Сущность способа выделения геномной ДНК из дрожжей и грамположительных микробов, основанный на разрушении их клеточных стенок литическими ферментами

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Известен наиболее близкий к заявленному способ выделения интактной геномной ДНК для определения размера хромосом с помощью техники пульс-электрофореза, где лизис соответствующих клеток или протопластов проводят в блоках из легкоплавкой агарозы, что предотвращает гидродинамические разрывы ДНК. После обработки клеток литическими ферментами гелевые блоки инкубируют в буфере, содержащем детергент и протеиназу К, и таким образом осуществляют депротеинизацию ДНК. Детергенты, протеиназу К, пептиды и другие компоненты клеток удаляют затем путем многократной промывки гелевых блоков в соответствующем промывочном буфере. После промывки и смены буфера интактные хромосомные ДНК, иммобилизованные в агарозе, фракционируют в агарозном геле с помощью пульс-электрофореза.

Вследствие того, что в геле агарозы диффузия ферментов, структурных белков, полисахаридов и даже низкомолекулярных компонентов сильно замедлена, процедура приготовления агарозных блоков с интактными ДНК занимает несколько суток. Последующая обработка гелевых блоков специфическими рестриктазами с целью получения макрорестриктов ДНК и их последующего пульс-электрофореза еще более усложняют и удорожают этот способ. Так, для получения макрорестриктов ДНК гелевые блоки после обработки протеиназой К интенсивно промывают в соответствующем отмывочном буфере, а затем инкубируют в буфере с PMSF (фенилметилсульфонилфторидом) - ингибитором протеиназы К (для полного удаления следов протеолитической активности). После этого блоки промывают в буфере для конкретнойрестриктазы и лишь после этого добавляют рестриктазу. Причем обработка рестриктазами, как правило, проводится в течение нескольких часов или в течение ночи. Следует подчеркнуть, что для полного расщепления ДНК в гелевых блоках требуются значительно больше количества рестриктаз по сравнению с расщеплением ДНК в растворе. На конечной стадии агарозные блоки промывают в буфере 0,5Х ТВЕ или в промывочном буфере с 50 mM ЭДТА, рН 8.0, после чего макрорестрикты ДНК подвергают пульс-электрофорезу.

Изобретение решает задачу упрощения процедуры, снижения трудоемкости и удешевления способа.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе выделения ДНК из клеток микроорганизмов гидролизом компонентов клеточных стенок с помощью литических ферментов предварительно клетки микроорганизмов обрабатывают буферным раствором с нейтральным значением рН, содержащим соль-хаотроп.

Одним из методов выделения нуклеиновых кислот бактерий и вирусов является обработка микроорганизмов гомогенной смесью фенола с водой. При использовании этого метода после добавления к суспензии микроорганизмов лизирующего раствора происходит образование двух фаз.Для эффективной депротеинизации нуклеопротеидного комплекса, образующегося после лизиса микробных клеток, смесь реагентов необходимо интенсивно встряхивать, что приводит к механическому повреждению молекул нуклеиновых кислот. Для того чтобы уменьшить гидродинамическое воздействие на молекулы ДНК и увеличить депротеинезирующую и денатурирующую активность фенола, необходимо избавляться от эффекта появления двух фаз. Чтобы предупредить их образование, некоторые исследователи предлагают добавлять в смесь реагентов органические растворители, что позволяет увеличить концентрацию фенола в лизирующем растворе и избежать образования двух фаз при выделении ДНК. Например, метод выделения нуклеиновых кислот вирусов в однофазных системах, где к фенольной фазе добавляют этанол (Тихоненко Т.И., 1962).

Недостатком данного метода является то, что при выделении нуклеиновых кислот бактерий увеличивается риск потери ДНК вследствие ее осаждения этанолом из-за более высокого молекулярного веса.

Цель изобретения - разработка нового способа выделения нуклеиновых кислот для получения препаратов ДНК сальмонелл и хламидий высокой степени чистоты и нативности.

Предлагаемый способ выделения ДНК микроорганизмов с последующей очисткой нуклеиновой кислоты хлороформом отличается от метода выделения нуклеиновых кислот в однофазной системе, где к фенольной фазе добавляют этанол, тем, что разделения реакционной смеси на две фазы во время лизиса клеток удается избежать за счет изменения рН предлагаемого лизирующего раствора до 9,3-9,5, обусловленного образованием при его приготовлении фенолята натрия. Высокая депротеинизирующая активность используемой смеси позволяет заменить резкое встряхивание препарата осторожным медленным перемешиванием и тем самым свести к минимуму гидродинамические воздействия на освобождающиеся нуклеиновые кислоты.

Состав лизирующего раствора: 80% фенол; 18,8% Н2O; 1,2% NaOH.

Методика приготовления (на 1 г лизирующего раствора): 800 мг кристаллического фенола насыщают 188 мклдеионизированной воды, затем добавляют 12 мг NaOH, pH раствора доводят до 9,3-9,5.

К полученному лизирующему раствору добавляют ДСН до конечной концентрации 1%.

Предлагаемый способ опробован при выделении ДНК сальмонелл и хламидий.

Нами предложена следующая схема выделения ДНК указанных микроорганизмов.

1. 1 мг культуры сальмонелл (или хламидий) суспендируют в 200 мкл дистиллированной воды. К полученной суспензии бактерий добавляют равный объем лизирующего раствора с ДСН, тщательно пипетируют и выдерживают при температуре 37С в термостате в течение 1 часа, время от времени перемешивая содержимое пробирки аккуратным покачиванием.

2. После экспозиции к лизату добавляют 200 мкл хлороформа, перемешивают содержимое пробирки, пока не образуется эмульсия. Затем смесь центрифугируют при 7000 g в течение 5 мин. Отбирают образовавшуюся водную фазу и повторно проводят экстракцию хлороформом в соотношении 1:1. Вновь проводят центрифугирование экстракта.

3. К извлеченной после последнего центрифугирования водной фазе добавляют 2 объема 96% этанола. Полученную смесь тщательно перемешивают и 1 час экспонируют при -20С.

4. ДНК осаждают путем центрифугирования при 7000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 70% этанолом и подсушивают при комнатной температуре.

5. Осадок ДНК растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМтрис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0).

Внимание! Степень чистоты всех используемых реактивов должна быть: "Чистый для анализа".

Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А260 /А280) колеблются в пределах 1,8-2,0, что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков и органических растворителей.

Практический выход ДНК сальмонелл составлет 10,2-20,4 мкг/мг, хламидий - 10,0-20,2 мкг/мг биомассы микроорганизма.

Для оценки нативности нуклеиновой кислоты растворы ДНК, полученные по указанной схеме, в количестве 1 мкг вносили в лунки 1%-ногоагарозного геля, содержащий этидиум бромидом 0,5 мкг/мл, и подвергают горизонтальному электрофорезу в буфере ТВЕ при напряжении 10 в/см в течение 1-2 часов (чертеж). ДНК сальмонелл (поз. 1) и хламидий (поз. 2) определяют по наличию светящейся в ультрафиолетовом свете полосы, на расстоянии 0,2-0,5 см от лунки, в которую была внесена проба.

Выделение ДНК из растений.

СТАВ-метод выделения ДНК из растений (DoyleandDoyle, 1987)

В основе метода лежит лизис клеток буфером на основе СТАВ (ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид, входит в состав многих бытовых моющих средств), депротинизация хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом.

Хлороформ - сильный канцероген, может вызывать нарушения работы центральной нервной системы. Работать необходимо в хорошо проветриваемом помещении под вытяжкой.

Необходимые реагенты:

СТАВ-буфер: 2% СТАВ(10,0 г), 1,4 M NaCI (40,91 г), 20 мM ЭДТА (20 мл 0,5 M ЭДТА), 100 мMTris-HCI pH 8 (50 мл 1М Tris-HCI) добавить дистиллированную воду до конечного объёма 500 мл.

ТЕ-буфер: 10 мM Tris-НС1, рН 8,0; 1 мM ЭДТА. Хранить при 2-8°С.

1. Примерно 2 см2 листьев положить в 1,5 мл пробирку. (Можно положить лист на пробирку и надавливанием крышки выдавить два-три круга).

2. Добавить 400 мкл СТАВ 2%-буфера и быстро в течении 30 сек измельчить с помощью палочки-измельчителя.

3. Добавить 10 мклРНКазы и 5 сек. встряхнуть на встряхивателе.

4. Инкубировать 60-80 мин при 65°С на водяной бане или сухом нагревателе, периодически аккуратно взбалтывать.

5. Добавить 400 мл очистительного раствора хлороформ-изоамиловый спирт (очистительный раствор: 92% хлороформа и 8% изоамилового спирта).

6. Центрифугировать 1 мин при максимальной скорости (13000 об/мин). гомогенный нуклеиновый клеточный диатомовый

7. Осторожно пипеткой отобрать верхнюю фазу (постараться не захватить промежуточную пленку) и перенести в новую пробирку.

8. Повторить пункты 5-7.

9. Добавить 350 мл холодного изопропанола и тщательно перемешать растворы не допуская энергичного встряхивания.

10. Центрифугировать 10 мин при максимальной скорости (13000 об/мин).

11. Изопропанолакуратно слить и осажденную ДНК прополоскать в 70% этаноле.

12. Центрифугировать 5 мин при максимальной скорости (13000 об/мин).

13. Спирт слить и ДНК оставить в открытой пробирке для сушки (часто достаточно около 1 часа).

14. Высохшую ДНК растворить в дистилированной воде или для долгого хранения ДНК лучше растворить в ТЕ-буфере.

Выделение суммарной клеточной ДНК из выборки клеток диатомовых водорослей с использованием СТАВ-буфера.

Метод выделения суммарной клеточной ДНК из растительного материала основан на том, что при высоких концентрациях солей, нуклеиновые кислоты образуют стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом. При снижении концентрации соли NaCl ниже 0,4 М комплекс СТАВ/н.к. выпадает в осадок.

После разрушения клеток белки денатурируют и экстрагируют смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. СТАВ удаляют путем осаждения этанолом (СТАВ растворим в этаноле, а ДНК нет).

Для выделения суммарной клеточной ДНК из диатомовых водорослей используют СТАВ-буфер следующего состава: 3% СТАВ, 1,4 М NaCl, 0,2% 2-меркаптоэтанол, 20 mM EDTA, 100 mM Tris -HCl (pH 8,0).

Выделение:

1. отобранные клетки отмывают от фиксатора (если проба фиксирована 80% этанолом) центрифугированием в течение 5', удалением спирта, добавлением воды; повторяют - 2 раза;

2. отбирают надосадочную воду, а осадок заливают 50 - 100 мкл предварительно прогретого при 60оС СТАБ-буфера, помещают пробирку в термостат (60оС) и тщательно растирают пестиком в течение 5 минут для разрушения прочных кремнистых стенок;

3. добавляют еще 100 мкл СТАБ-буфера и инкубируют в термостате при 60оС в течение 30 минут, периодически перемешивая раствор вращением пробирки (трясти пробирку не рекомендуется т. к. буфер пенится, ДНК разрушается);

4. остудив пробирку до комнатной температуры, добавляют равный объём смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1) и перемешивают медленным покачиванием в течение 10 мин;

5. разделяют фазы центрифугированием 10 мин (15000 об/мин)

6. супернатант переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл

7. добавляют 2/3 объема изопропанола

8. оставляют на ночь при -20о для осаждения ДНК

9. центрифугируют 20 мин, отбирают изопропанол

10. добавляют два объема 80% этанола, инкубируют 20 мин, центрифугируют 2 мин, тщательно удаляют спирт, подсушивают пробирку на воздухе для удаления паров спирта

11. осадок ДНК растворяют в 20 мкл воды или ТЕ-буфера (0,01М трис-HCl, pH-7,4, 0,1mM EDTA), до полного исчезновения осадка (прогревание при 60оС в течение 10 - 20 мин способствует растворению).

Полученный препарат тотальной ДНК (примерно 0,3 -0,8 нг ДНК) хранят в холодильнике, не замораживая, используют для реакций амплификации и др.

Размещено на Allbest.ru