Использование иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВПО «Уральский государственный экономический университет»

Департамент торговли, питания и сервиса

Кафедра Пищевой инженерии

Курсовая работа

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Исполнитель:

Парфёнов А.В.

Студент 2 курса группы ПБ-12

Научный руководитель:

Борисова Г. Г.

Екатеринбург - 2014

Содержание

• Введение

1. Классификация и номенклатура ферментов

1.1 Список ферментов

1.2 Специфичность ферментов

1.3 Активирование и ингибирование ферментов

2. Иммобилизация ферментов

2.1 Общая характеристика иммобилизованных ферментов

2.2 Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками

3. Применение ферментов

4. Ферменты в алкоголе

4.1 Применение ферментов в пивоваренной промышленности

5. Применение ферментов при производстве этилового спирта

Заключение

Введение

Фермемнты, или энзиммы[1] (от лат. fermentum, греч. жэмз, ?нжхмпн -- закваска) -- обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы, ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах. Реагенты в реакции, катализируемой ферментами, называются субстратами, а получающиеся вещества -- продуктами. Ферменты специфичны к субстратам (АТФаза катализирует расщепление только АТФ, а киназа фосфорилазы фосфорилирует только фосфорилазу). Ферментативная активность может регулироваться активаторами и ингибиторами (активаторы -- повышают, ингибиторы -- понижают). Белковые ферменты синтезируются на рибосомах, а РНК -- в ядре.Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый в основном в русской и немецкой научной литературе, второй -- в англо- и франкоязычной). Термин фермент предложен в XVII веке химиком ван Гельмонтом при обсуждении механизмов пищеварения.

История открытия и исследования ферментов весьма интересна и поучительна. Вопросы о том, что же собой представляют живые системы, какова природа процессов в живом, каковы химические основы наблюдаемых превращений вещества, волновали всех великих химиков XIX столетия. Современная химия многим обязана Йенсону Якобу Берцелиусу. Он в рамках атомистической теории Дальтона создал первую таблицу атомных масс, разработал номенклатуру соединений и усовершенствовал химическую символику, создал химический язык, которым мы пользуемся в настоящее время. Й. Берцелиус создал электрохимическую теорию химических реакций, ввел представление об изомерии, открыл ряд новых элементов, таких как церий, селен, торий, ванадий. Им же было введено в химию понятие катализа.

К этому времени уже накопилось много необъяснимых фактов, обнаруживающих влияние «третьего тела» на протекание химической реакции. В 1812 г. Ф. Фогель продемонстрировал, что в присутствии угля происходит реакция водорода и кислорода. В 1817 г. Г. Дэви экспериментально показал, что в присутствии металлической платины или палладия происходит медленное горение водорода, монооксида углерода, метана, паров спирта, эфира. Это были «химические фокусы». Г. Дэви демонстрировал, что при внесении в колбу, содержащую пары спирта или эфира, нагретой платиновой проволоки, часть проволоки, находящаяся в колбе, раскалялась докрасна и «оставалась в таком состоянии, пока в колбе было достаточное количество пара и воздуха». В это время уже были хорошо известны опыты К. Кирхгофа (1811, 1814 г.) по гидролизу крахмала под действием разбавленной серной кислоты и некоего «клейковатого вещества», выделяемого из пшеницы. И. Берцелиус был первым, кто осознал значимость влияния «третьего тела». Он использовал данные опытов К. Кирхгофа при построении своей концепции о катализе. В 1836 г. в статье «Некоторые соображения о до сих пор еще не познанной силе, действующей при образовании органических соединений в живой природе» Й. Берцелиус писал: «Сущность “каталитической силы” состоит в том, что тело лишь своим присутствием, а не благодаря химическому сродству, не проявляющемуся при этой температуре, может возбуждать дремлющие химические сродства взаимодействующих веществ». С самого начала развития представлений о катализе было ясно, что в биологических системах ускорение реакций под действием катализаторов играет первостепенную роль. Й. Берцелиус писал: «В живых растениях и животных, в тканях и жидкостях протекают тысячи каталитических процессов, осуществляя большое количество различных химических синтезов из общего исходного материала». Это была гениальная догадка. Из школьной характеристики И. Берцелиуса: «У мальчика хорошие способности, но плохое поведение. Его будущее сомнительно». В современном смысле понятие «катализ» вошло в химию лишь спустя полвека после смерти Й. Берцелиуса благодаря работам Вильгельма Оствальда. Были сформулированы основные понятия о скорости химических реакций, установлены зависимости скорости реакции от концентраций взаимодействующих веществ (Якоб Вант-Гофф (1852--1911) «Очерки по химической динамике» (1884 г.), Нобелевская премия по химии 1901 г. за открытие законов химической кинетики и осмотического давления), прежде чем понятие о катализе прочно вошло в категорию фундаментальных представлений химии. В. Оствальд определил катализатор как вещество, «которое, не входя в конечный продукт химической реакции, увеличивает ее скорость». Соответственно катализ представляет собой «ускорение медленно протекающих химических процессов в присутствии посторонних веществ». В 1901 г. В. Оствальд писал, что он различает четыре типа катализаторов: контактное действие «зародышей», гомогенный катализ, гетерогенный катализ и действие ферментов. В 1909 г. В. Оствальду была присуждена Нобелевская премия по химии за работы по катализу и основополагающие исследования скоростей химических реакций. Таким образом, основоположники теории катализа изначально рассматривали ферментативный катализ как неотъемлемую составную часть катализа в целом. Представления о том, что катализ в живых системах осуществляют химические вещества, также имеют свою историю. Впервые каталитическое действие биоматериала было обнаружено Константином Сигизмундовичем Кирхгофом (1764--1833). К. Кирхгоф (аптекарь и химик по образованию) занимался проблемой получения сахара из крахмала. В это время он работал в главной аптеке Санкт-Петербурга. К. Кирхгоф понимал, что сахар и крахмал являются химически родственными соединениями. В 1811 г. он представил в Академию наук образцы сахарного сиропа и кристаллического «сахара», полученные им путем гидролиза картофельного крахмала под действием разбавленной серной кислоты. Реакция протекала сутки, при этом серная кислота не расходовалась и по завершении процесса нейтрализовалась расчетным количеством карбоната кальция. Это был истинно каталитический процесс. В 1812 г. К. Кирхгофом были изложены основы этого процесса в статье «О приготовлении сахара из крахмала». Расширяя свои исследования, К. Кирхгоф обнаружил, что аналогичного результата можно добиться и без добавления кислоты, а под действием «клейковатого вещества» (клейковины), которое он получил из пшеничного зерна. 30 ноября 1814 г. К. Кирхгоф выступил с докладом «О получении сахара при осолаживании злаков».

Впервые было показано, что агентом, обеспечивающим гидролиз, является отличное от крахмала «клейковатое вещество». Работая в России, К. Кирхгоф провел большое число исследований в области технической химии. В 1812 г. он был избран экстраординарным академиком Петербургской академии наук, был членом Падуанской и Бостонской академий. Все великие химики первой половины XIX в. участвовали в дискуссии о природе процессов, происходящих в живых системах. В качестве модели и главного объекта анализа и дискуссии рассматривался процесс конверсии сахара в спирт или уксусную кислоту (винное или уксуснокислое брожение). Парижская академия наук в 1799 г. задала конкурсный вопрос: «Чем отличаются растительные и животные вещества, действующие как фермент, от тех веществ, которые подвергаются ферментации». Обоснованный ответ на этот вопрос был дан французским исследователем Шарлем Каньяр-Латуром (Ш. Каньяр де ла Тур) (1777--1859). Он экспериментально показал, что дрожжи, осуществляющие ферментацию, -- не просто химические вещества, а живые организмы, способные расти и размножаться, причем исходные вещества и продукты реакции -- простые химические соединения. Этот вывод был встречен в штыки Й. Берцелиусом, Ю.Либихом, Ф. Вёлером. Вклад Юстуса фон Либиха в развитие органической химии и агрохимии сравним лишь со значением работ Й. Берцелиуса для общей и неорганической химии. Ю. Либихом создана теория радикалов, разработаны методы анализа и впервые осуществлен синтез многих органических соединений, показана роль фосфора и азота в развитии растений, впервые использованы минеральные удобрения -- суперфосфат и сульфат аммония для повышения плодородия почв. Великий Ю.Либих в школе имел много проблем. Он увлекался химией и пренебрегал традиционными школьными предметами. Отец устроил его практикантом в аптеку. Но Юстус больше интересовался химическими экспериментами, чем производством лекарств. Опасные опыты с серебром и ртутью он проводил тайно. Опыты закончились сильным взрывом, взлетела на воздух крыша аптеки. На этом карьера Либиха-аптекаря закончилась. Фридрих Вёлер (1800-- 1882) знаменит, прежде всего, своими работами по получению мочевины и щавелевой кислоты (простейших органических соединений) из неорганических веществ. Им также впервые получен в значительных количествах металлический алюминий, открыта практически важная реакция получения ацетилена из карбида кальция. Ф. Вёлер так описал лабораторию И. Берцелиуса, в которой были сделаны выдающиеся научные открытия: «Рядом с жилым помещением находились две очень скромно оборудованные комнаты. Там не было газа и воды. В одной комнате стоял обычный деревянный стол, у стены -- несколько маленьких шкафов с небольшим количеством реагентов. Канализационную систему заменяли сосуд с водой, фаянсовая раковина и стоящие внизу ведра. Во второй комнате находились весы и другие инструменты и мастерская с маленьким токарным станком. На кухне выполняла свои служебные обязанности Анна, которая была служанкой и лаборанткой великого ученого. Там же стояла маленькая печь и постоянно горячая песочная баня». При этом И. Берцелиус утверждал, что хороший химик должен уметь просверлить отверстия пилой. Й. Берцелиус, Ю. Либих и Ф. Вёлер представляли себе процесс брожения как истинный химический процесс, в котором осадок (дрожжи) обладает некоторой химической активностью. Фактически вопрос сводится к тому, что же представляет собой катализатор: химическое вещество неизвестной, возможно, очень сложной структуры или живой микроорганизм? Ю. Либих, Й. Берцелиус, Ф. Вёлер и многие другие химики не могли воспринять идею о том, что живые организмы при брожении осуществляют химическую реакцию, несмотря на то, что поток фактов, подтверждающих это, непрерывно рос. Бурная дискуссия о природе химических реакций в живом развернулась между JI. Пастером, Ю. Либихом и М.Бертло. Луи Пастер был ярым сторонником того, что брожение (т.е. конверсию сахара в спирт или в уксусную кислоту и сопутствующие продукты) могут осуществить лишь живые клетки микроорганизмов. Л. Пастер отвергал саму идею необходимости существования растворимых ферментов, участвующих в брожении. Он писал: «Я не вижу никакой необходимости ни в существовании этих ферментов, ни в полезности их функционирования при брожении». Отметим, что Ю. Либих, проводя различные химические реакции с органическими молекулами, не мог допустить мысли, что для реализации простого химического процесса -- окисления спирта в уксусную кислоту (реакция идет под действием различных химических окислителей) -- необходимо участие такого сложного агрегата, как целая клетка живого микроба. Ю. Либих предполагал, что наблюдается всего лишь корреляция между «физиологическим процессом» образования продуктов и ростом клеток. Значительную роль в выяснении вопроса сыграла дискуссия между Л. Пастером и Марселеном Бертло. Работы М. Бертло внесли громадный вклад в развитие синтетической органической химии. Им были осуществлены реакции получения уксусной и муравьиной кислот, проведен синтез этанола из этилена, синтез жиров из глицерина и карбоновых кислот, синтез бензола из ацетилена, созданы основы газовой электрохимии и проведен синтез ацетилена в электрическом разряде. М. Бертло полагал, что процесс брожения осуществляется органической субстанцией дрожжей. Важным был эксперимент М. Бертло, в котором он разрушил клетки дрожжей, получил бесклеточный экстракт, переосадил его спиртом без существенной потери активности и доказал, что полученная субстанция обладает каталитическими свойствами. Этот эксперимент показал, что «фермент» и живые клетки микроорганизмов не одно и то же, продемонстрировал, что клетки содержат вещества, реально осуществляющие химическую реакцию. На то, что брожение имеет характер каталитического процесса, указывал Эйхальд Митчерлих. В 1843 г. он отмечал, что для проведения процесса сбраживания сахара необходимо незначительное количество дрожжей (менее 1 %), несоизмеримое с количеством конвертированного субстрата, т. е. вкладом дрожжей как вещества в материальный баланс реакции можно пренебречь. Дискуссия закончилась, но участники остались при своем мнении.

Необходимо отметить: авторитет JI. Пастера был настолько высок, что его мнение, что лишь живые клетки микроорганизмов являются носителями процессов конверсии вещества, господствовало среди микробиологов длительное время. Его влияние на исследователей ощущалось и в XX в. Эйхальд Митчерлих (1794-1863) Особую роль в дискуссии сыграла неоднозначность в терминах, существовавшая в те годы. В течение многих лет дрожжи называли ферментом. Л. Пастер был против распространения термина «фермент» на растворимые вещества, способные проводить конверсию сахара, а понимал под «ферментом» живые растущие клетки, осуществляющие образование этиленового спирта и СО2. Термины «энзим» и «энзимология» были введены в 1876 г. В. Кюном для обозначения «неорганизованных», «бесформенных» ферментов, таких как диастаза, пепсин, трипсин, известных уже тогда. Точку в этом историческом споре поставили опыты Э. Бухнера (1897 г.), который продемонстрировал возможность проведения процесса брожения под действием бесклеточных экстрактов. Э. Бухнер механически разрушал клетки дрожжей, наблюдая за процессом под микроскопом, проводил экстракцию водой с отделением жидкости от твердых частиц фильтрованием под высоким давлением. Полученный раствор смеси ферментов был способен к интенсивному выделению спирта и СО2 при введении его в раствор сахарозы. На реакцию не действовали классические антисептики. Опыты показали, что брожение -- результат действия ферментов, не зависящего от целостности клетки. В 1907 г. Э. Бухнеру была присуждена Нобелевская премия по химии. Результатом работы большой группы исследователей, начиная с К. Кирхгофа, И. Берцелиуса, заканчивая В. Оствальдом и Э. Бухнером, явилось утверждение, что ферменты -- это химические катализаторы и необходимо искать объяснения действия ферментов на химической основе. Таким образом, стало ясно следующее. Химический катализ и биологический катализ -- это явления одного порядка; катализаторы («третье тело») обладают общим свойством -- они способны ускорять химические реакции. При этом существуют как общие катализаторы, способные ускорять многие реакции (например, кислоты), так и специфические катализаторы, ускоряющие лишь узкий круг реакций и работающие с ограниченным набором субстратов. Последнее свойство характерно для ферментов. В клетках микроорганизмов, растений, животных, человека имеются вещества, обладающие исключительно высокой каталитической активностью. Биологические катализаторы способны ускорять как простейшие химические реакции (инверсию сахара, гидролиз белков, реакции окисления), так и сложные процессы, такие как диспропорционирование сахара в этанол и СО2. Важным результатом была демонстрация того факта, что биокаталитической функцией обладают белки. Наиболее четко это было сформулировано немецким исследователем М. Траубе. В 1858 г. он в рамках своего представления о действии ферментов охарактеризовал ферменты как химические вещества белковой природы. Этому предшествовал этап накопления экспериментальных фактов. В 1830 г. П. Робике и А. Бутрон-Шаляр исследовали гидролиз аминдалина под действием измельченного горького миндаля. В 1831 г. Э. Лейксом было обнаружено, что слюна обладает активностью диастазы. Впервые достаточно очищенный препарат фермента удалось получить А. Пайену и Ж. Персу в 1833 г. Они выделили амилазу из солода, осадив ферментный препарат спиртом. Аналогичными методами удалось получить ферментный препарат синигриназы (Ж. Форс, 1835 г.), пепсина (Т. Шванн, 1836 г.), трипсина (Л. Корвизар, 1857 г.). Заметную роль в развитии методологии выделения ферментов сыграли работы Э. Брюкке и А. Я. Данилевского, которые использовали явление адсорбции для разделения белков. В 1862 г. А. Я. Данилевскому впервые удалось разделить трипсин и панкреатическую амилазу. Эти работы стали основой современных методов получения белков.

Следующий этап исследования ферментов связан с осознанием того факта, что ферменты обладают способностью взаимодействовать лишь с избранными субстратами, т.е. обладают специфичностью. Также было доказано, что субстрат в процессе каталитической реакции образует лабильный комплекс с белком. Детальное исследование ряда систем позволило Эмилю Фишеру сформулировать представления о специфичности ферментативного катализа. Э. Фишер -- выдающийся химик-органик. Он занимался изучением природы белков, сахаров, красителей, азотистых оснований, дубильных веществ. Э. Фишер гидролитически расщепил белки и показал, что все белки построены из аминокислот. Ряд аминокислот он получил встречным синтезом. Э. Фишер синтезировал дипептиды и олигопептиды. В 1907 г. им синтезирован пептид, состоящий из восемнадцати различных аминокислот. В 1894 г. Э. Фишер начал цикл работ по изучению специфичности действия ферментов. Эти работы были продолжением его исследований структуры сахаров и пептидов. Для объяснения специфичности действия ферментов Э. Фишер сформулировал положение о том, что субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку. Это положение не потеряло актуальности и сегодня лежит в основе представлений о стерическом соответствии между субстратом и ферментом. Выдающиеся работы были выполнены Э. Фишером в области химии углеводов и красителей. Работы Э. Фишера заложили основы изучения нуклеиновых кислот. За исследования сахаров и пуриновых производных в 1902 г. Э. Фишер был удостоен Нобелевской премии по химии. То, что фермент взаимодействует с субстратом и образует фермент-субстратный комплекс, следовало из анализа кинетики каталитической реакции. Изучение кинетических закономерностей действия ферментов начиналось на этапе развития химической кинетики. Впервые скорость ферментативных реакций анализировал Г. Тамман. Он провел тщательное сравнительное исследование действия ферментов и химических катализаторов реакции гидролиза и показал, что ферментативный гидролиз гликозидов и дисахаридов аналогичен классическому кислотному, исследуемому со времен К. Кирхгофа. Г. Тамман впервые изучил температурные зависимости скорости ферментативной реакции. Результаты работы были опубликованы в 1892 г. в журнале русского физико-химического общества и впоследствии в журнале физической химии, издаваемом Я. Вант-Гоффом и В. Оствальдом. Завершенную форму химико-кинетические исследования приобрели в работах Луи Анри (1834 -- 1913) и Леона Михаэлиса. Из кинетических данных однозначно следовало, что в процессе каталитического действия фермент образует комплекс с субстратом. Интерпретация Л. Анри и Л. Михаэлисом роли этого комплекса была различной, однако оба подхода для объяснения экспериментальных данных постулировали образование фермент-субстратного комплекса. Значительный вклад в фундамент кинетики ферментативного катализа внесли работы Э. Армстронга (1904 г.), обнаружившего эффекты ингибирования ферментативных реакций аналогами субстрата, и С. Соренсена (1868 -- 1939), продемонстрировавшего зависимость скоростей ферментативных реакций от концентрации ионов водорода.

Впервые высокоочищенный кристаллический фермент (уреаза) был выделен в 1926 году Дж. Самнером. В течение последующих 10 лет было выделено ещё несколько ферментов, и белковая природа ферментов была окончательно доказана.Каталитическая активность РНК впервые была обнаружена в 1980-е годы у пре-рРНК Томасом Чеком, изучавшим сплайсинг РНК у инфузории Tetrahymena thermophila. Рибозимом оказался участок молекулы пре-рРНК Tetrahymena, кодируемый интроном внехромосомного гена рДНК; этот участок осуществлял аутосплайсинг, то есть сам вырезал себя при созревании рРНК.До известной степени эта эволюция ферментов продолжается и сейчас, и мы можем ее проследить, изучая ферментные системы в современных нам высших и низших организмах. Так, например, согласно исследованиям Р. Куна, инвертаза, полученная из различных рас дрожжей, не вполне одинакова по своей активности. Очень интересны также и исследования естественных протеолитических систем низших и высших животных и растений. Эти исследования показывают, что протеазные системы низших являются как бы прототипом аналогичных систем высокоразвитых организмов. Весьма вероятно, что последние системы развились из первых в процессе эволюции. Аналогичные примеры можно найти и из области окислительных ферментов. Однако нужно отметить, что основные формы построения ферментных систем сложились уже на сравнительно ранней стадии, разбираемой нами эволюции в самом начале процесса становления жизни. Поэтому даже у наиболее низко организованных живых существ отдельные ферменты уже представлены в виде довольно совершенных систем. [2]

Цель: рассмотреть специфичность действия ферментов в алкогольной продукции.

Задачи:

1. Изучить классификацию ферментов.

2. Разобрать строение, функции и химическую природу иммобилизованных ферментов.

3. Рассмотреть действие ферментов в производстве алкоголя.

1. Классификация и номенклатура ферментов

Современные классификация и номенклатура ферментов были разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве. Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стремительным ростом числа вновь открываемых ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более того, одному и тому же ферменту часто давали два или несколько названий, что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не отражали тип катализируемой реакции, а при наименовании фермента исходили из названия субстрата, на который действует фермент, с добавлением окончания -аза: в частности, амилазы (ферменты, гидро-лизирующие углеводы), липазы (действующие на липиды), протеиназы (гидролизирующие белки) и т.д. До 1961 г. не было и единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали различные принципы. Комиссией были рассмотрены 3 принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип - химическая природа фермента, т.е. принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфатпротеинам, гемо-протеинам, металлопротеинам и т. д.

Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип - химическая природа субстрата, на который действует фермент. По этому принципу трудно классифицировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное множество промежуточных продуктов обмена. В основу принятой классификации положен третий принцип - тип катализируемой реакции , который является специфичным для действия любого фермента. Этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов. Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата (субстратов) служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно Международной классификации, ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов:

1. Оксидоредуктазы - катализируют окислительно-восстановительные реакции;

2. Трансферазы - катализируют реакции межмолекулярного переноса групп атомов и радикалов;

3. Гидролазы - катализируют реакции расщепления при участии воды;

4. Лиазы - катализируют реакции внутримолекулярного негидролитического расщепления, с образованием двойной связи или присоединения по двойной связи;

5. Изомеразы - катализируют реакции изомеризации;

6. Лигазы (синтетазы) - катализируют реакции синтеза с затратой энергии.

Оксидоредуктазы

К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие реакции окисления-восстановления. Общая схема может быть представлена следующим образом: Окисление протекает как процесс отнятия атомов Н (электроном от субстрата, а восстановление - как присоединение атомов Н (электронов) к акцептору. Если обозначить рецептор буквой А, а субстрат В, то уравнение реакции окисления-восстановления при участии оксидоредуктаз примет такой вид: В природных объектах обнаружено около 500 индивидуальных оксидоредуктаз. Наиболее распространены оксидоредуктазы, содержащие в качестве активной группы никотинамидадениндинуклеотид, или НАДН+. Их принято называть дегидрогеназами. Число известных процессов окисления спиртовых групп до карбонильных с помощью никотинамидных коферментов превышает две сотни. Например, важный промежуточный этап окисления глюкозы - это окисление глицеральдегид-3-фосфата, который протекает по реакции и приводит к образованию смешанного ангидрида 3-фосфоглицериновой кислоты и ортофосфорной кислоты - 1,3-дифосфоглицерата. Такой характер окисления имеет важное биоэнергетическое значение, поскольку остаток фосфорной кислоты, образующий ангидридную связь, может быть перенесен от 1,3-дифосфоглицерата на АДФ с образованием АТФ. Фермент, катализирующий эту реакцию, называют глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназой. Особого рассмотрения заслуживает подподкласс оксидоредуктаз, к которым относится небольшое число исключительно важных ферментов, катализирующих окислительное декарбоксилирование кетокислот остатком липоамида, связанного амидной связью с через аминогруппу остатка лизина с апоферментом трансацетилазой: Кофактором этих ферментов является тиаминпирофосфат: Схема превращений, происходящих в активном центре фермента участием реакционноспособного карбаниона тиаминпирофосфата можно представить в виде образовавшийся дигидролипоамид окисляется с помощью НАД+ третьим ферментом, участвующим в окислительном декарбокиировании, - дигидролипоамид дегидрогеназой, катализирующей реакцию. Ферменты, катализирующие превращения с участием молекулярного кислорода, разделаются на три основные группы: оксидазы, монооксигеназы и диоксигеназы. К оксидазам относятся ферменты, катализирующие процессы, в результате которых О2 восстанавливается до Н2О2 или до двух молекул воды.

К моноксигеназам относят ферменты, катализирующие окисление органических соединений, приводящее к включению одного из атомов кислорода молекулы О2 в молекулы этих соединений, и восстановление второго атома кислорода до воды. К монооксигеназам относится важная группа ферментов, известных под общим названием цитохромы Р450.

Диоксигеназы катализируют превращения, в ходе которых оба атома молекулы кислорода О2 включаются в состав окисляемого субстрата. Например, деструкция триптофана начинается с реакции образования формилкенуренина, в состав которого входят оба атома кислорода молекулы О2. Фермент, катализирующий эту реакцию, является гемопротеидом и называется триптофан 2,3-диоксигеназой. Фермент, катализирующий диспропорционирование свободного радикала НO2, образующегося в некоторых реакциях с участием О2 и являющегося очень сильным окислителем, называют супероксидисмутазой.

Трансферазы

В этот класс входят ферменты, ускоряющие реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков от одного соединения к другому. В зависимости от характера переносимых группировок различают фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, трансферазы, переносящие одноуглеродные остатки (метилтрансферазы, формилтрансферазы), и другие.

Фосфотрансферазы

Сюда относят ферменты, ускоряющие реакцию переноса остатков фосфорной кислоты. К фосфотрансферазам относится, например, гексокиназа - фермент, ускоряющий перенос остатков фосфорной кислоты от молекулы АТФ к глюкозе (с этой реакции обычно начинается преобразование глюкозы). фермент иммобилизованный энзим молекула

Аминотрансферазы

Эти ферменты ускоряют реакцию переаминирования аминокислот с кетокислотами и очень важны для обеспечения биосинтеза аминокислот.

Пиридоксальфермент

Катализирует реакцию переаминирования. В результате серии реакций, включающих в себя непременное образование фермент-субстратных комплексов, аспаргиновая кислота переходит в щавелево-уксусную кислоту, а кетоглутаровая - в глутаминовую.

Гликозилтрансферазы

Эти ферменты ускоряют реакции переноса гликозильных остатков из молекул фосфорных эфиров или иных соединений к молекулам моносахаридов, полисахаридов или иных веществ, обеспечивая главным образом, реакции синтеза и распада олиго- и полисахаридов в животном и растительном мире. Ниже приведено уравнение реакции распада сахарозы при участии сахароза-6-глюкозилтрансферазы, или сахарозофосфорилазы.

Гидролазы

К классу гидролаз относят ферменты, ускоряющие реакции расщепления (иногда синтеза) органических соединений при участии воды. Они делятся на следующие подклассы:

Эстеразы катализируют реакции гидролиза сложных эфиров, спиртов с органическими и неорганическими кислотами. Важнейшими подподклассами эстераз являются гидролазы эфиров карбоновых кислот и фосфатазы. Представитель первого подподкласса - это липаза.

Липаза ускоряет гидролиз внешних, то есть, сложноэфирных связей в молекулах триглицеридов (жиров).

Гликозидазы

Ферменты данной группы ускоряют реакцию гидролиза гликозидов.

Пептид-гидролазы

Ферменты этого подкласса ускоряют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах, при определенных условиях также синтез пептидных связей.

Лиазы

К классу лиаз относят ферменты, ускоряющие негидролитические реакции распада органических соединений по связям С-С; С-N; C-O и т.д. При этом замыкаются двойные связи и выделяются такие простейшие продукты, как СО2, Н2О, NH3 и так далее.

Изомеразы

Ферменты, относящиеся к этому немногочисленному (около 90 индивидуальных ферментов) классу, ускоряют геометрические или структурные изменения в пределах одной молекулы. Эти изменения могут состоять во внутримолекулярном переносе водорода, фосфатных и ацильных групп, в изменении пространственного расположения атомных группировок, в перемещении двойных связей и тому подобное.[3]

1.1 Список ферментов

На основании разработанной системы, которая служит основой как для классификации, так и для нумерации (индексации) ферментов, Международная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г. примерно из 900 ферментов. В списке ферментов (см. Номенклатуру ферментов, 1978) насчитывалось уже 2142 индивидуальных фермента, к декабрю 1995 г. их идентифицировано более 3500. В списке для каждого фермента, помимо кодового номера (шифра), приводятся систематическое (рациональное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую катализирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Номер каждому ферменту рекомендуется присваивать по четырехзначному коду. Таким образом, код каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками, и составляется по определенному принципу. Первая цифра указывает номер одного из шести главных классов ферментов. Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на природу той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз - на тип гидролизуемой связи и т.д. Эти подклассы в свою очередь делятся на более частные подгруппы (подпод-классы), отличающиеся природой химических соединений доноров или акцепторов, участвующих в данной подгруппе реакций. Номер (цифра) подподкласса ставят на 3-е место в шифре фермента.

У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз - тип отщепляемой группы и т.д. Первые 3 цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер в алфавитном порядке, который ставят на 4-е место в шифре.

Каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью 4 цифр, имеет соответствующий код, под которым он внесен в список ферментов. В качестве примера в табл. 4.6 приведены 2 фермента из списка. Следует особо отметить, что Международную классификацию ферментов нельзя считать абсолютно совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соответствует общепринятой в органической химии классификации химических реакций, несмотря на то что ферменты катализируют по существу те же реакции.[4]

1.2 Специфичность ферментов

Различают групповую и индивидуальную (абсолютную специфичность).

Фермент с абсолютной специфичностью катализирует превращение только одного субстрата и не действует на другие вещества, даже с очень похожей структурой и составом. Ферменты с абсолютной стереоспецифичностью действуют только на один стереоизомер, например, фумараза катализирует реакцию гидратации только фумаровой кислоты (цис-изомер) и не действует на малеиновую кислоту (транс-изомер).

Ферменты, обладающие групповой специфичностью катализируют превращение группы сходных по строению веществ, например, протеолитические ферменты пепсин, трипсин, химотрипсин катализируют гидролиз пептидных связей в молекулах различных белков. Они гидролизуют связи образованные определенными аминокислотами. Химотрипсин действует на связи, образованные карбоксильной группой фенилаланина или тиртирозина. Фермент алкагольдегидрогеназа окисляет одноатомные спирты.

Именно специфичность действия ферментов обеспечивает строгую последовательность химических реакций в клетке. Субстраты изменяются в одном направлении. Например, глюкоза превращается только в глюкозо-6-фосфат, так как в клетке активен фермент глюкофосфотрансфераза (глюкокиназа).

Через регуляцию активности ферментов осуществляется координация всех метаболических процессов во времени и пространстве. Молекулы ферментов могут синтезироваться в неактивном виде как проферменты и активироваться при помощи различных механизмов.

Скорость ферментативной реакции пропорциональна его концентрации. Низкая концентрация фермента приводит к снижению скорости реакции. Таким образом, регуляция процессов осуществляется путем регуляции синтеза ферментов. В ферментативных реакциях практически не образуется побочных продуктов, т.е. реакции протекают практически со 100% выходом.[5]

1.3 Активирование и ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значительной степени определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту реакцию. Активирующее влияние на скорость ферментативной реакции оказывают разнообразные вещества органической и неорганической природы.

Так, соляная кислота активирует действие пепсина желудочного сока; желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а ряд ферментов - также витамином С. Особенно часто активаторами выступают ионы двухвалентных и, реже, одновалентных металлов. Получены доказательства, что около четверти всех известных ферментов для проявления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов. Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза (карбоангидраза), катализирующая биосинтез и распад Н2СО3, практически теряет свою ферментативную активность; более того, цинк при этом не может быть заменен никаким другим металлом. Известны ферменты , действие которых активируется ионами нескольких металлов; в частности, енолаза активируется Mg2+, Mn2+, К+ (табл. 3).

Молекулярный механизм действия металлов в энзиматическом катализе, или роль металлов в активировании ферментами. В ряде случаев ионы металлов (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп ферментов, или служат акцепторами и донаторами электронов, или выступают в качестве электрофилов либо нуклеофилов, сохраняя реактивные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg2+через отрицательно заряженную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфатных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соединений. Иногда металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg2+активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию истинного субстрата - магниевой соли АТФ. Наконец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отметить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов (эффекторов; см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостеричес-ким центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса. Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторы ферментов обычно принято делить на два больших класса: обратимые и необратимые. Это вещества, вызывающие частичное (обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Недавно открыты антиферменты (антиэнзимы, или антизимы), представляющие собой белки (или полипептиды), действующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, и сывороточный антитрипсин. Недавно открыт в печени животных антифермент орнитинде-карбоксилазы (см. главу 12). Антизимы, вероятнее всего, образуют трудно-диссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами, выключая их из химических реакций.

Иногда ингибитор является составным компонентом предшественника фермента, например пепсина (см. главу 12), или входит в состав сложных комплексов ферментов, например в состав протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфо-рилирования-дефосфорилирования в живых организмах.

Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторными субъединицами, в частности, какова разница в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе протеинкиназы и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы. Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак-тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой-либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обратимое или необратимое ингибирование.

2. Иммобилизация ферментов

2.1 Общая характеристика иммобилизованных ферментов

В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Иммобилизованные ферменты (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворимы в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов. Существует несколько основных способов иммобилизации ферментов:

1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей;

2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствуют фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля;

3) благодаря электростатическому взаимодействию противоположно заряженных групп фермента и матрицы;

4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;

5) связыванием фермента и матрицы в результате не валентных взаимодействий - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;

6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр., включением фермента в липосомы;

7) сшиванием молекул фермента между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты.

Особый случай иммобилизации проведение ферментативных реакций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты реакции распределяются между организменной и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэффициента распределения веществ между фазами сдвигать равновесие реакции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает поверхностьсть их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту. Среди способов иммобилизации наибольшее распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетические полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромцианом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, которые способны вступать в реакцию сочетания, взаимодействия с группами NH2, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно несколькими способами.

Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами и матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварительной химической модификации молекул фермента низкомолекулярными веществами или растворимыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицированных белков электростатический заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространственные затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицательного влияния матрицы между ней и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов - спейсер (наз. также "вставкой" или "ножкой"). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естественное микроокружение. При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитический центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомолекулярных субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетические параметры реакции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость реакции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и могут быть причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при которой скорость ферментативной реакции максимальна. Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и раствора.

Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это характерно для высокомолекулярных субстратов, которые из-за малого коэффициента диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованного фермента, что приводит к относит. увеличению скоростей других реакций с участием субстратов меньших размеров. В некоторых случаях возможно также изменение направления реакции. Так, фермент эндополигалактуроназа, катализирующий расщепление полигалактуроновой кислоты в середине молекулы, после иммобилизации отщепляет низкомолекулярные фрагменты от концов молекулы. Существенное влияние на кинетику реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, оказывают два диффузионных барьера - внешний и внутренний. Первый обусловлен наличием тонкого неперемешиваемого слоя растворителя вокруг частицы иммобилизованного фермента (слоя Нернста). Толщина этого слоя зависит от скорости перемешивания. Поэтому увеличение последней или скорости тока раствора в колонке с иммобилизованным ферментом увеличивает скорость ферментативной реакции. Внутренне диффузионный барьер возникает вследствие ограничения свободной диффузии субстрата внутри сетки полимерной матрицы. Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ.

К ним относятся: более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакционной среды и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. Важное значение имеет относительная стабильность иммобилизованных ферментов к денатурирующим воздействиям - нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и других. Последнему подвержены протеолитические ферменты. Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитического фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта реакция катализируется самим пепсином.

Иммобилизованные ферменты применяют в производстве L-аминокислот, 6-аминопенициллановой кислоты, из которой получают полусинтетической пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и других веществ, для создания аппаратов "искусственная почка" и "искусственная печень", для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении некоторых онкологии, заболеваний и другого. Большое значение приобрели в клинической и лабораторной практике иммуноферментные методы анализа, в которых также используются иммобилизованные ферменты.[6]

2.2 Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками

1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру.

3. Применение ферментов

Обладая высокой степенью избирательности, ферменты используются живыми организмами для осуществления с высокой скоростью огромного разнообразия химических реакций; они сохраняют свою активность не только в микропространстве клетки, но и вне организма. Ферменты нашли широкое применение в таких отраслях промышленности, как хлебопечение, пивоварение, виноделие, чайное, кожевенное и меховое производства, сыроварение, кулинария (для обработки мяса) и т.д. В последние годы ферменты стали применять в тонкой химической индустрии для осуществления таких реакций органической химии, как окисление, восстановление, дезаминирование, декарбоксилирование, дегидратация, конденсация, а также для разделения и выделения изомеров аминокислот L-ряда (при химическом синтезе образуются рацемические смеси L- и D-изомеров), которые используют в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Овладение тонкими механизмами действия ферментов, несомненно, предоставит неограниченные возможности получения в огромных количествах и с большой скоростью полезных веществ в лабораторных условиях почти со 100% выходом. В настоящее время развивается новая отрасль науки - промышленная энзимология, являющаяся основой биотехнологии. Фермент, ковалентно присоединенный («пришитый») к любому органическому или неорганическому полимерному носителю (матрице), называют иммобилизованным. Техника иммобилизации ферментов допускает решение ряда ключевых вопросов энзимологии: обеспечение высокой специфичности действия ферментов и повышения их стабильности, простоту в обращении, возможность повторного использования, применение их в синтетических реакциях в потоке.