Методы изучения морфологии бактерий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное образовательное учреждение

Среднего профессионального образования

Свердловский областной медицинский колледж

Каменск-Уральский филиал

Методы изучения морфологии бактерий

Автор: Гафарова А.В.

Фельдшерское отделение

Группа 101.

Преподаватель: Бичина Н.Ю.

2015 г.

Содержание

Введение

1. Виды бактерий

1.1 Микоплазмы

1.2 Риккетсии

1.3 Актиномицеты

1.4 Хламидии

2. Основные методы изучения морфологии бактерий

2.1 Микроскопический

2.2 Культуральный

2.3 Биологический

2.4 Молекулярно-генетический

2.5 Серологический

Заключение

Список литературы

Приложение

Введение

Актуальность проблемы изучения морфологии бактерий является одним из фундаментальных разделов биологии, изучающий взаимодействие микроорганизмов с окружающей средой, обусловливающей их развитие, размножение и выживание.

В последние годы одним из новых направлений в изучении поведения микроорганизмов стал популяционный подход, основывающийся на исследовании колоний бактерий. Данный подход является базовым для изучения бактерий, как в окружающей среде, так и в макроорганизме.

В настоящее время хорошо известно, что многие патогенные бактерии являются полноценными обитателями различных экосистем. Они способны существовать и активно размножаться не только в организме хозяина, но и на объектах окружающей среды: в почве, в воде, на растительных субстратах.

1. Виды бактерий

1.1 Микоплазмы

(Mycoplasmatales) - очень мелкие микроорганизмы, отличающиеся от истинных бактерий отсутствием клеточной стенки. М. - неподвижны, не образуют спор, способны проходить через бактериальные фильтры. В жидких питательных средах имеют кокковидную, дисковидную, нитевидную и др. формы, на плотных средах дают мелкие колонии с тёмным центром. Размножаются путём деления нитей на кокковидные клетки. По ряду морфологических и физиологических признаков сходны с L-формами бактерий. К М. относят микробы, которые ранее назывались плевропневмониеподобными организмами (PPLO -- формы); они вызывают у крупного рогатого скота плевропневмонию, а у птиц - Микоплазмоз респираторный. М. встречаются также у человека при заболеваниях ревматического и артрического характера, инфекциях молочных желёз и дыхательных путей и др.; известны сапрофитные формы, обитающие на слизистой оболочке рта, в воде пресных водоёмов, сточных водах, навозе.

1.2 Риккетсии

(Rickettsiae) - это самые маленькие живые клетки, известные в природе, они занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. Риккетсии имеют форму палочек, или кокков. Они значительно меньше многих бактерий. Это абсолютные паразиты, так как могут расти и размножаться исключительно в клетке хозяина. Чтобы представить их размеры, приведем такой пример. В одной клетке слизистой желудочно-кишечного тракта блохи их может находиться около 100 000. Впервые риккетсии были обнаружены и изучены американским микробиологом Риккетсом. Переносчиком риккетсии являются насекомые и клещи. Заболевания, вызываемые различными видами возбудителей этой группы, получили название риккетсиозов: сыпной тиф, пятнистая лихорадка Скалистых гор, сыпной тиф, Ку-лихорадка и др. В отличие от бактерий они не растут на искусственных питательных средах.

1.3 Актиномицеты

Крупная группа грамположительных бактерий, объединяемых в актиномицетную линию, или актинобактерии. К А. относят нокардии, актиномицеты с многоклеточными спорангиями, актинопланы, стрептомицеты, мадуромицеты, термоактиномицеты, способные к умеренной термофилии, и др. Филогенетически к А. близки коринеформные бактерии и микобактерии. Тривиальное название А. укоренилось за бактериями, образующими подобие мицелия, наиболее известными из которых являются нокардии и стрептомицеты. Уст. название А. - «лучистые грибки». В большинстве своем А. - обитатели почвы, почти все - аэробы, органотрофы, могут разлагать самые различные природные полимеры, в частности хитин, многие способны к активному антагонизму за счет синтеза антибиотиков. Последнее в значительной степени стимулировало изучение этой группы микроорганизмов в интересах биотехнологии.

1.4 Хламидии

(Chlamydiales) - порядок бактерий. Мелкие кокковидные микроорганизмы (0,2-1,5 мкм), грамотрицательные, облигатные внутриклеточные паразиты. За неспособность синтезировать собственные высокоэнергетические соединения (они развиваются за счет богатых энергией соединений клетки-хозяина) их называют иногда «энергетическими паразитами». Включают одно семейство, один род с двумя видами-Chlamydia trachomatis - возбудитель трахомы и Ch. psittaci - возбудитель орнитозов.

2. Основные методы изучения морфологии бактерий

2.1 Микроскопический

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия.

Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (см. прил. рис. 1).

Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15 (см. прил. рис. 2). Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.

Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точками препарата, при котором они еще четко различимы под микроскопом.

Разрешающая способность обычных световых микроскопов с иммерсионной системой равна 0,2 мкм.

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (см. прил. рис. 3). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «висячей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздавленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла. На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива (см. прил. рис. 4).

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения. Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (см. прил. рис. 5). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла. Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (см. прил. рис. 6).

В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

2.2 Культуральный

Культуральный метод представляет собой выделение из питательной среды бактерий определённого вида путём культивирования, с их последующей видовой идентификацией.

Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой. После окончательной идентификации их характеристик, бактерии, выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.

Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия. Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение. Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37^о.

В) Микроскопия. Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний. На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37^о. бактерия микроорганизм метод изучение

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия. Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры. Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37^о, но в некоторых случаях может быть иной).

3 этап

А) Уровень роста и чистоты культуры. В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики. На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

2.3 Биологический

Биологический (экспериментальный) метод заключается в заражении чувствительных лабораторных животных выделенной чистой культурой возбудителя, исследуемым материалом или введении бактериальных токсинов и воссоздание типичной картины заболевания. Для этого используют белых мышей, крыс, гвинейских свинок, кроликов. Этим методом определяют и вирулентность микробов. С диагностической целью биологическую пробу часто используют при чуме, сибирке, туляремии, туберкулезе, крупозной пневмонии, полиомиэлите, клещевом энцефалите и др.

2.4 Молекулярно-генетический

Молекулярно-генетический метод основан на анализе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул ДНК. Основной целью этих методов является диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также выявление гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации. По существу, молекулярная диагностика является наиболее объективным методом верификации наследственных заболеваний. Важно подчеркнуть, что нахождение мутаций в гомозиготном или гетерозиготном состояниях соответственно при рецессивных или доминантных заболеваниях является бесспорным подтверждением диагноза. Однако в тех случаях, когда мутации не удается обнаружить, решающее заключение при постановке диагноза сохраняется за клиницистом, так как используемые на практике методы молекулярной диагностики чаще всего не позволяют идентифицировать все возможные мутации в исследуемом гене.

Внедрению молекулярно-генетической методологии в клиническую практику способствовала разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК, произошедшая более 20 лет назад. Первооткрыватель этого метода Керри Мулис за свое изобретение был удостоен Нобелевской премии в 1993 году. Метод ПЦР позволяет тестировать состояния генов у отдельных индивидуумов. Его суть заключается в избирательном копировании небольшого фрагмента гена, в котором предположительно может быть локализована мутация, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК обследуемого. Небольшие размеры копируемого (или амплифицируемого) фрагмента гена в сочетании с их огромным числом позволяют в дальнейшем использовать очень простые методы для анализа этого участка ДНК, выявления его особенностей у обследуемого пациента. Главными из этих методов являются электрофорез амплифицированной ДНК, ее окрашивание, разрезание специфическими ферментами - рестриктазами, и определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента - секвенирование.

2.5 Серологический

Серологические методы выявления специфических АТ и Аг возбудителя - важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможности. При этом необходимо выявить повышение титров АТ, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). АТ обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Заключение

Благодаря этой работе, я научилась правильно оформлять реферат. Много полезного узнала из этой информации.

Методы изучения бактерий понадобятся мне в будущем. В медицине, с помощью этих методов мы будем определять различные заболевания, инфекции и способы устранения причины.

Список литературы

1. Донецкая Э.Г.-А. Клиническая микробиология. 2011 год.

2. Зверев В.В., Бойченко М.Н. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Том 1. 2010 год.

3. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология : учебник для мед. вузов 2008 год.

4. Красникова Л.В. Микробиология 2012 год.

5. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии 2012 год.

Приложения

Рис. 1. Ход лучей в иммерсионном объективе

Рис. 2. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Рис. 3. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле

Рис. 4. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Рис. 5. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий ультрафиолетовые лучи.

Рис. 6. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

Размещено на Allbest.ru