Вивчення функціональної ролі фосфорилювання мікротрубочок в рослинній клітині

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

“ІНСТИТУТ ХАРЧОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ГЕНОМІКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ”

УДК:576.311.348.7+544.475+581.43

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВИВЧЕННЯ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ РОЛІ ФОСФОРИЛЮВАННЯ МІКРОТРУБОЧОК В РОСЛИННІЙ КЛІТИНІ

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

ШЕРЕМЕТ ЯРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі геноміки та молекулярної біотехнології

Державної установи “Інститут харчової біотехнології та геноміки Національної академії наук України”

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Блюм Ярослав Борисович ДУ “Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України”, завідувач відділу геноміки та молекулярної біотехнології

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Кордюм Єлизавета Львівна Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, завідувач відділу клітинної біології та анатомії

доктор біологічних наук Кравець Володимир Степанович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини

Захист відбудеться “23” листопада 2010 р. о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.254.01 в ДУ “Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України” за адресою: 04123, м. Київ,

вул. Осиповського, 2а. Факс: (044) 434 37 77

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ “Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України” за адресою: 04123, м. Київ,

вул. Осиповського, 2а.

Автореферат розісланий “21” жовтня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук А.І. Ємець

інгібітор протеїнкіназ мікротрубочка рослинний

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Мікротрубочки є обов'язковим та універсальним структурним елементом еукаріотичних клітин, що відповідає за поділ клітин, підтримання їх форми, внутрішньоклітинний транспорт, позиціонування органел. Головним компонентом мікротрубочок є тубулін - гетеродимерний білок із молекулярною масою кожної субодиниці (- та -) близько 50 кДа. Відомо, що множинність ізотипів рослинного тубуліну є результатом експресії цілого сімейства генів, які кодують різні субодиниці тубуліну (Baird et al., 2000; Breviario, 2000; Fosket and Morejohn, 1992; Hussey et al., 1991). В подальшому мікрогетерогенність цих ізотипів визначається різними посттрансляційними модифікаціями обох субодиниць тубуліну, які забезпечують появу більшої кількості ізоформ (Blume et al., 1997, 2008; Smertenko et al., 1997). Це, в свою чергу, забезпечує появу тубулінів із різними властивостями і, відповідно, популяцій мікротрубочок із різними функціональними можливостями.

Серед відомих посттрансляційних модифікацій тубуліну фосфорилювання займає особливе місце за рахунок свого широкого розповсюдження в еукаріотичній клітині (Wang et al., 2007). Раніше було встановлено, що в рослинній клітині, так само як і у тваринній, обидві субодиниці тубуліну зазнають фосфорилювання по залишках серину та треоніну (Blume et al., 1997). Продемонстровано, що посттрансляційне фосфорилювання тубуліну по залишках серину та треоніну може приймати участь в реорганізації мікротрубочок рослинної клітини протягом мітотичного циклу (Blume et al., 2008), проте функціональна роль фосфорилювання білків мікротрубочок по залишках серину та треоніну залишається недостатньо дослідженою.

Нещодавно вперше було встановлено наявність в рослинній клітині фосфорилювання як б-, так і в-тубуліну по залишках тирозину (Blume et al., 2008). Завдяки застосуванню антитіл проти фосфотирозину було доведено наявність фосфорилювання по залишках тирозину б- та в- тубуліну Daucus carota L. та Nicotiana tabacum L. Встановлено, що чутлива до холоду фракція мікротрубочок Daucus carota L. є фосфорильованою по залишках тирозину у значно більшій мірі, ніж стійка до холоду фракція мікротрубочок, що дає можливість припустити існування субпопуляцій кортикальних мікротрубочок з різною чутливістю до дії холоду (Blume et al., 2008). Однак на сьогоднішній день функціональна роль фосфорилювання рослинного тубуліну по залишках тирозину також залишається практично недослідженою.

Відомо, що процес фосфорилювання білків каталізується взаємно збалансованою системою протеїнкіназ, які здійснюють перенесення кінцевого залишку фосфату з АТФ на певні залишки білкової молекули, та протеїнфосфатаз, які каталізують процес дефосфорилювання (Wang et al., 2007). На сьогодні ідентифіковано ряд як серин/треонінових, так і тирозинових протеїнкіназ, що залучені до регуляції фосфорилювання тубуліну в тваринних клітинах. Показано, що тубулін тваринного походження може фосфорилюватись різними системами циклонуклеотид-залежних (цАМФ- і цГMФ-залежних) протеїнкіназ, СаІ?-залежних протеїнкіназ (зокрема СаІ?-кальмодулін та СаІ?-залежними, фосфоліпід-стимульованими типами ферментів), казеїнкіназ (Ludueсa, 1998; MacRae, 1997), а також тирозинкіназ (Kukharskyy et al., 2004; MacRae, 1997; Sulimenko et al., 2006). Щодо рослинної клітини пошук специфічних протеїнкіназ, які каталізують фосфорилювання тубуліну, досі триває (Kарпов и др., 2009, Karpov et al., 2010). На даний час за допомогою методів біоінформатики знайдено ряд рослинних гомологів протеїнкіназ людини - представників різних груп/сімейств, що можуть приймати участь у фосфорилюванні білків мікротрубочок та регуляції поділу рослинної клітини (Kарпов и др., 2009, Karpov et al., 2010). Тому на сьогодні актуальним питанням залишається ідентифікація специфічних протеїнкіназ рослинної клітини здатних каталізувати фосфорилювання тубуліну як по залишках серину та треоніну, так і по залишках тирозину. На цьому шляху використання специфічних інгібіторів як серин/треонінових протеїнкіназ так і тирозинкіназ, а також протеїнфосфатаз є ефективним методом дослідження функціональної ролі не лише процесів фосфорилювання білків в еукаріотичній клітині в цілому, але й вивчення особливостей фосфорилювання таких важливих компонентів цитоскелету, як мікротрубочки, в тому числі, і у рослинній клітині.

Зв'язок роботи з науковою тематикою. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетної програми тематики відділу геноміки та біотехнології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України № 2.28.2.10 “З'ясування ролі цитоскелетних структур клітини у відповіді рослин на вплив абіотичних факторів та розробка біотехнологічних підходів для регуляції функціонування цитоскелету” (2000-2004, номер держреєстрації 0101U000395) та відділу геноміки та молекулярної біотехнології ДУ “Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України” № III-2-05 “Застосування методів геноміки та біоінформатики у вивченні структури та функцій цитоскелету рослин з метою розробки нових біотехнологій” (2005-2009, номер держреєстрації 0105U003354), а також згідно завдань гранту INTAS № 03-51-6459 “Фосфорилювання мікротрубочок під впливом різних умов навколишнього середовища” (2003-2007) та спільного російсько-українського проекту Національної академії наук України та Російського фонду фундаментальних досліджень № II-15-08 ”Порівняльний аналіз кіномів мікротрубочок у тварин та у вищих рослин” (2008-2009, номер держреєстрації 0108U004809).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження ролі різних типів серин/треонінових протеїнкіназ та тирозинкіназ, а також протеїнфосфатаз у регуляції фосфорилювання мікротрубочок та з'ясування функціональних наслідків цього процесу для рослинної клітини.

Згідно із поставленою метою до завдань експериментальної роботи входило:

1. Дослідити вплив різних типів інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ, зокрема СаІ?-залежних протеїнкіназ (СаІ?-кальмодулін-залежних протеїнкіназ (W7) і протеїнкінази С (Н7, стауроспорину)) та циклін-залежних протеїнкіназ (оломоуцину), на зміни параметрів росту та морфології первинного кореня, а також на організацію мікротрубочок в різних типах клітин проростків Arabidopsis thaliana.

2. Дослідити вплив інгібітору серин/треонінових протеїнфосфатаз, окадаїнової кислоти, на зміни параметрів росту та морфології первинного кореня, а також на організацію мікротрубочок в різних типах клітин проростків A. thaliana.

3. Дослідити вплив інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ (СаІ?-кальмодулін-залежних протеїнкіназ, протеїнкінази С і циклін-залежних протеїнкіназ) та протеїнфосфатаз на проходження мітозу клітинами синхронізованої суспензійної культури тютюну BY-2.

4. Дослідити вплив різних типів інгібіторів тирозинкіназ (гербіміцину А, генестеїну та тирфостину AG18) на зміни параметрів росту та морфології первинного кореня, а також організацію мікротрубочок в різних типах клітин проростків A. thaliana.

5. Дослідити вплив інгібітору тирозинфосфатаз, ортованадату натрію, на зміни параметрів росту та морфології первинного кореня, а також на організацію мікротрубочок в різних типах клітин проростків A. thaliana.

6. Дослідити вплив різних типів інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на організацію мікротрубочок та проходження мітозу клітинами синхронізованої суспензійної культури тютюну BY-2.

7. Оцінити колокалізацію залишків фосфотирозину та мікротрубочок в клітинах первинного кореня проростків A. thaliana за допомогою імунолокалізації б- і в-тубуліну та залишків фосфотирозину.

8. Дослідити зв'язок фосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину з відповіддю рослинної клітини на дію холоду.

Об'єкт дослідження - особливості структурної організації мікротрубочок в різних типах клітин первинного кореня A. thaliana та синхронізованої суспензійної культури тютюну BY-2.

Предмет дослідження - зміни в організації та функціонуванні мікротрубочок внаслідок впливу різних типів інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ та тирозинкіназ, а також протеїнфосфатаз в клітинах первинного кореня A. thaliana та синхронізованої суспензійної культури тютюну BY-2.

Методи дослідження. Для дослідження морфолого-анатомічної характеристики первинних коренів A. thaliana використовували методи оптичної мікроскопії. Вивчення просторової організації мікротрубочок в різних типах клітин первинного кореня A. thaliana, що експресує химерний білок GFP-MAP4, та клітинах синхронізованої суспензійної культури BY-2, що експресує химерний білок GFP-MBD (домен, що зв'язує мікротрубочки) проводили in vivo за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопу. Для визначення впливу інгібіторів протеїнкіназ і протеїнфосфатаз на проходження мітозу підраховували мітотичний індекс в клітинах синхронізованої суспензійної культури BY-2. Візуалізацію залишків фосфотирозину на кортикальних мікротрубочках в клітинах кореня A. thaliana проводили за допомогою методів непрямої імунофлюоресценції з використанням конфокальної мікроскопії. Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали згідно із стандартними методиками.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження особливості організації мікротрубочок в різних типах клітин всіх функціональних зон первинного кореня A. thaliana в умовах in vivo після обробки інгібіторами різних типів протеїнкіназ та протеїнфосфатаз. Встановлено, що мікротрубочки в клітинах різних ростових зон кореня мають різну ступінь чутливості до дії інгібіторів Са²⁺-кальмодулін-залежних протеїнкіназ, протеїнкінази С та циклін-залежних протеїнкіназ. Найбільшу чутливість до дії інгібіторів вищезазначених протеїнкіназ виявлено для мікротрубочок перехідної зони кореня. Показано, що інгібування Са²⁺-кальмодулін-залежних протеїнкіназ та протеїнкінази С призводить до уповільнення входження клітин синхронізованої культури BY-2 в мітоз, тоді як посилення процесу фосфорилювання білків внаслідок інгібування протеїнфосфатаз 1 та 2А призводить до незначного прискорення вступу синхронізованих клітин в профазу.

Вперше досліджено вплив інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на мікротрубочки рослинної клітини. Встановлено, що інгібування процесу фосфорилювання по залишках тирозину за допомогою інгібіторів як рецепторних, так і нерецепторних тирозинкіназ викликає зміни в організації кортикальних мікротрубочок різних типів клітин. Показано, що особливу чутливість до дії інгібіторів тирозинкіназ мають мікротрубочки в диференційованих клітинах, зокрема в кореневих волосках. Встановлено, що рівень фосфорилювання по залишках тирозину білків мікротрубочок приймає участь в регуляції процесів диференціації кореня, а саме індукції та формуванні кореневих волосків. Виявлено, що в клітинах синхронізованої суспензійної культури BY-2 рівень фосфорилювання по залишках тирозину білків мікротрубочок не впливає на орієнтацію та організацію як мітотичних, так і кортикальних мікротрубочок. За допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії показано фосфорилювання по залишках тирозину полімеризованих мікротрубочок в клітинах кореня Arabidopsis. Виявлено можливий функціональний взаємозв'язок між рівнем фосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину та чутливістю кортикальних мікротрубочок до дії холоду.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть використовуватися для проведення подальших досліджень щодо застосування специфічних інгібіторів протеїнкіназ, які приймають безпосередню участь у фосфорилюванні тубуліну рослинної клітини, та для пошуку нових біологічно-активних сполук з метою використання їх у сільському господарстві.

Розроблена методика оцінки впливу інгібіторів протеїнкіназ та протеїнфосфатаз на ріст та морфологію первинних коренів A. thaliana як модельної системи та організацію мікротрубочок в різних типах клітин усіх функціональних зон кореня.

Результати досліджень можуть бути використані у навчальному процесі під час підготовки фахівців з клітинної біології та генетичної інженерії на біологічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Постановку наукових завдань досліджень, наступну інтерпретацію отриманих результатів та розробку структури дисертаційної роботи було здійснено спільно з науковим керівником. Всі результати експериментальних досліджень, представлені в дисертаційній роботі, були отримані здобувачем особисто. Під час проведення досліджень здобувач користувалась консультаціями канд. біол. наук А.І. Ємець

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи доповідались на XV Конгресі Федерації європейського товариства біологів рослин (Ліон, Франція, 2006), Міжнародному симпозіумі “The plant cytoskeleton: genomic and bioinformatic tools for biotechnology and agriculture” (Ялта, Україна, 2006), 21-х Зборах Європейського цитоскелетного форума (Біополіс, Сінгапур, 2006), Міжнародному симпозіумі “Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture” (Київ, Україна, 2007), II-му З'їзді українського товариства клітинної біології (Київ, Україна, 2007), II-му З'їзді російського товариства клітинної біології (Санкт-Петербург, Росія, 2007), щорічних зборах Американського товариства клітинних біологів (Вашингтон, США, 2007), щорічних зборах Американського товариства рослинних біологів (Меріда, Мексика, 2008), IX Міжнародній конференції “Биология растений in vitro и биотехнология” (Звенігород, Росія, 2008), IV Міжнародній науковій конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, Україна, 2008), V Міжнародній конференції “Геном рослин” (Одеса, Україна, 2008), IV Конференції Польського товариства експериментальних біологів рослин (Краків, Польща, 2009), Щорічних зборах товариства експериментальної біології (Прага, Чеська Республіка, 2010).

Публікації. За результатами дисертації було опубліковано 23 наукові праці в профільних журналах та збірниках матеріалів конференцій, з них 4 статті у фахових виданнях та 15 тез.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключення, висновків та списку цитованої літератури, який містить 259 найменувань. Робота викладена на 141 сторінці, містить 50 рисунків та 3 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктами дослідження були чотиридобові проростки A. thaliana (L.) (екотип Colambia-0) та чотиридобові проростки стабільно трансформованої лінії A. thaliana (L.) (екотип Landsberg erecta (Ler.)), що експресують химерний ген gfp-map4 (Mathur and Chua, 2000). Також об'єктом дослідження в експериментах була суспензійна культура клітин тютюну BY-2, що експресує ген gfp-mbd (Granger and Cyr, 2001). Стабільно трансформовані лінії A. thaliana (GFP-MAP4) та BY-2 (GFP-MBD) були надані проф. Ж.-П. Вербеленом (Університет Антверпену, м. Антверпен) у рамках співробітництва за спільним науковим проектом INTAS № 03-51-6459.

Насіння A. thaliana пророщували на твердому модифікованому середовищі Мурасіге та Скуга (Murashige and Skoog, 1962), з додаванням Ѕ набору макро- та мікросолей, 10 г/л сахарози, 4 г/л джелрайта, рН 5,7. Висаджене насіння стратифікували при температурі +4єС протягом 24 год. Надалі чашки Петрі із насінням залишали для пророщування у вертикальному положенні протягом 4 діб при постійній температурі 22єС та 16-годинному періоді освітлення.

Для дослідження впливу інгібіторів протеїнкіназ та протеїнфосфатаз на ріст та морфологію коренів Arabidopsis чотириденні проростки обробляли відповідними концентраціями цих речовин протягом 1-48 год та фіксували зображення коренів за допомогою цифрової фотокамери Canon Power Shot G6 в режимі макрозйомки. Вимірювання довжини коренів проводили за допомогою програми ImageJ (версія 1.38 d), http://rsb.info.nih.gov/ij/. Приріст коренів (?) розраховували за формулою: (L_сер.-L₀/L₀)х100, де L₀ - середнє значення довжин коренів до початку експерименту (без обробки); L_сер - середнє значення довжин коренів, оброблених інгібітором протягом встановленого часу.

Для дослідження короткотривалої та пролонгованої дії інгібіторів протеїнкіназ та протеїнфосфатаз на орієнтацію та організацію мікротрубочок в клітинах різних ростових зон первинного кореня чотириденні проростки Arabidopsis обробляли відповідними речовинами в різних концентраціях протягом 1, 3, 6, 12, 24 та 48 год. Зміни в організації мікротрубочок після дії інгібіторів порівнювали із організацією мікротрубочок в клітинах кореня необроблених проростків. GFP-мічені мікротрубочки в клітинах кореня візуалізували in vivo за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопу LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина). Для отримання тривимірного зображення використовували аргоновий лазер з довжиною хвилі 488 нм (розділяючий фільтр HFT 405/488, дзеркало, фільтр емісії ВP 505-570) та об'єктив Plan Apochromat 63*1,4 Oil DIC. На основі серійних оптичних зрізів (з інтервалом 0,3-0,5 мкм) реконструювали тривимірні моделі побудов мікротрубочок за допомогою програмного забезпечення 4.0 SP2 version (Carl Zeiss, Німеччина).

Вирощування та синхронізацію суспензійної культури тютюну BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow-2) проводили у відповідності до методу Нагати (Nagata et al., 1992). Культуру клітин вирощували в постійній темноті при 28°C на орбітальному шейкері (130 об/хв). Синхронізацію культури клітин BY-2 проводили за допомогою афідиколіну. Для встановлення впливу інгібіторів протеїнкіназ і протеїнфосфатаз на проходження мітозу синхронізовану культуру клітин BY-2 обробляли інгібіторами через 4 год після відмивки від афідиколіну, коли клітини знаходились на межі переходу фаз G₂/M. Зразки клітин відбирали протягом 10 год із інтервалом в 1 год (0,5 мл суспензії на 1 зразок) та фіксували в розчині етилового спирту та оцтової кислоти, у співвідношенні 3:1. Для виявлення ядерної ДНК в клітинах використовували DAPI (4,6-диамідіно-2-феніліндол) в концентрації 5 мг/л. Підрахунки мітотичного індексу проводили за допомогою люмінесцентного інвертованого мікроскопу Eclipse E 600 (Nikon, Нідерланди). Мітотичний індекс (%) розраховували як відношення сумарної кількості клітин, що діляться, до сумарної кількості всіх клітин, помножене на 100 %. Відносну кількість клітин в про-, мета-, ана- та телофазі розраховували як відношення кількості клітин у відповідній фазі мітозу до сумарної кількості клітин, що діляться, помножене на 100 %.

Імунофлуоресцентну візуалізацію мікротрубочок та залишків фосфотирозину в клітинах кореня A. thaliana проводили у відповідності до методу Le et al. (Lee al., 2001) з використанням первинних мишиних антитіл проти б- та в-тубуліну, розведення 1:50 та 1:100 (надані доктором П. Драбером, Інститут молекулярної генетики Чеської академії наук, Прага, Чеська Республіка) та первинними кролячими антитілами проти фосфотирозину, розведення 1:50 (Upstate Biotechnology, США). Як вторинні антитіла використовували антимишині антитіла, мічені Cy3 (індокарбоцианатом), розведення 1:500, та вторинні антикролячі антитіла мічені FITC (флуоресцинізотіоціанатом), розведення 1:100 (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, США). Препарати досліджували за допомогою конфокального мікроскопу LSM 510 META (Carl Zeiss, Німеччина) із мультиканальною конфігурацією. Канал для FITC: збудження аргоновим лазером з довжиною хвилі 488 нм (інтенсивність роботи лазера 10-15 %), розділяючий фільтр HFT 405/488, дзеркало, фільтр емісії ВР 505-530 нм; канал для Cy3: збудження гелій-неонним лазером з довжиною хвилі 543 нм (інтенсивність роботи лазера 65 %), розділяючий фільтр HFT 405/488/543/633, дзеркало, фільтр емісії LP 560. Використовували об'єктив Plan-Apochromat 63*/1,4 Oil DIC.

Для дослідження впливу процесів фосфорилювання білків по залишках тирозину на чутливість кортикальних мікротрубочок в клітинах коренів Arabidopsis до дії пониженої температури використовували гербіміцин А (30 мкМ) та ортованадат натрію (250 мкМ). Проростки A. thaliana обробляли інгібіторами при кімнатній температурі (+24° С) протягом 1 та 2 год. Надалі їх утримували в умовах холодового стресу (+0,5° С) протягом 1-5 год. Як контроль використовували корені після експозиції протягом 1-5 год при температурі +0,5° С без попередньої обробки інгібіторами.

Як інгібітор циклін-залежних протеїнкіназ використовували оломоуцин (50 та 100 мкМ), який розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО) в концентрації 50 мМ та зберігали при температурі -20^оС. Інгібітор Са²⁺-кальмодулін-залежних протеїнкіназ, W7 (1, 10 та 50 мкМ) розчиняли в дистильованій воді шляхом нагрівання до 70 ⁰С, і 100 мМ маточний розчин зберігали при температурі -20^оС. Інгібітор протеїнкінази С (Са²⁺-залежна, фосфоліпід-стимульована протеїнкіназа), стауроспорин (10 та 50 нМ), розчиняли до концентрації 10 мМ в ДМСО і зберігали при температурі -20^оС. Маточний розчин інгібітору протеїнкінази С, Н7 (50 мМ), також готували в ДМСО та зберігали при температурі -20^оС. Для досліджень використовували Н7 в концентраціях 10, 50, та 100 мкМ. Окадаїнову кислоту (0,1, 1, 10 та 100 нМ) використовували як інгібітор серин/треонінових протеїнфосфатаз (ПФ1 та ПФ2А), розчиняли в ДМСО до концентрації 10 мкМ і зберігали при температурі -20^оС. Як інгібітор нерецепторних тирозинкіназ використовували гербіміцин А (1, 30 та 50 мкМ), який розчиняли в ДМСО в концентрації 1 мМ та зберігали при температурі -20^оС. Маточні розчини інгібіторів рецепторих тирозинкіназ, 10 мМ генестеїну та 50 мМ тирфостину AG18, також готували в ДМСО та зберігали при температурі -20^оС. В роботі використовували генестеїн в концентраціях 1, 10 та 50 мкМ та тирфостин AG 18 в концентраціях 0,1, 1, 10 та 50 мкМ. Як інгібітор тирозинфосфатаз використовували ортованадат натрію (250 та 500 мкМ), який розчиняли в лужному середовищі шляхом нагрівання до 70 ⁰С на водяній бані, 250 мМ маточний розчин готували безпосередньо перед експериментом.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження впливу інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ на морфологію кореня A. thaliana та організацію мікротрубочок в його клітинах. Нами встановлено, що інгібітори Са²⁺-кальмодулін-залежних (W7), циклін-залежних (оломоуцин) протеїнкіназ та протеїнкінази С (Н7 та стауроспорин) викликають уповільнення росту первинного кореня та у випадку обробки W7 та стауроспорином індукують збільшення діаметру кореня (формування так званого свелінгу) в різних ростових зонах кореня, а також призводять до порушення процесів ініціації та росту кореневих волосків (табл. 1). Обробка первинних коренів проростків A. thaliana інгібітором протеїнфосфатаз, окадаїновою кислотою, мала стимулюючу дію на ріст первинних коренів, проте призводила до порушень морфології кореневих волосків.

Таблиця 1 Вплив ефективних концентрацій інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ та протеїнфосфатаз на ріст та морфологію первинних коренів A. thaliana

Назва інгібі-тору	Ріст первинних коренів	Індукція свелінгу	Вплив на кореневі волоски
		меристематична зона	зона розтягу	Індукція утворення	ріст	Морфологія
					стимуляція	пригнічення	свелінг	розгалуження	загинання
	24 год	48 год
оломоу-цин	v в 4 рази	v в 2,5 рази	-	-	+	-	+	-	-	-
W7	v в 4 рази	v в 4 рази	-	+	+	-	+	-	-	-
H7	v в 2 рази	v в 2 рази	-	-	+	-	+	-	-	-
стауро-спорин	v в 1,5 рази	v в 1,7 рази	+	-	-	-	+	-	-	-
окадаї-нова кислота	^ в 1,3 рази	^ в 1,4 рази	-	-	-	-	+	+	+	+

Умовні позначення: “+ ” - зміни у порівнянні із контролем; “-” - без змін у порівнянні із контролем; “v” - інгібування росту; “^” - стимуляція росту.

Виявлено, що найбільшу чутливість до дії всіх протестованих типів інгібіторів протеїнкіназ мали мікротрубочки в епідермальних клітинах та клітинах кори перехідної зони і зони розтягу кореня, які змінювали орієнтацію із поперечної/косої на повздовжню або були дезорієнтовані (рис. 1б-г) у порівнянні із орієнтацією мікротрубочок в контрольних проростках (рис. 1а). Організація мікротрубочок в трихобластах та атрихобластах зони диференціації також зазнавала змін після дії інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ. Показано, що виявлені порушення в орієнтації та організації мікротрубочок в клітинах кореня співвідносяться зі змінами загальної морфології первинних коренів. Було продемонстровано, що індукція формування великої кількості нових кореневих волосків після обробки інгібіторами протеїнкіназ є наслідком зміни орієнтації мікротрубочок в клітинах кореня. Необхідно зазначити, що в самих кореневих волосках обробка інгібіторами серин/треонінових протеїнкіназ не викликала значних змін в організації мікротрубочок у порівнянні із контролем.

Рис. 1. Організація мікротрубочок в клітинах коренів A. thaliana:

а - контроль, перехідна зона; б - W7 (10 мкМ, 24 год), перехідна зона; в - Н7 (50 мкМ, 24 год), зона розтягу; г - стауроспорин (50 нМ, 3 год), зона розтягу. Масштаб - 20 мкм

Також було встановлено, що обробка проростків інгібітором протеїнфосфатаз, окадаїновою кислотою, справляла протилежну дію до впливу інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ як на ріст і розвиток кореня (табл. 1), так і на орієнтацію мікротрубочок в його клітинах. Було виявлено, що інгібування ПФ1 та ПФ2А по-різному впливає на організацію мікротрубочок в залежності від типу клітин, викликаючи дезорієнтацію та/або деполімеризацію кортикальних мікротрубочок в клітинах перехідної зони, зони розтягу, або призводячи до стабілізації мікротрубочок в клітинах зони диференціації.



Рис. 2. Схематичне зображення змін в орієнтації та організації кортикальних мікротрубочок в клітинах первинних коренів проростків A. thaliana відносно основної вісі кореня після дії ефективних концентрацій інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ та протеїнфосфатаз.

Особливу чутливість до дії окадаїнової кислоти виявляли мікротрубочки в клітинах кореневих волосків, які змінювали свою вихідну орієнтацію, внаслідок чого загальна морфологія кореневих волосків зазнавала порушень: вони роздувались, розгалужувались або зовсім припиняли свій ріст. Узагальнені дані щодо впливу інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ та протеїнфосфатаз на організацію мікротрубочок в різних типах клітин основних зон первинного кореня A. thaliana підсумовані у вигляді схематичного малюнку (рис. 2).

Дослідження впливу інгібіторів серин/треонінових протеїнкіназ та протеїнфосфатаз на проходження мітозу клітинами синхронізованої культури BY-2. В результаті проведених досліджень щодо впливу інгібіторів Са²⁺-кальмодулін-залежних, циклін-залежних протеїнкіназ і протеїнкінази С на величину мітотичного індексу та проходження всіх фаз мітозу виявлено, що інгібування фосфорилювання білків по залишках серину і треоніну у більшості випадків призводить до затримки при входженні клітин в мітоз, зниження значення мітотичного індексу, а також до зміщення піку мітозу в порівнянні з контролем (рис. 3). Встановлено, що інгібування циклін-залежних протеїнкіназ та протеїнкінази С призводить до затримки входження клітин в профазу. В той же час інгібування протеїнфосфатаз ПФ1 та ПФ2А окадаїновою кислотою викликає незначне прискорення вступу синхронізованих клітин в мітоз.

Рис. 3. Величина мітотичного індексу синхронізованої культури BY-2 після обробки інгібіторами серин/треоніно-вих протеїнкіназ та протеїнфосфатаз. Стрілкою вказано час додавання інгібіторів до культури клітин: 100 мкM оломоуцин, 10 мкM W7, 50 мкM H7, 50 нM стауроспорин та 10 нМ окадаїнова кислота

Дослідження впливу інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на морфологію кореня A. thaliana та організацію мікротрубочок в його клітинах. У табл. 2 узагальнено результати досліджень in vivo щодо впливу інгібіторів нерецепторних (гербіміцину А) та рецепторних тирозинкіназ (генестеїну та тирфостину AG18) на ріст та загальну морфологію первинних коренів A. thaliana. Встановлено, що обробка інгібіторами тирозинкіназ коренів Arabidopsis призводила до уповільнення швидкості їх росту у порівнянні із контролем та викликала порушення процесів формування і росту кореневих волосків.

Таблиця 2 Вплив ефективних концентрацій інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на ріст та морфологію первинних коренів A. thaliana

Інгібітор	Інгібуван-ня росту первинних коренів	Індукція свелінгу	Вплив на кореневі волоски
		Меристематична зона	зона розтягу	Індукція утворення	ріст	морфологія
					стимуляція	пригнічення	свелінг	розгалуження	загинання
гербімі-цин А	в 2 рази	-	-	-	-	+	-	-	-
генестеїн	в 4 рази	-	-	-	-	+	-	-	-
тирфос-тин AG18	-	-	-	-	-	+	+	-	-
ортована-дат натрію	в 4,5 рази	-	-	+	+	-	-	-	-

Умовні позначення: “+ ” - зміни у порівнянні із контролем; “-” - без змін у порівнянні із контролем

Виявлено, що особливою чутливістю до дії інгібіторів тирозинкіназ характеризуються мікротрубочки в диференційованих клітинах, зокрема в кореневих волосках. Було встановлено, що після обробки інгібіторами тирозинкіназ мікротрубочки в кореневих волосках були дезорієнтовані, стабілізовані або повністю деполімеризовані (рис. 4), що призводило до порушень в процесах ініціації, формування та росту кореневих волосків.



Рис. 4. Організація мікротрубочок в кореневих волосках первинних коренів A. thaliana після обробки інгібіторами тирозинкіназ: а) гербіміцином А, 30 мкМ, 4 год; б) тирфостином AG18, 50 мкМ, 12 год; в) генестеїном, 10 мкМ, 12 год. Масштаб: 20 мкм

Обробка проростків інгібітором тирозинфосфатаз призводила до зміни орієнтації мікротрубочок в клітинах перехідної зони та зони розтягу кореня із поперечної/косої на повздовжню у порівнянні із контролем. Встановлено, що в умовах гіперфосфорилювання по залишках тирозину прискорювалась диференціація клітин, що проявлялась в індукції формування нових кореневих волосків. Оскільки відомо, що мікротрубочки приймають безпосередню участь в процесах росту та диференціації рослин (Paradez et al., 2006), отримані нами дані можуть свідчити про вплив цього типу фосфорилювання білків мікротрубочок на процеси диференціації. Узагальнені дані щодо впливу інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на організацію мікротрубочок в різних типах клітин основних зон первинного кореня A. thaliana підсумовані у вигляді схематичного малюнку (рис. 5).



Рис. 5. Схематичне зображення змін в орієнтації та організації кортикальних мікротрубочок в клітинах первинних коренів проростків A. thaliana відносно основної вісі первинного кореня після дії ефективних концентрацій інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз.

Дослідження впливу інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на проходження мітозу клітинами синхронізованої культури тютюну BY-2. В результаті проведених досліджень щодо впливу інгібіторів тирозинкіназ та тирозинфосфатаз на величину мітотичного індексу і проходження всіх фаз мітозу клітин синхронізованої культури BY-2 та організацію мітотичних і кортикальних мікротрубочок в них було встановлено, що після обробки культури гербіміцином А та генестеїном клітини входили в мітоз на 1 год пізніше та виходили з мітозу із двохгодинним запізненням, а пік мітотичного індексу зміщувався на 1 год пізніше, у порівнянні із контролем (рис. 6). Було виявлено, що всі типи протестованих нами інгібіторів тирозинкіназ призводили до затримки входження клітин в профазу. Обробка культури клітин інгібітором тирозинфосфатаз ортованадатом натрію призводила до незначного прискорення вступу синхронізованих клітин в мітоз. Було встановлено, що всі зміни в проходженні мітозу клітинами суспензійної культури BY-2 в результаті дії вищезазначених інгібіторів не були пов'язані із будь-якими змінами в організації як мітотичних так і кортикальних мікротрубочок, однак дані речовини призводили до зменшення кількості мітотичних побудов мікротрубочок в клітинах синхронізованої культури BY-2.

Рис. 6. Величина мітотич-ного індексу синхронізова-ної культури BY-2 після обробки інгібіторами тирозинкіназ та тирозин-фосфатаз. Стрілкою вказа-но час додавання інгібіторів до культури клітин: 10 мкM генестеїн, 30 мкM гербімі-цин А, 50 мкM тирфостин AG18 та 250 мкM ортованадат натрію

Експозиція залишків фосфотирозину на мікротрубочках в клітинах кореня A. thaliana. За допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії з використанням поліклональних антитіл проти залишків фосфотирозину та моноклональних антитіл проти б- та в-тубуліну було встановлено, що фосфотирозинові антитіла візуалізують всі типи побудов мікротрубочок в рослинних клітинах. Виявлено, що в проростках Arabidopsis попередньо оброблених ортованадатом натрію рівень фосфорилювання по залишках тирозину значно вищий у порівнянні із інтактними рослинами (рис. 7).



Рис. 7. Колокалізація антитіл до залишків фосфотирозину та антитіл до в-субодиниці тубуліну (TUB 2.1) в клітинах кореня проростків A. thaliana (а,в,д) та попередньо оброблених 250 мМ ортованадатом натрію (б,г,е): а, б) антитіла до в-субодиниці тубуліну; в,г) антитіла до залишків фосфотирозину; д, е) спів-ставлення зображень а,в та б,г. Масштаб: 20 мкм

З'ясування ролі фосфорилювання тубуліну по залишках тирозину в механізмі холодостійкості у рослин. Встановлено, що обробка проростків A. thaliana інгібітором тирозинкіназ, 30 мкМ гербіміцином А, значно збільшує чутливість кортикальних мікротрубочок до дії пониженої температури. На противагу цьому після обробки коренів інгібітором тирозинфосфатаз, 250 мкМ ортованадатом натрію, кортикальні мікротрубочки у різних типах клітин первинного кореня стають більш стійкими до дії низької температури у порівнянні із контролем. Отримані результати дозволяють зробити припущення про те, що існує певний функціональний взаємозв'язок між рівнем фосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину та чутливістю кортикальних мікротрубочок до дії холоду.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі встановлено закономірності впливу різних інгібіторів серин/треонінових, зокрема, СаІ?-залежних (СаІ?-кальмодулін-залежних протеїнкіназ (W7) і протеїнкінази С (Н7 і стауроспорину) та циклін-залежних протеїнкіназ (оломоуцину), а також тирозинкіназ (гербіміцину А, генестеїну і тирфостину AG18) та серин/треонінових (окадаїнової кислоти) і тирозинових (ортованадату натрію) протеїнфосфатаз на проходження мітозу клітин синхронізованої суспензійної культури тютюну BY-2, ріст і морфологію первинного кореня Arabidopsis thaliana та організацію різних побудов мікротрубочок у клітинах цих модельних об'єктів.

1. Встановлено, що обробка коренів проростків A. thaliana інгібіторами серин/треонінових протеїнкіназ (W7, Н7, стауроспорин та оломоуцин) призводить до уповільнення їх росту та у випадку обробки W7 та стауроспорином до формування свелінгу.

2. Виявлено, що мікротрубочки в клітинах різних ростових зон кореня проростків A. thaliana характеризуються різною чутливістю до інгібіторів Са²⁺-кальмодулін- і циклін-залежних протеїнкіназ, а також протеїнкінази С. Найбільш чутливими до їх дії є мікротрубочки клітин перехідної зони та зони розтягу кореня, де після обробки W7 або оломоуцином вони змінюють свою орієнтацію із поперечної/косої на повздовжню відносно основної осі кореня, а після дії Н7 та стауроспорину стають дезорієнтованими. Мікротрубочки клітин меристематичної зони, а також кореневих волосків не зазнають змін в організації за даних умов.

3. Окадаїнова кислота (інгібітор протеїнфосфатаз 1 та 2А) стимулює ріст кореня і значно змінює морфологію кореневих волосків, що проявляється в їх розгалуженні, свелінгу або повному пригніченні росту. Одночасно її дія призводить до дезорієнтації та/або деполімеризації кортикальних мікротрубочок в клітинах перехідної зони та зони розтягу кореня, а в клітинах зони диференціації викликає стабілізацію та дезорієнтацію мікротрубочок.

4. Показано, що інгібування Са²⁺-кальмодулін- та циклін-залежних протеїнкіназ, а також протеїнкінази С призводить до уповільнення входження клітин синхронізованої культури тютюну BY-2 в мітоз. В той же час, інгібування протеїнфосфатаз ПФ1 та ПФ2А викликає незначне прискорення входження синхронізованих клітин у профазу.

5. Встановлено, що обробка коренів A. thaliana інгібіторами рецепторних (генестеїн) та нерецепторних (гербіміцин А) тирозинкіназ викликає уповільнення їх росту, а також спричиняє порушення формування і пригнічення росту кореневих волосків, тоді як інгібітор тирозинфосфатаз (ортованадат натрію) стимулює формування нових кореневих волосків та їх ріст.

6. Виявлено, що мікротрубочки в клітинах зони диференціації кореня проростків A. thaliana є чутливими до дії вищезазначених інгібіторів тирозинкіназ, що проявляється в зміні їх орієнтації, стабілізації або повній деполімеризації, тоді як обробка коренів ортованадатом натрію змінює орієнтацію мікротрубочок у клітинах перехідної зони, зон розтягу та диференціації із поперечної/косої на повздовжню.

7. Виявлено, що генестеїн та гербіміцин А призводять до уповільнення входження клітин синхронізованої культури тютюну BY-2 в мітоз, тоді як інгібування тирозинфосфатаз ортованадатом натрію, навпаки, дещо прискорює цей процес. Встановлено, що ці зміни в проходженні мітозу клітинами суспензійної культури BY-2 в результаті дії вищезазначених інгібіторів не пов'язані з будь-якими порушеннями організації як мітотичних, так і інтерфазних мікротрубочок.

8. У результаті імунофлуоресцентної візуалізації мікротрубочок клітин кореня A. thaliana з одночасним використанням специфічних антитіл до тубуліну та фосфорильованих залишків тирозину продемонстровано чітко виражену колокалізацію обох типів антитіл на полімеризованих мікротрубочках, що свідчить про інтенсивні процеси фосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину.

9. Встановлено, що обробка проростків A. thaliana інгібітором нерецепторних тирозинкіназ гербіміцином А значно підвищує чутливість мікротрубочок до дії пониженої температури, що свідчить про можливий функціональний взаємозв'язок фосфорилювання білків мікротрубочок по залишках тирозину та чутливості інтерфазних мікротрубочок до дії холоду.

10. Отримані результати дозволяють стверджувати, що до регуляції структурно-функціональних властивостей мікротрубочок рослинних клітин залучені декілька типів серин/треонінових протеїнкіназ, зокрема Са²⁺-залежні (Са²⁺-кальмодулін-залежні протеїнкінази та протеїнкіназа С) і циклін-залежні протеїнкінази, а також протеїнкінази, що фосфорилюють білки по залишках тирозину. При цьому функціональний стан мікротрубочок визначається тісною взаємодією цих протеїнкіназ, а також відповідних типів серин/треонінових та тирозинових протеїнфосфатаз.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Yemets A. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells / A. Yemets, Ya. Sheremet, K. Vissenberg, J. Van Orden, J-P. Verbelen, Ya. B. Blume // Cell Biol. Int. - 2008. - Vol. 32. - P. 630-637. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).

2. Шеремет Я.А. Влияние окадаиновой кислоты на морфологию корня Arabidopsis и организацию микротрубочек в его клетках / Я.А. Шеремет, А.И. Емец, Ж.-П. Вербелен, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. - 2009. - том 43, №1.- С. 3-10. (Здобувач провела дослідження, прийняла участь в опрацюванні експериментальних даних, написанні та підготовці статті до друку).

3. Blume Ya.B. Exposure of beta-tubulin regions defined by antibodies on an Arabidopsis thaliana microtubule protofilament model and in the cells / Ya.B. Blume, A. Yemets, Ya. Sheremet, A. Nyporko, V. Sulimenko, T. Sulimenko, P. Draber // BMC Plant Biol. - 2010. - Vol. 10. - P. 1-10. doi:10.1186/1471-2229-10-29. (Здобувач провела досліди по імунолокалізації тубуліну та фосфорильованих залишків тирозину в клітинах первинного кореня A. thaliana та суспензійної культури тютюну BY-2).

4. Шеремет Я.А. Влияние ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ на морфологию корня Arabidopsis thaliana и организацию микротрубочек в его клетках / Я.А. Шеремет, А.И. Емец, К. Виссенберг, Ж.-П. Вербелен, Я.Б. Блюм // Цитология. - том 52, №5. - 2010. - С. 399-406. (Здобувач провела дослідження, прийняла участь в опрацюванні експериментальних даних, написанні та підготовці статті до друку).

5. Yemets A.I. Does tubulin phosphorylation correlate with cell death in plant cells? A.I. Yemets, Ya.A. Sheremet, Ya.B. Blume // BMC Plant Biol. - 2005. - Vol. 5, suppl. 1:S36. - P. 1-3. doi: 10.1186/1471-2229-5-S1-S36.

6. Шеремет Я.О. З'ясування ролі фосфорилювання тубуліну по залишках тирозину у формуванні механізмів холодостійкості рослинних клітин / Я.О. Шеремет, А.І. Ємець, Я.Б. Блюм // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. - К. Логос, - 2008. - С. 454-458.

7. Blume Ya.B. Elucidation of microtubule regulation for practical applications through bioinformatic analysis of Arabidopsis kinome and phosphatome / Ya.B. Blume, P.A. Karpov, A.Yu. Nyporko, D.A. Samofalova, Ya.O. Sheremet, A.I. Yemets // Геном рослин: Зб. наук. статей V Міжнародної конференції. / Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН (Україна). - Одеса, 2008. - С. 162-164.

8. Шеремет Я.А. Использование ингибиторов тирозинкиназ и тирозинфосфатаз для изучения роли микротрубочек в ответе клеток растений на холод / Я.А. Шеремет, А.И. Емец, Я.Б. Блюм // Фізіологія рослин: проблеми та перспективи розвитку / НАН України, Ін-т фізіології рослин і генетики, Укр. т-во фізіологів рослин; гол. ред. В.В. Моргун. - К. Логос, - 2009. - том 2.- С. 209-216.

9. Шеремет Я.А. Влияние ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на прохождение митоза в синхронизированной культуре клеток табака BY-2 / Я.А. Шеремет, А.И. Емец, Ж.-П. Вербелен, Я.Б. Блюм // Цитология. - 2007. - том 49, № 9. - С. 807-808.

10. Емец А.И. Влияние ингибиторов тирозинкиназ и тирозинфосфатаз на организацию микротрубочек в клетках корня / А.И. Емец, Я.А. Шеремет, Ж.-П. Вербелен, Я.Б. Блюм // Цитология. - 2007. - том 49 № 9. - С. 743.

11. Sheremet. Ya.A. Tyrosine phosphorylation modulates organization of cortical microtubules in Arabidopsis root cells / Ya.A. Sheremet, A.I. Yemets, Ya.B. Blume // Acta Biol. Cracov. - 2009. - Vol. 51, suppl. 2. - Р. 120.

12. Sheremet I. Effects of kinase and phosphatase inhibitors on microtubule оrganization and dynamics in Arabidopsis root cells / I. Sheremet, A. Yemets, J.-P. Verbelen, Ya.B. Blume // Abstr. of XV Congres of FESPB. - Lyon, France, 2006. - P. 73.

13. Yemets A. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells / A. Yemets, Ya. Sheremet, J.-P. Verbelen, Ya. Blume // Abstr. of Int. Symp. “The plant cytoskeleton: genomic and bioinformatic tools for biotechnology and agriculture” - Yalta, Ukraine, 2006. - P. 101-106.

14. Yemets A. Effects of protein kinase and phosphatase inhibitors on microtubule organization and dynamics in Arabidopsis root cells / A. Yemets, Ya. Sheremet, J.-P. Verbelen, Ya. B. Blume // Abstr. of 21^st European Cytoskeleton Forum. - Biopolis, Singapore, 2006. - P.79-80.

15. Sheremet Ya. Effects of serine/threonine and tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on cortical microtubules organization in Arabidopsis root cells / Ya. Sheremet, A. Yemets, J.-P. Verbelen, Ya. B. Blume // Abstr. of 2^nd Int. Symp. “Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture”. - Kyiv, Ukraine, 2007. - P. 36.

16. Шеремет Я.А. Вплив інгібіторів протеїнкіназ та фосфатаз на проходження мітозу в синхронізованій культурі клітин тютюну BY-2 / Я.А. Шеремет, А.І. Ємець, Ж.-П. Вербелен, Я.Б. Блюм // Тези доповідей II З'їзду українського товариства клітинної біології. - Київ, Україна, 2007. - С. 258.

17. Шеремет Я.А. Взаємодія між протеїнкіназами та протеїнфосфатазами модулює організацію кортикальних мікротрубочок в клітинах кореня Arabidopsis / Я.А. Шеремет, А.І. Ємець, Ж.-П. Вербелен, Я.Б. Блюм // Тези доповідей II З'їзду українського товариства клітинної біології. - Київ, Україна, 2007. - С. 259.

18. Sheremet Ya.A. Protein kinase-protein phosphatase interplay modulates organization of cortical microtubules in Arabidopsis root cells / Ya.A. Sheremet, A.I. Yemets, J.-P. Verbelen, Ya.B. Blume // Abstr. of 47^th Annual Meeting of ASCB. - Washington, USA, 2007. - P. 399-400.

19. Yemets A. Protein kinase-protein phosphatase interplay modulates microtubule organization in Arabidopsis cells / A. Yemets, Ya. Sheremet, K. Vissenberg, J. Van Orden, J-P. Verbelen, Ya.B. Blume // Abstr. of Annual Meeting of the ASPB. - Merida, Mexico, 2008. - 176-177.

20. Шеремет Я.А. Линия Arabidopsis thaliana экспрессирующая белок GFP-MAP4, как модель для изучения роли микротрубочек в холодоустойчивости растений / Я.А. Шеремет, А.И. Емец, Я.Б. Блюм // Тезисы докладов IX Межд. конф. “Биология растений in vitro и биотехнология”. - Звенигород, Россия, 2008. - С. 436-437.

21. Blume Ya.B. Bioinformatic analysis of Arabidopsis kinome and phosphatome for investigation of microtubule functions and applied aspects of their regulation / Ya.B. Blume, P.A. Karpov, A.Yu. Nyporko, D.A. Samofalova, Ya.A. Sheremet, A.I. Yemets // Abstr. of Plant Genomic European Meetings. - Albena, Bolgaria, 2008 - P. 1-2.

22. Карпов П.А. Биоинформационный анализ кинома и фосфатома Arabidopsis в связи с исследованием функционирования микротрубочек и прикладные аспекты их регулирования / П.А. Карпов, А.Ю. Ныпорко, Д.А. Самофалова, Я.А. Шеремет, А.И. Емец, Я.Б. Блюм // Тезисы докладов Межд. научной школы-конференции "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". - Зенигород, Россия, 2008. - С. 31.

23. Sheremet I. Plant microtubules are modified by the tyrosine phosphorylation in Arabidopsis root cells / I. Sheremet, A. Yemets, P. Drбber, Ya.B. Blume // Abstr. of Annual Main Meeting of SEB. - Prague, Czech Republic, 2010. - P. 246.

...