mах), час досягнення максимальної концентрації (t_max); загальний об'єм розподілу (V_d), уявну початкову концентрацію (С₀), період напіврозподілу (t_1/2,б), площу під фармакокінетичною кривою (AUC), тканинну біодоступність (f), константу швидкості елімінації (К_еl), константу швидкості масопереносу з периферичної камери в центральну (К_i1), період напівелімінації (t_1/2), середній час перебування препарату в організмі (MRT), загальний кліренс препарату (Cl_t).

Вплив б-ліпоєвої кислоти на зв'язуючу здатність сироваткових білків при ЗЧМТ визначали за допомогою методу рівноважного діалізу (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984). Параметри, що характеризують процес зворотного зв'язування - константу асоціації (К_ас) і число місць зв'язування (N) обчислювали за комп'ютерною програмою, розробленою на нашій кафедрі (Кравец Д.С., 2000; В.Д.Лук'янчук та співавт., 2004).

Одержані дані оброблені статистично загальноприйнятими методами з використанням програми Statgraf, оцінюючи вірогідність на рівні значущості не менше 95% (Р<0,05) з використанням критерію t Стьюдента, а також непараметричного критерію U (Уілкоксона-Манна-Уітні) (С. Гланц, 1999).

Результати досліджень та їх обговорення. На першому етапі дослідження церебропротекторної активності б-ліпоєвої кислоти вивчали її вплив на стан процесів антирадикальної та антиоксидантної систем захисту організму в динаміці у тварин із ЗЧМТ. При цьому встановлено, що досліджуваний потенційний церебропротектор реалізує свою антирадикальну активність за рахунок суттєвого пригнічення інтенсивності вільнорадикальних ланцюгових реакцій шляхом зменшення І₁, І₂, І_к, S та збільшення ф як в сироватці крові, так і в корі головного мозку щурів із ТХГМ.

Крім того, б-ліпоєва кислота здатна пригнічувати ПОБ в умовах травматичного пошкодження головного мозку за рахунок зниження вмісту АФГ та КФГ при спонтанному окисленні білків в сироватці крові - в середньому на 58,5 і 47,6 %, відповідно, та в мозковій тканині - в 2,4 і 2,0 рази, а в разі індукованого ПОБ в сироватці крові - на 53,6 і 48,2 %, в корі головного мозку - на 46,5 і 42,7 % (рис. 1).

У підтвердження даних БХЛ-метрії свідчить також виявлена в експерименті здатність б-ліпоєвої кислоти знижувати рівень основного метаболіту оксиду азоту - нітрит-іону (NOП₂) в обох досліджуваних біосубстратах.

Враховуючи, що стан прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу організму підтримується за рахунок функціонування АОС, вивчали вплив б-ліпоєвої кислоти на рівень і активність основних її компонентів у щурів за умов форми ТХГМ, що моделюється. Показано, що застосування потенційного церебропротектора істотно попереджує інактивацію основних ферментів АОС захисту організму - СОД, в середньому в 1,8 і 1,6 рази, та каталази - в 2,0 і 1,7 рази в сироватці та корі головного мозку, відповідно. Разом з тим, препарат також позитивно впливає на функціонування неферменетативної ланки АОС за рахунок підвищення рівня вільних сульфгідрильних груп як в сироватці крові, в середньому в 3,4 рази, так і в корі головного мозку - в 2,6 рази.

При цьому, реєструється вірогідне (Р<0,01-0,001) збільшення концентрації глутатіону відновленого у порівнянні з контрольною групою тварин в обох біосубстратах.

Доведено, що б-ліпоєва кислота підвищує забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами, на що вказує зменшення проценту гемолізованих еритроцитів у крові тварин із ЗЧМТ. Більш того, виражені антиоксидантні властивості б-ліпоєвої кислоти підтверджуються й результатами аналізу фактору антиоксидантної активності в сироватці крові та тканині головного мозку.

При вивченні впливу б-ліпоєвої кислоти на енергетичний гомеостаз тварин з формою ТХГМ, що моделюється, доведено, що препарат перерозподіляє пул аденілових нуклеотидів на користь синтезу АТФ, збільшуючи при цьому такі параметри енергетичного обміну, як ЕЗ, ЕП, ІФ, ТКД, а також знижуючи величини К_пор та СФ (табл. 1).

Таблиця 1 Вплив б-ліпоєвої кислоти на показники енергетичного гомеостазу (відн. од.) у щурів із ЗЧМТ (n=7)

Примітки: 1. (1) - P<0,05 у порівнянні з інтактною групою;

2. (2) - P<0,05 у порівнянні з контрольною групою;

3. (3) - P<0,05 у порівнянні з референтною групою.

Поряд з цим, на тлі ЗЧМТ та використанні досліджуваного потенційного церебропротектора - б-ліпоєвої кислоти, знижується активність лактатдегідрогенази (в середньому в 5,9 рази) та підвищується активність креатинкінази (в середньому на 25,7%), у порівнянні з контролем, що, таким чином, сприяє індукції ефективних шляхів ресинтезу макроергів.

Доведено, що б-ліпоєва кислота ефективно коригує процеси глікогенолізу та аеробного гліколізу в умовах ТХГМ, зберігаючи при цьому рівень глюкози, глікогену, пірувату з одночасним зниженням концентрації лактату в обох біосубстратах щурів в усі терміни дослідження. Цей факт підтверджується і при визначенні величин ОВП системи лактат-піруват, які вірогідно нижче (Р<0,001) в сироватці крові та корі головного мозку дослідних тварин в порівнянні з контролем.

Наступним етапом логічного завершення дослідження енергозберігаючої активності б-ліпоєвої кислоти була оцінка впливу препарату на процеси стомлюваності і тривожності, обрані як інтегральні показники, що підсумовують стан енергетичного профілю у тварин в умовах ЗЧМТ.

Встановлена активність б-ліпоєвої кислоти в плані реалізації значного (P<0,01), порівняно з контролем, підвищення фізичної витривалості (збільшення часу пробігу) щурів з ТХГМ, що полягає в здатності препарату не тільки збільшувати рівень глікогену, але і ефективно використовувати останній як джерело енергії для виконуваної роботи. Оцінюючи тест «підвішування за хвіст» слід зазначити, що застосування б-ліпоєвої кислоти в значній мірі знижує тривожність тварин, про що свідчить збільшення в 1,9 рази, порівняно з контрольною серією, періоду іммобільності тварин, що знаходяться в підвішеному стані.

При проведенні фармакокінетичного аналізу впливу б-ліпоєвої кислоти на інтенсивність перебігу ендогенної інтоксикації в умовах форми травматичного пошкодження головного мозку, що моделюється, встановлено, що введення цього препарату реалізується активацією реакцій І та ІІ фаз біотрансформації, про що свідчить значне підвищення екскреції з сечею метаболітів амідопірину (4-ААП і N-ацетил-4-ААП), використаного в якості тест-препарату (рис. 3). Активність потенційного церебропротектора у відношенні НАДФ·Н-залежної монооксигеназної системи печінки підтверджена і при визначенні тривалості тіопенталового сну, котра вірогідно (Р<0,001) знижується в умовах ЗЧМТ. Крім того, детоксикуюча дія б-ліпоєвої кислоти реалізується і зниженням рівня універсальних маркерів ендотоксикозу - МСМ в сироватці крові дослідних тварин, в середньому на 43,5%, порівняно з контрольною серією. Наслідком цього є покращення клінічного перебігу посттравматичного періоду, що реалізується прискоренням відновлення рефлекторно-поведінкового статусу і нормалізацією вегетативних реакцій у щурів із ЗЧМТ, лікованих б-ліпоєвою кислотою.

Фармакокінетика б-ліпоєвої кислоти у здорових тварин і на моделі ЗЧМТ при інтраперітонеальному введенні. Для проведення ефективної та безпечної фармакотерапії ТХГМ б-ліпоєвою кислотою в подальшому доцільним було вивчити її фармакокінетичні характеристики. Проведена серія фармакологічних досліджень дозволила експериментально довести, що при ЗЧМТ відбувається істотна модифікація фармакокінетики б-ліпоєвої кислоти при її внутрішньоочеревинному введенні у бік зниження всмоктування в системний кровообіг, зменшення надходження в печінку, нирки, головний мозок і сальник, збільшення розподілу в серце і поперечносмугасту мускулатуру, зменшення елімінації з організму, що, у відомому сенсі, сприяє пролонгації лікувального ефекту, а отже, і вимагає відповідної корекції режиму дозування залежно від інтенсивності ЗЧМТ (табл. 2). Виявлена здатність б-ліпоєвої кислоти регулювати природні захисно-адаптаційні механізми організму за рахунок модифікації процесу зворотного зв'язування лігандів з білками сироватки крові на етапі біотранспорту.

Таблиця 2 Фармакокінетичні параметри б-ліпоєвої кислоти при внутрішньоочеревинному введенні в нормі та на тлі зчмт (n=6)

Примітки: 1.* - P<0,001 в порівнянні із здоровими тваринами;

2.** - P<0,05 в порівнянні із здоровими тваринами.

Отримані в експерименті результати свідчать про високийступінь афінітету б-ліпоєвої кислоти (здорова група), однаково вираженого по відношенню до основного транспортного білка крові - альбуміну, а також до сироватки крові, дещо меншої - до білків цільної крові і низькою - до мембран еритроцитів, що відображається на величинах відповідних констант асоціації «ліганд-білок». При цьому, максимальне число активних центрів церебропротектора реєструється на молекулах білків сироватки крові, що обумовлено ключовою роллю альбуміну в процесі його біотранспорту. У дослідній же серії тварин відзначається значне збільшення спорідненості б-ліпоєвої кислоти до мембран еритроцитів, що, найімовірніше, обумовлено зменшенням кількості та/або афінітету до еритроцитів продуктів патологічного метаболізму (ендотоксинів), що утворюються, як відомо, в надзвичайно великій кількості при ТХГМ.

Таким чином, б-ліпоєва кислота в умовах ТХГМ проявляє церебропротекторну активність за рахунок попередження формування поширеної мембранопатії, ефективно регулюючи прооксидантно-антиоксидантну рівновагу в силу реалізації вираженого антиоксидантного потенціалу в поєднанні з антирадикальними властивостями, що, в свою чергу, проявляється стабілізацією енергетичного гомеостазу. Поряд з цим, досліджуваний церебропротектор підвищує функціонування захисно-компенсаторних реакцій на етапі біотранспорту ендотоксинів в умовах екстремального стану, що моделюється.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено нове рішення актуальної наукової проблеми, що полягає в теоретичному та експериментальному обґрунтуванні доцільності застосування з лікувальною метою препарату метаболічної дії - б-ліпоєвої кислоти в ранньому посттравматичному періоді за умов ЗЧМТ. Фармакотерапевтичні властивості цього церебропротектора реалізуються шляхом впливу на найбільш вразливі ланки патогенезу травматичної хвороби, що моделюється, на основі встановлених в роботі особливостей фармакодинаміки і -кінетики.

1. Біохемілюмінісцентний аналіз церебропротекторної дії б-ліпоєвої кислоти за умов ЗЧМТ свідчить про її здатність більш ефективно, ніж референтний препарат - пірацетам, регулювати кінетику вільнорадикальних ланцюгових реакцій в сироватці крові та головному мозку щурів у різні терміни дослідження шляхом зменшення амплітуд швидкого та повільного спалахів, кінцевого значення інтенсивності надслабкого світіння і загальної світлосуми при збільшенні часу індукції повільного спалаху. Реалізація таким чином антирадикальної активності препарату забезпечує підтримку динамічної рівноваги в системі «радикалоутворення-антиоксидантний захист».

2. Курсове застосування б-ліпоєвої кислоти (білі щури, 100 мг/кг внутрішньоочеревинно 1 раз на добу на протязі 6 діб) сприяє зниженню вмісту як ранніх (АФГ), так і пізніх (КФГ) продуктів спонтанної та індукованої перекисної деструкції білків, а також зменшенню в 1,5 рази концентрації стабільного метаболіту оксиду азоту - нітрит-іону (NOП₂) в сироватці крові та корі головного мозку щурів.

б-ліпоєва кислота не тільки запобігає зниженню активності ферментів (СОД, каталази) та витрату фонду неферментативної ланки антиоксидантної системи захисту (глутатіону відновленого, SH-груп) в корі головного мозку та сироватці крові, але й відновлює запаси ендогенних антиоксидантів, підвищуючи величину сумарного фактора антиоксидантної активності (на 74,1-79,2%) за рахунок попередження гіперактивації процесів ліпідпереокислення та окислювальної модифікації білків (при індукованій протеїнпероксидації в сироватці - на 53,6% та 48,2%, а в мозковій тканині - на 46,5% та 42,7%, АФГ та КФГ, відповідно).

3. Церебропротекторна активність б-ліпоєвої кислоти обумовлена усуненням дисбалансу в системі АТФ-АДФ-АМФ у всі терміни дослідження за умов травматичної хвороби головного мозку. При цьому, збільшується величина енергетичного заряду (в середньому на 15%), енергетичного потенціалу (на 19%), індексу фосфорилювання (на 29%), термодинамічного контролю дихання (на 32,8%), а також вірогідно знижується ступінь фосфорилювання (на 13%), коефіцієнт порівняння (на 11%), відносно контролю.

4. Застосування б-ліпоєвої кислоти при ЗЧМТ стимулює глюконеогенез за рахунок суттєвого збільшення концентрації глюкози, глікогену та пірувату (в середньому в 2,9; 2,1 та 3 рази, відповідно) в крові та головному мозку, в порівнянні з контролем, на тлі зниження вмісту лактату та величини окислювально-відновного потенціалу. За цими показниками б-ліпоєва кислота не тільки не поступається препарату порівняння - пірацетаму, а, навіть, перевершує його (збільшення рівня глюкози на 5,2-6,2%, глікогену - на 11%, пірувату - на 11,0-11,2% та зниження концентрації лактату на 7,6-19,6% в сироватці крові та корі головного мозку, відповідно). Крім того, препарат підвищує активність креатинкінази (на 25,7%) та знижує активність лактатдегідрогенази, що, в підсумку, підвищує толерантність організму до фізичних навантажень при даній патології.

5. Вплив б-ліпоєвої кислоти на стан процесів природної детоксикації на рівні НАДФяН-залежної монооксигеназної системи свідчить, що цей препарат має більш виразну, ніж у референтного препарату, здатність інтенсифікувати в динаміці реакції І (N-деметилювання) та ІІ (N-ацетилювання) фаз біотрансформації в умовах травматичного пошкодження головного мозку, а також знижувати (на 43,5%, в порівнянні з контролем) вміст універсального маркеру ендотоксикозу - середньомолекулярних пептидів, що, в кінцевому підсумку, прискорює відновлення рефлекторно-поведінкового статусу тварин із ЗЧМТ.

6. Аналіз фармакокінетики б-ліпоєвої кислоти на моделі зчмт у щурів при внутрішньоочеревинному введенні свідчить, що всі досліджувані параметри зазнають суттєвих змін у порівнянні зі «здоровою» серією на всіх етапах проходження препарату в організмі: абсорбції (підвищення періоду напівабсорбції на 11,3%, зменшення константи швидкості абсорбції на 11,9% та максимальної концентрації препарату на 9,8%); біотранспорту (вірогідне зменшення константи асоціації комплексу «ліганд-білок» та числа місць фіксації на молекулі протеїну); розподілу по органах та тканинах (збільшення періоду напіврозподілу на 11,3% та зменшення уявної початкової концентрації на 29,8%, загального об'єму розподілу на 91,0%, зниження максимальної концентрації в сироватці крові, печінці, нирках, головному мозку, серці, сальнику, м'язах та константи швидкості зворотного масопереносу, часу утримання в органах, за винятком головного мозку та печінки, тканинної біодоступності на 15,7%); елімінації (збільшення періоду напівелімінації на 8,5% та зменшення константи швидкості елімінації, загального кліренсу на 55,0%, площі під кінетичною кривою на 22,6%).

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лук'янчук В.Д., Шевчук О.В. Фармакокорекція б-ліпоєвою кислотою процесів енергозабезпечення у щурів із закритою черепно-мозковою травмою // Ліки. - 2006. - № 1-2. - С. 57-64. (дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка та інтерпретація даних, підготовка матеріалів до друку ).

2. Лукьянчук В.Д., Шевчук О.В. Фармакокинетический анализ церебропротекторного действия б-липоевой кислоты при закрытой черепно-мозговой травме // Журнал АМН України. - 2007. - Т.13, № 1. - С. 159-167 (дисертантом виконані експериментальне дослідження, обробка та інтерпретація даних, підготовка матеріалів до друку).

3. Шевчук О.В. Антиоксидантний профіль організму щурів із закритою черепно-мозковою травмою на тлі корекції б-ліпоєвою кислотою // Актуальні проблеми сучасної медицини: Вісник медичної стоматологічної академії. - 2007.- Т.7, випуск 1-2 (17-18) - С. 91-94.

4. Шевчук О.В. Биохемилюминисцентный анализ церебропротекторной активности б-липоевой кислоты при закрытой черепно-мозговой травме // Український журнал екстремальної медицини України ім. Г.О. Можаєва. - 2007. - Т.8, № 1. - С. 35-39.

5. Деклараційний патент на корисну модель 13678, Україна, МПК G09В 23/28. Спосіб моделювання черепно-мозкової травми / В.Д. Лук'янчук, О.В. Шевчук, О.В. Бадінов. - № u 2005 09483; Заявл. 10.10.05; Опубл. 17.04.06, Бюл. № 4 - 8 с.

6. Патент на корисну модель 18120, Україна, МПК G01N 33/48. Спосіб фармакокорекції закритої черепно-мозкової травми -ліпоєвою кислотою / В.Д. Лук'янчук, О.В. Шевчук - № u 2006 05948; Заявл. 29.05.06; Опубл. 16.10.06, Бюл. № 10 - 20 с.

7. Шевчук О.В Обґрунтування доцільності застосування ліпоєвої кислоти при закритій черепно-мозковій травмі // Тези ІІ Науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів «Актуальні проблеми фармакології та токсикології». - Київ, 2005. - С. 63-64.

8. Shevchuk O.V. Optimization of the method of cranial trauma modelling // Укр. мед. альманах (додаток). - 2006. - Т.9, №2. - С. 229-230 (proc. All-Ukrainian scientific-applaied conference for students, young scientists and interns «Actual problems of fundamental medicine». - Lugansk, 2005).

9. Шевчук О.В. Зміна параметрів енергетичного гомеостазу при травматичній хворобі головного мозку на фоні застосування б-ліпоєвої кислоти // Український медичний альманах. - 2006. - Т.9, №4 (додаток). - С. 208 (Всеукраинская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы биологии, медицины и фармации». - Луганск, 2006).

10. Лук'янчук В.Д., Шевчук О.В. Характер розподілу б-ліпоєвої кислоти в організмі щурів за умов закритої черепно-мозкової травми // Матер. XI Конгресу Світової федерації українських лікарських товариств. - Полтава-Київ-Чикаго, 2006. - С. 585-586.

11. Лук'янчук В.Д., Шевчук О.В. Вплив ліпоєвої кислоти на обмін аденілових нуклеотидів у щурів з черепно-мозковою травмою // Тези доповідей ІІІ Національного з'їзду фармакологів України «Фармакологія 2006 - крок у майбутнє». - Одеса, 2006. - С. 101-102.

12. Shevchuk O.V., Visotskij A.A. Kinetics of free-radical reactions in closed craniocerebral trauma // Укр. мед. альманах (додаток). - 2006. - Т.9, №6. - С. 201 (Всеукраїнська науково-практична конференція студентів, молодих вчених та інтернів «Досягнення фундаментальної та прикладної медицини».

13. Лукьянчук В.Д., Шевчук О.В. Биохемилюминисцентный анализ церебропротекторного действия б-липоевой кислоты в условиях травматической болезни головного мозга // Матер. VI Всеукраинской научно-практической конференции «Клиническая фармация в Украине». - Харьков, 2007. - 131-132.

14. Шевчук О.В. Фармакокінетична характеристика екскреційно-елімінаційних процесів -ліпоєвої кислоти у щурів із закритою черепно-мозковою травмою // Тези доповідей 76-ої межвузівської наукової конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю “Працюємо, творимо, презентуємо”. - Івано-Франківськ, 2007. - С. 208-209.

15. Шевчук О.В. Влияние б-липоевой кислоты на состояние окислительного гомеостаза в коре головного мозга крыс с закрытой черепно-мозговой травмой // Матер. 69 Міжнародної конференції «Актуальні питання клінічної, теоретичної, економічної, профілактичної медицини та стоматології».- Донецьк, 2007. - С. 137.

16. Лук'янчук В.Д., Шевчук О.В. Профіль перекисного окислення білків при травматичному пошкодженні головного мозку та застосуванні б-ліпоєвої кислоти // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2007. - №11 (2/2). - С. 787.

17. Шевчук О.В. Вплив -ліпоєвої кислоти на стан вуглеводного обміну в тканині головного мозку за умов його травматичного пошкодження // Тези Міжнародної наукової конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання в сучасній медицині». - Харків, 2007. - С. 159.

18. Лук'янчук В.Д., Шевчук О.В. Застосування б-ліпоєвої кислоти у лікуванні закритої черепно-мозкової травми // Інформаційний листок про нововведення в системі охорони здоров'я № 10. - Луганськ, 2007 (дисертантом виконаний експериментальний розділ дослідження, обробка і аналіз матеріалу).

АНОТАЦІЯ

Шевчук О.В. Експериментальне обґрунтування доцільності застосування б-ліпоєвої кислоти при закритій черепно-мозковій травмі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Державна установа «Інститут фармакології та токсикології» АМН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена експериментальному обґрунтуванню доцільності застосування б-ліпоєвої кислоти при закритій черепно-мозковій травмі.

В основі протекторного ефекту препарату лежить його спроможність попереджати формування розповсюдженої мембранопатії за рахунок істотного зниження інтенсивності генерації та накопичення вільних радикалів, а також ефективної регуляції прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу в сироватці крові та мозковій тканині щурів із закритою черепно-мозковою травмою.

Крім того, протекторна активність б-ліпоєвої кислоти реалізується значним позитивним впливом на енергетичний обмін шляхом збереження фонду АТФ та модифікації активності ферментів, а також ефективною корекцією посттравматичного метаболічного лактоацидозу та попередженням розвитку синдрому ендогенної інтоксикації за умов досліджуваної форми травматичної хвороби головного мозку.

Ключові слова: б-ліпоєва кислота, закрита черепно-мозкова травма, церебропротектор.

Шевчук О.В. Экспериментальное обоснование целесообразности применения б-липоевой кислоты при закрытой черепно-мозговой травме. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология - Государственное учреждение «Институт фармакологии и токсикологии» АМН Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена экспериментальному обоснованию целесообразности применения б-липоевой кислоты при закрытой черепно-мозговой травме.

Установлено, что исследуемый церебропротектор в условиях закрытой черепно-мозговой травмы проявляет высокую антиоксидантную активность с антирадикальными свойствами. Согласно результатов биохемилюминисцентных исследований, б-липоевая кислота весьма эффективно предупреждает гиперактивацию свободнорадикальных цепных реакций как в сыворотке крови, так и в коре головного мозга экспериментальных животных, на что с высокой степенью достоверности указывают изменения ряда параметров сверхслабого свечения.

Доказано, что изучаемый потенциальный церебропротектор реализует свою активность путем предупреждения накопления продуктов перекисного окисления протеинов и липидов, повышения функциональной активности и содержания компонентов ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы защиты организма и, как следствие, сохранения фонда эндогенных антиоксидантов в сыворотке крови и мозговой ткани животных с травматическим повреждением головного мозга.

Церебропротекторное действие б-липоевой кислоты проявляется также сохранением уровня высокоэнергетических фосфатных связей и устранением дисбаланса в системе адениловых нуклеотидов. При этом, исследуемый препарат предупреждает в динамике модификацию активности ферментов энергообмена на фоне индукции эффективных путей ресинтеза макроэргов.

Протекторная активность б-липоевой кислоты в изучаемых условиях эксперимента реализуется способностью корригировать протекающие на высоком уровне процессы анаэробного гликолиза путем повышения концентрации глюкозы, гликогена и пирувата на фоне одновременного снижения содержания лактата и величины окислительно-восстановительного потенциала в сыворотке крови и коре головного мозга. В пользу энергосберегающей активности б-липоевой кислоты свидетельствует также способность исследуемого препарата повышать толерантность организма к физической нагрузке и снижать тревожность в изучаемых экстремальных условиях.

Результаты фармакокинетического анализа детоксицирующей активности б-липоевой кислоты дают все основания утверждать, что препарат обладает весьма существенной способностью модифицировать реакции І и ІІ фаз биотрансформации в условиях травматического повреждения головного мозга, вероятнее всего, путем протекторного действия в отношении ферментов монооксигеназной системы печени, а также, устранять проявления синдрома эндогенной интоксикации травматического генеза за счет снижения уровня его маркеров - молекул средней массы в сыворотке крови, и, в конечном итоге, улучшать клиническое течение посттравматического периода.

Проведенная серия фармакологических исследований позволила экспериментально доказать, что при закрытой черепно-мозговой травме происходит существенная модификация фармакокинетики б-липоевой кислоты при ее внутрибрюшинном введении в сторону снижения всасывания в системный кровоток, уменьшения поступления в печень, почки, головной мозг и сальник, увеличения распределения в сердце и поперечно-полосатую мускулатуру, уменьшения элиминации из организма, что, в известном смысле, способствует пролонгированию лечебного эффекта этого потенциального церебропротектора, а следовательно, требует соответствующей коррекции режима дозирования в зависимости от интенсивности закрытой травмы головного мозга.

Ключевые слова: б-липоевая кислота, закрытая черепно-мозговая травма, церебропротектор.

Shevchuk О.V. Experimental substantiation of expedience of б-lipoic acid application in closed craniocerebral trauma. - Manuscript.

The dissertation for obtaining an academic degree of the candidate of medical sciences in spesiality 14.03.05 - pharmacology. - State establishment «Institute of Pharmacology and Toxicology», Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

Dissertation is devoted to the experimental substantiation of expedience of б-lipoic acid application in closed craniocerebral trauma.

Its possibility to prevent the formation of spread membrane pathology lies in the basis of protector effect of the preparation. It is realized by means of significant decrease of intensity of free radicals generation and accumulation and also effective regulation of oxidant-antioxidant homeostasis in blood serum and brain tissues of rats with closed craniocerebral trauma.

Moreover, protector activity of б-lipoic acid is realized by considerable positive influence on energetic metabolism by means of preservation of ATP fund and modification of enzyme activity as well as effective correction of posttraumatic metabolic lactoacidosis and prevention of development of endogenous intoxication syndrome in conditions of the investigated form of brain traumatic disease.

Keywords: б-lipoic acid, closed craniocerebral trauma, cerebroprotector.

Размещено на Allbest.ru