Цитология - наука о клетке

Из разных видов бактерий выделено около 200 различных рестриктаз, для которых описаны сайты рестрикции.

Методы генной инженерии. Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помощью той же рестрикционной эндонуклеазы, поэтому его «липкие» концы являются комплиментарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды. Ферментом лигазой «сшивают» оба куска ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию Е. coli . Все потомки этой бактерии, называемые клоном, содержат в плазмидах чужеродный ген и способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном. Весь процесс получения таких бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий:

1. Рестрикция - разрезание ДНК рестрикционной эндонуклеазой (рестриктазой) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2. Лигирование - включение фрагментов ДНК в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высевают на студнеобразную питательную среду, предварительно разведя их так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининг - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченным зондом. Зонд - это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке, образовавшихся из-за радиоактивной метки зонда, позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном .

Не всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей, некоторые гены не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с вырезания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента - обратной транскриптазы синтезируют комплиментарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой Н - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой комплиментарной второй цепи ДНК.

Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены. С помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК. Это позволяет изучить первичную структуру клонированного фрагмента, что приближает нас к пониманию организации структуры хромосомы. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то экспериментально можно изучить механизм, регулирующий транскрипцию этого гена, а также наработать нужный белок в том количестве, которое требуется для медицинских или исследовательских целей. Кроме того, клонированный фрагмент ДНК одного организма можно ввести в клетки другого организма. Уже предпринимаются попытки вводить в те или иные культурные растения гены, обеспечивающие устойчивость к ряду болезней. Не за горами вмешательство в наследственную программу, полученную ребенком от родителя. Станет возможным введение в зародыш на ранних этапах его развития каких-либо недостающих генов и тем самым избавление людей от страданий, вызываемых генетическими болезнями.

Сегодня накапливаются клонированные фрагменты ДНК человека, ряда сельскохозяйственных животных и растений. Коллекцию разных клонов называют клонотекой, геномной библиотекой или банком генов. Для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов.

Процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован.

Бурное развитие новых методов исследований в генетике, расширение и углубление наших представлений о структуре и законах организации наследственного аппарата клетки обусловили создание и разработку принципиально новых методов селекции. Раньше генетическое разнообразие форм растений и животных - исходного материала для селекции - экспериментально создавалось методами гибридизации, полиплоидии, мутагенеза и другими. Теперь ученые могут достигать еще большего разнообразия благодаря манипулированию отдельными клетками живого организма, отдельными хромосомами и отдельными генами. Родились новые понятия и направления современной генетики: клеточная инженерия, хромосомная инженерия и генная инженерия. При этом принципиальное отличие данных методов от традиционно используемых в селекции, например мутагенеза, состоит в целенаправленном, а не случайном расширении границ изменчивости генотипа, в планируемом разнообразии исходного материала для селекции. Наибольшее применение эти современные методы получили в селекции растений.

Клеточная инженерия связана с культивированием отдельных клеток или тканей на специальных искусственных средах. Показано, что если взять кусочки ткани или отдельные клетки из разных органов, допустим, растений, хотя это возможно и уживотных, и пересадить их на специальные среды, содержащие минеральные соли, аминокислоты, гормоны и другие питательные компоненты, то они способны расти. Это значит, что в таких изолированных от организма тканях и клетках продолжаются клеточные деления.

Но самым важным и интересным оказалось то, что отдельные растительные клетки (в отличие от клеток животных) в таких искусственных условиях обладают тотипотентно-стью, т. е. способны к регенерации (формированию) полноценных растений. Эта их способность была использована для селекции в разных направлениях.

Селективные среды. Если необходимо, например, получить солеустойчивые растения, то составляется специальная питательная среда для культивирования клеток растений с повышенным содержанием солей (например, NaCl) и высеваются на эти среды в чашках Петри тысячи растительных клеток. Большинство таких клеток, не выдерживая высокие концентрации солей, гибнет, но отдельные выживают и из них, как наиболее солеустойчивых, могут регенерировать целые растения. Это один из примеров селекции на клеточном уровне, когда отбору подвергаются не растения, а клетки, из которых потом воспроизводятся растения. Преимущества клеточной селекции очевидны, так как в объеме одной чашки Петри можно поместить тысячи клеток. Это во много раз повышает возможности отбора.

Вторым новейшим методом клеточной селекции у растений, уже давшим огромный эффект, является метод гаплоидов. Напомним, что гаплоидами называются организмы с уменьшенным вдвое числом хромосом, у которых в ядрах клеток из каждой пары гомологичных хромосом, характерных для диплоидов, присутствует только одна хромосома. Например, если у кукурузы диплоидные растения имеют 20 хромосом, то гаплоидные - всего 10 хромосом. Гаметы, в том числе и мужские (пыльцевые зерна), имеют гаплоидный набор хромосом. Этот факт и был использован для получения гаплоидных растений.

Сейчас разработан метод проращивания пыльцевых зерен на искусственных питательных средах в пробирках и получения из них полноценных гаплоидных растений. Комбинационная селекция в основе ее лежит гибридизация, в результате которой получаются гетерозиготные организмы, а затем длительная гомозиготизация до восьмого поколения, т. е. получение стабильных нерасщепляющихся форм. На создание сорта таким методом уходит более 10 лет. С помощью гаплоидов этот срок можно сократить в 2 раза. Для этого получают гибриды, берут из них пыльцу, на питательных средах в пробирках регенерируют из нее гаплоидные растения, а затем удваивают у них число хромосом и сразу получают полностью гомозиготные диплоидные растения. Вся эта процедура вместо 6-8 лет занимает 2-3 года.

Так как мы берем пыльцу из гибридных растений и получаем через гаплоидные растения сразу гомозиготные диплоидные, то остается только оценить их и затем размножить лучшие.Хромосомная инженерия в настоящий момент связывается прежде всего с возможностями замещения (замены) отдельных хромосом у растений или добавления новых. Известно, что в клетках каждого диплоидного организма имеются пары гомологичных хромосом. Такой организм называют дисомиком. Если в какой-либо паре хромосом остается одна гомологичная хромосома, то получается моносомик. При добавлении третьей гомологичной хромосомы возникает трисомик, а при отсутствии в геноме одной пары гомологичных хромосом возникает нуллисомик.

Такие манипуляции с хромосомами дают возможность заменять одну или обе гомологичные хромосомы, допустим, одного сорта пшеницы на ту же пару хромосом, но из другого сорта. Что это дает селекционеру? Тем самым он может один признак, который ему кажется слабым у данного сорта (например, качество зерна или устойчивость сорта к болезням), заменить на этот же, но более сильный признак из другого сорта. Таким образом, он приближается к созданию «идеального» сорта, у которого все полезные признаки (качества) будут выражены в максимальной степени.

Эту же цель преследует и методика замены отдельных хромосом одного вида (например, пшеницы) на хромосомы другого вида, близкого по своему происхождению (например, ржи). В научной литературе принято вместо слов «замена хромосом» употреблять «замещение хромосом». Поэтому полученные таким путем формы называются замещенными линиями.

Другой методический прием состоит во введении (внедрении) в геном определенного вида или сорта какой-либо дополнительной пары хромосом другого вида растений, которые определяют развитие признака, отсутствующего у первого вида. Если такое введение пары дополнительных хромосом удается осуществить, то полученные формы называют дополненными линиями.

Генная инженерия. Под генной инженерией обычно понимают искусственный перенос нужных генов от одного вида живых организмов (бактерий, животных, растений) в другой вид, часто очень далекий по своему происхождению. Чтобы осуществить перенос генов (или трансгенез), необходимо выполнить следующие сложные операции:

- выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса. Иногда эту операцию заменяют искусственным синтезом нужных генов, если таковой оказывается возможным;

- создание специальных генетических конструкций (векторов), в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида. Такие конструкции кроме самого гена должны содержать все необходимое для управления его работой (промоторы, терминаторы) и гены-«репортеры», которые будут сообщать, что перенос успешно осуществлен;

- внедрение генетических векторов сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы (регенерация).

Растения и животные, геном которых изменен в результате таких генно-инженерных операций, получили название трансгенных растений или животных.Для более наглядного представления рассмотрим пример, в котором ученым из разных стран, в том числе и нашей, удалось с помощью генно-инженерных методов создать ценные для селекции новые формы растений

В природе существует бактерия Bacillus thuringiensis, которая нарабатывает белок, называемый d-эндотоксином. Свое название он получил потому, что при попадании этой бактерии в желудок насекомых - вредителей сельскохозяйственных растений этот белок вызывает лизис (разрушение) стенки желудка и гибель насекомого-вредителя. Это свойство белка генные инженеры решили использовать для создания форм полезных сельскохозяйственных растений, устойчивых к насекомым-вредителям. Они выделили из бактериальной ДНК ген, кодирующий белок d-эндотоксин . Далее ген был встроен в состав природных генетических векторов - Ti-плазмид, присутствующих в клетках почвенной бактерии Agrobacterium tumefaeiens. Этой бактерией были заражены "кусочки растительной ткани, выращиваемой на питательной среде. Через некоторое время плазмиды, несущие ген белка-токсина, внедрились в растительные клетки, а затем ген встроился в ДНК растений. О том, что этот процесс прошел успешно, сообщил специальный ген-«репортер», также искусственным путем введенный в состав Ti-плазмид. Затем кусочки растительной ткани перенесли на питательную среду другого состава, которая обеспечивает рост и развитие полноценных растений. В конце концов такие растения были выращены, и оказалось, что если на их листья посадить гусениц насекомых-вредителей, то, попробовав растительной ткани с белком-токсином, гусеницы погибают. Важно, что белок-токсин оказался гибельным только для насекомых и совершенно безвреден для человека и сельскохозяйственных животных. Описанным выше путем к настоящему моменту удалось получить формы картофеля, томатов, табака, рапса, устойчивые к разнообразным сельскохозяйственным вредителям. Это одно из первых и самых значительных достижений генной инженерии растений в практической селекции.

Новые методы селекции животных. Мощное развитие животноводства за последние десятилетия привело к появлению выдающихся пород животных. Продуктивность молочного скота у некоторых пород достигла 8-9 тыс. кг. Новый сибирский тип российской мясо-шерстной породы овец отличается высокой мясной и шерстной продуктивностью. Средняя масса плембаранов составляет 11О-130 кг, средний настриг шерсти в чистом волокне 6-8 кг. Лучшие породы кур дают по 400 яиц в год на несушку, а бройлерные цыплята достигают массы 2,5-3 кг за семь недель. Примеры достижений селекции можно перечислять очень долго. Однако больше интересует какие новые методы селекции используются для совершенствования животных. Таких методов много, остановимся на некоторых из них.

Посмотрим, для примера, как осуществляется селекционный процесс у молочного скота. Комплекс селекционных приемов, используемых в молочном скотоводстве, называется крупномасштабной селекцией. Она обеспечивает очень эффективный отбор производителей, создание больших запасов замороженной спермы от выдающихся быков, отбор и эффективное использование лучших коров. Методы гормональной суперовуляции и трансплантации позволяют получать от лучших коров десятки зигот в год и выращивать их в коровах, имеющих более низкую племенную ценность. Вся система управляется из единого информационного центра. Такая широкомасштабная селекция позволяет повышать продуктивность породы на 1-2% в год. Это очень высокий показатель для таких медленно размножающихся животных, как крупный рогатый скот.

Успехи селекции. Создание продовольственного потенциала как в мире, так и в нашей стране базируется на использовании потенциала сортов растений и пород животных, полученных в процессе селекции. Другими словами, наше благополучие напрямую связано с уровнем развития и эффективностью селекции, что и определяет ее особую значимость для человечества. Хотя человек и освоил под сельское хозяйство всего 10% суши нашей планеты, но увеличить значительно долю пахотных земель сегодня невозможно, так как все доступные на сегодня резервы пригодных для сельского хозяйства земель фактически исчерпаны. Остается одно - значительно увеличить отдачу используемых земель, резко повысить продуктивность растений и животных. И в этом деле селекция приобретает особое значение, так как именно она создает потенциал продуктивности растений и животных.

За предшествующие 100 лет в деле улучшения растений и животных селекция сделала поразительные успехи. Например, урожайность зерновых культур за это время повысилась почти на порядок. Сегодня во многих развитых странах получают рекордные урожаи (100 ц/га) пшеницы, риса, кукурузы.

Считается, что конечный результат в растениеводстве на 50% зависит от уровня урожайности сорта, на такую же величину от совершенства технологии земледелия и возделывания растений.

Столь же внушительные результаты получены и в животноводстве. В процессе селекции созданы породы крупного рогатого скота, дающие более 10 тыс. кг молока на корову за год. Естественно, что и в животноводстве, кроме породы, большую роль играет технология содержания и кормления животных. Однако как у растений, так и у животных определяющей компонентой конечной продуктивности является биологический потенциал сортов и пород, созданный в процессе селекции.

Сравнение средних и рекордных урожаев свидетельствует лишь о тех резервах, которые заложены в новых сортах и которые могут быть реализованы при совершенствовании технологий возделывания растений. Это свидетельствует и о том, что селекция имеет огромные перспективы в деле наращивания продовольственного потенциала.

Успехи биотехнологии впечатляют: ученые могут, например, разделить эмбрион коровы в стадии 16- 32 клеток на несколько частей. И из каждой такой части эмбриона у приемной матери может развиться полноценный теленок .

Селекционер, создающий новые сорта растений и породы животных,- это прежде всего ученый, в совершенстве владеющий знаниями генетики, систематики, физиологии и многих других наук. Кроме того, это, образно говоря, художник, создающий вначале абстрактный образ будущего сорта растений или породы животных и только после этого приступающий к его реальному воплощению.

Клеточная инженерия у растений заключается в получении растений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированными клетками, направленными на преобразование их генотипов. Метод получения растений из одной клетки основан на способности тканей растений ряда видов к неорганическому росту на специальных искусственных средах, содержащих питательные вещества и регуляторы роста. При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших название каллуса.

затем каллус разделить на отдельные клетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах, то из отдельных (одиночных) клеток могут развиться настоящие растения. Способность одиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение, называют тотипотентностыо. Возможно, тотипотентность присуща клеткам всех листостебельных растений. Но пока она обнаружена у растений ограниченного круга. В частности, эта способность обнаружена у клеток картофеля, моркови, табака и ряда других видов сельскохозяйственных культур. Этот метод клеточной инженерии растений уже вошел в широкую практику. Однако растения, развившиеся из одной клетки, характеризуются генетической нестабильностью, что связано с мутациями их хромосом. Поскольку генетическая нестабильность дает разнообразные формы растений, они очень полезны в качестве исходного материала для селекции.

Однако растения можно получить и из так называемых протопластов растительных клеток, под которыми понимают клетки, у которых искусственно с помощью гидролитических ферментов (пек-тиназы и целлюлазы) удалена клеточная стенка. Обычно протопласты получают из клеток листьев, корней, лепестков, прорастающей пыльцы, плодов и других структур растений. Способность протопластов давать начало растениям выявлена у очень большого количества видов.

Получение растений из одной клетки или протопласта часто называют клональным микроразмножением. Главнейшее преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет резко сократить сроки размножения многих видов растений, а также очень быстро воспроизвести одно и то же растение в сотнях тысяч экземпляров, что имеет исключительно важное значение в селекционной работе и в получении посадочного материала, незараженного возбудителями болезней .

Генетические манипуляции, связанные с растительными клетками, направлены на преобразование генотипов клеток растений, что достигают либо путем соматической гибридизации (получения гибридных клеток) либо путем переноса в клетки генетического материала, происходящего от других организмов. Во всех случаях исходным материалом являются протопласты клеток.

Соматическую гибридизацию осуществляют в несколько этапов, а именно:

1. Получение и слияние протопластов, происходящих от клеток растений разных видов.

2. Культивирование гибридных протопластов, используя селективные питательные среды.

3. Регенерация растений из соматических гибридов (гибридов протопластов) через образование последними каллуса.

Как видно, соматическая гибридизация осуществляется по схеме растения -- протопласты -- каллус -- растения. Ее практическая ценность заключается в том, что соматические гибриды используют в селекционной работе.

Перенос генетического материала от одних клеток к другим осуществляют путем трансформации протопластов чужеродной ДНК либо введением в протопласты чужеродной ДНК с помощью плаз-мид. Из образующегося затем каллуса выращивают растения, содержащие интересующий ген. Растения, полученные таким путем, называют трансгенными растениями .

Культивирование клеток растений

Полемика, вызванная успешным клонированием ряда животных, почему-то оставила в тени успехи, связанные с клонированием растений. Ведь уже достаточно давно мы имеем дело либо непосредственно с растениями, разводимыми на основе клонирования, либо с веществами, полученными из культивируемых растительных клеток и тканей. Так, с помощью культивирования меристемы, гарантирующего безвирусность растения, были выведены всюду продаваемые гвоздики, хризантемы, герберы и другие декоративные растения. Также можно купить и цветки экзотических орхидных растений, производство клонов которых уже имеет промышленную основу. Некоторые сорта клубники, малины, цитрусовых выведены с использованием техники клонирования. Прежде для выведения нового сорта требовалось 10-30 лет, теперь же, благодаря применению методов культивирования тканей этот период сокращен до нескольких месяцев. Весьма перспективными признаются работы, связанные с производством на основе культивирования тканей растений лекарственных и технических веществ, которые невозможно получить путем синтеза. Так, уже получают подобным способом из клеточных структур барбариса изохинолиновый алкалоид берберин, а из женьшеня - гинсеносид.

Основу культивирования растительных клеток и тканей составляют содержащаяся в каждой клетке информация о всех свойствах и возможностях организма и способность клетки к самостоятельному обмену веществ. Для культивирования подходят различные органы растений. Как правило, используют молодые листья и осевые побеги верхних мутовок, а также столоны, клубни, пыльники, кончики корней, пазушные почки и другие части растения. Меристемные ткани верхушек ростовых побегов и корней имеют особое значение для получения безвирусных клонов. Отобранный материал стерилизуется различными веществами. При этом необходимо соблюсти баланс времени, чтобы, с одной стороны, его продолжительность обеспечила уничтожение микроорганизмов, с другой - не повредила бы клетки самой растительной ткани. Подготовка материала к культивированию завершается многократным обмывом стерильной водой, после чего его помещают в стерильную рабочую банку на питательную среду и растят обязательно в стерильных условиях.

Свойство питательной среды определяются поставленными целями культивирования растительного материала, поскольку именно от заданных условий зависит конечный продукт. Питательная среда бывает жидкой или твердой. Она, как правило, состоит из большого числа синтетических веществ с заданной концентрацией. Поскольку изолированные растительные клетки и ткани большей частью являются гетеротрофными, в ней должен содержаться органически связанный углерод, источником которого обычно служат глюкоза или сахароза. Азот добавляется в форме нитратов, используемых клетками с помощью нитратредуктазы. Применяют также фосфор, калий, кальций, магний, сульфаты. Необходимым компонентом являются витамины, в особенности группы В (В1, В2, В6), миоинозит, биотин, а также аминокислоты и органические соли. К безусловно необходимым микроэлементам относятся бор, марганец, иод, медь, кобальт, молибден. Так, недостаток марганца препятствует синтезу белков, уменьшает количество РНК и приводит к увеличению содержания свободных аминокислот. Железо имеет значение для деления ядра и для деятельности дыхательных ферментов. Наконец, необходимо наличие в питательной среде ряда фитогормонов. Манипулируя концентрациями различных веществ в питательных средах, кислотностью последних, температурой, освещенностью и влажностью в камерах для культивирования, можно получить растения и вещества с требуемыми свойствами. В зависимости от используемых растительных клеток и тканей, способов культивирования различают следующие основные типы структур: каллюсные, суспензионные, протопластов, меристематические, пыльников.

Каллюсные структуры

Для каллюсных структур исходным материалом является каллюс - это ткань, образующаяся у растений на местах ранений и способствующая их заживлению. Она состоит из более или менее однородных паренхимных клеток, начало которым дает раневая меристема. Элементы каллюса мало дифференцированы, однако вблизи его поверхности наблюдается рост, обусловленный активностью меристематических клеток. Впоследствии в каллюсе возможна дифференцировка его элементов и образование флоэмы, ксилемы и других тканей. Наружные клетки каллюса опробковевают.

Для культивирования на выбранном органе делают надрез, на всей поверхности которого развивается ткань, состоящая из неорганизованно растущих клеток. Эта образовавшаяся ткань и культивируется в заданных условиях. В зависимости от вида растения и поставленной цели предварительно необходимо установить состав питательных сред и концентрации фитогормонов, требуемых для оптимального роста. Каллюсы могут выглядеть очень различно. Они бывают рыхлыми или плотными. Окраска каллюса позволяет судить об образовании вторичных веществ. Если каллюс содержать в полной темноте, он беловато-желтый. На свету он образует хлорофилл и становится зеленым. Красный свет указывает на наличие антоциана и бетациана. Чтобы ослабить или устранить эти эффекты, в питательную среду добавляют поливинилпирролидон, глутатион или аскорбиновую кислоту. Коричневые клетки образуются перед отмиранием, поэтому такую ткань необходимо поместить в свежую среду. При длительном культивировании каллюсы могут терять свой морфогенетический потенциал. После нескольких смен питательных сред и при добавлении ростовых гормонов каллюс дифференцирует и регенерирует, образует осевые побеги, корни и, наконец, все растение целиком, способное к размножению и выращиванию в грунте. Однако большей частью каллюсы используются в качестве исходного материала для клеточного или суспензионного культивирования.

Суспензионная культура

Для суспензионных культур исходным материалом могут быть кака изолированные целые клетки выбранного органа растения, так и измельченный каллюс. Образовавшиеся клетки помещают в жидкую питательную среду и культивируют при постояном перемешивании. Рост суспензионной культуры происходит во многих случаях существенно быстрее, чем каллюсной культуры, поскольку скопления клеток поглощают питательные вещества значительно большей общей поверхностью, а у каллюса это происходит лишь в той его части, которая лежит на субстрате. При этом происходит деление клеток, новые клетки не отделяются, и их скопление увеличивается. С помощью особых приемов суспензионную культуру можно перенести на твердую питательную среду. Здесь из клеток или комплексов клеток может образоваться способный к жизни каллюс. В суспензии могут возникнуть также и зародыши, которы после их переноса на агар образуют новое растение.

Культура протопластов.

Культуры протопластов получают главным образом из приготовленной из мезофила суспензии, обрабатывая ее ферментами, разрушающими клеточные стенки. В результате этого может произойти присоединение чужих органелл, а также чужой ДНК, которая в страивается в генетический материал ядра, что может выразиться в экспрессивности. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, необходимо нейтрализовать их отталкивание друг от друга, после чего они соединяются. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться и регенерируют новые растения. Во многих случаях удавались слияния протопластов разных родительских растений и последующая регенерация через культуру каллюса нового растения с заданными свойствами. Оказалось возможным скрещивать представителей разных видов и родов, что прежде не удавалось. Слиянием протопластов вырастили, например, гибрид картофеля и томата, "томофель". Этот способ имеет коммерческое значение при выведении новых сортов соевых бобов, цитрусовых, сахарного тростника, кукурузы, пшеницы и картофеля. Получен также гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше алкалоида тропана в сравнении с родительскими растениями.

Меристематическая культура.

Для меристематической культуры используют меристему - образовательную ткань растений, долго сохраняющую способность к делению и образованию новых клеток и отличающуюся высокой метаболической активностью. Для культивирования изолируют конусы нарастания побегов, корней, а также пазушные почки. Меристематические культуры более известны в садоводстве, так как они дают возможность получить безвирусные клоны. Из этого можно сделать вывод, что распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема их лишена. Из безвирусной меристемы в большом количестве могут регенерировать генетически идентичные безвирусные растения. Этот способ используют для выведения сортов картофеля, винограда, а также декоративных растений и в лесоводстве.

Культура пыльников используется для получения галлоидных растений. Как правило, растение является диплоидным, т.е. в его клетках содержится два гомологичных набора хромосом. Только зародышевые клетки являются гаплоидными. Для получения гаплоидной культуры наиболее удобны незрелые пыльники, в которых пыльцевые зерна находятся еще в стадии, предшествующей первому делению микроспор на вегетативное и генеративное зерна. После переноса стерильных пыльников на питательную среду пыльцевые клетки начинают делиться. Развивается промежуточный каллюс или сразу образуется гаплоидный зародыш, который позднее дифференцируется в гаплоидное растение. Такие гаплоидные растения стерильны, но они могут перейти в диплоиды после воздействия колхицина или слияния протопластов. Так образуются плодовитые гомозиготные чистые линии растений, имеющие большое значение для селекции, поскольку в последующих поколениях всегда встречаются те же заданные признаки. Благодаря этому методу выведены новые сорта зерновых и табака, а также получены многочисленные лекарственные растения с улучшенными свойствами.

Регенерация

Регенерация - явление восстановления целого организма из его части. При культивировании регенерация может происходить разными путями: прямая регенерация из культур меристемы, верхушечных побегов, пазушных почек и узлов, причем дифференциация управляется фитогормонами, и косвенная, с промежуточной стадией каллюса. В последнем случае возможны также возможны два пути: при органогенезе определенными концентрациями и соотношениями фитогормонов вызывают образование придаточных побегов и корней; при соматическом эмбриогенезе в каллюсе образуются зародыши, из которых вырастает растение, затем переносимое в грунт. В таблице приведены данные об атомном составе клеток. Из 109 элементов периодической системы Менделеева в клетках обнаружено значительное их большинство. Особенно велико содержание в клетке четырех элементов - кислорода, углерода, азота и водорода. В сумме они составляют почти 98% всего содержимого клетки. Следующую группу составляют восемь элементов, содержание которых в клетке исчисляется десятыми и сотыми долями процента. Это сера, фосфор, хлор, калий, магний, натрий, кальций, железо. В сумме они составляют 1.9%. Все остальные элементы содержатся в клетке в исключительно малых количествах (меньше 0,01%)

Таким образом, в клетке нет каких-нибудь особенных элементов, характерных только для живой природы. Это указывает на связь и единство живой и неживой природы. На атомном уровне различий между химическим составом органического и не органического мира нет. Различия обнаруживаются на более высоком уровне организации - молекулярном.

Клетка многоклеточного организма может существовать в двух состояниях: нормальном и трансформированном, т.е. опухолевом. Для исследовательских целей во многих случаях более удобна культура опухолевых клеток.

Опухолевая клетка по многим биохимическим признакам отличается от нормальной. Её наиболее характерным отличительным свойством является способность к непрерывному делению, которое не подчиняется регуляторным сигналам организма. В результате деления из одной клетки образуются две, также способные к бесконтрольному делению, т.е. способность к нерегулируемому делению передается по наследству. Увеличение размера опухоли происходит за счет размножения исходной опухолевой клетки, а не превращения новых нормальных клеток в опухолевые. Отсюда следует, что из одной опухолевой клетки в организме может возникнуть опухолевой узел.

Имеются прямые доказательства того, что опухоли человека имеют моноклональное происхождение (клон - некоторое количество клеток, произошедших от одной родительской клетки в результате ее деления).

Помимо способности к бесконтрольному росту еще два свойства опухолей определяют ихопасность для жизни организма: способность к инвазии и метастазированию Инвазия - явление прорастания опухоли в нормальные ткани, нарушая их питание, функционирование, что приводит их к гибели.

Метастазирование - это способность злокачественной опухоли образовывать опухолевые узлы в отдаленных от первичной опухоли частях организма. Опухолевые клетки, в отличие от нормальных, плохо скреплены между собой. Отрываясь от основного узла, одиночные опухолевые клетки током крови или лимфы разносятся по всему организму. В некоторых органах они могут задержаться и начать делиться, что приведет к образованию новых опухолевых узлов, способных к инвазии, таким образом, даже если опухоль поражен не жизненно важный орган, то и в этом случае способность опухоли к метастазированию делает ее опасной для жизни.

Особый интерес представляет вопрос, может ли идти обратный процесс, т.е. может ли из опухолевой клетки образоваться нормальная? Дать положительный ответ, разумеется, никто не решится, но в то же время имеются данные, свидетельствующие о теоретической возможности перерождения - нормализации опухолевых клеток.

Было отмечено, что при введении некоторых веществ (масляной кислоты, диметилсульфоксида, витамина А и др.) в клеточную культуру опухоли, клетки по некоторым биохимическим признакам становились похожими на нормальные, однако при удалении этих веществ клетки вновь приобретали опухолевые черты.

Беатриса Минц, одна из исследователей рака, пересаживала клетку тератомы - опухолисеменников черной мыши в полость бластулы (этап развития оплодотворенной яйцеклетки) белой мыши. Через положенный срок рождались мышата, которые отличались от контрольных только тем, что они были пестрыми - на белой шкурке были черные полосы. Следовательно, в окружении нормальных клеток опухолевая клетка включилась в процессы развития организма как нормальная клетка.

Наконец, каждый из нас слышал о чудесных случаях исчезновения опухолей и выздоровления больных раком. Анализ историй болезней людей, болевших в стадии, когда медицина была бессильна им помочь и никакого лечения не проводилось, показывает, что очень малая доля больных по совершенно непонятным причинам выздоравливала. Погибали ли опухолевые клетки в организме в результате изменений в функционировании всего организма, превращались ли они в нормальные клетки - совершенно неизвестно.

Итак, рак это с одной стороны генетическое заболевание, когда ломается заранее заданная программа клеточного деления и клетка переходит в режим безостановочного самовоспроизводства, а с другой стороны - иммунное заболевание, поскольку происходит нарушение координации в системе надзора за тем, чтобы клетки, нарушившие закон о строгом выполнении программы развития, уничтожались. Исследования клетки имеют большое значение для разгадки заболеваний. Именно в клетках начинают развиваться патологические изменения, приводящие к возникновению заболеваний. Чтобы понять роль клеток в развитии заболеваний, приведем несколько примеров. Одно из серьезных заболеваний человека - сахарный диабет. Причина этого заболевания - недостаточная деятельность группы клеток поджелудочной железы, вырабатывающих гормон инсулин, который участвует в регуляции сахарного обмена организма. Злокачественные изменения, приводящие к развитию раковых опухолей, возникают также на уровне клеток. Возбудители кокцидиоза - опасного заболевания кроликов, кур, гусей и уток - паразитические простейшие - кокцидии проникают в клетки кишечного эпителия и печени, растут и размножаются в них, полностью нарушают обмен веществ, а затем разрушают эти клетки. У больных кокцидиозом животных сильно нарушается деятельность пищеварительной системы, и при отсутствии лечения животные погибают. Вот почему изучение строения, химического состава, обмена веществ и всех проявлений жизнедеятельности клеток необходимо не только в биологии, но также в медицине и ветеринарии.

Изучение клеток разнообразных одноклеточных и многоклеточных организмов с помощью светооптического и электронного микроскопов показало, что по своему строению они разделяются на две группы. Одну группу составляют бактерии и сине-зеленые водоросли. Эти организмы имеют наиболее простое строение клеток. Их называют доеденными (прокариотами), так как у них нет оформленного ядра (греч. «картон»-ядро) и нет многих структур, которые называют органоидами. Другую группу составляют все остальные организмы: от одноклеточных зеленых водорослей и простейших до высших цветковых растений, млекопитающих, в том числе и человека. Они имеют сложно устроенные клетки, которые называют ядерными (эукариотическими). Эти клетки имеют ядро и органоиды, выполняющие специфические функции.Особую, неклеточную форму жизни составляют вирусы, изучением которых занимается вирусология.

Клетка любого организма, представляет собой целостную живую систему. Она состоит из трех неразрывно связанных между собой частей: оболочки, цитоплазмы и ядра. Оболочка клетка осуществляет непосредственное взаимодействие с внешней средой и взаимодействие с соседними клетками (в многоклеточных организмах).

Оболочка клеток. Оболочка клеток имеет сложное строение. Она состоит из наружного слоя и расположенной под ним плазматической мембраны. Клетки животных и растений различаются по строению их наружного слоя. У растений, а также у бактерий, сине-зеленых водорослей и грибов на поверхности клеток расположена плотная оболочка, или клеточная стенка. У большинства растений она состоит из клетчатки. Клеточная стенка играет исключительно важную роль: она представляет собой внешний каркас, защитную оболочку, обеспечивает тургор растительных клеток: через клеточную стенку проходит вода, соли, молекулы многих органических веществ.

Наружный слой поверхности клеток животных в отличие от клеточных стенок растений очень тонкий, эластичный. Он не виден в световой микроскоп и состоит из разнообразных полисахаридов и белков. Поверхностный слой животных клеток получил название гликокаликс.

Гликокаликс выполняет прежде всего функцию непосредственной связи клеток животных с внешней средой, со всеми окружающими ее веществами. Имея незначительную толщину (меньше 1 мкм), наружный слой клетки животных не выполняет опорной роли, какая свойственна клеточным стенкам растений. Образование гликокаликса, так же как и клеточных стенок растений, происходит благодаря жизнедеятельности самих клеток.

Плазматическая мембрана. Под гликокаликсом и клеточной стенкой растений расположена плазматическая мембрана (лат. “мембрана»-кожица, пленка), граничащая непосредственно с цитоплазмой. Толщина плазматической мембраны около 10 нм, изучение ее строения и функций возможно только с помощью электронного микроскопа.

В состав плазматической мембраны входят белки и липиды. Они упорядочено расположены и соединены друг с другом химическими взаимодействиями. По современным представлениям молекулы липидов в плазматической мембране расположены в два ряда и образуют сплошной слой. Молекулы белков не образуют сплошного слоя, они располагаются в слое липидов, погружаясь в него на разную глубину.

Молекулы белка и липидов подвижны, что обеспечивает динамичность плазматической мембраны.

Плазматическая мембрана выполняет много важных функций, от которых завидят жизнедеятельность клеток. Одна из таких функций заключается в том, что она образует барьер, отграничивающий внутреннее содержимое клетки от внешней среды. Но между клетками и внешней средой постоянно происходит обмен веществ. Из внешней среды в клетку поступает вода, разнообразные соли в форме отдельных ионов, неорганические и органические молекулы. Они проникают в клетку через очень тонкие каналы плазматической мембраны. Во внешнюю среду выводятся продукты, образованные в клетке. Транспорт веществ- одна из главных функций плазматической мембраны. Через плазматическую мембрану из клети выводятся продукты обмена, а также вещества, синтезированные в клетке. К числу их относятся разнообразные белки, углеводы, гормоны, которые вырабатываются в клетках различных желез и выводятся во внеклеточную среду в форме мелких капель.

Клетки, образующие у многоклеточных животных разнообразные ткани (эпителиальную, мышечную и др.), соединяются друг с другом плазматической мембраной. В местах соединения двух клеток мембрана каждой из них может образовывать складки или выросты, которые придают соединениям особую прочность.

Соединение клеток растений обеспечивается путем образования тонких каналов, которые заполнены цитоплазмой и ограничены плазматической мембраной. По таким каналам, проходящим через клеточные оболочки, из одной клетки в другую поступают питательные вещества, ионы, углеводы и другие соединения.

На поверхности многих клеток животных, например, различных эпителиев, находятся очень мелкие тонкие выросты цитоплазмы, покрытые плазматической мембраной, - микроворсинки. Наибольшее количество микроворсинок находится на поверхности клеток кишечника, где происходит интенсивное переваривание и всасывание переваренной пищи.

Фагоцитоз. Крупные молекулы органических веществ, например белков и полисахаридов, частицы пищи, бактерии поступают в клетку путем фагоцита (греч. “фагео” - пожирать). В фагоците непосредственное участие принимает плазматическая мембрана. В том месте, где поверхность клетки соприкасается с частицей какого-либо плотного вещества, мембрана прогибается, образует углубление и окружает частицу, которая в “мембранной упаковке” погружается внутрь клетки. Образуется пищеварительная вакуоль и в ней перевариваются поступившие в клетку органические вещества.

Цитоплазма. Отграниченная от внешней среды плазматической мембраной, цитоплазма представляет собой внутреннюю полужидкую среду клеток. В цитоплазму эукариотических клеток располагаются ядро и различные органоиды. Ядро располагается в центральной части цитоплазмы. В ней сосредоточены и разнообразные включения - продукты клеточной деятельности, вакуоли, а также мельчайшие трубочки и нити, образующие скелет клетки. В составе основного вещества цитоплазмы преобладают белки. В цитоплазме протекают основные процессы обмена веществ, она объединяет в одно целое ядро и все органоиды, обеспечивает их взаимодействие, деятельность клетки как единой целостной живой системы.

Эндоплазматическая сеть. Вся внутренняя зона цитоплазмы заполнена многочисленными мелкими каналами и полостями, стенки которых представляют собой мембраны, сходные по своей структуре с плазматической мембраной. Эти каналы ветвятся, соединяются друг с другом и образуют сеть, получившую название эндоплазматической сети.

Эндоплазматическая сеть неоднородна по своему строению. Известны два ее типа - гранулярная и гладкая. На мембранах каналов и полостей гранулярной сети располагается множество мелких округлых телец - рибосом, которые придают мембранам шероховатый вид. Мембраны гладкой эндоплазматической сети не несут рибосом на своей поверхности.

Эндоплазматическая сеть выполняет много разнообразных функций. Основная функция гранулярной эндоплазматической сети - участие в синтезе белка, который осуществляется в рибосомах.

На мембранах гладкой эндоплазматической сети происходит синтез липидов и углеводов. Все эти продукты синтеза накапливаются в каналах и полостях, а затем транспортируются к различным органоидам клетки, где потребляются или накапливаются в цитоплазме в качестве клеточных включений. Эндоплазматическая сеть связывает между собой основные органоиды клетки.

Рибосомы. Рибосомы обнаружены в клетках всех организмов. Это микроскопические тельца округлой формы диаметром 15-20 нм. Каждая рибосома состоит из двух неодинаковых по размерам частиц, малой и большой.

В одной клетке содержится много тысяч рибосом, они располагаются либо на мембранах гранулярной эндоплазматической сети, либо свободно лежат в цитоплазме. В состав рибосом входят белки и РНК. Функция рибосом - это синтез белка. Синтез белка - сложный процесс, который осуществляется не одной рибосомой, а целой группой, включающей до нескольких десятков объединенных рибосом. Такую группу рибосом называют полисомой. Синтезированные белки сначала накапливаются в каналах и полостях эндоплазматической сети, а затем транспортируются к органоидам и участкам клетки, где они потребляются. Эндоплазматическая сеть и рибосомы, расположенные на ее мембранах, представляют собой единый аппарат биосинтеза и транспортировки белков.

Митохондрии. В цитоплазме большинства клеток животных и растений содержатся мелкие тельца (0,2-7 мкм) - митохондрии (греч. «митос» - нить, «хондрион» - зерно, гранула).

Митохондрии хорошо видны в световой микроскоп, с помощью которого можно рассмотреть их форму, расположение, сосчитать количество. Внутреннее строение митохондрий изучено с помощью электронного микроскопа. Оболочка митохондрии состоит из двух мембран - наружной и внутренней. Наружная мембрана гладкая, она не образует никаких складок и выростов. Внутренняя мембрана, напротив, образует многочисленные складки, которые направлены в полость митохондрии. Складки внутренней мембраны называют кристами (лат. «криста» - гребень, вырост) Число крист неодинаково в митохондриях разных клеток. Их может быть от нескольких десятков до нескольких сотен, причем особенно много крист в митохондриях активно функционирующих клеток, например мышечных.

Митохондрии называют «силовыми станциями» клеток» так как их основная функция - синтез аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Эта кислота синтезируется в митохондриях клеток всех организмов и представляет собой универсальный источник энергии, необходимый для осуществления процессов жизнедеятельности клетки и целого организма.

Новые митохондрии образуются делением уже существующих в клетке митохондрий.

Пластиды. В цитоплазме клеток всех растений находятся пластиды. В клетках животных пластиды отсутствуют. Различают три основных типа пластид: зеленые - хлоропласты; красные, оранжевые и желтые - хромопласты; бесцветные - лейкопласты.

Хлоропласт. Эти органоиды содержатся в клетках листьев и других зеленых органов растений, а также у разнообразных водорослей. Размеры хлоропластов 4-6 мкм, наиболее часто они имеют овальную форму. У высших растений в одной клетке обычно бывает несколько десятков хлоропластов. Зеленый цвет хлоропластов зависит от содержания в них пигмента хлорофилла. Хлоропласт - основной органоид клеток растений, в котором происходит фотосинтез, т. е. образование органических веществ (углеводов) из неорганических (СО2 и Н2О) при использовании энергии солнечного света.

По строению хлоропласты сходны с митохондриями. От цитоплазмы хлоропласт отграничен двумя мембранами - наружной и внутренней. Наружная мембрана гладкая, без складок и выростов, а внутренняя образует много складчатых выростов, направленных внутрь хлоропласта. Поэтому внутри хлоропласта сосредоточено большое количество мембран, образующих особые структуры - граны. Они сложены наподобие стопки монет.

В мембранах гран располагаются молекулы хлорофилла, потому именно здесь происходит фотосинтез. В хлоропластах синтезируется и АТФ. Между внутренними мембранами хлоропласта содержатся ДНК, РНК и рибосомы. Следовательно, в хлоропластах, так же как и в митохондриях, происходит синтез белка, необходимого для деятельности этих органоидов. Хлоропласты размножаются делением.

Хромопласты находятся в цитоплазме клеток разных частей растений: в цветках, плодах, стеблях, листьях. Присутствием хромопластов объясняется желтая, оранжевая и красная окраска венчиков цветков, плодов, осенних листьев.

Лейкопласты. находятся в цитоплазме клеток неокрашенных частей растений, например в стеблях, корнях, клубнях. Форма лейкопластов разнообразна.

Хлоропласты, хромопласты и лейкопласты способны клетка взаимному переходу. Так при созревании плодов или изменении окраски листьев осенью хлоропласты превращаются в хромопласты, а лейкопласты могут превращаться в хлоропласты, например, при позеленении клубней картофеля.

Аппарат Гольджи. Во многих клетках животных, например в нервных, он имеет форму сложной сети, расположенной вокруг ядра. В клетках растений и простейших аппарат Гольджи представлен отдельными тельцами серповидной или палочковидной формы. Строение этого органоида сходно в клетках растительных и животных организмов, несмотря на разнообразие его формы.