Культуральные свойства бактерий

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Культуральные свойства бактерий

К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. бактерий микроорганизм углерод биосфера

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.

При описании колоний учитывают следующие признаки:

1) форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;

2) размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

3) поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

4) профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;

5) прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

6) цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

7) край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

8) структуру колонии - однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

9) консистенцию колонии; определяют прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.

Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.

Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.

Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.

Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям -относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

2. Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий -обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной практике, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и в целом при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация. Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:

1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.

С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.

Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.

Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

3. Рост бактерий в периодической культуре

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Рост в такой «закрытой системе» подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста имеет S-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.

Рост микроорганизмов на твердых питательных средах протекает в основном так же, хотя при этом достигаются значительно более высокие плотности клеток.

Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествовавших условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста данная среда. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК,образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то приспособление (адаптация) к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит так называемая диауксия. Это явление двухфазного роста или двойного цикла роста наблюдается на средах, содержащих смесь питательных веществ. Из смеси глюкозы и сорбитола Escherichia coli, например, поглощает в первую очередь глюкозу. Глюкоза индуцирует сначала в клетках синтез ферментов, которые нужны для ее использования и одновременно подавляет (репрессирует) синтез ферментов, необходимых для использования сорбитола. Эти последние ферменты образуются лишь после того, как вся глюкоза будет израсходована. Такие регуляторные процессы достаточно хорошо объясняют наличие двух начальных фаз.

Количественное изменение состава бактериальной клетки во время начальной фазы роста сильнее всего затрагивает рибонуклеиновую кислоту: содержание РНК повышается в 8-12 раз. Это указывает на участие РНК и рибосом в синтезе ферментных белков.

Экспоненциальная фаза. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин,Escherichia coli при 37°С-примерно каждые 20 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у Nitrosomonas и Nitrobacter-даже 5-10 ч.

Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными. В известном смысле можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей.

Нередко, однако, и в экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и т. д.), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

Стационарная фаза. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата-при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления 0₂ или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. И в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность-до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.

Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а также от условий культивирования.

Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Сравнительно легко понять случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Число живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

4. Роль микроорганизмов в круговороте углерода в биосфере

Вся земная жизнь основана на углероде. Каждая молекула живого организма построена на основе углеродного скелета. Атомы углерода постоянно мигрируют из одной части биосферы (узкой оболочки Земли, где существует жизнь) в другую. На примере круговорота углерода в природе можно проследить в динамике картину жизни на нашей планете.

Основные запасы углерода на Земле находятся в виде содержащегося в атмосфере и растворенного в Мировом океане диоксида углерода, то есть углекислого газа (CO₂). Рассмотрим сначала молекулы углекислого газа, находящиеся в атмосфере. Растения поглощают эти молекулы, затем в процессе фотосинтеза атом углерода превращается в разнообразные органические соединения и таким образом включается в структуру растений. Далее возможно несколько вариантов:

• углерод может оставаться в растениях, пока растения не погибнут. Тогда их молекулы пойдут в пищу редуцентам (организмам, которые питаются мертвым органическим веществом и при этом разрушают его до простых неорганических соединений), таким как грибы и термиты. В конце концов углерод вернется в атмосферу в качестве CO₂;

• растения могут быть съедены травоядными животными. В этом случае углерод либо вернется в атмосферу (в процессе дыхания животных и при их разложении после смерти), либо травоядные животные будут съедены плотоядными (и тогда углерод опять же вернется в атмосферу теми же путями);

• растения могут погибнуть и оказаться под землей. Тогда в конечном итоге они превратятся в ископаемое топливо -- например, в уголь.

В случае же растворения исходной молекулы CO₂в морской воде также возможно несколько вариантов:

• углекислый газ может просто вернуться в атмосферу (этот вид взаимного газообмена между Мировым океаном и атмосферой происходит постоянно);

• углерод может войти в ткани морских растений или животных. Тогда он будет постепенно накапливаться в виде отложений на дне Мирового океана и в конце концов превратится в известняк или из отложений вновь перейдет в морскую воду.

Если углерод вошел в состав осадочных отложений или ископаемого топлива, он изымается из атмосферы. На протяжении существования Земли изъятый таким образом углерод замещался углекислым газом, попадавшим в атмосферу при вулканических извержениях и других геотермальных процессах. В современных условиях к этим природным факторам добавляются также выбросы при сжигании человеком ископаемого топлива. В связи с влиянием CO₂ на парниковый эффект исследование круговорота углерода стало важной задачей для ученых, занимающихся изучением атмосферы.

Составной частью этих поисков является установление количества CO₂, находящегося в тканях растений (например, в только что посаженном лесу) -- ученые называют это стоком углерода. Поскольку правительства разных стран пытаются достичь международного соглашения по ограничению выбросов CO₂, вопрос сбалансированного соотношения стоков и выбросов углерода в отдельных государствах стал главным яблоком раздора для промышленных стран. Однако ученые сомневаются, что накопление углекислого газа в атмосфере можно остановить одними лесопосадками.

5. Микробиология виноделия и пивоварения

Микробиология виноделия, прикладная наука, рассматривающая микроорганизмы с точки зрения их использования в винодельческой промышленности. Начало развития микробиологии виноделия было положено работами Л. Пастера и Э. Ганзена. Г. Мюллер-Тургау и Ю. Вортман впервые выделили и применили чистые культуры дрожжей в виноделии. Большой вклад в развитие микробиологии виноделии внесли русские ученые А. Е. Саломон, М.А. Ховренко, М.А. Герасимов, Н. Ф. Саенко, Н. К. Могилянский, Е. Н. Одинцова, Е. И. Квасников, А. М. Шумаков, Д. К. Чаленко, Г. И. Мосиашвили, Г. Ф. Кондо и мн. др., а также зарубежные: Э. Пейно, Ж. Риберо-Гайон, Г. Шандерль, Ф. Радлер, Б. Ранкин, С. Оуг и др. М. в. призвана решить 2 главные задачи: первая -- наиболее полно выяснить биологические и биохимические свойства организмов, превращающих виноградное сусло в вино; вторая -- осуществлять контроль за деятельностью полезных микроорганизмов и посторонних, вредных, являющихся причиной производственных потерь и порчи получаемого продукта. Круг исследований включает: оценку видов и рас дрожжей рода Saccharomyces и др. родов дрожжей, встречающихся в виноделии; определение оптимальных условий развития и биосинтеза тех или иных продуктов метаболизма с целью более эффективного использования технологии, возможностей дрожжей для повышения качества вин; определение посторонней дрожжевой флоры, являющейся возбудителем заболеваний вин; оценку возможности промышленном использования молочнокислых и уксуснокислых бактерий, способы регулирования технологических режимов для индуцирования полезных процессов и предотвращения заболеваний; методы контроля процессов, вызываемых дрожжами и бактериями, и оценку микробиологического состояния вина на различных стадиях технологии.

Можно утверждать, что не только микробиологические аспекты пивоварения, но имикробиология как наука ведет свое начало с получения пива. Большой вклад в развитие современной микробиологии внесли исследования проблем порчи пива, проведенные Луи Пастером. Пивоварение -- это, по существу, слияние усилий инженеровсо знаниями из области ботаники, общей химии, биохимии и микробиологии. Археологические данные свидетельствуют о том, что пиво варили еще 4000 лет до н. э. [10],однако о микробиологическом характере этого процесса узнали лишь 150 лет назад.В последнее время одной из задач микробиологии стала оптимизация технологиидля достижения высокой эффективности и качества. Существуют два принципиальных аспекта микробиологии пивоварения: а) качество производственной культурыдрожжей и б) контроль возможного микробиологического загрязнения продукта.Ниже мы посвятим отдельную главу полному описанию различных микробиологических аспектов производства пива, а здесь дадим лишь общее представление о микробиологии в производстве алкогольных напитков, особенно пива (о других аспектахпивоварения см.[4, 8, 10]). Общая технология процесса пивоварения представлена насхеме 1.1.В большинстве стран основным сырьем для производства пива является ячменныйсолод, который служит благоприятной средой для развития микрофлоры (см. главу 4). Основная часть этих микроорганизмов в нормальных условиях не способна развиваться в пиве. Развитие большинства грибов и бактерий подавляется одним илинесколькими из нижеперечисленных факторов: антимикробными свойствами хмеля;снижением pH во время брожения с 5,0-5,2 в сусле до 3,8-4,0 в пиве; образованиемСО2 и анаэробными условиями; увеличением содержания этилового спирта. Отсутствие этих защитных факторов приводит к предрасположенности сусла к порче, воизбежание чего в сусло должны быть внесены дрожжи сразу же после, а лучше вовремя перекачки. При должном выполнении процессов, предшествующих брожению,развитие инфицирующих микроорганизмов будет подавлено внесением большого количества засевных дрожжей. Пиво с присущими ему антимикробными свойствами инизким уровнем несбраживаемых сахаров является относительно стабильной средой,однако в анаэробных условиях определенные виды бактерий и дрожжей способныразвиваться на полисахаридах или других органических соединениях, оставшихсяпосле брожения [3]. Источником инфицирования сусла и пива может являться солод, в котором содержится небольшое количество молочнокислых, уксуснокислыхмикроорганизмов и энтеробактерий (табл. 1.1), способных размножаться в благоприятных условиях. Сильное инфицирование возможно в неохмеленном .

Пиво готовится из злаков, а углеводом злаковых культур является крахмал. Дрожжи не способны его переработать, в связи с чем зерна предварительно проходят стадию солодоращения, в ходе которой происходит модификация крахмала, а затем, при затирании, крахмал гидролизуется с образованием сбраживаемых сахаров. Так как солодоращение -- это контролируемый процесс, подобный натуральному проращиванию, соложению может быть подвергнута любая злаковая культура, а ячмень широко применяется для производства пива благодаря особым свойствам его оболочек,которые ограничивают развитие инфицирующих грибов и образуют натуральный фильтрующий слой при фильтровании сусла.Для солодоращения подходят не все сорта ячменя. Помимо необходимых ботанических характеристик (отсутствие периода покоя или эффективность модификации сорта), важным свойством является содержание азота. Слишком низкий уровень аминного азота в сусле ограничивает рост дрожжей, однако чаще встречаются с проблемой слишком высокого содержания в ячмене азота (превышающего необходимый для развития дрожжей уровень). Избыток азота, особенно аминного, приводит к микробной порче готового пива (прежде всего молочнокислыми бактериями, см.главу 5).Поскольку ячмень созревает только осенью, а солодоращение проводят на протяжении всего года, зерно с влажностью 20-25% должно быть высушено до содержания влаги 11%, подходящей для хранения перед солодоращением. Такая влажность предотвращает инфицирование микроорганизмами (особенно грибами), и, кроме того, при такой влажности зерно еще не теряет своей жизнеспособности. Сушка и хранение предназначенного для солодоращения ячменя должны тщательно контролироваться во избежание риска перехода зерна в состояние покоя или его гибели. Для предотвращения повреждения зерна рекомендуется щадящий режим сушки [11]. При солодоращении эндосперм крахмала зерна модифицируется в результате действия гидролитических ферментов, его структура изменяется. Одновременно происходит гидролиз белков протеолитическими ферментами до потребляемых дрожжами аминокислот и пептидов. Процесс солодоращения происходит в три этапа -- замачивание, проращивание и сушка, причем каждый из этих этапов может быть подвержен микробиологическому загрязнению (см. главу 4). Замачивание в воде происходит в течение 48 ч при температуре 15-18 °С обычно в две или более стадии с воздушными паузами, стимулирующими рост зародыша, подобно тому, как это происходит в природе. Влага, тепло и аэрация при замачивании и проращивании вызывают рост микрофлоры, неизбежно присутствующей на поверхности зерна (см. главу 4). Проросший и модифицированный зеленый солод для лучшего хранения подвергают сушке, в ходе которой формируется характерный «солодовый» привкус. Так как на практике фактором, предотвращающим микробную порчу, является активность воды, а не процент содержания влаги, то влажность, достигнутую во время проращивания (46-50%) необходимо уменьшать до пригодной для хранения (5%). При этом необходимо найти компромисс между требованиям к микробиологической стабильности и энергетическими затратами на сушку. Другие аспекты сушки (усиление цвета и вкуса, сохранение гидролитической активности протеолитических и амилолитических ферментов, участвующих в затирании)

6. Микрофлора желудочно-кишечного тракта животных

В последнее время значительно возрос интерес к индигенной (собственной) микрофлоре сельскохозяйственных и домашних животных и способам её коррекции. Вопрос овозможности существования животных и человека в отсутствии микроорганизмов впервыебыл поставлен Луи Пастером (цитируется по 10). Согласно современным представлениям, вестественной среде обитания необходим симбиоз макроорганизма с заселяющей егомикрофлорой. Безмикробные животные (и растения) могут жить и развиваться только вусловиях искусственной изоляции (стерильной окружающей среде). Нормальная микрофлора животного и человека постоянно персистирует в организмездорового хозяина и взаимодействует с ним по принципу симбиоза. Индигенная флора представлена микробиоценозами (определенными сообществамимикроорганизмов), формирующимися в естетственных нишах (биотопах) физиологическихсистем макроорганизма (пищеварительный тракт, респираторный и урогенитальныйаппараты, кожный покров и т.д.) контактирующих с внешней средой. В любоммикробиоценозе различают характерную для данного вида (облигатную, резидентную) ислучайную (факультативную, временную, транзиторную) микрофлору. В каждом из биотопов формируются собственные, отличные от других, условия длясуществования и взаимодействия населяющих их микроорганизмов. Поэтому видовой иколичественный состав флоры в разных биоценозах имеют существенные различия. В связис этим существуют такие понятия, как микроэкология кишечника, кожного покрова, гениталий, верхних дыхательных путей, полости рта и т. д. В живом организме содержится огромное количество клеток микроорганизмов-симбионтов(достигает 1014). Их видовое разнообразие (свыше 400 видов) обеспечивают участиенормальной микрофлоры в самых разнообразных физиологических функцияхмакроорганизма (13, 14). Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является обеспечениеколонизационной резистентности (КР) по отношению как к посторонним микроорганизмам, проникающим в организм хозяина, так и ограничение размножения ее отдельныхпредставителей вне мест свойственного им обитания. При снижении КР происходитнарушение равновесия качественного и количественного состава индигенной флоры. За счетувеличения роста отдельных популяций микроорганизмов происходит колонизацияпоследними кожного и слизистых покровов макроорганизма, а также отмечают расширение ареала распространения представителей оппортунистической (условно-патогенной) микрофлоры, включая аэробы и анаэробы, их транслокацию во внутренние органы. Этоведёт к гнойно-воспалительным процессам, септицемии. Усиливается передача факторовантибиотикорезистентности и патогенности между сообществами бактерий (1, 8, 16). Наиболее сложные микробиоценозы млекопитающих - микрофлора толстого отделакишечника, рта и носоглотки. Качественный и количественный состав микрофлорыповерхности кожи, а также слизистых полости носа, гениталий и т.д. более скуден. Поэтомуиндигенная микрофлора кишечника оказывает существенное влияние на состояниемикробиоценозов остальных биотопов живого организма. Состав нормальной флоры желудочно-кишечного тракта здоровой взрослой собаки (табл. 1) стабилен и при отсутствии существенных изменений в условиях кормления, содержания, стрессовых ситуаций, а также заболеваний с применением фармакологических препаратовколеблется незначительно. Из-за высокой кислотности микробиоценоз желудка достаточноскуден. Микроорганизмы, способные сохранять свою жизнедеятельность в кислой среде и вприсутствии пепсина (ацидофильная палочка и другие лактобактерии, энтерококки, грибы, бациллы, сарцины), локализуются преимущественно в пилорической его части. Удельноеколичество микрорганизмов двенадцатиперстной и тощей кишок колеблется в пределах 102-105 бактерий в 1 г их содержимого. Торможение их роста в этой части тонкого отделакишечника обеспечивается за счет более кислой среды, которая поддерживается за счетпоступления химуса (содержимого желудка), и выброса желчных кислот. Активнаяперистальтика, секреторные иммуноглобулины (IgA, IgЕ), и ферменты непосредственноучаствуют в регуляции численности микроорганизмов. Основные обитатели - лактобактерии, энтерококки, энтеробактерии, стептококки, по своему количественномупредставительству незначительно уступают бифидобактериям, иногда встречаются кандиды. Аналогичная ситуация наблюдается и в краниальной части подвздошной кишки, тогда как вкаудальной микробиоценоз значительно разнообразнее и часто включает в свой состав виды, преимущественно обитающие в толстом отделе кишечника (бактероиды, клостридии, эубактерии, фузобактерии и др.). Удельное содержание микроорганизмов в данном участкеможет достигать 107 в 1 г содержимого кишечника. Следует сказать, что микробиозенозиндигенной флоры толстого отдела кишечника в сравнении с тонким значительнопреобладает как в качественном так и количественном отношении. Кроме упомянутых втаблице 1, здесь практически всегда имеются представители вейолонелл, пептококков, пептострептококков, актиномицетов, псевдомонасов, алкалигенесов и других родов (11). Помере продвижения к прямой кишке удельное содержание бактерий растет (1010-1012микробных клеток в 1г содержимого). В зависимости от влажности фекалий процентноесодержание бактериальной массы по отношению к общему весу исследуемого материалаколеблется в пределах 15-30%. В данной статье в первую очередь предлагаются результаты исследования микроэкологиикишечника у собак в возрасте 2-7 лет, где особое внимание уделяли нормальноймикрофлоре. В ближайших номерах мы планируем представить материалы по возрастной динамикеиндигенной флоры кишечника, также будут рассмотрены причины развития дисбактериозов(снижения КР) и способы их коррекции. Полученные результаты показывают, что основу нормальной микрофлоры кишечника усобак, как и у других животных, составляют неспорообразующие облигатные анаэробныемикроорганизмы. Соотношение представителей анаэробной-аэробной флоры кишечника внорме составляет примерно 1000:1 соответственно. Важнейшими представителями резидентной флоры желудочно-кишечного тракта являютсябифидо- и лактобактерии, бактероиды, энтерококки, эшерихии, дрожжеподобные грибы (9). БифидобактерииБольшую часть нормофлоры кишечника (от 60 до 90% и более) у здоровых собак, как и удругих моногастричных животных составляют бифидобактерии (рис. 1). В норме из 1 гсодержимого толстого отдела кишечника собак (в зависимости от возраста, типа кормленияи др.) их высевали до 1012. Следует обратить внимание ветеринарных врачей на то, что микроскопическое исследованиефекалий при использовании специальных методов окраски мазков может дать лишьориентировочное представление о соотношении основных групп популяциймикроорганизмов (присутствие кокков, грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов и т. д.). Наличие либо отсутствие бифидофлоры этим методом установить нельзя, т.к. она имеет морфологические сходства с целым рядом других бактерий - облигатныхмикроорганизмов кишечника (приложение 1). Определение количественного содержания бифидофлоры осуществляют методом посевапоследовательных десятикратных разведений исследуемого материала на элективные(специальные) полужидкие питательные среды, которые разливают высоким (не менее двухтретьих высоты пробирки) столбиком и перед посевом регенерируют (прогревают). Подвергаемый бактериологическому анализу материал вносят аккуратно в нижнюю частьпробирки, содержимое которой слегка перемешивают, соблюдая при этом условияанаэробиоза, и далее инкубируют при оптимальной температуре от 1 до 3 дней. Такого родаисследование требует высокой квалификации и практических навыков бактериолога. Учитывая доминирующее положение бифидофлоры в кишечнике здоровых особей, а такжеданные клинических и микробиологических исследований, многие авторы пришли к выводуо том, что представители рода бифидобактерий - основная таксономическая группамикрофлоры желудочно кишечного тракта, которая является показателем здоровья (4). Действительно, при снижении КР бифидофлора первой исчезает из желудочно-кишечноготракта. Преобладание же данных микроорганизмов в кишечнике, как правило, препятствуетразмножению патогенных и условно-патогенных бактерий, нормализуя микробиоценоз вцелом. Антагонистическая активность бифидобактерий к патогенам, относящимся кэнтеробактериям (эшерихии, клебсиеллы, сальмонеллы, протей, шигеллы и т.д.), коккам(срепто-, стафилококки), вибрионам, кампилобактериям, клостридиям, и другиммикроорганизмам обеспечивается за счет образования в процессе ферментации углеводовацетата и лактата, продукции летучих жирных кислот (ЛЖК), лизоцимоподобных и другихвеществ, обладающих антибактериальной активностью, а также способности подавлятьтоксиноообразование либо разрушать токсины патогенных бактерий и т.д. Особо следуетподчеркнуть их участие в симбиозе с макроорганизмом на уровне пристеночногопищеварения, что определяется хорошо выраженными адгезивными свойствами. Этоявляется одним из главных элементов конкурентоспособности в освоении пищевой ниши поотношению к другим представителям индигенной флоры и патогенам. Бифидобактерии непосредственно принимают участие в регуляции иммунных функциймакроорганизма. Они стимулируют пролиферацию клеток лимфоидной ткани, усиливаютфагоцитарную активность макрофагов, моноцитов и гранулоцитов, усиливаютспецифический гуморальный иммунитет, синтез цитокинов (выработку гамма-интерферона, JL-6, TNF, ALPHA), а также стимулируют иммунные механизмы на уровне клеток, включаяпротивоопухолевую защиту (7, 15). Как и другие представители индигенной флоры бифидобактерии способны вызыватьдеконъюгацию желчных кислот. Они также активно участвуют в водно-солевом, белковом, жировом, нуклеотидном, витаминном обменах, поддержании рН и анаэробиоза в кишечнике. Они синтезируют такие аминокислоты, как лизин, аргинин, валин, метионин, лейцин, тирозин, а также глютаминовую кислоту. На долю незаменимых аминокислот приходитсяоколо 40% от общего их количества. Внутриклеточно бифидобактерии аккумулируютвитамины В1, В2, В6, В12, С, никотиновую, фолиевую кислоты и биотин, а такжепродуцируют в культуральную среду В6, В12 и фолиевую кислоту. При дефицитепредставителей данного рода снижается синтез эндогенного образования витамина К, чтоведёт к нарушению процессов свёртывания крови. Изложенная кратко характеристика бифидобактерий свидетельствует о том, что они как однаиз разновидностей нормальной флоры макроорганизма доминируют не только вколичественном, но и в качественном (физиологическом) отношении. В проведенной нами видовой идентификации бифидобактерий, выделенных из фекалийсобак, показано, что преобладающим оказался вид B.adolescentis (41,7% штаммов), вторымпо численности был вид B.globosum (16,7%), третьим - B.termophilum (8,3%). Ни в одном изслучаев не удалось выделить от собак бифидобактерии вида B.bifidum, характерные длякишечника человека и используемые для изготовления пробиотических препаратов вгуманитарной медицине. ЛактобактерииВторой по численности, а очевидно и по значимости группой резидентной флорыжелудочно-кишечного тракта собак являются молочнокислые бактерии, представители родаLactobacterium (приложение 2). По данным наших исследований количество лактобактерий уздоровых собак составляет 106-109/г содержимого толстого отдела кишечника (рис.1). Приснижении КР (дисбактериозах) лактобактерии высеваются в значительно меньшемколичестве или их не удается обнаружить вовсе (рис. 2). Молочнокислые бактерии как облигатные представители желудочно-кишечного трактапринимают активное участие в происходящих в нем процессах. Они ферментируют большоеколичество углеводов и спиртов, отдельные представители данного рода вызывают гидролизкрахмала и синтезируют белки. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий в отношении гнилостной, патогенной и условно-патогенной микрофлоры обусловлена их способностью синтезироватьмногочисленные антибиотические вещества. Некоторые из них относятся к низкомолекулярными белкам. Их классифицировали какбактериоцины, сходные по механизму своего действия с антибиотиками, но отличающиесяот них малой активностью в отношении близкородственных видов микроорганизмов(приложение 3). Характеристика физико-химических свойств бактериоцинов ацидофильныхбактерий позволила объединить их под термином «Лактацин В». Кроме того, лактобактериипродуцируют антимикробные вещества, получившие название лантабиотиков. Они менеечувствительны к действию амилаз и протеиназ и содержат аминокислоты, обычно неприсутствующие в бактериоцинах. Помимо бактериоцинов и лантабиотиков лактобактерии синтезируют неидентифицированные вещества, обладающие бактериоциноподобным эффектом. Этинизкомолекулярные органические соединения небелковой природы проявляют своюактивность в присутствии кислоты или перекиси водорода. Они сдерживают рост и развитиепсевдоманад, сальмонелл, шигелл, стрептококков, стафилококков, а также анаэробных бактерий, в том числе клостридий, бифидобактерий и бактероидов. Одним из важнейших продуктов метаболизма молочнокислых бактерий является перекисьводорода. Способность к ее продукции определяется генетически детерминируемымпризнаком и не зависит от основной среды и контакта с кислородом. Ингибирующий эффектперекиси водорода в кишечнике имеет более важное значение для сдерживания численностипредставителей аэробной флоры, чем действие продуцируемых ею органических кислот. Бактерицидный эффект перекиси водорода связан с ее сильным окислительным действием набактериальные клетки и разрушением основной молекулярной структуры клеточных белков. Лактобактерии играют важную роль в становлении иммунитета у новорожденных, имеющихнизкую активность клеточного и гуморального иммунитета и низкую фагоцитарнуюактивность мононуклеарных макрофагов. Усиление фагоцитарной активности макрофагов, захват и катаболизм ими антигенов наблюдают при пероральном, подкожном иинтраперитонеальном введении живых лактобактерий, супернатантов, убитых культур илифрагментов их стенок. В условиях in vitro и in vivo молочнокислые бактерии стимулируютпродукцию интерферонов и интерлейкинов (3, 7). Помимо перечисленных свойств, обеспечивающих иммуностимулирующий иантагонистический в отношении патогенов эффект, лактобактериям присущи и другиеважнейшие физиологические функции. Они активно участвуют в метаболизме углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот. Им, также как и бифидобактериям, принадлежитважная роль в регуляции водно-солевого обмена, поддержании рН и анаэробиоза вкишечнике, деконьюгации желчных кислот, синтезе витаминов, аминов и другихбиологически активных соединений. Большая часть изученных нами штаммов лактобактерий, выделенных из фекалий собак, была отнесена к виду L.acidophilum (56%), вторым по численности был вид L.plantarum (16%), третьим - L.helveticum (12%). ЭшерихииЭто сапрофиты, которые в норме входят в состав резидентной флоры кишечника. Онирасполагаются беспорядочно и равномерно по всей полости кишечника, локализуютсяпреимущественно в просвете и лишь отчасти примыкают к эпителию его ворсинок. Так же, как бифидо- и лактобактерии, эшерихии активно участвуют в ферментативныхпроцессах в кишечнике, образуя при этом органические кислоты, витамины и другиебиологически активные вещества. В 1905 году H. Conrad установил, что в результатежизнедеятельности эшерихий в питательной среде накапливаются бактерицидные вещества, препятствующие росту других бактерий. В настоящее время известно, что эшерихиипродуцируют как in vitro, так и in vivo до 24 типов таких веществ, названных колицинами. Возможно, кишечную флору следует именовать не сапрофитной, а условно- патогенной, таккак в сравнении с другими представителями, относящимся к данной категориимикроорганизмов, она является наиболее агрессивной: эшерихии числе первых заселяюторганизм после рождения и их чаще других обнаруживают в крови животных при сниженииестественного иммунитета, например, после облучения. Так, по данным авторов (2, 5), болеечем в 50 % случаев они являются причиной септицемии у облученных животных. Следуетпомнить, что огромное число эшерихий - патогены с постоянно выраженной высокойвирулентностью (приложение 4). В различных отделах кишечника здоровых собак количество эшерихий колеблется впределах от 102 до 109 колониеобразующих единиц на 1 г исследуемого материала. Собственные исследования, проведенные на здоровых собаках, показывают, что количествоэшерихий колеблется в пределах 106-109 в одном грамме фецес. БактероидыВ состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, а также ротовой полости, верхних дыхательных путей, мочеполовых органов, входят бактероиды. Род Bacteroides включает более 20 видов, большинство из которых выделяется из организма человека иживотных. В условиях кислой среды бактероиды проявляют антагонистическую активность поотношению к сальмонеллам, эшерихиям, другим микроорганизмам и, по-видимому, играютсущественную роль в резистентности организма к инфекциям. Однако результатыисследований последних лет свидетельствуют об их участии в этиологии многихпатологических процессов: энтеритов, некротических гепатитов, перитонитов, менингитов ит. д. Изучение патогенности представителей данного рода на животных свидетельствует обих синергизме в развитии инфекционных процессов, который отмечают в отношенииборрелий, микоплазм, стрептококков, стафилококков, пастерелл, а у человека - холерноговибриона (6). В 1 г содержимого толстого отдела кишечника здоровых собак их количество колеблется впределах 107-1010. ЭнтерококкиШироко распространены в природе фекальные стрептококки или энтерококки. Ихобнаруживают в кишечнике и фекалиях человека и животных, а также в почве и воде. Энтерококки являются облигатными представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и некоторые из них (главным образом Ent. faecium) включают в составпробиотических препаратов для нормализации кишечной микрофлоры. Антагонистическиефункции этих микроорганизмов связаны, главным образом, с их кислотообразующимисвойствами и способностью продуцировать бактериоцины. В тоже время энтерококки - это факультативно-анаэробные условно-патогенныемикроорганизмы, способные вызывать у животных и человека гастроэнтериты, пневмонии, маститы, эндокардиты, менингиты, септицемию и другие заболевания. Как и свойственновсем условно-патогенным микроорганизмам, их отрицательное воздействие проявляется уособей со снижением общей резистентности. Содержание представителей данного рода микроорганизмов у здоровых собак составляет104-108/ г фекалий (собственные исследования). Клостридии В организме животных и человека обнаруживается до 35 видов клостридий. Количественныйпоказатель отдельных видов (Cl.clostridiforme, Cl.innocuum, Cl.ramosum) может достигать108-109/г фекалий (11). По данным собственных исследований, частота выделения клостридий из кишечника собакколебалась в пределах 75-100% случаев. Их удельное содержание в различных отделахсоставляло от 0 до 104 /г исследуемого материала. Характерной особенностью клостридий является их способность к сапрофитномусуществованию в почве и желудочно-кишечном тракте человека и животных. Рольпредставителей данного рода для макроорганизма (исключая патогенные виды) изученанедостаточно. Имеются данные литературы, свидетельствующие о синтезе клостридиямивитаминов: никотиновой, фолиевой, пантотеновой кислот и рибофлавина (12). Поэтомуестественно предполагать, что клостридии также участвуют в поддержании кишечногонормобиоза своего хозяина. Более того, некоторые авторы считают, что клостридии, вособенности тех видов, количество которых может достигать больших величин, являютсянаиболее древней регуляторной системой микроэкологии человека и животных, обеспечивающей гомеостатические взаимоотношения между хозяином и его микрофлорой. Грибы рода Candida Дрожжеподобные грибы рода Candida составляют самостоятельный род и насчитываютболее 80 видов. Они входят в состав нормальной флоры, заселяющей слизистые оболочкиреспираторного аппарата и желудочно-кишечного тракта, а также половых органов и кожи. Из фекалий здоровых собак мы высевали их в количествах до 103, редко - 104/г. Грибы родаCandida также относятся к условно-патогенным микроорганизмам, и все факторы, снижающие общую или колонизационную резистентность макроорганизма и угнетающиенеспецифическую иммунную защиту, создают условия для активизации их роста и развитияспецифического заболевания - кандидамикоза. В экспериментах на обезьянах и собакахпоказано, что эти микроорганизмы могут проникать в организм хозяина через слизистыеоболочки кишечного тракта и поступать в кровь. Существенное значение в патогенезезаболевания имеет эндотоксин, вызывающий поражение паренхиматозных органов. Перечисленные выше группы микроорганизмов составляют основную часть более или менееизученной для желудочно-кишечного тракта животных резидентной микрофлоры. При этомследует отметить тот факт, что только бифидо- и лактобактерии являютсямикроорганизмами, участие которых в патологических процессах (как прямое, так икосвенное) на сегодняшний день не установлено. Кроме резидентной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте спорадически встречаются идругие микроорганизмы, именуемые транзиторными, которые чаще всего высеваются призаболеваниях желудочно-кишечного тракта животных, хотя и среди них встречаютсясапрофитные виды микробов. В первую очередь это клебсиеллы, псевдомонасы, протей, стафилококки, спирохеты, цитробактеры, энтеробактеры, плесневые грибы и другие. На количественное разнообразие резидентной микрофлоры собак, на численноесоотношение в микробиоценозе того или иного биотопа резидентной и транзиторноймикрофлоры основное влияние оказывают возраст, тип кормления и различные факторывнешней среды, включая применение лекарственных препаратов. Пока в микробиоценозахпреобладают представители нормальной микрофлоры, сохраняется КР и здоровьемакроорганизма в целом. Если же внешние воздействия (химиотерапевтические препараты, пестициды и другие яды, стрессы, вирулентные микроорганизмы и т.д.) по своейинтенсивности превышают компенсаторные механизмы экологической системы«макроорганизм - его нормальная микрофлора», то в микробиоценозах начинаетпреобладать транзиторная микрофлора, что ведет к развитию локальных инфекционныхпроцессов, либо даже генерализованной инфекции и другим осложнениям. Таким образом, очевидно, что животный организм и населяющая его микрофлора являютсявзаимозависимыми и сосуществующими частями единой системы. С экологических позицийвзаимодействие между макро- и микроорганизмами является частным случаем универсальнораспространенного в живом мире симбиоза с его различными формами (комменсализм, мутуализм, паразитизм, хищничество и т.п.). Исходя из выше сказанного следует, что взаимодействие между нормальной микрофлорой иорганизмом хозяина преимущественно осуществляется на уровне мутуализма. Микроорганизмы кишечника, являясь частью нормофлоры, одновременно представляютсобой сложную саморегулирующуюся открытую систему, где их различные популяцииимеют многообразные взаимоотношения как на уровне их сообществ, так и с организмомхозяина. Наиболее заметную роль играют их конкурентно-антагонистические свойства, что, в основном, и определяет нормальное функционирование единой экологической системы: животный организм - окружающая его среда

7. Иммунная система организма. Виды иммунитета

Иммунная системы человека обеспечивает специфическую защиту организма от генетически чужеродных молекул и клеток, в том числе инфекционных агентов - бактерий, вирусов, грибов, простейших.

Лимфоидные клетки созревают и функционируют в определенных органах.

Органы иммунной системы делят на:

1) первичные (центральные); вилочковая железа, костный мозг являются местами дифференцировки популяций лимфоцитов;