Размещено на http://www.allbest.ru/

ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И.И. МЕЧНИКОВА

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

Реферат на тему

«ИОННОЕ ПОЛУПРОВОДНИКОВОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ»

студент 5 курса

дневной формы обучения

Захаров Андрей Владимирович

Одеса - 2015

• ВВЕДЕНИЕ

Секвенирование нового поколения -- техника определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК для получения формального описания ее первичной структуры. Технология методов секвенирования нового поколения (СНП) позволяет «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов секвенирования. СНП осуществляется с помощью повторяющихся циклов удлинения цепи, индуцированного полимеразой, или многократного лигирования олигонуклеотидов. В ходе СНП могут генерироваться до сотен мегабаз и гигабаз нуклеотидных последовательностей за один рабочий цикл.

Быстрое совершенствование технологий секвенирования ДНК в последние годы привело к значительному снижению стоимости оцифровки генетической информации. Производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней. В результате стоимость заказного секвенирования геномов к середине 2011 года понизилась до 5000 $ (при заказе секвенирования 10 и более образцов).

Сегодняшние методы секвенирования позволяют достигнуть желаемого результата (получение нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты) с высокой скоростью при минимальных затратах. У каждого метода есть как свои преимущества, так и свои недостатки, которые и определяют рациональность использования метода в конкретной ситуации.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Первая концепция секвенирования была предложена Сэнгером в 1977 году. Технология получила название «метод обрыва цепи». В том же году Максам и Гилберт предложили альтернативный метод, получивший название «метод химической деградации». Необходимость в массовом, качественном и быстром секвенировании стимулировала многочисленные модификации и всевозможные улучшения этих методов. В той или иной степени изменениям подверглись практически все составляющие этого процесса. Переломной точкой развития технологии стало появление ПЦР и автоматизация основных этапов «чтения» ДНК, давшие начало методам секвенирования следующего поколения. Платформы для методов нового поколения основываются на распараллеливании процесса «чтения» ДНК, и таким образом за один прогон работы секвенатора можно определить первичные структуры нескольких участков генома. Секвенаторы нового поколения стали значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.

Все основные принципы работы технологий СНП базируются на секвенировании ДНК-чипов, используя интерактивные циклические ферментативные реакции с дальнейшим сбором полученной информации в виде иллюстраций. Полученные данные используются для восстановления нуклеотидной последовательности или, как для технологии SOLiD, динуклеотидных «цветов». Несмотря на разные методы получения копий (амплификация) участков генома и на техническую разницу дифференциации различных нуклеотидов в прочтённых последовательностях, общая схема работы для всех секвенаторов одна. Первый этап секвенирования -- создание библиотеки случайных последовательностей ДНК, которые можно будет сшить с общедоступными адаптерными последовательностями. Второй этап -- создание ампликонов с помощью ПЦР, которые будут использованы как образцы. Третий этап -- определение первичной структуры всех фрагментов.

ПРИНЦИП ИОННОГО ПОЛУПРОВОДНИКОВОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Микролунки, содержащие предназначенную для секвенирования молекулу матричной ДНК, наполняют дезоксирибонуклеотидтрифосфатом (dNTP) одного вида. Если введенный dNTP является комплементарным к ведущему нуклеотиду шаблона, он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение ионов водорода, который вызывает срабатывание ионного датчика ISFET, который указывает, что реакция произошла. Если в последовательности матричной цепи присутствует повтор одного нуклеотида, несколько молекул dNTP будут присоединены в одном цикле. Это приводит к увеличению количества образовавшихся ионов водорода и пропорционально более высокому электрическому сигналу.

Эта технология отличается от других технологий секвенирования тем, что не использует модифицированные нуклеотиды и оптические датчики. Ion semiconductor sequencing может также упоминаться как Ion torrent sequenсing, рН-опосредованное секвенирование, или полупроводниковое секвенирование. Разработанная Ion Torrent Systems, Inc технология была лицензирована из DNA Electronics Ltd, и выпущена в феврале 2010 года. Ion Torrent позиционировали свои системы как быстрые, компактные и экономичные секвенаторы, подходящие многим лабораториям как профессиональные системы. Roche's 454 Life Sciences сотрудничает с DNA Electronics в разработке компактной, читающей длинные последовательности ДНК платформы с использованием этой технологии.

ТЕХНОЛОГИЯ ИОННОГО ПОЛУПРОВОДНИКОВОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Включение дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в растущую цепь ДНК происходит с образованием ковалентной связи и высвобождением пирофосфата и положительно заряженного иона водорода. dNTP будет включен, только если он комплементарен ведущему непарному нуклеотиду матричной цепи. Ионное полупроводниковое секвенирование основано на том факте, что при замене одного вида dNTP на другой высвобождается ион водорода.

В каждую микролунку на полупроводниковом чипе, содержащую одну подлежащую секвенированию одноцепочечную молекулу ДНК-матрицы и ДНК-полимеразу, последовательно заливаются немодифицированные A, C, G или Т dNTP. Если введенный dNTP комплементарен следующим непарным нуклеотидом на матричной цепи, он включается в растущую комплементарную цепь с помощью ДНК-полимеразы. Если введенный dNTP не комплементарен, реакции полимеризации не происходит. Ион водорода, который выделяется в реакции, изменяет рН раствора, которое обнаруживается ISFET. Не прореагировавшие молекулы dNTP вымываются перед следующим циклом, когда будут введены другие виды dNTP.

Под ион-чувствительным слоем микролунок расположены ISFET датчики. Все слои помещены на CMOS-чип, аналогичный широко используемым в электронной промышленности.

Каждый чип содержит массив микролунок с соответствующими ISFET датчиками. Каждый выделившийся ион водорода вызывает срабатывание ISFET датчика. Серия электрических импульсов, передаваемых от чипа к компьютеру, переводится в последовательность ДНК без промежуточного преобразования сигнала, поскольку электроника регистрирует непосредственно события включений нуклеотидов в цепочку, без использования меченых нуклеотидов и оптических измерений. Обработка сигналов и сборка последовательности ДНК может быть выполнена програмно.

Точность ионного полупроводникового секвенирования по состоянию на февраль 2011 года составила 99,6 % при 50-нуклеотидной длине фрагмента (рида), 100 Мб на один проход. По состоянию на февраль 2011 года длина секвенируемых фрагментов составила 100 пар оснований. Точность чтения повторов длиной 5 нуклеотидов составила 98 %. Следует отметить, что эти данные еще не были независимо проверены вне компании.

СИЛЬНЫЕ И СЛАБЫЕ СТОРОНЫ

Основные преимущества ионного полупроводникового секвенирования -- высокая скорость секвенирования при низких начальных вложениях и эксплуатационных расходах. Это стало возможным благодаря отсутствию модифицированных нуклеотидов и оптических измерений.

Поскольку система записывает события присоединений нуклеотидов, осуществляемых при помощи природной полимеразы, секвенирование может происходить в режиме реального времени. На самом деле, скорость секвенирования ограничена скоростью смены нуклеотидного субстрата. Ion Torrent Systems, разработчик технологии, утверждает, что измерение (фиксация) каждого присоединения нуклеотида занимает 4 секунды, и каждый прогон длится около часа, в течение которого секвенируется последовательность из 100--200 нуклеотидов. Прогресс в области полупроводниковых чипов (предсказанныйзаконом Мура), позволяет ожидать, что количество операций чтения на чип (и, следовательно, на прогон) должно возрасти. секвенирование ионный нуклеотид

Расходы на приобретение рН-опосредованного секвенатора от Ion Torrent Systems, Inc на момент запуска были около 50 000 USD, не включая оборудования для подготовки образцов и сервера для анализа данных. Стоимость за один цикл также значительно ниже, чем у альтернативных методов автоматизированного секвенирования и составляет на уровне примерно $ 1000.

Если гомополимер, состоящий из повторов одного и того же нуклеотида (например GGGGG), присутствует на матричной цепи (подлежащей секвенированию), присоединяются сразу несколько нуклеотидов и в одном цикле образуется больше ионов водорода. Это приводит к большему изменению рН и пропорционально более высокому электронному сигналу. Ограничение данной системы в том, что трудно посчитать длину повтора. Это ограничение характерно и для других методов, которые определяют вставки отдельных нуклеотидов, такие как пиросеквенирования. Сигналы, генерируемые длинным повтором трудно отличить от сходного другой длинны, например, гомоповтор длиной 7 нуклеотидов трудно отличить от гомоповтора длиной 8 нуклеотидов.

Другим недостатком этой системы является короткая длина читаемого фрагмента по сравнению с другими методами секвенирования, такие как секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование. Большие длины читаемых фрагментов полезны для сборки генома de novo. На текущий момент длина чтения, достигнутая Ion Torrent Systems, Inc составляет 400 пар оснований за один проход. В настоящее время пропускная способность ниже, чем у других высокопроизводительных технологий секвенирования, хотя разработчики надеются изменить это путем увеличения плотности микролунок на чипе.

ВЫВОД

В не далеком будущем технологии секвенирования станут более быстрыми и менее дорогими, что позволит использовать их для идентификация мишеней для лекарственной терапии онкологических больных. Уже сейчас анализ по технологии секвенирования следующего поколения (NGS) от момента биопсии до завершения NGS занимает менее 100 дней. Столько же времени занимает секвенирование всего генома (whole genome sequencing, WGS) и секвенирование всего транскриптома.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bio-IT World, Davies, K. Powering Preventative Medicine. Bio-IT World 2011

2. GenomeWeb DNA Electronics Licenses IP to Ion Torrent. August 2010

3. Rusk, N. (2011). «Torrents of sequence». Nat Meth 8(1): 44-44.

4. GenomeWeb Roche Partners with DNA Electronics to Help Migrate 454 Platform to Electrochemical Detection. November 2010

5. Purushothaman, S, Toumazou, C, Ou, C-P Protons and single nucleotide polymorphism detection: a simple use for the ion sensitive field effect transistor

6. Pennisi, E. (2010). «Semiconductors inspire new sequencing technologies». Science 327(5970): 1190.

7. Perkel, J., «Making contact with sequencing's fourth generation». Biotechniques, 2011.

8. Alberts B, Molecular Biology of the Cell. 5th Edition ed. 2008, New York: Garland Science.

9. Karow, J. (2009) Ion Torrent Patent App Suggests Sequencing Tech Using Chemical-Sensitive Field-Effect Transistors. In Sequence.

10. Bio-IT World, Davies, K. It's «Watson Meets Moore» as Ion Torrent Introduces Semiconductor Sequencing. Bio-IT World 2010.

11. Karow, J. (2009) At AGBT, Ion Torrent Customers Provide First Feedback; Life Tech Outlines Platform's Growth. In Sequence.

12. Eid, J., et al., «Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules». Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.

13. Karow, J. (2010) Ion Torrent Systems Presents $50,000 Electronic Sequencer at AGBT. In Sequence.

Размещено на Allbest.ru