Организация митохондриального генома грибов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Организация митохондриального генома грибов

Введение

геном гриб митохондриальный рекомбинация

Тема моей курсовой работы «Организация митохондриального генома грибов». Актуальность изучения митохондриального генома связана с мутациями в митохондриальных генах, которые оказываются летальными или приводят к снижению скорости роста, дыхательной активности грибов. Мутации в ДНК митохондрий могут вызывать наследственные заболевания, а также являются одной из основных причин старения и болезней, связанных со старостью не только грибов, но и других организмов.

Так как митохондриальная ДНК не является высококонсервативной и имеет высокую скорость мутирования, она является хорошим объектом для изучения эволюционного родства живых организмов. Для этого определяют последовательности митохондриальной ДНК у разных видов и сравнивают их при помощи специальных компьютерных программ и получают эволюционное древо для изученных видов.

Изучение митохондриального генома - основной инструмент при проведении идентификации. Возможность индентификации связана с существующими в митохондриальном геноме групповыми и даже индивидуальными различиями.

Сегодня митохондриальная генетика интенсивно развивается как в популяционном, так и в медицинском аспекте. Установлена связь между рядом тяжелых наследственных заболеваний и дефектами в митохондриальных ДНК. Генетические изменения, ассоциированные со старением организма, наиболее выражены в митохондриях. Что же представляет из себя геном митохондрий, отличающийся у грибов ичеловека или других животных от такового у растений, простейших и по размеру, и по форме, и по генетической емкости? Как работает и как возник митохондриальный геном у разных таксонов? Об этом пойдет речь на примере дрожжей (Saccharomycescerevisiae) и нейроспоры (Neurosporacrassa) как наиболее изученных объектов.

1. Митохондриальный геном дрожжей

1.1 МитохонриальныйгеномSaccharomycescerevisiae

Митохондриальная ДНК дрожжей в несколько раз больше, чем у человека (80 т. п.н.). Карты митохондриального генома дрожжей и человека представлены на рисунке1. Гены митохондриальной ДНК дрожжей кодируют большую и малую рРНК, тРНК, субъединицы цитохром-с-оксидазы, 9-ю субъединицу АТРазы, цитохромb. В митохондриальном геноме дрожжей есть также гены устойчивости к антибиотикам.

Saccharomycescerevisiae - вид одноклеточных микроскопических (5-10 микрон в диаметре) грибков (дрожжей) из рода сахаромицетов, широко используемый в производстве алкогольной и хлебопекарной продукции, а также в научных исследованиях.

S. cerevisiae-классический генетический объект, является также одним из наиболее детально изученных и в митохондриальной генетике.

Клетки S.cerevisiae размножаются вегетативным образом при помощи почкования. Сначала появляется вырост на материнской клетке, затем происходит деление ядра, образование клеточной стенки и отделение клеток друг от друга. На материнской клетке остается шрам от почкования, что позволяет определить её возраст. Обычно материнская клетка может образовывать 20-30 почек.

Клетки дрожжей могут пребывать в одном из двух стабильных состояниях: гаплоидном (сфероиды) и диплоидном (эллипсоиды).

Для выращивания оптимальными условиями является раствор дрожжевого экстракта с температурой 30°C, содержащий пептон и глюкозу [2].

Saccharomycescerevisiae - один из наиболее изученных модельных организмов, на примере которого происходит исследование клеток эукариотов, они легко выращиваются и не являются патогенными для человеческого организма. По сравнению с кишечной палочкой (Escherichiacoli), клетка дрожжей содержит в несколько раз больше ДНК и имеет более сложную организацию, чем бактерии. Клетки сохраняют жизнеспособность даже с множественными генетическими маркерами в своем генотипе, что существенно с точки зрения генной инженерии [4].

Основной наследственной единицей митохондриального генома дрожжей является нуклеоид, имеющий диаметр 20-50 нм. исостоящий обычно из 3-4 молекулмтДНК (рисунок 1).Митохондриальная ДНК дрожжей связана с гистоподобными белками. Показано, что при аминокислотном голодании у мутантов дрожжей с дыхательной недостаточностью количество нуклеоидов увеличивается примерно в 10 раз при неизменном количестве копий мтДНК. Увеличение числа нуклеоидов способствует усилению трансмиссии мтДНК.

Рисунок 1. Митохондриальный геном дрожжей

1.2 Строение митохондриального генома Saccharomycescerevisiae

Отдельные элементы регуляторной области генов, называемые энхансерами, могут располагаться перед структурной частью гена, позади нее или даже в ней самой. В структурной части большинства митохондриальныхгенов кодирующие последовательности нуклеотидов - экзоныперемежаются протяженными некодирующимипоследовательностями - интронами (рисунок 2). Суммарный размер интронов, как правило, многократно превышает общий размер экзонов гена. Исходя из этого факта, можно сделать вывод о том, что митохондриальный геном любого эукариотическогоорганизма содержит не только последовательность нуклеотидов с генетической информацией о белках и рибонуклеиновых кислотах (тРНК, рРНК и некоторых других), но и большоеколичество последовательностей нуклеотидов, не несущих информации.

Помимо интронов, в геноме Saccharomycescerevisiae имеется большое количество других некодирующих последовательностей нуклеотидов, главным образом различных повторяющихся последовательностей. Поэтому общая длина некодирующих последовательностей нуклеотидов в геноме Saccharomycescerevisiae в десятки раз превышает длину кодирующих последовательностей [2].

Рисунок 2. Гены цитохромаb и соответствующие мРНК у дрожжей и человека. Экзоны выделены цветом; интроны в дрожжевой ДНК выделены точками

Митохондриальную ДНК S. Cerevisiae в редких случаях удавалось выделить в виде замкнутого кольца размером 25 мк. Как и в случае с мтДНК растений, обнаруживаемые линейные ДНК молекулы первоначально считали результатом разрывов ДНК invitro в процессе приготовления препаратов. Однако линейная структура молекул мтДНК обнаруживалась не только при электронномикроскопических исследованиях, но и при рестрикционном картировании геномов, пульс-электрофорезе. В настоящее время линейные молекулы мтДНК обнаружены почти у трети из 60 изученных видов дрожжей, а также у ряда других таксономических групп, включая водоросли, паразитических простейших, плесневые грибы, оомицеты. При изучении структуры линейныхмтДНК обнаружены гомогенные терминальные структуры, что позволило ввести термин «митохондриальныетеломеры».

Изученные к настоящему времени митохондриальные геномы дрожжей чрезвычайно изменчивы по размерам (от 17,3 т. п.н. у Schizosaccharomycespombe до 101 т. п.н. у Brettanomycescustersii) и порядку расположения генов, в то время как общее число генов изменяется незначительно. Основные причины столь существенных различий в размере геномов объясняются наличием или отсутствием интронов и изменчивостью межгенныхучастков-спейсеров [1, 10].

Общее количество ГЦ-пар в мтДНК дрожжей чрезвычайно мало-18%; молекула состоит из ГЦ- и АТ-богатых зон. Половину всей мтДНК составляют АТ-богатые последовательности, содержащие менее 5% ГЦ-пар - так называемые спейсеры. Два-три процента генома составляют короткие участки, богатые ГЦ (более 50%). Половина этих участков содержит сайт рестрикции Haelll и называется сайт-кластерами, остальные несут сайт Hpall и названы ГЦ-кластерами. Длина ГЦ-кластеров обычно 30-60 п.н., число их на митохондриальный геном может превышать 150, обнаруживаются они по всему геному, но преимущественно в межгенных участках. Наконец, в оставшейся части генома содержание ГЦ-пар около 26%-это участки, состоящие из собственно генов (Приложение А) представлена карта митохондриального генома Saccharomycescerevisiae, на которой показаны известные гены, точки начала репликации и их ориентация [4].

Размер митохондриального генома у разных видов рода Saccharomyces обычно колеблется от 85 т. п.н. (так называемые длинные геномы) до 78 т. п.н. (короткие геномы) и 74 т. п.н. (сверхкороткие геномы). У S.cerevisiae количество молекул мтДНК на гаплоидную клетку составляет в среднем 21-23. Этот вид имеет «длинный» геном - 85 т. п.н. [1,3].

Митохондриальный геном одного из примитивных видов дрожжей-S.uvarum оказался значительно меньшего размера-57 т. п.н. Соответственно у данного вида имеется меньше точек начала репликации(ori) - четыре вместо восьми; ГЦ-кластеров всего 50-60, в то время как у S.cerevisiae их 200. Учитывая, что все характерные для дрожжей митохондриальные гены присутствуют и у S.uvarum, сокращение размера молекулы мтДНК можно с уверенностью отнести за счёт некодирующих участков. Заметим, что у S.cerevisiae из восьми точек ori-активными являются только четыре (рисунок 3).

Рисунок 3. Схематичная структура ori последовательности. А, В, С - ГЦ-кластеры, r^* и r - сайты, в которых репликация ДНК инициируется в обоих направлениях РНК-праймерами, l - АТ-богатый участок.

Ori-область митохондриальной ДНК дрожжей имеет обычно следующую структуру: три ГЦ-кластера, сайты инициации репликации и АТ-богатый участок длиной приблизительно 200 п.н. [4].

1.3 Гены, кодируемые митохондриальной ДНК дрожжей

Гены, кодируемые митохондриальной ДНК дрожжей представлены в таблице 1. Два гена, кодирующих рибосомальную РНК большой и малой субъединиц, у S.cerevisiae находятся на значительном расстоянии друг от друга, размеры этих генов соответственно 3100 (21S) и 1460 (15S) нуклеотидов. У грибов с малым митохондриальным геномом (Kloeckeraаfricana - 27 т. п.н. и Torulopsisglabrata - 19 т. п.н.) рибосомальные РНК также меньше: 2700 и 1400-1450 нуклеотидов. Ген rns непрерывен, тогда как rnl в зависимости от штамма может содержать интрон группы l, включающий ген эндонуклеазы.

Таблица 1. Гены, идентифицированные в митохондриальных геномах дрожжей

У дрожжей известен только один рибосомальный белок, кодируемый митохондриальным геномом - var 1, размер которого изменяется в зависимости от штамма (отсюда и название - variable) - от 40 до 44 кД.

Все тРНК гены, за исключением одного (tmtl), кодируются на одной и той же ДНК-нити, ни один из них не имеет интронов. Терминальный триплет ССА ко всем тРНК молекулам добавляется посттранскрипционно, подобно тому как это происходит с ядерными тРНК. Имеющихся в митохондриальном геноме 24 тРНК достаточно для переноса 20 аминокислот, импортируется из цитоплазмы лишь одна тРНК(CUU).

По своей кодирующей способности мтДНК дрожжей значительно уступают митохондриальному геному растений. Это касается генов, кодирующих как структурные рибосомальные белки, так и белки комплексов электронно-транспортной цепи митохондрий. Очевидно, эта редукция связана с переносом соответствующих генов в ядро [11].

1.4 Сюрпризы митохондриального генома

Несмотря на то, что в геномах митохондрий млекопитающих и дрожжей содержится приблизительно одинаковое количество генов, размеры дрожжевого генома в 4-5 раз больше - около 80 тыс. пар нуклеотидов. Хотя кодирующие последовательности мтДНК дрожжей высоко гомологичны соответствующим последовательностям у человека, дрожжевые мРНК дополнительно имеют 5'-лидерную и 3'-некодирующую области, как и большинство ядерных мРНК. Ряд генов содержит еще и интроны. Так, в гене box, кодирующем цитохромоксидазу b, имеется два интрона. Из первичного РНК-транскриптаавтокаталитически (без участия каких-либо белков) вырезается копия большей части первого интрона. Оставшаяся РНК служит матрицей для образования фермента матуразы, участвующей в сплайсинге. Часть ее аминокислотной последовательности закодирована в оставшихся копиях интронов. Матураза вырезает их, разрушая свою собственную мРНК, копии экзонов сшиваются, и образуется мРНК для цитохромоксидазы b (рисунок 4). Открытие такого феномена заставило пересмотреть представление об интронах, как о «ничего не кодирующих последовательностях» [4].

Рисунок 4. Процессинг (созревание) м РНК цитохромоксидазыb в митохондриях дрожжей. На первом этапе сплайсинга образуется мРНК, по которой синтезируется матураза, необходимая для второго этапа сплайсинга

1.5 Интроны митохондриальных генов дрожжей

Все интроны митохондриальных генов дрожжей, выявленные к настоящему времени, относятся к группам l и ll. Присутствие этих интронов не является обязательным для организма: сконструированы жизнеспособные штаммы, полностью лишенные митохондриальных интронов.

Некоторые митохондриальные гены прерываются большим количеством интронов, варьирующим у разных штаммов. Так ген цитохрома b может иметь до пяти, а ген coxl - до девяти интронов[1].

Многие интроны содержатori значительной длины, которые могут перекрываться с 3^'-концами прилегающих экзонов, эти orf кодируют матуразы и участвуют в сплайсинге, как это наблюдается для хпДНК и мтДНК растений. Некоторые матуразы участвуют не только в сплайсинге собственных интронов, но и интронов других митохондриальных генов. Так, матураза 4-го интронаcyb гена (bl) удаляет также интронal4б гена coxl.

Интроны ряда митохрндриальных генов (coxl, cob, rnl) содержат orf, кодирующиеэндонуклеазы. Именно присутствие этих высокоспецифических интрон-кодируемых ферментов, способных расщеплять двунитчатые ДНК молекулы, очевидно, связано с мобильностью ряда интронов группы l. Первый такой мобильный интрон размером 1,1 т. п.н. (ScLSU.1) был обнаружен в гене rnl гене, кодирующем рРНК большой субъединицы митохондриальных рибосом S. сerevisiae, затем мобильные интроны были описаны и для других генетических систем: ядерного рРНК гена Physarum, двух генов фага Т4E.coli, показаны возможные варианты перемещения интронов (Приложение Б), схема встраивания интрона в реципиентный геном (Приложение В).

Интрон-кодируемые эндонуклеазы содержат протяженные сайты узнавания - до 18 нуклеотидов; относительная важность каждого нуклеотида ScLSU.l-интрона показана на рисунке 5. Специфичность этих эндонуклеаз гораздо выше, чем обычных рестрикционных ферментов. Фермент разрезает ДНК, оставляя четырехнуклеотидные липкие концы. Эндонуклеазы содержат короткие декапептиды, так называемые LAGLI-DADG-последовательности, которые обнаруживаются и у большинства других orfинтронов группы l. Вся эта структура обеспечивает весьма эффективный сайт-специфический перенос интронов группы l не только в аллельные гены, но и в другие места тех же генов, а также в иные гены, имеющие сайт узнавания данной эндонуклеазой [4, 8].

Рисунок 5. Сайт узнавания эндонуклеазой, кодируемой мобильным интрономScLSU.l. Показана последовательность митохондриального гена LSU(rnl) вокруг сайта инсерцииинтрона (черная стрелка) и эндонуклеазного сайта расщепления (ломаная линия) (верхняя цепочка соответствует РНК). Указаны замены оснований по отношению к верхней цепочке. Минимальная узнающая последовательность взята в рамки.

1.6 Рекомбинации митохондриального генома дрожжей

Митохондриальные геномы дрожжей чрезвычайно изменчивы не только по размеру, но и по порядку генов при весьма константном наборе этих генов. Структурной основой рекомбинации мтДНК дрожжей являются ГЦ-богатые межгенные районы. Изменение порядка митохондриальных генов проиллюстрированона примере трех видов Saccharomyces (Приложение Г). Вид Saccharomycesuvarum имеет наименьший по размеру митохондриальный геном: 57 т. п.н., два других-соответственно 70 и 85 т. п.н. Ori/rep - последовательности и тРНК гены богаты ГЦ-кластерами. Очевидно, изменение порядка генов происходило путем перемещения генных блоков, состоящих, как правило, из структурного гена, фланкированного либо генами тРНК, либо ori/rep - последовательностями:

ori/rep - сохЗ - ш; ori/rep - cyb -г; µ - rpm 1 - р,

где греческими буквами обозначены соответствующие тРНК.

Давно известны спонтанные крупные делеции митохондриальной ДНК дрожжей, приводящие к фенотипу дыхательной недостаточности, так называемым мутациям «petite». Аналогичные цитоплазматически наследуемые мутации известны и у других грибов, они встречаются также у грибов-гифомицетов. Механизм образования таких делеций пока неясен, вероятно, они сайт-специфичны, и их возникновение связано либо с упомянутыми выше транспозонными свойствами интронов группы ll, либо с неправильной рекомбинацией [10].

2. Митохондриальный геном гриба (Neurospora)

2.1 Геномы митохондриальных плазмид Neurospora

Нейроспора (лат. Neurosporacrassa) - вид мицелиальных грибов отдела аскомицетов. Один из наиболее популярных объектов генетики.

Neurosporacrassa известна как модельный организм генетических исследований, так как она быстро растёт на минимальной среде и имеет гаплоидный жизненный цикл. Генетический анализ в этом случае оказывается простым, так как рецессивные черты проявляются в первом же поколении. Геном нейроспоры - семь хромосом (групп сцепления).

На N. crassa впервые было непосредственно доказано, что менделевское расщепление признаков - закономерный результат мейоза, а не статистическая закономерность. Линейное расположение мейоспор в аске позволяет определить результаты кроссинговера непосредственно по гаплоидным продуктам.

Нейроспора использовалась в экспериментах Э. Тейтума и Дж. Бидла по изучению генетического контроля процессов метаболизма. Вызванные рентгеновским облучением мутации приводили к изменению структуры генов и легко выявлялись по нарушениям отдельных биохимических реакций. Это привело исследователей к гипотезе «Один ген - один фермент» и представлению о том, что каждый ген кодирует определённый белок. В 1958 году Бидл и Тейтум получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

В составе ДНК доля пар Г+Ц - 52-55%. Доля кодирующих (неповторяющихся) последователей - 90% генома. К 2003 году геном N. crassa был полностью секвенирован. Он составляет 43 млн пар оснований и содержит около 10 000 генов.

Митохондриальная генетика нейроспоры разрабытывалась в основном на стандартных лабораторных штаммах Neurosporacrassa [3, 5].

Митохондриальная ДНК N. crassa на 95% секвенирована, она представляет собой кольцевую молекулу размером 62 т. п.н. (Приложение Д), гены и продукты, которые они кодируют (Приложение Е).

Очевидно, что количество генов в митохондриальном геноме N.crassa превышает таковое у дрожжей: тРНК представлены 27 генами, имеется дополнительно ген рибосомального белка 5S, гены семи субъединиц NADH дегидрогеназы, ряд URF. При этом несколько генов, имеющихся у Saccharomyces, у нейроспоры отсутствуют.

У поддерживаемого в большинстве лабораторий штамма N.crassa Oak Ridge (74-OR23-1A) все интроны относятся к группе I, однако в некоторых природных изолятах были также обнаружены интроны группы II. Во многих интронах (ND1, ND4, ND4L, АТР6, ND5 и cob) присутствуют ORF, часть из которых пока не идентифицирована ВND3 интроне обнаружена ORF с двумя сдвигами рамки [1, 12].

Размер кольцевых митохондриальных плазмид колеблется от 0,9 до 5,3 т. п.н., линейные плазмиды достигают длины 8,6 т. п.н. (Приложение Ж). Плазмиды делятся на несколько групп, названных по географическому местонахождению изолята, из которого они впервые были выделены. Малые кольцевые плазмиды (VS-ДНК) иногда сосуществуют в митохондриях штаммов, несущих плазмиды группы Mauriceville.

Как уже упоминалось, линейные плазмиды kalilo (8,6 т. п.н.), обнаруженные в N. intermedia на одном из Гавайских островов, вызывают старение штамма. При этом плазмиды встраиваются в мтДНК. В стареющих штаммах N.crassa была обнаружена другая линейная плазмида maranhar (7 т. п.н.), напоминающая по структуре плазмиду kalilo.

Пять основных кольцевых и две линейные плазмиды секвенированы. За исключением VS-плазмиды, все они несут длинную ORF, занимающую большую часть плазмиды. Эти ORF несут полимеразы, которые выполняют репликацию или транскрипцию плазмидной ДНК.

Сходные между собой кольцевые плазмиды Маиriceville и Varkudкодируют обратные транскриптазы, участвующие в репликации плазмид. Реверта за плазмидыMauriceville необычна тем, что способна инициировать кДНК синтез непосредственно напротив 3'-терминального нуклеотида матричной РНК - вероятно, этот фермент является примитивной формой обратной транскриптазы, родственной той, которая образовалась когда-то из РНК-за висимой РНК-полимеразы.

VS-ДНК не кодирует никакой полимеразы, и ее репликация зависит от ферментов других плазмид (Mauriceville/Varkud).VS-PHK способна к само-сплайсингу и может образовывать мономерные молекулы из мультимерных РНК, транскрибируемых с мультимерных версий VS-ДНК.

Линейные плазмиды kalilo и maranharсодержат генетическую информацию о структуре ДНК-полимеразы В и РНК-полимеразы, сходной с бактериофаговой и митохондриальной. Концы молекулы kaliloсодержат длинные (1,4 т. п.н.) терминальные инвертированные повторы, 5'-концы которых связаны с терминальными белками размером около 120 кД. У плазмиды maranhar терминальные инвертированные повторы более короткие - 349 п.н., они также связаны с белками. До сих пор неясно, где кодируется информация о терминальных белках.

Генетическая организация и нуклеотидные последовательности плазмид Neurospora привели к предположению, что они родственны митохондриальным интронам и мобильным генетическим элементам. «Вездесущесть» плазмид можно объяснить тем, что они могут передаваться от одних штаммов к другим во время нестабильных вегетативных слияний гифов. Из-за более быстрой эволюции плазмид по сравнению с мтДНК многие из них кажутся неродственными (например, Fiji и LaBelle), хотя при сравнении аминокислотных последовательностей их полимераз становится очевидным наличие общего предка [12, 13].

3. Аномалии митохондриального генома и старение

Впервые явная связь между нестабильностью митохондриального генома и старением штаммов грибов была обнаружена на нитчатом (filamenous) грибе Podosporaanserina. Сравнительный анализ митохондриальной ДНК у разных штаммов данного вида показал, что в стареющих культурах накапливаются специфические молекулы плазмидоподобных ДНК. Эти кольцевые молекулы образуются в результате сплайсинга нитрона субъединицы Iцитохромоксидазы (pl-интрон) и являются мобильными генетическими элементами. Данный интрон кодирует фермент - обратную транскриптазу. Встраиваясь в различные места мтДНК, он формирует повторяющиеся последовательности, которые впоследствии рекомбинируют с образованием дефектных молекул мтДНК с делециями разной длины. Протяженные делеции, выявленные в стареющих культурах штаммов Р.anserina, приводят к нарушению функций митохондрий, энергетическому дефициту и гибели культуры, начиная с кончиков гифов. При дальнейших исследованиях были выявлены мутантные штаммы Р.anserina, имеющие значительно большую продолжительность жизни, у которых не наблюдалось ни амплификации pl-интрона, ни реорганизации мтДНК. Наследование фенотипа «долгожителя» у одного из таких мутантов - grisea - происходит по менделевскому типу и связано, вероятно, с особенностями ядерного генома. Были также описаны два стареющих мутанта Р.anserina, у которых изменены компоненты ТОМ-комплекса - наружной мембраны митохондрий. Накопление специфических мутаций мтДНК у этих штаммов не было связано с амплификацией pl-интрона.

Еще один механизм старения, связанный с реорганизацией митохондриального генома, выявлен у нейроспоры. В данном случае наблюдалась не утрата фрагментов мтДНК, а инактивация генов, связанная с интеграцией плазмид в митохондриальный геном.

Большинство природных и лабораторных штаммов Neurosporaне стареют и кажутся бессмертными, но, как упоминалось в предыдущем разделе, описано два случая старения, связанного с линейными плазмидами.

Наиболее детально исследованы штаммы kalilo(умирающие), обнаруженные на Гавайях, которые в природных популяциях сосуществуют с нестареющими штаммами N. intermedia. Было показано, что в ювенильной стадии плазмида присутствует в митохондриях в большом количестве копий и наследуется преимущественно по материнской линии. Начало старения совпадает с внедрением каlДНК молекулы в мтДНК. Это событие происходит во времени более или менее случайно, да и в мтДНК плазмида внедряется в самые различные локусы. Внедрившаяся плазмида вызывает разрушение - старение и гибель организма, поскольку нарушается функционирование митохондриального генома. Свободные и встроенные плазмиды стареющего штамма передаются потомству вместе с мтДНК через материнскую цитоплазму. Чем короче жизненные циклы, тем ближе материнский родитель к смерти. При этом обнаруживаются цитохромные и рибосомальные дефекты, наблюдается цианид-нечувствительное дыхание.

Хотя точный механизм встраивания неизвестен, показано, что для этого процесса необходимо совпадение последовательности любых 5 п.н. из терминальных 20 нуклеотидов каlДНК с таковыми мтДНК. Молекула мтДНК со встроенной плазмидой имеет структуру…С-В-А - kalДНК-А-В-С… (где А, В, С - митохондриальные сегменты), тогда как до встраивания она представляла собой структуру…X-Y-Z-A-B-C… Неясно, существуют ли молекулы…X-Y-Z - kalДНК - Z-Y - X….

Кроме этих молекул в стареющих kalilo клетках обнаруживают и другие аномалии: большие сцепленные (concatenated) кольцевые или линейные комплексы каlДНК без мтДНК или минорные варианты делегированных kal ДНК разных размеров.

Вторая линейная плазмида, вызывающая старение, - maranhar-также встраивается в митохондриальный геном, хотя при этом не наблюдается 5'-нуклеотидной гомологии между ее концом и мтДНК. Комплекс тагДНК/ мтДНК так же симметрично фланкирован митохондриальными последовательностями, как и kalДНК/мтДНК.

У патогенного гриба другой систематической группы - Fusariumoxy-sporum - обнаружены две линейные митохондриальные плазмиды, для которых впервые была доказана репликация путем обратной транскрипции. Поскольку эти плазмиды также имеют 5-нуклеотидный повтор на одном конце молекулы, как и kalДНК, механизм встраивания может быть аналогичным.

Реорганизация митохондриального генома и связанные с ней процессы старения могут запускаться с помощью разных механизмов, в которых, вероятнее всего, участвует и ядерный геном [12].

4. Транскрипция дрожжевой митохондриальной днк

В митохондриальном геноме дрожжей выявляется 19-20 сайтов инициации транскрипции, все они начинаются высококонсервативной 9-членной последовательностью 5'-ATATAAGTA-3', З'-нуклеотид которой является 5'-началом мРНК.

Критическая область, необходимая для функционирования промотора, расположена между нуклеотидами -10 и +2 по отношению к точке начала транскрипции. Важность каждого из нуклеотидов этой последовательности была определена методом точечного мутагенеза с последующим исследованием транскрипции в системе invitro. Оказалось, что наиболее важными позициями являются -2, - 4, -6 и -7 нуклеотиды. Обнаруженная митохондриальная мутация в промоторе СОХ2 гена - замена А на Т в положении - 4 - вызывает прекращение транскрипции invivo, подтверждая результаты invitroанализа.

У дрожжей были выделены и охарактеризованы два кодируемых ядром белка, связанных с инициацией транскрипции мтДНК: РНК-полимераза и фактор специфичности sc-mtTFB[11].

Транскрипция различных митохондриальных генов дрожжей происходит с неодинаковой скоростью прежде всего из-за различий между промоторами. Различия между самым сильным и наиболее слабым промоторами достигают 20-кратной величины как при invivo, так и при invitroопределении. Ранее было показано, что наличие в положении +2 пурина делает промотор сильным, тогда как пиримидин на +2 позиции определяет слабый промотор. Именно второй нуклеотид от начала мРНК молекулы определяет скорость транскрипции разных матриц invivo.

Другим важным фактором регуляции экспрессии на уровне транскрипции является то, что митохондриальные гены транскрибируются в полицистронных матрицах (Приложение И). Оказалось, что уровень мРНК тех или иных генов зависит от их удаленности от промотора: он тем выше, чем ближе ген к началу транскрипта. Для некоторых генов эта разница может быть 17-кратной в пределах одной мРНК молекулы. Возможно, причиной этого является ослабление активности РНК-полимеразы, хотя не следует исключать и возможность избирательной деградации дистально расположенных транскриптов.

Специфических ядерных генов, контролирующих транскрипцию специи-фических митохондриальных генов, не было обнаружено. Транскрипционная активность митохондриального генома изменяется в зависимости от внешних условий. Было показано, что уровень большинства митохондриальных мРНК в 3-6 раз выше в дерепрессированных клетках по сравнению с репрессированными глюкозой. Соотношение некоторых мРНК к тотальной РНК остается неизменным при добавлении глюкозы (например, СОХЗ мРНК), тогда как количество других мРНК в отсутствие глюкозы пропорционально возрастает (21SрРНК синтезировалась в 7,2 раза быстрее). Это отчасти связано с увеличением числа мтДНК матриц (приблизительно в 2 раза).

Уровень РНК-полимеразы (RP041 мРНК) также снижен в клетках дрож-жей, репрессированных глюкозой. Однако, скорее всего, RP041 транскрипция не является в данной системе лимитирующим фактором, так как 10 - 15-кратное искусственное ее увеличение не приводит к повышению уровня митохондриальныхмРНК.

Хуже изучена зависимость уровня транскрипции в митохондриях от кон-центрации кислорода. Показано 2-3-кратное подавление СОХЗ мРНК в анаэробных условиях; уровень СОХ1 и CYBмРНК не изменялся [7, 10].

5. Трансляция митохондриальной ДНК

Трансляционный аппарат митохондрий грибов кодируется в основном ядерными генами: 77 рибосомальных белков, тРНК-синтетазы, гомологи бактериальных факторов элонгации Тu и G.

Гены митохондрий дрожжей входят в состав полицистронных комплексов, включающих 2-7 генов, однако РНК-матрицы семи из восьми генов имеют длинную (от 300 до 950) 5'- и более короткую З'-нетранслируемые области. Все 5'-нетранслируемые области (5'UTL - untranslatedleader) имеют по крайней мере по одному AUG-триплету [7, 13].

Механизм, с помощью которого митохондриальные рибосомы дрожжей идентифицируют инициирующие кодоны, неясен. Рибосомы митохондрий дрожжей не сканируют мРНК в поисках инициирующего кодона подобно цитоплазматическим. Нет никаких указаний, что в данной системе задействованы последовательности Shine-Dalgarno. Во многих отношениях инициация трансляции в митохондриях дрожжей напоминает процесс, который описан для ряда вирусных и клеточных мРНК в цитоплазме клеток животных.

Описана делеция участка (от -32 до -5), предшествующего инициирую-щему кодону cob гена, которая вызывает прекращение трансляции активного цитохромаb. При этом начинает синтезироваться белок несколько меньшего молекулярного веса, чем цитохромb, - очевидно, происходит сдвиг инициации трансляции к какому-то из нижележащих AUG-триплетов внутри кодирующей последовательности цитохрома.

Необычной чертой трансляционной системы митохондрий дрожжей яв-ляются специфические белки-активаторы: именно они взаимодействуют с 5'UTR-областями митохондриальных транскриптов и играют решающую роль в регуляции трансляции. Такие активаторы кодируются ядром и обнаружены почти для всех генов, транслируемых на митохондриальных матрицах.

Роль отдельных ядерных белков в активации митохондриальных транс-криптов удалось установить при исследовании митохондриальных супрессоров соответствующих ядерных мутантов. Такие супрессии возникают, если спонтанная делеция участка митохондриальной ДНК приводит к присоединению 5'UTR одного гена к кодирующей части гена, не экспрессировавшегося у данного мутанта [12, 13].

Заключение

Так как митохондриальная ДНК не является высококонсервативной и имеет высокую скорость мутирования, она является хорошим объектом для изучения филогении живых организмов. Для этого определяют последовательности митохондриальной ДНК у разных видов и сравнивают их при помощи специальных компьютерных программ и получают эволюционное древо для изученных видов.

Кроме изучения для построения различных филогенетических теорий, изучение митохондриального генома - основной инструмент при проведении идентификации.

У грибов наблюдается наибольшая вариабельность в организации митохондриального генома, связанная прежде всего с различной длиной некодирующих областей и различным содержанием интронов в генах.

Из митохондриальных белоксинтезирующих систем разных систематических групп организмов (растения, животные, грибы) самой изученной является дрожжевая. Однако, несмотря на обнаружение ряда регуляторных белков, общая картина регуляции экспрессии митохондриального генома пока отсутствует. Неясно, чем объясняются различия количества транскриптов с разных участков одной полицистронной матрицы, как координируются процессы транскрипции и трансляции в митохондриях, как активируется трансляция мтДНК специфическими белками. Тем не менее наличие большого числа мутантных и супрессорных штаммов и особенности самого объекта - Saccharomycescerevisiae - позволяют предсказать дальнейший значительный прогресс в данном разделе митохондриальной генетики.

Особенности митохондриального генома Saccharomycescerevisiae:

1) клетки содержат в несколько раз больше ДНК, чем у бактерий и имеют более сложную организацию;

2) чрезвычайно изменчивы по размерам и по порядку расположения генов, в то время как общее число генов не изменяется;

3) по своей кодирующей способности мтДНК дрожжей значительно уступают митохондриальномугеному растений, это связано с переносом соответствующих генов в ядро;

4) присутствие интронов в организме не является обязательным: сконструированы жизнеспособные штаммы, полностью лишенные митохондриальныхинтронов.

Особенности митохондриального генома Neurospora:

1) количество генов в митохондриальном геноме N.crassa превышает таковое у дрожжей, при этом несколько генов, имеющихся у Sacchamyces, у нейроспоры отсутствуют;

2) генетическая организация и нуклеотидные последовательности плазмидNeurospora привели к предположению, что они родственны митохондриальныминтронам и мобильным генетическим элементам;

3) из-за более быстрой эволюции плазмид по сравнению с митохондриальной ДНК многие из них кажутся неродственными, но при сравнении аминокислотных последовательностей их полимераз становится очевидным наличие общего предка.

Список литературы

1. Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл-2010.-с. 494

2. Дмитриев Д.А., Дмитриева С.В. Молекулярные основы наследственности. Строение и функции нуклеиновых кислот: Чебоксары, 2009.-с. 16

3. Жизнь растений. В 6-ти т. Т. 2. Грибы / Под ред. проф. М.В. Горленко. - М.: Просвещение, 2010. - С. 146-147.

4. Минченко А.Г., ДудараваН.А. Смтохондриальный геном. Новосибирск, 1990.

5. Мюллер Э., Леффлер В. Микология: Пер. с нем. - М.: Мир, 1995.

6. WolfK. Mitochondrialgeneticsofyeast //TheMycotaII. Genetics and Biotechnology. Berlin, Heidelberg: Springer, 2009. P. 75-91.

7. Dujon B., Belcour L. Mitochondrial DANN instabilities and rearrangements in yeast and fungi // Mobile DNA. Amer. Soc. Microbiology. 1989. P.861-878

8. Wallace D.C. Structure and evolution of organelle genomes //Microbiol. Rev. 1982. Vol. 46, No. 2. P. 208-240

9. Grivell L.A. Nuclkeo-mitochondrial interactions in yeast mitochondrial biogenesis //Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 182. No. 1. P. 477-493

10. Perlman P.S., Butow R.A. Mobile inrons and intron-encoded proteins //Science. 1989. Vol. 246.P.1106-1009.

11. Wernette C.M., Saldahne R., Perlman P.S., Butow R.A. Purification of a site-specifie endonuclease, I-Sce-II, encoded by intron-4-alpha of the mitochondrial coxl gene of Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 189-206.

12. Clark-Walker G.D. Evolution of mitochondrial genomes in Fungi //Int. Rev. Cytol. 1992. Vol. 141. P. 89-127.

13. Tarassov I.A., Entelis N.S. Mitochondrially imported cytoplasmic transfer RNA of Saccharomyces cerevisiae - in vivo and in vitro targeting systems //Nucl. Acids Res. 1992. Vol. 20. P. 1277-1281.

Размещено на Allbest.ru

...