Бактериальные культуры

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Фазы развития бактериальной культуры

При развитии бактерий наблюдается последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток.

· I - исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается.

· II - лаг-фаза, или фаза задержки размножения, характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой.

Две первые фазы можно назвать периодом адаптации бактериальной популяции, продолжительность которого определяется возрастом культуры, а также количеством и качеством питательной среды.

· III - лог-фаза, или логарифмическая (экспоненциальная) фаза, отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколько часов.

· IV - фаза отрицательного ускорения характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода.

· V - максимальная стационарная фаза характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток. Графически максимальная стационарная фаза изображается в виде прямой линии, параллельной оси абсцисс. При этом количество живых бактерий в популяции обозначают как их максимальную (М) концентрацию в единице объема питательной среды. Данный признак является достаточно стабильным для определенного вида бактерий в стандартных условиях.

· VI - фаза логарифмической гибели бактерий происходит в постоянной скоростью и сменяется VII-VIII фазами уменьшения скорости отмирания клеток.

2. Особенности роста и размножения бактерий на жидких и плотных питательных средах

Под ростом бактериальной клетки понимают координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки.

Термином «размножение» обозначают увеличение числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножаются поперечным делением, некоторые почкованием. При размножении микробной клетки наиболее важные процессы происходят в ядре (нуклеоиде), содержащем всю генетическую информацию в двунитевой молекуле ДНК. Репликация ДНК происходит полуконсервативным способом, обеспечивающим равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками. Надежность процесса репликации и правильность расхождения (сегрегация) дочерних цепей обеспечивается связью ДНК с цитоплазматической мембраной.

Репликация начинается в определенной точке (локус) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Синтез дочерних нитей ДНК идет ступенчато, короткими фрагментами, равными 1-2 тысячи нуклеотидов, которые «сшиваются» специальным ферментом лигазой.

Параллельно с репликацией ДНК начинается образование межклеточной (поперечной) перегородки. Вначале с обеих сторон клетки происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны. Затем между ними синтезируется пептидогликан. Этот процесс чувствителен к действию некоторых антибиотиков (пенициллинов), ингибирующих синтез пептидогликана.

В период репликации ДНК и образования перегородки микробная клетка непрерывно растет. Наряду с пептидогликаном синтезируются биополимеры, входящие в состав цитоплазматической мембраны, рибосом и цитоплазмы. На последней стадии дочерние клетки отделяются друг от друга. В этом период у грамотрицательных бактерий синтезируется наружная мембрана, которая встраивается между двумя слоями пептидогликана межклеточной перегородки. В том случае, когда разделившиеся бактериальные клетки сохраняют межклеточные связи, образуются цепочки, состоящие из клеток шаровидных или палочковидных форм (стрептококки и стрептобактерии).

Бактерии, как правило, характеризуются высокой скоростью роста и размножения по сравнению с другими прокариотами. Скорость их роста и размножения, помимо видовой принадлежности, зависит от состава питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Внешний вид колоний у многих бактерий настолько характерен, что может служить одним из дифференциальных признаков для их идентификации. Колонии разных видов отличаются по своим размерам, форме, поверхности, окраске, прозрачности и др. Однако эти признаки могут изменяться в зависимости от условий культивирования.

На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения, либо осадка. Размножение бактерий определяется временем генерации, то есть периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции состава питательной среды, температуры и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 минут у кишечной палочки Escherichia coli до 14 часов у микобактерий туберкулеза Mycobacterium tuberculosis, в связи, с чем их колонии образуются через 18-20 часов либо через 3-6 недель соответственно. При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток.

3. Понятие о механизмах передачи возбудителей (фекально-оральный, аэрогенный, контактный, гемоконтактный, вертикальный)

Механизм передачи возбудителей - это способ переноса возбудителя с источника инфекции на восприимчивый организм.

Существует 5 механизмов передачи: фекально-оральный, аэрогенный, контактный, гемоконтактный (посредством кровососущих членистоногих) и вертикальный (от матери плоду).

Фекально-оральному механизму передачи соответствует основная локализация возбудителя в пищеварительной системе организма хозяина. В связи с тем, что паразит локализуется чаще всего в кишечнике, эти заболевания называют обычно кишечными инфекциями. Между тем после обнаружения микроорганизмов, которые вегетируют в слизистой оболочке желудка (хеликобактер), правомерно говорить о желудочно-кишечных инфекциях. Известно немало примеров первичного рака пищевода.

Рис. 1 свидетельствует о сложности фекально-орального механизма передачи, о множестве факторов передачи, их эстафете, обеспечивающей перемещение паразита, а также о различных путях, действующих в рамках одного механизма передачи. Эти пути передачи обозначаются по конечному фактору (пища, вода, предметы обихода).



Рис.1. Схема фекально-орального механизма передачи

Укороченный путь фекально-орального механизма передачи (зараженные руки - рот) наблюдается только при энтеробиозе (самозаражение детей) и иногда в психиатрических стационарах (копрофагия при некоторых заболеваниях).

Сложность фекально-орального механизма передачи определила достаточно высокую устойчивость возбудителей инфекций пищеварительного тракта во внешней среде: в эволюции паразитов это качество сформировалось за счет селектирующей функции затяжного механизма передачи (стихийный отбор устойчивых рас из неоднородной и изменчивой популяции возбудителя). В рамках механизма передачи надо различать главные (основные) пути и пути, которые могут иметь значение при определенных условиях и в отношении отдельных групп населения.

К основным нужно отнести водный и пищевой путь фекально-орального механизма передачи. Это связано, во-первых, с тем, что именно указанные пути могут обеспечить заражение достаточно большими дозами возбудителя. Во-вторых, надо иметь в виду, что инфекционный процесс может развиться в том случае, если возбудитель оказывается в (на) восприимчивых тканях. Чаще всего локализация инфекционного процесса связана со слизистой оболочкой кишечника (именно поэтому укоренилось понятие «кишечные инфекции»). Попадание в указанные слизистые оболочки возможно практически только после заглатывания зараженной пищи или воды (при пустой ротовой полости глотательный акт невозможен).

Лишь у детей младшего возраста, поскольку они многие предметы берут в рот, что сопровождается обильным слюноотделением, глотание имеет место (или может быть) без приема пищи или питья воды. В этом отношении заслуживают внимания опыты R. Hornick с соавторами на добровольцах-военнослужащих. Авторы ни разу не смогли воспроизвести инфекционный процесс у добровольцев, которые должны были прополоскать рот и горло суспензией, содержащей в заданном объеме 109 микробных клеток вирулентного штамма возбудителя брюшного тифа, а затем ее выплюнуть (не глотать). Заметим, что при заглатывании указанной дозы заболело 95% добровольцев. Итак, приведенные два обстоятельства определяют ведущую роль водного и пищевого пути передачи.

Воздушно-капельному (аэрогенному) механизму передачи соответствует локализация возбудителя в дыхательной системе организма.

Необходимо отметить, что существует несколько названий обсуждаемого механизма передачи. Наряду с приведенным в заголовке названием эта группа инфекций имеет наименования аэрогенных, аспирационных, аэрозольных, капельных.

Термин «аэрогенный» наименее удачен, поскольку воздух не создает, не генерирует эту группу болезней, а является только средой для передачи возбудителей Термин «аспирационный» также нельзя считать удачным: аспирация, вдыхание является только частью (третьей фазой) механизма передачи. Кроме того, понятие аспирации носит более универсальный характер - возможна аспирация возбудителей, существующих за счет иных механизмов передачи, а также различных химических и физических агентов, не имеющих отношения к воспроизведению инфекционного процесса. Название «аэрозольный» нельзя принять потому, что аэрозоли часто приводят к заболеваниям, которые не могут быть отнесены к эволюционно сформировавшимся инфекциям дыхательной системы.

Рис. 2. Схема аэрогенного механизма передачи

Человек при разговоре, особенно громком, при актах, сопровождающих патологию - кашле, чиханье, выбрасывает в воздух в виде капелек слизь, находившуюся на поверхности эпителия (первая фаза механизма передачи). За счет кинетической энергии выброса капельки слизи летят вперед на несколько метров (при громком разговоре) и даже до десятка метров (при чиханье, особенно при кашле). Пространство, в котором оказываются выброшенные капельки, проецируется на землю (пол) в виде эллипса, именуемого динамической проекцией. В зоне динамической проекции под действием гравитационных сил (притяжение Земли) происходит оседание капелек. Быстрее всего оседают крупные капельки (диаметром примерно 100 мкм), хотя, обладая наибольшей кинетической энергией, они летят дальше всего.

Процесс оседания ускоряется за счет агрегации (коагуляции) частиц и завершается в течение нескольких секунд - это срок существования капельной фазы аэрозоля. В зоне динамической проекции концентрация аэрозольных частиц (капелек) максимальная для каждого эпизода формирования аэрозолей и более или менее постоянная, поскольку оседание сопровождается уменьшением объема, занятого аэрозолями. Наряду с оседанием наблюдается рассеивание мелких аэрозольных частиц (диаметр примерно 10 мкм и меньше). Рассеивание сопровождается уменьшением концентрации аэрозольных частиц пропорционально квадрату расстояния, т. е., например, на расстоянии 3 м от места формирования аэрозоля концентрация уменьшается в 9 раз, 4 м - в 16 раз и т. д.

Контактный механизм передачи возбудителей (контактно-бытовой) - механизм передачи, при котором возбудители локализуются на коже и ее придатках, на слизистой оболочке глаз, полости рта, половых органов, на поверхности ран, поступают с них на поверхность различных предметов и при контакте с ними восприимчивого человека (иногда при непосредственном контакте с источником инфекции) внедряются в его организм.

Трансмиссивный механизм передачи инфекции (также называемый "гемоконтактным") - механизм передачи инфекции, при котором возбудитель инфекции находится в кровеносной системе и лимфе, передается при укусах специфических и неспецифических переносчиков: укусе кровососущего членистоногого (насекомого или клеща).

Трансплацентарный путь передачи инфекции (вертикальный) - механизм передачи инфекции, при котором возбудитель инфекции передается от матери к плоду во время беременности.

Механизм передачи возбудителя зависит от первичной локализации возбудителя в организме хозяина. Естественно, что в случае, когда возбудитель локализуется в кишечнике (брюшной тиф, дизентерия, холера), механизм передачи может быть только фекально-оральным, а если возбудитель локализуется в эпителии дыхательных путей (грипп, риновирусная инфекция, менингококковая инфекция), то - аэрогенным.

Процесс передачи возбудителя от источника инфекции на восприимчивый организм (т. е. механизм передачи) проходит определенные фазы.

1 фаза - это выделение возбудителя во внешнюю среду, ее особенности зависят от вида механизма передачи. Возбудитель может выделятся с каловыми и рвотными массами (при фекально-оральном механизме), во время чихания и кашля (при аэрогенном механизме), во время укуса насекомого (при гемоконтактном механизме).

2 фаза - это фаза пребывания возбудителя во внешней среде. При контактном механизме передачи она, как правило, отсутствует. При аэрогенном механизме (в данном случае внешней средой считается воздух) эта фаза очень непродолжительна - секунды (грипп, детские капельные инфекции). При фекально-оральном механизме возбудители могут долгое время сохраняться во внешней среде от нескольких дней до месяцев (холера, дизентерия, брюшной тиф). Клещи (гемоконтактный механизм) могут не только сохранять возбудителя в течение всей своей жизни, но и передавать его по наследству, в этих случаях 2-я фаза может продлиться на многие года (боррелиозы, клещевой энцефалит и др.).

3 фаза - внедрение в новый организм. Особенности этой фазы также зависят от специфики механизма передачи. При фекально-оральном механизме внедрение происходит через рот в кишечник, при аэрогенном - с капельками слизи в дыхательные пути, гемоконтактном - при укусе насекомых-переносчиков (малярия, лейшманиоз, трипаносомозы, клещевой энцефалит), при контактном - в процессе непосредственного контакта (венерические заболевания).

4. Стерилизация. Методы и режимы стерилизации, применяемая аппаратура

Стерилизация предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергающихся обработке.

Существует три основных метода стерилизации: тепловой, лучевой, химической.

Тепловая стерилизация основана на чувствительности микробов к высокой температуре. При 60^оС и наличии воды происходит денатурация белка, деградация нуклеиновых кислот, липидов, вследствие чего вегетативные формы микробов погибают. Споры, содержащие очень большое количество воды в связанном состоянии и обладающие плотными оболочками, инактивируются при 160-170 °С. Для тепловой стерилизации применяют, в основном, сухой жар и пар под давлением.

Стерилизацию сухим жаром осуществляют в воздушных стерилизаторах (прежнее название - «сухожаровые шкафы» или «печи Пастера»). Воздушный стерилизатор представляет собой металлический плотно закрывающийся шкаф, нагревающийся с помощью электричества и снабженный термометром. Обеззараживание материала в нем производят, как правило, при 160° С в течение 120 мин. Однако возможны и другие режимы: 200 °С - 30 мин, 180 °С - 40 мин. Стерилизуют сухим жаром лабораторную посуду и другие изделия из стекла, инструменты, силиконовую резину, т. е. объекты, которые не теряют своих качеств при высокой температуре. Большая часть стерилизуемых предметов не выдерживает подобной обработки, и поэтому их обеззараживают в паровых стерилизаторах.

Обработка паром под давлением в паровых стерилизаторах (старое название - «автоклавы») является наиболее универсальным методом стерилизации. Паровой стерилизатор (существует множество его модификаций) - металлический цилиндр с прочными стенками, герметически закрывающийся, состоящий из водопаровой и стерилизующей камер. Аппарат снабжен манометром, термометром и другими контрольно-измерительными приборами. В автоклаве создается повышенное давление, что приводит к увеличению температуры кипения. Поскольку кроме высокой температуры на микробы оказывает воздействие и пар, споры погибают уже при 120 °С. Наиболее распространенный режим работы парового стерилизатора: 2 атм. - 121 °С 15-20 мин. Время стерилизации уменьшается при повышении атмосферного давления, а, следовательно, и температуры кипения (136 °С - 5 мин). Микробы погибают за несколько секунд, но обработку материала производят в течение большего времени, так как, во-первых, высокая температура должна быть и внутри стерилизуемого материала и, во-вторых, существует так называемое поле безопасности (рассчитанное на небольшую неисправность автоклава).

Стерилизуют в автоклаве большую часть предметов: перевязочный материал, белье, коррозионно-устойчивые металлические инструменты, питательные среды, растворы, инфекционный материал и т. д. Одной из разновидностей тепловой стерилизации является дробная стерилизация, которую применяют для обработки материалов, не выдерживающих температуру выше 100 °С, например, для стерилизации питательных сред с углеводами, желатина. Их нагревают в водяной бане при 80 °С в течение 30-60 мин.

В настоящее время применяют еще один метод тепловой стерилизации, предназначенный специально для молока - ультравысокотемпературный (УВТ): молоко обрабатывают в течение нескольких секунд при 130-150 °С.

Химическая стерилизация предполагает использование токсичных газов: оксида этилена, смеси ОБ (смеси оксида этилена и бромистого метила в весовом соотношении 1:2,5) и формальдегида. Эти вещества являются алкилирующими агентами, их способность в присутствии воды инактивировать активные группы в ферментах, других белках, ДНК и РНК приводит к гибели микроорганизмов.

Стерилизация газами осуществляется в присутствии пара при температуре от 18 до 80 ° С в специальных камерах. В больницах используют формальдегид, в промышленных условиях - оксид этилена и смесь ОБ.

Перед химической стерилизацией все изделия, подлежащие обработке, должны быть высушены. Этот вид стерилизации небезопасен для персонала, для окружающей среды и для пациентов, пользующихся простерилизованными предметами (большинство стерилизующих агентов остается на предметах). Однако существуют объекты, которые могут быть повреждены нагреванием, например, оптические приборы, радио- и электронная аппаратура, предметы из нетермостойких полимеров, питательные среды с белком и т. п., для которых пригодна только химическая стерилизация. Например, космические корабли и спутники, укомплектованные точной аппаратурой, для их деконтаминации обезвреживают газовой смесью (оксид этилена и бромистого метила).

В последнее время в связи с широким распространением в медицинской практике изделий из термолабильных материалов, снабженных оптическими устройствами, например, эндоскопов, стали применять обезвреживание с помощью химических растворов. После очистки и дезинфекции прибор помещают на определенное время (от 45 до 60 мин) в стерилизующий раствор, затем прибор должен быть отмыт стерильной водой. Для стерилизации и отмывки используют стерильные емкости с крышками.

Простерилизованное и отмытое от стерилизующего раствора изделие высушивают стерильными салфетками и помещают в стерильную емкость. Все манипуляции проводят в асептических условиях и в стерильных перчатках. Хранят эти изделия не более 3 суток.

Лучевая стерилизация осуществляется либо с помощью гамма-излучения, либо с помощью ускоренных электронов. Лучевая стерилизация является альтернативой газовой стерилизации в промышленных условиях, и применяют ее также в тех случаях, когда стерилизуемые предметы не выдерживают высокой температуры. Лучевая стерилизация позволяет обрабатывать сразу большое количество предметов (например, одноразовых шприцев, систем для переливания крови). Благодаря возможности широкомасштабной стерилизации, применение этого метода вполне оправданно, несмотря на его экологическую опасность и неэкономичность.

Еще одним способом стерилизации является фильтрование.

Фильтрование с помощью различных фильтров (керамических, асбестовых, стеклянных), а в особенности мембранных ультрафильтров из коллоидных растворов нитроцеллюлозы или других веществ позволяет освободить жидкости (сыворотку крови, лекарства) от бактерий, грибов, простейших и даже вирусов. Для ускорения процесса фильтрации обычно создают повышенное давление в емкости с фильтруемой жидкостью или пониженное давление в емкости с фильтратом.

В настоящее время все более широкое применение находят современные методы стерилизации, созданные на основе новых технологий, с использованием плазмы, озона.

5. Методы выделения чистых культур анаэробов

Выделение чистых культур анаэробов производится в несколько этапов.

I этап - обогащение. На среде Китт - Тароцци, предварительно прокипяченной в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются.

II этап - получение изолированных колоний. На средах Китт - Тароцци обнаруживается помутнение с пузырьками газа. Выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов:

а) по Цейсслеру - каплю материала со среды Китт - Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпателем производят посев во второй и третьей чашках;

б) по Вейнбергу: каплю материала со среды Китт - Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Виньял - Вейона и инкубируют в термостате.

III этап - выделение чистой культуры на среде Китт - Тароцци.

Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заключается в снижении парциального давления молекулярного кислорода.

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 - 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов - анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.

Физические методы:

1. Анаэростат - создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа - замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци - содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода.

Химические методы:

1. Прибор Омелянского - для поглощения кислорода используется пирогаллол.

2. Среда Вильсон - Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета - сернистое железо.

Биологический метод Фортнера:

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб - «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24 - 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

6. Роль плазмид и подвижных генетических элементов в формировании лекарственной устойчивости бактерий

Плазмидная устойчивость приобретается микробными клетками в результате процессов генетического обмена. Сравнительно высокая частота передачи R-плазмид обеспечивает широкое и достаточно быстрое распространение устойчивых бактерий в популяции, а селективное давление антибиотиков - отбор и закрепление их в биоценозах.

Плазмиды - внехромосомные (дополнительные по отношению к хромосоме) генетические структуры бактерий, способные автономно размножаться и существовать в цитоплазме бактериальной клетки. Некоторые плазмиды могут с определенной частотой включаться (интегрироваться) в бактериальный геном и размножаться (копироваться) затем вместе с ним как его составная часть.

Термин «плазмида» введен американским генетиком Ледербергом в 1952 г. для обозначения полового фактора бактерий (F-фактора, F-плазмиды), обнаруженного в клетках культуры кишечной палочки и ответственного за их способность быть донорами генетического материала (молекул ДНК) при конъюгации с клетками-реципиентами, не содержащими полового фактора.

В дальнейшем у бактерий различных видов были выявлены плазмиды, контролирующие их устойчивость к сульфаниламидам, антибиотикам и другим антибактериальным препаратам (лекарственная устойчивость микроорганизмов) - так называемые К-плазмиды, а также плазмиды, ответственные за бактериоциногению, т.е. способность клеток синтезировать вещества (бактериоцины), убивающие бактерии того же вида, не содержащие таких плазмид. Были обнаружены плазмиды, несущие гены, которые контролируют синтез гемолизинов (Hly-плазмиды), энтеротоксинов (Ent-плазмиды), специфических поверхностных антигенов и др.

В зависимости от способности или неспособности передаваться из одной бактериальной клетки в другую в процессе конъюгации различают конъюгативные (трансмиссивные) и неконъюгативные (нетрансмиссивные) плазмиды. При передаче некоторых конъюгативных R-плазмид в клетки отдельных видов бактерий наблюдается распад (диссоциация) этих плазмид с образованием «чистого» полового фактора (фактора переноса, или фактора RTF) и неконъюгативной плазмиды, несущей гены лекарственной устойчивости. Это позволило предположить, что конъюгативные плазмиды возникли в процессе эволюции как результат объединения факторов переноса и неконъюгативных плазмид. Плазмиды классифицируют также на основании явления их несовместимости, состоящем в неспособности двух родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной и той же бактериальной клетке. При этом несовместимые друг с другом плазмиды объединяют в одну группу несовместимости. Такая классификация в значительной мере отражает степень филогенетического родства отдельных плазмид, о чем свидетельствует более высокая степень гомологии ДНК различных плазмид одной группы несовместимости по сравнению с гомологией ДНК у совместимых плазмид из различных групп.

Плазмиды представляют собой молекулы ДНК с молекулярной массой от 1?10⁶ до 200?10⁶. Эти молекулы, как правило, замкнуты в кольцо и находятся в клетке в сверхспирализованной форме. Неконъюгативные плазмиды, мол, масса которых не превышает 20?10⁶, имеют относительно простую генетическую организацию. Конъюгативные плазмиды имеют более крупные размеры и наряду с генетической областью, контролирующей их репликацию, содержат также так называемую tra-область (англ. transfer перенос). Эта область определяет способность клетки, содержащей плазмиду, быть генетическим донором, т.е. вступать в конъюгацию с другой клеткой (реципиентом) и передавать ей свой генетический материал (плазмидную либо хромосомную ДНК). Под контролем tra-генов синтезируются поверхностные «половые» ворсинки (F-пили) клетки-донора, необходимые для ее конъюгации с клеткой-реципиентом, а также ферменты, обеспечивающие метаболизм ДНК в процессе конъюгации. Неконъюгативные плазмиды обычно не содержат tra-области и поэтому не могут самостоятельно передаваться из одной клетки в другую. Однако передача неконъюгативной плазмидой возможна за счет продуктов (белков) tra-генов конъюгативной плазмидой, находящейся вместе с неконъюгативной плазмидой в одной и той же клетке.

Активность плазмидных генов, ответственных за репликацию, несовместимость плазмид, конъюгативность и другие свойства бактериальных клеток, в той или иной мере находится также под контролем хромосомных систем генетической регуляции.

Значительное место в составе плазмидной ДНК могут занимать различные гены, обеспечивающие бактериям-хозяевам в определенных условиях существования селективные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями (например, гены, контролирующие устойчивость клеток к действию антибиотиков, солей тяжелых металлов, ионизирующего излучения, бактериоциногенность и др.). Предполагают, что в процессе эволюции бактерий такие гены могли попасть в состав плазмид в результате генетического обмена (рекомбинации) между различными молекулами ДНК бактериальных клеток.

Установлена важная роль в этом процессе мигрирующих (транслоцирующихся) фрагментов ДНК (транспозонов), способных перемещаться из одной генетической структуры клетки в другую (например, из хромосомы в плазмиду, из одной плазмиды в другую плазмиду, из бактериофага в плазмиду и наоборот).

Плазмидная устойчивость может быть множественной, т. е. к нескольким лекарственным препаратам, и при этом достигать достаточно высокого уровня.

7. Антитела. Основные классы иммуноглобулинов, их свойства

Антитела - белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование, или с изолированной детерминантной группой этого антигена (гаптеном).

Защитная роль антител как факторов гуморального иммунитета обусловлена их антигенраспознающей и антигенсвязывающей активностью и рядом эффекторных функций: способностью активировать систему комплемента, взаимодействовать с различными клетками, усиливать фагоцитоз.

Эффекторные функции антител реализуются, как правило, после их соединения с антигеном, вслед за которым происходит удаление чужеродного агента из организма. При инфекциях появление в крови больного антител против возбудителя инфекции свидетельствует о сопротивлении организма данной инфекции, а уровень антител служит мерой напряженности иммунитета.

Впервые появление в крови у животных веществ, которые специфически взаимодействовали с введенными ранее токсинами бактерий, обнаружили в 1890 г. Беринг и Китасато. Вещество вызывало обезвреживание токсина и было названо антитоксином. Более общий термин «антитела» был предложен, когда выявили возникновение подобных веществ при введении в организм любых чужеродных агентов.

Первоначально о появлении и накоплении антител судили по способности исследуемых сывороток давать при соединении с антигенами, видимые серологические реакции или по их биологической активности - способности нейтрализовать токсин, вирус, лизировать бактерии и чужеродные клетки. Предполагали, что каждому феномену соответствуют особые антитела.

Однако впоследствии оказалось, что тип антиген - антитело реакции определяется физическими свойствами антигена - его растворимостью, а антитела разной специфичности и видового происхождения принадлежат к гамма-глобулиновой фракции крови или, по номенклатуре ВОЗ, к иммуноглобулинам (lg).

Иммуноглобулины - это совокупность сывороточных белков, несущих активность антител. Позже была обнаружена гетерогенность по физико-химическим свойствам и сродству к антигену антител одной специфичности, выделенных от одного индивида, и показано, что они синтезируются в организме разными клонами плазматических клеток. Важным шагом в изучении строения антител стало использование с этой целью миеломных белков - гомогенных иммуноглобулинов, синтезируемых одним клоном плазматических клеток, подвергшихся малигнизации.

Классы иммуноглобулинов и их физико-химические свойства: Иммуноглобулины составляют около 30% всех белков сыворотки крови. Их количество значительно возрастает после антигенной стимуляции.

Антитела могут принадлежать к любому из пяти классов иммуноглобулинов (lgA, lgG, lgM, lgD, lgE). Молекулы иммуноглобулинов всех классов построены из полипептидных цепей двух видов: легких (L) с молекулярной массой около 22000, одинаковых для всех классов иммуноглобулинов, и тяжелых (Н) с молекулярной массой от 50000 до 70000 в зависимости от класса иммуноглобулина. Структурные и биологические особенности каждого класса иммуноглобулинов обусловлены особенностями строения их тяжелых цепей. Основной структурной единицей иммуноглобулинов всех классов является димер двух идентичных пар легкой и тяжелой цепей (L--Н)₂.

Иммуноглобулин G (lgG) имеет молекулярную массу около 160000, молекула состоит из одной (L-Н)₂-субъединицы и содержит два антигенсвязывающих центра. Это основной класс антител, составляющий до 70-80% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови. Концентрация lgG в сыворотке крови 6-16 г/л. В процессе первичного иммунного ответа (после первичного введения антигена) он появляется позднее lgM-антител, но образуется раньше при вторичном иммунном ответе (после повторного введения антигена). lgG - единственный класс антител, которые проникают через плаценту и обеспечивают иммунологическую защиту плода, активируют систему комплемента, обладают цитофильной активностью. Благодаря высокому содержанию в сыворотке крови lgG имеет наибольшее значение в противоинфекционном иммунитете. Поэтому об эффективности вакцинации судят по наличию его в сыворотке крови.

Иммуноглобулин М (lgM) имеет молекулярную массу 900000. молекула состоит из 5 (L-Н)₂-субъединиц, скрепленных дисульфидными связями и дополнительной пептидной цепью (J-цепь). lgM составляет 5-10% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови; концентрация его в сыворотке крови 0,5-1,8 г/л. Антитела этого класса образуются при первичном иммунном ответе, Молекула lgM содержит 10 активных центров, поэтому lgM особенно эффективен против микроорганизмов, содержащих в мембране повторяющиеся антигенные детерминанты. lgM обладает высокой агглютинирующей активностью, сильным опсонизирующим эффектом, активирует систему комплемента. В виде мономера является антигенсвязывающим рецептором В-лимфоцитов.

Иммуноглобулин A (lgA) составляет 10-15% от сывороточных иммуноглобулинов; концентрация его в сыворотке 1-5 г/л крови. lgA существует в виде мономера, димера, тримера (L-Н)₂-субъединицы. В виде секреторного lgA (slgA), устойчивого к протеазам, является основным глобулином экстраваскулярных секретов (слюны, слезной жидкости, носового и бронхиального секретов, поверхности слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта). lgA-антитела обладают цитофильной активностью, агглютинируют бактерии, активируют систему комплемента, нейтрализуют токсины, создают защитный барьер в местах наиболее вероятного проникновения инфекционных агентов. Уровень lgA в сыворотке крови возрастает при перинатальных инфекциях, заболеваниях дыхательных путей. бактериальный размножение стерилизация анаэроб

Иммуноглобулин Е (lgE) имеет вид мономера (L-Н)₂-субъединицы и молекулярную массу около 190000. В сыворотке крови содержится в следовых количествах. Обладает высокой гомоцитотропной активностью, т.е. прочно связывается с тучными клетками соединительной ткани и базофилами крови. Взаимодействие связанных с клетками lgE с родственным антигеном вызывает дегрануляцию тучных клеток, высвобождение гистамина и других вазоактивных субстанций, что приводит к развитию гиперчувствительности немедленного типа. Ранее антитела lgE-класса назывались реагинами.

Иммуноглобулин D (lgD) существует в виде мономерного антитела с молекулярной массой около 180000. Концентрация его в сыворотке крови 0,03-0,04 г/л. lgD в качестве рецептора присутствует на поверхности В-лимфоцитов.

Общий план строения макромолекулы антител обычно рассматривают в отношении lgG-антател, включающих одну (L-Н)₂-субъединицу. При ограниченном протеолизе папаином молекулы антител этого класса распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Каждый Fab-фрагмент содержит по одному активному центру, или антидетерминанте, т.к. соединяется с антигеном, но не может его преципитировать. В организации активного центра принимают участие вариабельные участки легкой и тяжелой цепей.

Fc-фрагмент не связывает антиген. В его состав входят константные участки тяжелых цепей. В Fc-фрагменте расположены центры, ответственные за эффекислоторные функции, общие для всех антител одного класса. Схематически молекулу lgG-антител можно представить в виде буквы Y, верхние плечи которой составляют идентичные Fab-фрагменты, а нижний отросток является Fc-фрагментом.

Иммунная система позвоночных способна синтезировать 10⁵-10⁸ молекул антител разной специфичности.

Специфичность - важнейшее свойство антител, позволяющее им избирательно реагировать с тем антигеном, которым был стимулирован организм. Специфичность антител определяется уникальностью строения антидетерминанты и является результатом пространственного соответствия (комплементарности) между детерминантой антигена и аминокислотными остатками, выстилающими полость антидетерминанты. Чем выше комплементарность, тем большее число нековалентных связей возникает между детерминантой антигена и аминокислотными остатками антидетерминанты и тем прочнее, стабильнее образующийся иммунный комплекс.

Различают аффинность антител, которая является мерой прочности связывания одной антидетерминанты с детерминантой, и авидность антител - суммарную силу взаимодействия поливалентного антитела с полидетерминантным антигеном. Хотя антитела способны различать незначительные изменения в структуре антигена, известно, что они могут реагировать и с детерминантами сходной структуры.

Антитела одной специфичности представлены пулом молекул с разной молекулярной массой, электрофоретической подвижностью и разным сродством к антигену.

Для получения однородных по специфичности и сродству к антигену антител применяют гибридому - гибрид моноклона антителопродуцирующей клетки с клеткой миеломы. Гибридома приобретает способность продуцировать в неограниченном количестве моноклональные антитела, абсолютно идентичные по классу и типу молекул, по специфичности и сродству к антигену. Моноклональные антитела - наиболее перспективное диагностическое и лечебное средство.

Различают полные и неполные антитела. Полные антитела имеют в молекуле не менее двух активных центров и при соединении с антигенами дают видимые серологические реакции. Могут быть тепловые и холодовые полные антитела, которые реагируют с антигеном соответственно при t° 37° или при 4°. Известны двухфазные, биотермические антитела. Они соединяются с антигеном при низких температурах, а видимый эффект соединения проявляется при 37°. Полные антитела могут принадлежать ко всем классам иммуноглобулинов.

Неполные антитела (моновалентные, непреципитирующие, блокирующие, агглютиноиды) содержат в молекуле одну антидетерминанту вторая антидетерминанта или замаскирована, или обладает низкой аффинностью. Неполные антитела не дают при соединении с антигеном видимых серологических реакций. Их выявляют по способности блокировать реакцию специфического антигена с полными антителами той же специфичности либо с помощью антиглобулинового теста - так называемые пробы Кумбса. К неполным антителам относятся антитела к резус-фактору.

Нормальные (естественные) антитела обнаруживают в крови животных и человека при отсутствии явной инфекции или иммунизации. Антибактериальные нормальные антитела возникают, вероятно, в результате постоянного, незаметного контакта с данными бактериями. Предполагают, что они могут определять индивидуальную устойчивость организма к инфекциям. К нормальным антителам относят изоантитела, или алло-антитела. Нормальные антитела, как правило, представлены lgM.

Синтез молекул иммуноглобулинов осуществляется в плазматических клетках. Тяжелые и легкие цепи молекулы синтезируются на разных хромосомах и кодируются разными наборами генов.

Динамика выработки антител в ответ на антигенный стимул зависит от того, впервые или повторно организм сталкивается с данным антигеном. При первичном иммунном ответе появлению антител в крови предшествует латентный период продолжительностью 3-4 дня. Первые образующиеся антитела принадлежат к lgM. Затем количество антител резко возрастает и происходит переключение синтеза с lgM- на lgG-антитела. Максимум содержания антител в крови приходится на 7-11-е сутки, после чего их количество постепенно снижается. Для вторичного иммунного ответа характерны укороченный латентный период, более быстрое нарастание титров антител. и большее их максимальное значение. Характерно образование сразу lgG-антител.

Способность к иммунному ответу по вторичному типу сохраняется в течение многих лет и представляет собой проявление иммунологической памяти, примерами которой может служить противокоревой и противооспенный иммунитет.

8. Роль микрофлоры в порче растительного лекарственного сырья и лекарственных средств

Лекарственное растительное сырье может инфицироваться патогенными микроорганизмами на всех этапах заготовки (сбор, первичная обработка, сушка, измельчение, упаковка) и хранения. При хранении сырья важно соблюдение санитарного режима в аптеках. Неблагоприятное действие оказывают влажность, пыль, насекомые и другие факторы, повышающие микробное обсеменение и приводящие к порче лекарственного сырья.

Внешними проявлениями микробной порчи растительного сырья являются изменение цвета и консистенции, загнивание, плесневение всего растения или его частей. При этом резко снижается содержание или полностью исчезают фармакологически активные вещества, использование такого недоброкачественного сырья становится бесполезным или вредным. Легко портятся плоды, ягоды и корневища, богатые углеводистыми соединениями, более устойчивыми являются сухие листья, корни, кора.

Состав микроорганизмов зависит от вида лекарственного сырья, его структуры и фармакологических свойств. Преобладают грибы (Mucor, Penicillium, Aspergillus, Saccharomyces, Candida), актиномицеты и спорообразующие виды бактерий (Bacillus subtillis, B. megatherium).

Микробы, обитающие на лекарственном растительном сырье могут включать представителей нормальной эпифитной и фитопатогенной микрофлоры. Микробная обсеменённость растительного лекарственного сырья зависит от исходной загрязненности, но может повышаться на этапах первичной обработки, измельчения, приведения в стандартное состояние.

Порча сырья происходит в основном при повышенной влажности, способствующей размножению гнилостных микроорганизмов.

В испорченном сырье уменьшается количество лекарственных веществ, и накапливаются токсины. Такое сырье непригодно для получения лекарственных препаратов.

Для оценки санитарного состояния лекарственного сырья определяют микробное число. Кол-во микробов в 1 г сырья называется микробным числом.

Меры предупреждения порчи лекарственного сырья:

- уничтожать больные растения;

- соблюдать технологию транспортировки, сушки, хранения переработки.

Микробной порче подвергаются и готовые лекарственные формы: сухие (порошки, сборы), жидкие (микстуры, настои, отвары, капли), мягкие (мази, пасты, шарики, свечи) и стерильные инъекционные препараты. Лекарства с высокой обсемененностью микробами, особенно патогенными, могут вызывать инфекционные заболевания у людей.

К фитозоонозам - инфекциям, вызываемым патогенными микроорганизмами, общими для теплокровных (включая человека) и растений чаще всего относят кишечный иерсиниоз, листериоз, псевдотуберкулез, микотоксикозы. Размножение микроорганизмов в готовых лекарствах ведет к изменению их физических и органолептических свойств, появлению токсичности.

Микробная обсемененность лекарственных препаратов зависит от соблюдения в аптеке санитарно - эпидемического режима, регламентируемого в настоящее время приказом МЗ РФ №309 от 21.10.97 «Об утверждении инструкции по санитарному режиму аптечных организаций (аптек)».

Причиной микробного обсеменения готовых лекарств может быть микробное загрязнение растительного лекарственного сырья, воздуха производственных помещений, оборудования, посуды, дистиллированной воды, рук персонала.

Причиной пирогенности лекарственных препаратов (появление эндотоксинов и вследствие пирогенности) являются микробное загрязнение дистиллированной воды, нарушения асептики технологического процесса, увеличение времени между приготовлением раствора и стерилизацией.

Из жидких инъекционных лекарственных форм легче всего обсеменяются микробами настои и отвары; при их хранении появляются признаки порчи: муть, изменение цвета, пленка, необычный запах. Срок хранения этих препаратов ограничен. Спиртовые настойки меньше подвержены порче вследствие антимикробного действия алкоголя.

Сухие порошкообразные вещества, особенно тальк и крахмал, мягкие лекарственные формы также подвержены микробному загрязнению. Их микробная порча носит очаговый характер и проявляется изменением цвета и консистенции вещества.

Микробный состав готовых лекарств может быть представлен следующими группами:

- плесневые и дрожжевые грибы - Penicillium, Aspergillus, Mucor;

- кокки - сарцины, стафилококки;

- спороносные палочковидные бактерии - B. subtillis, B. mesentericus.

Предупреждение микробной порчи лекарственных веществ возможно при соблюдении условий, снижающих их микробное загрязнение: соблюдение правил личной гигиены, качественное обеззараживание воздуха аптечных помещений, правильная обработка посуды, оборудования, при необходимости (стерильные лекарства) - асептическое изготовление.

9. Стерилизация лекарственных средств в зависимости от их природы, формы, лабильности к химическим и физическим факторам

Стерилизация лекарственных средств и вспомогательных материалов имеет важное практическое значение для обеспечения асептики.

Стерилизация - полное уничтожение в том или ином объекте живых микроорганизмов и их спор.

Создание условий асептики необходимо и в случае изготовления лекарственных форм для инъекций и для нестерильных лекарственных форм, при этом стерилизация рассматривается как неотъемлемый этап технологического процесса.

Проблема выбора вида и режима стерилизации лекарственных форм основывается, с одной стороны, на многообразии видов микроорганизмов и их высокой жизнеспособности, с другой - невозможностью проведения термической стерилизации из-за термолабильности многих лекарственных веществ и форм или невозможности использования других методов стерилизации. При применении любого метода стерилизации преследуется цель сохранения структуры и свойств лекарственных форм при полном освобождении их от микроорганизмов.

При этом данный метод должен быть удобным для применения в аптечных условиях (в аптеках лечебно-профилактических учреждений, например, 60-80 % рецептуры составляют стерильные растворы).

Существуют различные способы стерилизации лекарственных средств и вспомогательных материалов:

1. физические, основанные на действии высокой температуры, ультрафиолетовых лучей, токов высокой частоты, ионизирующих излучений, вызывающих гибель микроорганизмов;

2. механические, заключающиеся в отделении микробов фильтрованием жидкостей через микропористые фильтры, задерживающие микробы в своих порах;

3. химические, основанные на бактерицидности различных химических веществ.

Основные методы стерилизации, используемые в технологии лекарственных форм:

1. Термическая стерилизация.

2. Стерилизация фильтрованием.

3. Стерилизация ультрафиолетовой радиацией.

4. Радиационная стерилизация.

5. Химическая стерилизация.

Строгое соблюдение режимов стерилизации обеспечивает надежность используемого метода.

Термическая стерилизация. Тепловые процессы широко используются для увеличения скорости приготовления ряда лекарственных средств и скорости растворения и смешивания жидкостей. Кроме того, тепловые процессы используются для стерилизации, в частности, инъекционных растворов. При приготовлении инъекционных растворов стерилизации подвергают посуду, вспомогательные материалы, исходные продукты и готовый раствор. В аптечной практике для стерилизации посуды и лекарств пользуются исключительно способами, основанными на воздействии высоких температур, - тепловой обработкой. Использование высокой температуры основано на необратимой коагуляции протоплазмы, пирогенетическом (температурном) ее разрушении и на повреждении ферментных систем в микробной клетке. Температура и длительность нагревания различны для различных видов микрофлоры. Большинство микроорганизмов погибает при температуре 60 °С, но их споры выдерживают и значительно более высокую температуру. Текучий пар и кипящая вода убивают микроорганизмы значительно быстрее, но многие споры и в этих условиях сохраняются в течение нескольких часов (особенно в вязкой среде). Чистый водяной пар действует сильнее, чем в смеси с воздухом. Пар под давлением (при температуре выше 100 °С) убивает все микроорганизмы очень быстро. Сухой горячий воздух убивает бактерии и их споры при более высокой температуре по сравнению с водяным паром. Выбирая метод стерилизации, стремятся к полной ликвидации микрофлоры и спор, сохраняя в то же время неизменность лекарственного вещества. В фармацевтической практике применяются следующие методы.

...