Люминесцентные показатели листьев растений, обработанных препаратом BION

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Термолюминесценция в применении к высшим растениям и водорослям является довольно эффективным методом исследования фотосинтетического аппарата, а в особенности той ее части, которая связана с работой второй фотосистемы. Это стало возможным благодаря установлению природы ряда пиков термолюминесценции у целых листьев, хлоропластов и водорослей. К сожалению, происхождение некоторых пиков термолюминесценции остается еще спорным или неясным. Выяснение их природы позволит расширить применение метода. К числу пиков, вызывающих наибольшее количество споров, можно отнести пик С. В изучении этого пика несомненный интерес представляет тот факт, что его появление в ряде случаев вызывает специальный активатор системной приобретенной устойчивости к патогенам - препарат BION, действие которого на термолюминесценцию зависит от вида растения.

Цели данной работы.

Цель данной работы заключалась в изучении люминесцентных характеристик листьев растений (бобов, пшеницы), обработанных препаратом BION.

В цели работы входило:

- установление влияния обработки растений препаратом BION на термолюминесценцию листьев в области пика С,

- анализ возможных механизмов возникновения пика С (на основе данных литературы и собственных экспериментальных данных).

Для лучшего понимания действия препарата BION на фотосинтетический аппарат были поставлены следующие задачи:

- установление различий в термолюминесценции листьев при обработке препаратом растений разными методами,

- выявление его действия на флуоресценцию листьев растений,

- анализ его влияния на пики термолюминесценции А и В, природа которых известна,

- влияние его на жизнеспособность растений.

Список сокращений:

ДХММ - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (диурон);

КВС - кислород-выделяющая система;

РЦ - реакционный центр;

ССК 1 - светособирающий комплекс первой фотосистемы;

ССК 2 - светособирающий комплекс второй фотосистемы;

ТЛ - термолюминесценция;

ФС 1 - фотосистема 1;

ФС 2 - фотосистема 2;

BTH - бензо [1,2,3] тиадиазол-7-тионкарбоновая кислота S-метил эфир;

QA - первичный хиноновый акцептор;

QB - вторичный хиноновый акцептор;

SAR - системная приобретенная устойчивость.

1. Термолюминесценция фотосинтетического аппарата растений

Что такое термолюминесценция?

Термолюминесценция (ТЛ) - это свечение предварительно освещенных объектов при нагревании.

При предварительном освещении вещества в нем возникают свободные носители зарядов: электроны и дырки. Эти носители стабилизируются на центрах захвата (ловушках). Для высвобождения носителя зарядов из ловушки ему будет нужна дополнительная энергия. Эту дополнительную энергию носитель заряда может получить либо из тепловой энергии, либо при освещении вещества инфракрасным светом. Но если образец держать при низкой температуре, без освещения инфракрасным светом, то носители зарядов могут жить довольно продолжительное время. Нагревание вещества дает носителям зарядов энергию для высвобождения из ловушек. Электрон и дырка, высвобожденные нагревом из ловушек, могут рекомбинировать с излучением кванта света.

Если предварительно освещенный объект подвергать нагреву в темноте, то достигнув температуры, при которой тепловая энергия становится сравнимой с энергией активации (Еа - энергия, необходимая для высвобождения носителя заряда из ловушки), вещество начинает светиться. С течением времени все электрон-дырочные пары рекомбинируют, и свечение прекратится. Построив график зависимости интенсивности свечения от температуры регистрации излучения, мы получим кривую ТЛ. Температура максимума интенсивности на этой кривой позволяет нам вычислить энергию активации (глубину ловушки).

Явление ТЛ тесно связано с замедленной флуоресценцией. Замедленная флуоресценция отличается от обычной флуоресценции тем, что обладает временами затухания, характерными для фосфоресценции (характерное время жизни в возбужденном состоянии при фосфоресценции: >10-6с, при флуоресценции: ~10-9с). Но в то же время длина волны излучения замедленной флуоресценции совпадает с длиной волны обычной флуоресценции, тогда как у фосфоресценции спектр излучения сдвинут в красную область относительно спектра излучения флуоресценции. Причина этого заключена в следующем. При возбуждении системы молекул она из состояния Z0 переходит в состояние Z1. Из этого состояния система молекул может перейти обратно в Z0 с испусканием света, тогда мы получим флуоресценцию. Но возможен и другой путь. В возбужденном состоянии может произойти разделение зарядов и захват их в ловушки, тогда система перейдет в состояние Z2. Прожив в Z2 довольно продолжительное время, система молекул вернется в Z1 (за счет тепловой энергии) и, испустив квант света, перейдет в Z0. Время жизни в состоянии Z2, а значит и время затухания замедленной флуоресценции, будет определятся температурой вещества и энергией активации. Таким образом, энергия активации будет определять и температуру максимума пика ТЛ и характерное время замедленной флуоресценции.

Фотосинтетический аппарат растений.

В применении к растениям ТЛ используют для исследования работы фотосинтетического аппарата, а точнее - донорной и акцепторной стороны второй фотосистемы. Поэтому рассмотрим современные представления о структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата растений. Фотосинтез растений происходит в особых органеллах растительной клетки - хлоропластах. Хлоропласт имеет внешнюю и внутреннюю мембраны, граны, которые состоят из тилакоидов гран и соединены межгранными тилакоидами. Пространство внутри хлоропласта называют стромой. Фотосинтетический аппарат растений расположен в мембранах тилакоидов.

В ходе фотосинтеза происходит преобразование световой энергии в энергию химических связей. Рассмотрим кратко работу фотосинтетического аппарата. При попадании света на лист растения его поглощают светособирающие пигменты: хлорофиллы различных видов и каротиноиды. Эти пигменты расположены преимущественно в ССК 1 и ССК 2 (светособирающих комплексах фотосистемы 1 и фотосистемы 2 соответственно). Далее поглощенная энергия передается на реакционный центр (РЦ) какой-либо фотосистемы. Возбужденный реакционный центр отдает свой электрон на первичный акцептор электронов. Так, с РЦ второй фотосистемы (ФС 2) через ряд акцепторов электрон попадает на пластохинон. Получив два электрона и забрав с внешней стороны мембраны два протона, полностью восстановленный пластохинон приобретает способность передвигаться в липидной мембране. Он покидает ФС 2, а его место занимает окисленный пластохинон. Окисленный РЦ ФС 2 получает электроны от кислород-выделяющей системы (КВС), которая осуществляет реакцию расщепления воды: 2Н2ОО2+4e-+4H+внутри тилакоида. В ходе работы ФС 2 происходит перенос протонов из межгранного пространства внутрь тилакоида.

В липидной мембране пластохинон присоединяется к b6/f комплексу, на который он отдает два электрона. Комплекс цитохромов b6/f обеспечивает восстановление пластоцианина и перенос протонов внутрь тилакоида. Этот комплекс имеет два участка связывания пластохинонов: Qz, связывающий полностью восстановленный пластохинон, и Qc, к которому присоединяется окисленный пластохинон. При присоединении восстановленного пластохинона внутрь тилакоида происходит выброс двух протонов. Один из электронов идет через ряд переносчиков на пластоцианин, а другой на восстановление окисленного пластохинона. Электроны, идущие на восстановление пластохинона, участвуют в следующей реакции: 2PQH2+PQ+2H+вне тилакоида 2PQ+PQH2+4H+внутри тилакоида+2e-(на пластоцианин) (Q цикл). В ходе работы Q цикла происходит перенос протонов внутрь тилакоида.

Электрон с пластоцианина передается на окисленный РЦ ФС 1. В свою очередь, при возбуждении РЦ ФС 1 электрон с него идет на ферредоксин, который отдает его на ферредоксин НАДФ редуктазу. Этот фермент катализирует следующую реакцию: НАДФ++2e-+H+вне тилакоидаНАДФН.

При таком продвижении электрона по цепи электронного транспорта происходит перенос ионов Н+ внутрь тилакоида и создается трансмембранная разность потенциалов. Впоследствии энергия, запасенная в виде трансмембранной разности потенциалов, расходуется АТФ-синтазой на синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Молекулы АТФ в дальнейшем расходуются в ходе энергозависимых процессов в клетке. Молекулы НАДФН, совместно с молекулами АТФ используются в цикле Кальвина-Бенсона для фиксации СО2.

Разделение зарядов при возбуждении реакционного центра ФС 2 делает возможной ТЛ фотосинтетического аппарата.

Вторая фотосистема высших растений и кислород-выделяющая система, разделение зарядов.

Источником ТЛ фотосинтетического аппарата растений является ФС 2 и КВС. Рассмотрим этот процесс с энергетической точки зрения. Продвижение электрона по цепи электронного транспорта и его поступление от донора электронов сопровождается на каждом шаге потерей энергии. Таким образом, скорость прямой реакции переноса электронов оказывается много больше скорости обратной реакции. Этим предотвращается возврат электрона на РЦ с последующим излучением энергии. Но если все переносчики цепи электронного транспорта заняты, то возможен обратный процесс за счет энергии тепловых колебаний. Состояние, когда невозможен перенос электронов по цепи электронного транспорта, достигается, когда растения подвергают освещению при низкой температуре. В этом случае пластохиноны не могут передвигаться в мембране и передача электронов на b6/f комплекс становится невозможной. Но при низкой температуре тепловой энергии не хватает для обратного переноса. При нагреве становится возможным процесс обратного движения электронов и происходит излучение запасенной энергии.

Для понимания природы различных пиков ТЛ рассмотрим более подробно структуру и функции ФС 2. РЦ ФС 2 состоит из четырех мембранных протеинов D1, D2, Cyt b559, белка - продукта psb I гена, 2-х белков внутренней светособирающей антенны ФС 2: CP 47 и СР 43. Также вблизи кислород-выделяющего центра расположены три белка: 33 EP, 24 EP и 17 EP, связанные с кислород-выделяющей активностью хлоропластов. При возбуждении РЦ происходит быстрое разделение зарядов с передачей электрона на первичный акцептор - феофитин. Далее электрон идет на первичный хиноновый акцептор, а потом на двухэлектронный вторичный хиноновый акцептор. Цикл работы вторичного хинонового акцептора показан на рис.6. Донором электронов в реакционном центре выступает в основном YZ, реже YD. В свою очередь YZ получает электроны от КВС. Система выделения кислорода может находиться в одном из пяти состояний: S0, S1, S2, S3 и S4. Такой цикл работы КВС был установлен при освещении растений короткими вспышками. Было показано, что выделение кислорода происходит с периодом в 4 вспышки. В КВС важную роль играют ионы Mg2+ и Ca2+, при их удалении выделение кислорода прекращается, а при добавлении - восстанавливается.

Если возбуждать ТЛ короткими вспышками, то можно наблюдать изменение интенсивности отдельных компонент ТЛ. Эти изменения носят периодический характер и связаны с циклом работы КВС и заменой дважды восстановленного хинонового акцептора на окисленный пластохинон. Знание числа вспышек, на которые приходится максимум излучения какого-либо компонента ТЛ и состояния системы до предварительного освещения позволяет установить природу данного компонента. Более подробная информация о состоянии, в которое приходит система после освещения, содержится в работах.

Природа пиков термолюминесценции растений.

Как было сказано выше, источником ТЛ является вторая фотосистема. Теперь рассмотрим механизм возникновения отдельных пиков ТЛ.

Пик Z.

Предполагается, что этот пик происходит от рекомбинации зарядов: Chl+Chl-. Это основано на том, что этот пик ССК 1 и ССК 2 излучают сильнее, чем ФС 1 и ФС 2. При этом максимум излучения этого пика приходится на длину волны 730 нм, а возбуждение его происходит синим светом с большей эффективностью, чем красным.

Пик Zv.

Индекс V в обозначении этого пика означает, что температура его максимума меняется (v - variable). Температура этого пика зависит от температуры предварительного освещения, при этом температура максимума на 10-20С превосходит температуру предварительного освещения. Этот пик проявляется с периодом в четыре вспышки, хотя он излучается D1/D2/Cyt b559 препаратом РЦ ФС 2, обедненной Mn. Предполагаемым источником этого пика является P680+QA-.

Пик А.

Предполагается, что источником этого пика является S3+QA-. Это связано с тем, что пик А хорошо виден при предварительном освещении двумя вспышками при комнатной температуре, охлаждении и освещении непрерывным светом при -1960С. Если начальным состоянием ФС 2 и КВС было S1QAQB, то две вспышки при комнатной температуре переведут их в состояние S3+QAQB2-, Пластохинон, забрав два протона из стромы покинет ФС 2. Его место займет окисленный пластохинон, и система перейдет в состояние S3+QAQB, которое не содержит отрицательных зарядов, а значит не может быть источником ТЛ. Освещение при -1960С приводит к окислению Cyt b559 или хлорофилла вместо Mn кластера (переход S3S4 блокируется при -20С). При этом ФС 2 и КВС переходят в состояние S3+QA. При возбуждении ТЛ вспышками, пик А испытывает осцилляции с периодом в 4 вспышки с максимумами на второй и шестой вспышке.

Пик АТ.

Назван АТ, чтобы отличать его от пика А, имеющего такую же температуру. Он проявляется в трис-обработанных частицах ФС 2, обедненных Mn-кластерами. Предполагают, что он происходит от рекомбинации зарядов с QA- и His+ (гистидин), расположенных в РЦ ФС 2. Это основано на опытах с генетически измененной ФС 2.

Пик В (В1+В2).

Пик В состоит из двух компонент: В1 и В2. Разделение этих компонент происходит при pH<6.0, при pH в интервале 7.0 - 7.5 эти две компоненты имеют одинаковую температуру и проявляют себя, как один пик В. Пик В испытывает осцилляции с периодом в четыре вспышки с максимумами на вторую и шестую вспышки. При этом за пик В1 ответственно состояние S3+QB-, а за пик В2 - S2+QB-.

Пик D (Q).

Появляется при обработке растений диуроном или другим гербицидом, связывающимся со ФС 2 и конкурентно замещающим QB. При этом пропадает пик В. Это послужило обоснованием гипотезы о том, что отрицательные заряды, ответственные за появление пика В, накапливаются на QB, а носителем отрицательных зарядов в случае пика D является QA. Источником этого пика является S2+QА-.

Пик С.

Относительно происхождения пика С существует несколько гипотез. Одна из них - то, что пик С происходит от рекомбинации пары зарядов QА-YD+. Менее распространенной гипотезой о происхождении пика С является предположение об его происхождении от S0/1QA-. Это предположение основано на том, что пик С испытывает осцилляции с периодом в четыре вспышки с максимумом, когда КВС находится в состоянии S0 или S1. А предположение о QА, как источнике отрицательных зарядов, основано на том, что происходит усиление пика С при добавлении диурона. Но в литературе есть и иные данные на этот счет. Отмечено, что Арнольд и Аззи наблюдали исчезновение пика С при добавлении диурона. А авторы сообщают о том, что при обработке диуроном наблюдали смещение пика С к 65С, тогда как в контроле они наблюдали его при 55С. Аналогичные данные есть и в, где авторы наблюдали смещение пика С с 51С к 57С при добавлении диурона. Это может свидетельствовать о том, что пик С имеет составную природу, и в области 40 - 60С существует два пика различного происхождения. Сильное влияние на интенсивность пика С оказывает удаление ионов Ca2+, которое усиливает его. Одновременно удаление ионов Ca2+ ведет к ингибированию КВС. Это свидетельствует в пользу того, что источником пика С является ФС 2. Но при таком предположении затруднительно объяснить смещение пика С в область более высоких температур при обработке диуроном.

О природе происхождения пика С существует также предположение, что он связан с процессом разрушения мембран хлоропластов при замораживании. Такое мнение основано на том, что пик С является кислород-зависимым, при удалении из криостата кислорода пик С пропадает. Немного другого мнения придерживаются авторы работы. Они предполагают, что полоса С в субхлоропластных частицах вызвана взаимодействием детергентов (дигитонина или Тритона Х-100) с пигмент-белковыми комплексами. И эту полосу в субхлоропластных частицах следует отличать от подобной ей в целых листьях или хлоропластах.

Низкотемпературная термолюминесценция.

К низкотемпературной термолюминесценции относят ТЛ, проявляющуюся в области < -196 C . В этой области наблюдают три пика: Z, Z, Z с температурами -250, -220, -200C соответственно. На основании того, что эти пики возбуждает преимущественно синий свет, а излучает наиболее сильно ССК 2 и агрегированные формы хлорофилла, авторы предполагают, что источниками пиков низкотемпературной ТЛ являются являются молекулы хлорофилла, взаимодействующие с другими молекулами хлорофилла или с молекулами растворителя.

Высокотемпературная термолюминесценция.

К высокотемпературной термолюминесценции относят ТЛ в области выше 70С. В этой области можно наблюдать пик с максимумом около 125С. Как предполагают авторы, этот пик связан с перекисным окислением липидов.

Математические модели, описывающие термолюминесценцию растений.

Самой первой моделью, моделирующей ТЛ фотосинтетического аппарата, была модель Рэндолла - Уилкинса. Эта модель была создана для описания ТЛ кристаллофосфоров. Согласно этой модели, интенсивность ТЛ можно записать следующим образом:

,

где I - интенсивность излучения, n - число электронов (дырок) в ловушках в данный момент времени t, E - энергия активации, s - частотный фактор рекомбинации. Зная температуру максимума ТЛ - Tмакс, полуширину пика ТЛ - T1/2 и предполагая скорость нагрева B постоянной, можно определить энергию активации и частотный фактор рекомбинации:

;

.

Недостатком этой модели является то, что она моделирует одиночный пик ТЛ, тогда как в ТЛ растений существует множество взаимосвязанных пиков (это видно из рассмотрения источников тех или иных пиков). Другой недостаток этой модели заключен в том, что обратное продвижение электрона и дырки и их рекомбинацию она описывает одной реакцией. Реально этот процесс носит многоступенчатый характер. При этом каждому этапу соответствует своя скорость реакции и энергия активации. Определить эти параметры только с помощью E и s невозможно и это сильно снижает ценность этих оценок.

Большой интерес представляет работа, в которой авторы предлагают модель, лишенную вышеописанных недостатков. В качестве основной схемы для рассмотрения авторы предлагают:

Z2Z1Z0,

вводя при этом следующие пареметры: k0 - скорость реакции Z1Z0, k1 - Z2Z1, k-1 - Z2Z1. В данной схеме интенсивность флуоресценции определяет переменная Z1. Вводя малый параметр , и используя теорему Тихонова, авторы получают следующее выражение для интенсивности ТЛ:

,

где С - некоторая постоянная, Z2(0) - значение переменной Z2 в начальный момент времени, - скорость нагрева, предполагаемая постоянной, T0 - температура в начальный момент времени.

Более сложную схему:

Z3Z2Z1Z0,

авторы сводят к более простой (ABC), вводя эффективные скорости реакций:

 и ,

где k2 - скорость реакции Z3Z2, k-2 - Z3Z2, ka - AB, k-а - АВ. Такая замена возможна при k1>k0, ki>ki+1, ki+1>k-i.

Флуоресценция фотосинтетического аппарата.

При попадании света на лист часть световой энергии растение запасает в виде энергии химических связей, часть переходит в тепло, а часть высвечивается в виде флуоресценции или фосфоресценции. При этом фосфоресценция фотосинтетического аппарата гораздо менее интенсивна, чем его флуоресценция, и фосфоресценцией можно пренебречь. Таким образом, наблюдая за флуоресценцией, мы можем судить об эффективности работы фотосинтетического аппарата. Детальный обзор по флуоресценции фотосинтетических объектов в данной работе будет приведена лишь краткая сводка сведений.

Флуоресценция зеленого листа в красной области спектра имеет два максимума при 680 и 730 нм. Влияние различных факторов на отношение величин интенсивностей этих максимумов (). К сожалению зависимость от большого числа различных факторов затрудняет интерпретацию этого параметра, и в данной работе его не использовали.

Если наблюдать за изменением флуоресценции после включения возбуждающего света, то можно увидеть, что сначала флуоресценция нарастает (в течение первых 2-3 с), а потом уменьшается и за 10-20 минут выходит на стационарный уровень. Такое изменение флуоресценции со временем получило название индукции флуоресценции. Нарастание флуоресценции связано с тем, что после темновой адаптации пул акцепторов электронов ФС 2 преимущественно полностью окислен, все РЦ открыты. При включении света происходит восстановление акцепторов электронов ФС 2, число переносчиков, готовых к приему электронов, уменьшается. В результате этого вероятность излучения энергии увеличивается, и флуоресценция растет.

На втором этапе происходит тушение флуоресценции, которое обычно подразделяют на фотохимическое и нефотохимическое. Фотохимическое тушение связано с окислением переносчиков электронов между фотосистемами за счет, например, активации ферментов цикла Кальвина. Нефотохими-ческое тушение напрямую с окислительно-восстановительным состоянием переносчиков электронов не связано. Нефотохимическое тушение разделяют на три компонента:

1)энергетическое тушение (зависящее от (pH) на тилакоидной мембране);

2)тушение связанное с фосфорилированием белков ССК 2, и их переходом из «состояния 1» в «состояние 2» (это обеспечивает перераспределение поглощенной энергии в пользу ФС 1);

3)тушение, связанное с фотоингибированием фотосинтеза (усиление безызлучательной диссипиции при повышении освещенности).

В качестве параметра индукции флуоресценции часто используют отношение FM/FT, где FM - максимальное, а FT - стационарное значение интенсивности флуоресценции. Ранее было показано, что изменения этого показателя при различных способах обработки растений коррелируют с изменением фотосинтетической активности (скорости выделения O2) в расчете на хлорофилл.

2. Влияние препарата BION® на растения

Препарат BION® известен как активатор системной приобретенной устойчивости (SAR - systemic acquired resistance) ряда растений к грибной инфекции. Это коммерческий препарат (фирма Novartis), который содержит 50 % (по весу) активного вещества - бензо тиадиазол-7-тионкарбоновой кислоты (S-метил эфир) (BTH). Одним из механизмов SAR, как предполагают является усиление наработки активных форм кислорода, таких, как пероксид (H2O2) и супероксид O2-, которые могут привести к гибели клеток патогена. Одновременно с этим для защиты своих клеток в растении увеличивается активность пероксидазы, которая переводит H2O2 в H2O. По своему действию BTH схож с основной сигнальной молекулой в реакциях SAR (салициловой кислотой) и по-видимому полностью замещает ее при активации SAR, так как при обработке препаратом BION накопления салициловой кислоты не происходит.

При обработке препаратом BION в клетке начинается накопление веществ, отвечающих за наработку и удаление H2O2: оксалатоксидазы, липогеназы, пероксидазы. При этом оксалатоксидаза увеличивает наработку H2O2 [31]. Под воздействием BION® происходит связывание с клеточными стенками пероксидазы, которая участвует в реакции перевода H2O2 в H2O. Это позволяет защитить клеточные стенки растения. Но в то же время BTH подавляет действие каталазы и аскорбатпероксидазы, которые уменьшают уровень H2O2 в хлоропластах.

3. Методика экспериментов

Методика измерения термолюминесценции и методы обработки результатов экспериментов.

Экспериментальная установка.

При измерении ТЛ ФЭУ (в установке используется ФЭУ-79) работает в режиме счета фотонов. В блоке предварительной оцифровки сигнала происходит выделение моментов срабатывания ФЭУ и подача выходного сигнала в блок цифровой обработки сигнала. В блоке цифровой обработки сигнала происходит счет числа срабатываний ФЭУ за 1,25 с, оцифровка сигнала от термодиода и выдача этой информации в компьютер.

Водяной светофильтр использовали для подавления инфракрасного света от лампы накаливания, освещение которым может привести к нагреванию образца.

Охлаждающий кожух требовался для уменьшения фона и шумов ФЭУ, вызванных нагревом.

Методика измерения термолюминесценции.

Для измерения ТЛ образец (высечка из листа бобового растения или несколько вырезок из листьев проростков пшеницы) помещали в держатель и подвергали предварительному освещению. Сначала образец освещали при 20 0С светом от лампы накаливания, пропущенным через водяной и интерференционный светофильтр с max=735 нм, в течение 1 минуты, потом в течение 3 минут при -30 0С светом от лампы накаливания, пропущенным только через водяной светофильтр. Далее образец охлаждали до -80 0С, вставляли нагреватель в держатель образца и производили нагрев до 80 0С с одновременной записью ТЛ.

Методики обработки результатов.

Параметрами, характеризующими ТЛ, являются: температура максимумов ТЛ и величина пика интенсивности. По изменению температуры пика можно судить об изменении энергии активации и скорости реакции разделения зарядов в ФС 2. При этом, так как разделение отдельных пиков ТЛ представляет собой довольно трудную задачу, то для оценки достоверности различий в ТЛ листьев контрольных и обработанных растений использовали следующую процедуру. Пусть Iо(T) -кривая ТЛ растения, обработанного препаратом, а Iк(T) - кривая ТЛ контрольного растения. Находим:

.

Приведенная функция позволяет определить, в какой температурной области кривые ТЛ значимо отличаются друг от друга (т.е. Iр(T) отличается от нуля более, чем на величину тепловых флуктуаций люминесценции). Для определения температурной области, где различие между кривыми ТЛ превосходит величину теплового шума, для серии экспериментов находили Iр(T) для усредненных кривых ТЛ. Различие кривых ТЛ может быть также вызвано большой вариабельностью растений. Для учета этого фактора необходимо проводить статистическую оценку достоверности результатов. Для статистической обработки результатов введем следующий параметр:

,

где [T1, T2] - область, где Iр(T) отличается от нуля более, чем на величину теплового шума. Такой параметр уже легко подвергнуть статистической обработке, а температурную область определяли при помощи графика Iр(T) для усредненных кривых ТЛ листьев контрольных и обработанных растений.

Вышеописанная процедура хорошо применима для случая, когда нет изменения температуры пиков. Если происходит изменение температуры пиков, то лучше сравнивать следующие параметры:

и ,

где T2 и T1 обозначают границы области, где кривые ТЛ обработанного и контрольного растения сильно различаются.

Предложенная методика обладает следующими достоинствами. Пик, претерпевающий изменения, может сильно перекрываться с другим пиком, или даже выглядеть как плечо другого пика. Полученная процедура позволяет легко получить температурную область, где происходят изменения и численно оценить их достоверность. Этот метод не запутывает так интерпретацию результатов, как в случае, когда находят площади пиков по отношению к общей площади ТЛ (величину максимума интенсивности одного пика по отношению к величине максимума интенсивности другого).

К недостаткам данной методики следует отнести то, что она требует большего числа опытов, чем методика, где находят отношение максимумов интенсивностей (площадей) пиков.

Методика измерений спектров флуоресценции и их обработка.

Как и при измерении ТЛ, ФЭУ работал в режиме счета фотонов.

Для измерения спектров флуоресценции в держатель образца помещали высечку из листа боба или вырезки из листьев пшеницы. Измерения спектров проводили при комнатной температуре. Перед измерениями лист подвергали 5 мин освещению светом с длиной волны 470 нм. Измерения спектра проводили в области 630-800 нм с шагом 2 нм.

Для оценки влияния препарата на флуоресценцию использовали следующий параметр:

,

где I() - интенсивность флуоресценции на длине волны .

Методика измерения медленной индукции флуоресценции и ее обработка.

Медленную индукцию флуоресценции измеряли на длине волны 720 нм при комнатной температуре. При адаптации лист подвергали 30 с освещению светом с длиной волны 470 нм, потом лист 5 мин выдерживали в темноте. При последующем включении света производили измерение кинетики флуоресценции. Измерение индукции флуоресценции производили на той же установке, на которой производили измерение спектров флуоресценции. Для оценки результатов был использован параметр FM/FT, где FM - максимум флуоресценции, FT - ее стационарный уровень.

4. Результаты экспериментов

Опыт с пшеницей «Любава», выращенной в почвенной культуре.

Обработку проростков пшеницы Triticum aestivum L. (сорт «Любава») производили спустя две недели после посадки и повторно - спустя три недели после посадки. Обработку производили опрыскиванием растений раствором препарата в дистиллированной воде в пропорции 20 мг препарата на 100 мл воды. Контрольные растения опрыскивали при этом дистиллированной водой. Измерения производили дважды: непосредственно перед второй обработкой (измеряли однократно обработанные растения) и через неделю после второй обработки (измеряли двукратно обработанные растений).

Для пшеницы урожая 2001 г.

Результаты измерений термолюминесценции

Пик в области 0С (далее обозначен, как пик Х) вызван тем, что при 0С в листе начинает таять лед и температура в течение некоторого времени (пока тает лед) не изменяется. Таким образом, причиной пика Х по существу является некоторая неравномерность нагрева в области 0С. Авторы работы наблюдали максимум этого пика при 0С, при этом температура регистрации по их данным в течение некоторого времени не менялась. Этот пик вызвал значительные проблемы, так как при измерении однократно обработанных растений и соответствующих им контрольных пики А и В видны как плечи этого пика. Для двукратно обработанных растений пик А неразличим на фоне пика Х ни в контрольных, ни в обработанных растениях. Пик В виден в контрольных проростках как плечо пика Х, а в обработанных теряется на фоне пиков С и Х.

Обработка с использованием светосумм дала следующие результаты. Кривые ТЛ однократно обработанных и контрольных растений различались не более чем на величину шума. Оценка разности светосумм в области от -80С до 80С дала: Sp(-80C,80C)=03 усл.ед. (приборная погрешность 2 усл. ед., уровень значимости 0,1). Для двукратно обработанных растений было получено, что есть статистически достоверное отличие в области -3010 С и 3080 С (Sp(-30C,10C)=1,61,2 усл.ед. Sp(30C,80C)=16,65,2 усл.ед. с уровнем значимости 0,1). Таким образом, можно констатировать, что двукратная обработка препаратом BION® приводит к увеличению ТЛ в области пика А и появлению пика С. В то время, как однократная обработка не приводит к изменениям ТЛ.

Результаты измерений спектров флуоресенции.

Оценка светосуммы флуоресценции в области 630 - 800 нм дала следующие результаты. После первой обработки параметр Р контрольных и обработанных препаратом растений соответственно составлял: 4,50,9 и 4,20,9 (с уровнем значимости 0,1). После второй обработки этот показатель равнялся: для контрольных растений 8,02,0, для обработанных 8,11,7 (с уровнем значимости 0,1).

Результаты измерений медленной индукции флуоресценции.

Расчет параметра FM/FT дал следующий результат. В случае однократно обработанных растений указанный параметр был равен: 1,760,16 - для контрольных растений (с уровнем значимости 0,1), 1,920,14 - для обработанных препаратом (с уровнем значимости 0,1). После второй обработки для контрольных и обработанных растений параметр соответственно был равен 2,040,17 и 2,000,15 (с уровнем значимости 0,1).

Таким образом, можно констатировать, что измерения спектров и медленной индукции флуоресценции листьев пшеницы не выявили различий в работе фотосинтетического аппарата контрольных и обработанных препаратом BION растений.

Для пшеницы урожая 1992 г..

Отличия ТЛ, превышающие тепловой шум ФЭУ, для однократно обработанных растений наблюдали в областях: -2000С и 30800С. Статистическая оценка этих отличий дала следующие результаты: Sp(-20C,0C)=0,91,1 усл.ед. Sp(30C,80C)=15,45,3 усл.ед. (с уровнем значимости 0,1). Это говорит о том, что достоверные различия есть только в области пика С. При измерении ТЛ двукратно обработанных растений существенные отличия были обнаружены только в области 3080С. Численная обработка этого дала следующий результат: Sp(30C,80C)=28,14,8 усл.ед. (с уровнем значимости 0,1).

В ходе данного эксперимента пик Х обнаружен не был. Возможно, он проявляется только в том случае, когда в области 0С вклады в люминесценцию от соседних пиков равны (в этой области находятся плечи пиков А и В). А если в области 0С преобладает вклад в люминесценцию одного из пиков, то пик Х будет представлен в виде плеча более сильного пика и на фоне шумов может быть не различим.

В результате этого опыта можно сделать вывод, что обработка препаратом BION вызвала изменение в ТЛ уже после 1-ой обработки, а после второй произошло усиление разницы в ТЛ обработанных и контрольных растений в области 3080С приблизительно в 2 раза. Еще одно отличие от опыта с пшеницей «Любава» урожая 2001 г. состоит в том, что не было обнаружено отличия ТЛ в области пика А после второй обработки.

Опыт с бобами, выращенными в почвенной культуре.

Опыт проводили аналогично опытам с выращиванием пшеницы в горшках с землей. Семена бобов Vicia faba сорта «Русские Черные» высаживали в горшки с землей после двух часов замачивания в воде. Обработку проводили спустя две недели после посадки и повторно - спустя три недели. Растения обрабатывали опрыскиванием раствором препарата BION в пропорции 20 мг препарата на 100 мл дистиллированной воды. Контрольные растения обрабатывали дистиллированной водой. Измерения ТЛ производили непосредственно перед второй обработкой - спустя неделю после первой и неделю спустя после второй обработки.

Численная обработка кривых ТЛ по вышеизложенной методике дала следующие результаты. После однократной обработки кривые ТЛ обработанных и контрольных растений отличались более чем на величину шума в областях: 1045С и 4565С. Статистическая оценка этих изменений дала следующие результаты: Sp(10C,45C)=6,56,1 усл.ед. и Sp(45C,60C)=-0,12,3 усл.ед. (с уровнем значимости 0,1). С уровнем значимости 0,05 для области 10450С была получена следующая оценка: 6,57,2 усл.ед.. Это значит, что в ТЛ контрольных и однократно обработанных растений достоверных отличий не обнаружено.

После второй обработки растений было обнаружено появление пиков в области 7С и 53С, последний из которых виден в виде плеча. В контрольных растениях эти пики неразличимы на фоне более сильного пика В. Пик в области 7С соответствует пику D, который обычно проявляется при обработке растений диуроном. Возможно, этот пик есть и в необработанных диуроном растениях, но он мал и не виден на фоне более сильного пика B. Для статистической обработки результатов были выделены три области ТЛ: -1515С, 1530С и 3080С. Получены следующие результаты: Sp(-15C,15C)=1,52,5 усл.ед., Sp(15C,30C)=-=1,51,7 усл.ед. и Sp(30C,80C)=6,12,0 усл.ед. (с уровнем значимости 0,1). Исходя из этих результатов, можно заключить, что увеличение ТЛ в области 7С является статистически недостоверным, а рост люминесценции в области пика С - статистически достоверным. По результатам опыта с обработкой бобовых растений можно сделать следующие выводы: однократная обработка препаратом BION не принесла никаких изменений в ТЛ (по сравнению с контрольными растениями), а двукратная обработка привела к росту ТЛ в области пика С (по сравнению с контролем). Стоит еще заметить, что увеличение ТЛ в области пика С у бобов было в 2,5 раза меньше, чем у пшеницы «Любава» урожая 2001 г.

5. Обсуждение результатов

Препарат BION вызывал появление пика С у пшеницы «Любава» урожая 2001 г. после второй обработки, а у пшеницы «Любава» урожая 1992 г. - после первой обработки. У бобов препарат вызывал лишь слабое усиление ТЛ в области пика С. Последний факт не может быть вызван тем, что вещество не проникало в клетки растений. так как при выращивании бобов в условиях гидропоники существенного увеличения пика С также не наблюдалось, а состояние растений коррелировало с концентрацией препарата. Можно предположить, что различия в действии препарата на бобы и пшеницу связаны с различиями в защитных реакций этих растений против проникающей в клетки инфекции. Известно, что действующее вещество препарата BION, будучи функциональным аналогом салициловой кислоты, является активатором SAR. У пшеницы и бобов реакции против проникающей инфекции могут быть различны. Так, авторами работы было установлено, что K2HPO4 вызывает SAR у одних растений, но не вызывает ее у других. Можно предположить следующий механизм действия препарата. Обработка препаратом BION, как и салициловой кислотой, вызывает усиленное образование активных форм кислорода. Эти соединения повреждают не только клетки патогена, но также и мембраны тилакоидов, и вызывают изменения в комплексе КВС. Указанные изменения в состоянии клеток растения с учетом обсуждавшихся выше данных литературы о природе ТЛ растений и приводят к «разгоранию» пика С. Можно предположить, что основную роль в «разгорании» пика С играют изменения КВС. КВС расположена вблизи внутренней поверхности мембраны и хуже защищена от активных форм кислорода, чем мембранные белки (мембраны при активации SAR защищены связанной с ними пероксидазой). Скорее всего О2- играет в нашем случае большую роль, чем перекиси (пик С является кислород-зависимым). Факторы, влияющие на работу КВС, вызывают появление пика С (как это происходит, например, при удалении ионов Са2+). У пшеницы и бобов, как было отмечено выше, могут быть разные механизмы SAR. У бобовых растений BION не вызывает такого значительного образования активных форм кислорода, как у пшеницы, и это приводит лишь к незначительному усилению пика С. То, что препарат вызывает появление пика С у пшеницы «Любава» урожая 2001 г. лишь после второй обработки, хорошо согласуется с данными о том, что однократная обработка препаратом не вызывает SAR.

Различное действие препарата на пшеницу с разными сроками хранения можно объяснить изменениями в клеточном метаболизме, вызванными длительным хранением.

Незначительное увеличение интенсивности пика А под действием BIONа, наблюдавшееся в ряде опытов, также может быть связано с изменениями в работе КВС - возможно, что при предварительном освещении происходило накопление дырок в состоянии S3 в большем числе, чем у контрольных растений.

Сказанное выше позволяет предположить, что к появлению пика С могут приводить и другие активаторы SAR, и что он будет «разгораться» при поражении растений инфекцией. Подтверждением этого предположения может служить наблюдавшееся авторами работы усиление полосы С при поражении растений патогенами.

Отсутствие изменений флуоресцентных показателей: Р и FM/FT после обработки растений препаратом BION можно объяснить недостаточной точностью эксперимента.

Заключение

термолюминесценция фотосинтетический флуоресценция

1. Обработка пшеницы и бобов препаратом BION приводит к увеличению интенсивности термолюминесценции в области пика С. Предполагается, что этот эффект связан с интенсивным образованием активных форм кислорода, оказывающих влияние на мембраны тилакоидов и работу КВС.

2. Установлены различия в термолюминесценции листьев в зависимости от количества и способов обработки препаратом BION. В случае семян урожая 1992 г. полоса С наблюдалась после первой обработки, а в случае семян 2001 г. - после повторной обработки растений. Предполагается, что эти различия коррелируют с нарушениями в структуре цитоплазматических мембран при хранении семян.

3. При измерении спектров флуоресценции и медленной индукции флуоресценции листьев пшеницы, обработанных препаратом BION, существенных изменений флуоресцентных показателей обнаружено не было.

4. Установлено, что препарат BION оказывает угнетающее действие на развитие растений.

Размещено на Allbest.ru

...