Вірусні хвороби смородини чорної і малини у Лісостепу України та одержання здорового садивного матеріалу

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

06.01.11 - фітопатологія

ВІРУСНІ ХВОРОБИ СМОРОДИНИ ЧОРНОЇ І МАЛИНИ У ЛІСОСТЕПУ УКРАЇНИ ТА ОДЕРЖАННЯ ЗДОРОВОГО САДИВНОГО МАТЕРІАЛУ

ТАРАНУХО ЮЛІЯ МИКОЛАЇВНА

Київ - 2010

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

вірусний хвороба смородина малина

Актуальність теми. Смородина чорна і малина є цінними ягідними культурами. Однак одержанню їх високих і сталих врожаїв залежить від зниження втрат, спричинених комплексом шкідливих організмів та збудників хвороб, серед яких значного поширення набули вірусні. Нині в літературі описано понад 30 вірусних хвороб видів Ribes і Rubus [Jones, 2002, 2004]. Хронічний характер цих захворювань, розмножування смородини чорної та малини вегетативним способом, відсутність фітовірусологічного контролю за їх насадженнями сприяють накопиченню і розповсюдженню вірусної інфекції та значному ураженню рослин. Проте не всі вірусні хвороби спричиняють великий недобір урожаю. Одні з них інфікують рослини, але не мають економічного значення через обмежене географічне поширення, інші не шкідливі внаслідок толерантності їх рослин-господарів. Однак деякі вірусні захворювання (махровість, кільцева плямистість, кущова карликовість, хлороз жилок та ін.) набули значного розповсюдження, завдають істотну шкоду і являють собою одну з головних причин обмеження вирощування вищезгаданих ягідних культур.

Незважаючи на наявність значної кількості методичних і наукових доробок вітчизняних і зарубіжних авторів стосовно морфології вірусів та їх інгібованої дії на процеси плодоношення смородини чорної та малини, ця сфера ще містить досить широке коло актуальних питань, що вимагають подальшого дослідження, серед яких вивчення поширення та шкідливості вірусних патогенів указаних культур у Лісостепу України, а також розробка та застосування комплексу біотехнологічних методів діагностики і оздоровлення рослин у процесі виробництва здорового садивного матеріалу. Розв'язанню цих проблем були присвячені наші дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконували в рамках тематичного плану науково-дослідних робіт відділу вірусології, оздоровлення та розмноження плодових і ягідних культур Інституту садівництва (ІС) УААН (нині - НААН України) за темою 02.04. “Створення бази вихідного садивного матеріалу плодових і ягідних культур, вільного від шкодочинної вірусної інфекції, за технологіями, що відповідають міжнародним вимогам” (номер державної реєстрації 0104U004117) та кафедри фітопатології імені академіка В.Ф. Пересипкіна Національного університету біоресурсів і природокористування України “Обґрунтувати екологічно безпечні заходи обмеження розвитку найбільш поширених облігатних та некротрофних патогенів зернобобових культур” (номер державної реєстрації 0106U005712).

Мета і завдання дослідження. Метою нашої роботи було вивчити поширення і шкідливість вірусних хвороб смородини чорної і малини в Лісостепу України та обґрунтувати заходи щодо одержання здорового садивного матеріалу.

Дослідження були спрямовані на вирішення таких завдань:

– виявити вірусні хвороби вказаних культур у Лісостепу України та провести ідентифікацію їх збудників;

– вивчити патологічні зміни у хворих рослинах;

– визначити стійкість сортів смородини чорної проти вірусу махровості (ВМ), а малини - проти жовтої плямистості (ВЖПМ);

– провести тестування сортів цих культур на наявність латентної вірусної інфекції з використанням методів біологічного тестування на рослинах-індикаторах, імуноферментного аналізу (ІФА) та електронної мікроскопії та виділити здорові клони для подальшого розмножування;

– дослідити вплив ВМ і ВЖПМ на біохімічний склад плодів та фотосинтетичну активність рослин;

– виявити вплив вірусів махровості смородини чорної та жовтої плямистості малини на індукцію флуоресценції хлорофілу;

– встановити оптимальний розмір апікальної меристеми in vitro в оздоровленні смородини чорної від ВМ і малини - від ВЖПМ;

– одержати вихідний безвірусний садивний матеріал смородини чорної та малини для закладання маточних насаджень.

Об'єкт дослідження - ультраструктурні біохімічні та фізіологічні зміни в рослинах культур, які вивчалися, під впливом вірусної інфекції.

Предмет дослідження - віруси, виділені з рослин смородини чорної (Ribes nigrum L.) і малини (Rubus idaeus L.).

Методи дослідження включали візуальну діагностику, біотестування, імуноферментний аналіз, електронну мікроскопію, колориметричний метод кількісного визначення хлорофілу, метод індукції його флуоресценції, рефрактометричний (визначення вмісту сухих розчинних речовин) і спектрофотометричний (кількість цукрів, аскорбінової кислоти, фенольних речовин), біотехнологічні, титрування (встановлення кислотності плодів), математично-статистичні обробки даних тощо.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі результатів візуального обстеження насаджень смородини чорної та малини в Лісостепу України виявлено найбільш поширені вірусні хвороби: махровість, зелена крапчастість, хлороз жилок і жовта плямистість.

Уперше в Україні проведено імуноферментний аналіз цих культур для визначення наявності латентної вірусної інфекції. Виявлено значне інфікування їх вірусами кільцевої плямистості малини (RRSV), кущової карликовості малини (RBDV), латентної кільцевої плямистості суниці (SLRV) та мозаїки резухи (ArMV).

Виконано фітовірусологічну оцінку на стійкість сортів смородини чорної проти ВМ і малини - проти ВЖПМ. Серед 15 сортів першої культури стійкість проти ВМ проявили Ювілейна Копаня, Черешнева, Українка та Вернісаж, а з 10 сортів другої проти ВЖПМ - Гусар і Баб'є лєто.

Удосконалено електронно-мікроскопічний метод діагностики ВЖПМ, який включає попередню фіксацію фрагментів тканин листка малини у 6,5%-му розчині глютеральдегіду на фосфатному буфері рН 7,2.

Уперше досліджено вплив ВМ і ВЖПМ на біохімічний склад плодів та вміст фотосинтетичних пігментів у листках культур, які вивчались.

З використанням методу індукції флуоресценції хлорофілу вперше вивчено фотосинтетичну активність рослин, здорових та уражених вірусною інфекцією.

Уперше в Україні встановлено, що віруси махровості смородини чорної та жовтої плямистості малини в меристематичний купол завдовжки до 0,3 мм не проникають.

Практичне значення одержаних результатів. На основі біотестування, імуноферментного аналізу та електронної мікроскопії були відібрані безвірусні клони 11 сортів смородини чорної (Казкова, Радужна, Надійна, Ювілейна Копаня, Вербна, Німфа, Санюта, Софіївська, Вернісаж, Володимирська, Черешнева) і 7 - малини (Марія, Бальзам, Іскра, Гусар, Ольга, Геракл, Феномен). Вони були передані дослідному господарству “Новосілки” ІС НААН України для подальшого розмножування і створення елітних маточних насаджень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати наших досліджень представлені на ІV (Київ, 2004) і V (Київ, 2007) міжнародних конференціях “Біоресурси та віруси”, міжнародній науково-практичній конференції з нагоди 100-річчя з дня народження проф. М.Г. Городнього (Київ, 2008), V міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2009), всеукраїнській науковій конференції молодих учених і спеціалістів “Проблеми адаптації та перспективи розвитку ягідництва” (Київ, 2008), науково-практичній конференції науково-педагогічних працівників та аспірантів НДІ агротехнологій та якості продукції рослинництва НУБіП України (Київ, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 6 - у фахових виданнях, 4 тези доповідей у матеріалах відповідних конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 171 сторінці комп'ютерного тексту. Вона складається зі вступу, огляду літератури, 7 розділів експериментальної частини, висновків, списку використаної літератури (296 джерел), із них 212 - іноземними мовами, додатків на 22 сторінках. Робота ілюстрована 18 таблицями і 37 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

На підставі узагальнення літературних джерел описано основні, найбільш поширені та економічно важливі вірусні хвороби смородини чорної та малини, наведено дані про систематичне положення, біологічні особливості та шляхи поширення їх збудників у природних умовах, а також основні заходи щодо одержання здорового садивного матеріалу.

Візуальну діагностику культур, які вивчались, біологічне тестування і штучне інфікування щепленням “щитком кори” проводили за методиками, наведеними у праці “Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур” (під заг. ред. В.І. Кашина, 2001).

Імуноферментний аналіз у варіанті “сендвіч” здійснювали згідно з методиками M.F. Clark, J.R. Adams (1977) і О.В. Митрофанової та ін. (2000).

Морфологію вірусних часток вивчали із застосуванням методу електронної мікроскопії ультратонких зрізів (Карупу В.Я., 1984; Уілкі Б., 1975; Мельничука М.Д. та ін., 2002). Негативне контрастування нативних вірусів виконували з використанням 2%-го розчину фосфорно-вольфрамової кислоти рН 7,0-7,2 (Brenner S., 1959).

Вміст сухих розчинних речовин у плодах смородини чорної і малини визначали рефрактометричним методом, цукрів, аскорбінової кислоти та фенольних речовин - спектрометричним, а кислотність - титруванням (П.В. Кондратенко та ін., 2008).

Хлорофіл із листків рослин екстрагували 96%-ним етиловим спиртом. Їх концентрацію встановлювали за щільністю спиртової витяжки, визначеною з використанням спектроколориметра КФК-3. Кількість пігментів обчислювали за формулою Веттштейна (Гродзинський А.М., 1972).

Вплив вірусної інфекції на стан фотосинтетичного апарату рослин вивчали за допомогою методу індукції флуоресценції хлорофілу (ІФХ), описаного в працях О.В. Брайона та ін. (2000) і Д.Ю. Корнєєва (2002). Зміни ІФХ досліджували з використанням портативного приладу “Флоратест”.

Методичною основою введення в культуру in vitro меристематичних апексів смородини чорної та малини були праці Е.В. Колбанової та Н.В. Кухарчика (2006), Т.Є. Титаренко (2006). Виділені експланти висаджували в пробірки зі стерильним поживним середовищем Мурасіга і Скуга (1962).

Математично-статистичну оцінку вірогідності одержаних результатів проводили методом дисперсійного аналізу (Доспехов А.Б., 1985) із застосуванням комп'ютерних програм Microsoft Excel.

Автор висловлює вдячність за надані консультації та методичну допомогу в проведенні досліджень завідувачу сектором фізіології рослин ІС НААН України Китаєву О.І. і старшому науковому співробітнику цього сектора Скрязі В.А., співробітникам відділу вірусології, оздоровлення та розмноження плодових і ягідних культур указаного інституту Таранухо М.П., Тряпіциній Н.В., а також співробітникам відділу зберігання та переробки Бабенко С.М. і Бублик В.П.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Діагностичні ознаки та поширеність вірусних хвороб смородини чорної і малини на різних за стійкістю сортах

З метою виявлення ареалу вірусних хвороб досліджуваних культур протягом 2007-2009 рр. були проведені обстеження їх насаджень в ІС НААН України, його дослідних господарствах (ДГ) «Новосілки» і «Дмитрівка», товариства з обмеженою відповідальністю (ТОВ) «Контракт» і на присадибних ділянках с. Новосілки Київської області. Під час маршрутних оглядів плантацій смородини чорної найчастіше зустрічалися кущі з характерними симптомами махровості (реверсії), в яких однорічні пагони мали пригнічений вигляд, форма листкової пластинки була асиметричною, подовженою, часто трилопатевою. На деяких листках між жилками спостерігалася хлоротична плямистість. Сітка жилок була менш насичена, порівняно рідка. Квітки аномальні, квіткова китиця іноді повністю перетворювалася в пагін типу “стовбура”.

Під час візуальної діагностики були також виявлені рослини, що мали знебарвлені широкі смуги вздовж основних жилок листкової пластинки, іноді на них спостерігалася ледь помітна зелена крапчастість. Ці зовнішні ознаки виникають під впливом вірусу огіркової мозаїки - збудника зеленої крапчастості смородини чорної. Крім того, в насадженнях цієї культури відмічено поодинокі рослини, на листках яких було помітне світло-жовте облямування основних жилок у вигляді папоротеподібного візерунку. Такими є характерні симптоми ураження рослин облямуванням жилок аґрусу.

З даних, наведених у таблиці 1, випливає, що в найгіршому стані стосовно ураження вірусними хворобами знаходяться насадження смородини чорної на присадибних ділянках с. Новосілки, де махровістю було охоплено від 25,3 до 80,7% рослин, а зеленою крапчастістю - 6,3-13,9%.

Візуальний огляд плантацій малини показав досить широке варіювання симптомів ураження. При цьому зустрічалося темно-зелене, зморшкувате листя із закрученими донизу краями або рідкі дрібні жовтувато-зелені плями на ньому, що є характерним зовнішнім проявом кільцевої плямистості малини. Спостерігався також хлороз жилок цієї культури. Траплялися розкидані великі неправильної форми яскраво-жовті плями, які часто зливалися, що є ознакою жовтої плямистості. Можна було помітити сітчастоподібний хлороз уздовж жилок листка, який характерний для жовтої сітчастості малини. Крім того, були виявлені поодинокі рослини з діагностичними симптомами кущової карликовості у вигляді хлорозу тканин, розміщених між жилками листків, з подальшим пожовтінням усієї листкової пластинки, а в період плодоношення на них були помітні дрібні та крихкі плоди.

Обстеження свідчать, що гіршим був стан колекційних насаджень малини ІС НААН України і присадибних ділянок у с. Новосілки. Найбільша кількість рослин у цих насадженнях була уражена збудниками жовтої плямистості (відповідно 25-100 і 15,0-100%) і хлорозу жилок (14,3-100 і 7,1-60,0%) (табл. 2).

При уражені рослин вірусами симптоми хвороби часто відсутні, що, як правило, має місце при перебуванні патогенів у латентному стані. Аналіз результатів, одержаних з використанням ІФА, показав досить високий рівень латентного інфікування сортів смородини чорної вірусами кільцевої плямистості малини (Raspberry ringspot virus - RRSV), кущової карликовості малини (Raspberry bushy dwarf virus - RBDV), мозаїки резухи (Arabis mosaic virus -ArMV) і латентної кільцевої плямистості суниці (Strawberry latent ringspot virus - SLRV). Найбільша кількість рослин була уражена RRSV (48±5,4%), дещо менша - RBDV, ArMV і SLRV (11±2,3, 28±4,9 і 8±2,6% відповідно) (табл. 3). При цьому жоден сортозразок не мав позитивної реакції на наявність вірусу чорної кільчастості томату (Tomato black ring virus - TBRV).

Серед досліджуваних сортів смородини чорної частка рослин, вільних від перелічених вище вірусів, становила 32±3,1% від їх загальної кількості,

35±3,1% були інфіковані одним збудником, 26±3,1% - двома, 6±3,1% - трьома. Водночас по чотири віруси було виявлено лише в рослин двох сортів: Краса Львова та Черешнева (див. табл. 3).

На малині також найбільшого поширення набув Raspberry ringspot virus (48±5,9%), а RBDV, ArMV і SLRV інфікували 33±5,9, 14±3,6 і 11±3,6% рослин відповідно. Аналізуючи одержані результати, ми встановили, що кількість рослин, вільних від вищевказаних вірусів, становить 30±3,6% від їх загальної кількості, 26±3,6% були уражені одним патогеном, 33±3,6% - двома, 9±3,6% - трьома, по чотири віруси одночасно виявлено у 3±3,6% (сорти Бальзам, Солнишко і гібрид 3-2-2) (табл. 4).

Для підтвердження вірусної етіології хвороб досліджуваних культур застосовували біологічне тестування та електронно-мікроскопічний аналіз із метою виявлення відповідних вірусних часток.

Морфологічна характеристика вірусів - збудників хвороб смородини чорної та малини

Досліджуючи ультратонкі зрізи тканин листків і пелюсток аномальних квіток смородини чорної з характерними симптомами махровості, ми виявили бацилоподібні частки завдовжки 271±7,19 нм і діаметром 78±2,31 нм. Віріони в основному локалізуються в ядрі, перинуклеарному просторі та цитоплазмі. Іноді вони зустрічаються у вигляді великих скупчень, оточених мембраною або ні. Наприклад, у ядрі інфікованих клітин розміщення вірусних часток мало як упорядкований, так і хаотичний характер).

З використанням методу щеплення “щитків кори” вивчали чутливість 15 сортів цієї культури до збудника махровості. Протягом другого і третього років інфікування симптоми ураження (асиметричність і мозаїчність) спостерігали на листках 11 сортів: Володимирська, Німфа, Поезія, Софіївська, Козацька, Краса Львова, Тітанія, Альта, Вербна, Аметист, Зоря Галицька - і лише на Альті проявилася властива для реверсії патологія окремих квіток (махровість). Сорти Ювілейна Копаня, Вернісаж, Українка та Черешнева не мали явних ознак ураження, що характеризує їх стійкість проти Blackcurrant reversion virus.

У процесі вивчення ультратонких зрізів тканин листків малини з характерними симптомами хлорозу жилок нами були ідентифіковані бацилоподібні частки вірусу хлорозу жилок малини - Raspberry vein chlorosis virus. Типовим місцем їх локалізації є цитоплазма. Віріони зустрічалися поодиноко або утворювали невеликі скупчення, оточені клітинними мембранами. Їх розмір становить 473±4,80 х 79±0,95 нм.

У тканинах лободи рисової, штучно інфікованих вірусом огіркової мозаїки (ізолят із смородини чорної), нами було виявлено в окремих зонах цитоплазми високу концентрацію віріонів. Ці зони, оточені мембраною, різняться між собою розміром і ступенем насиченості вірусними частками. Розподіл віріонів у них має хаотичний характер. Розмір часток у середньому становить 29,6±0,59 нм.

У результаті електронно-мікроскопічних досліджень ультратонких зрізів тканин листків малини з типовими ознаками жовтої плямистості, виявлено сферичні вірусні частки діаметром 112±2,82 нм. Вони локалізуються в основному в цитоплазмі та перинуклеарному просторі ядра.

Удосконалено електронно-мікроскопічний метод діагностики вірусу жовтої плямистості, який включає попередню фіксацію фрагментів тканин листка малини у 6,5%-му розчині глютеральдегіду на фосфатному буфері рН 7,2.

Інфікуючи рослини збудником жовтої плямистості, досліджено чутливість до нього 10 сортів малини. У третьому вегетаційному періоді відзначено різний ступінь ураження цих сортів. При цьому симптоми у вигляді характерних жовтих плям на листках найчіткіше проявилися на сортах Солнишко та Персея. І лише сорти Гусар і Баб'є лєто не мали явних ознак інфікування. Це свідчить, що вони є стійкими до цього патогену.

Патологічні зміни клітинних органел, спричинені вірусами смородини чорної та малини

Внутрішньоклітинний розвиток вірусів і використання ними для свого розмноження енергетичних систем і складових частин рослинних клітин призводять до значних морфологічних і структурних змін останніх. Зокрема, електронно-мікроскопічними дослідженнями ультратонких зрізів тканин хворих рослин смородини чорної і малини порівняно зі здоровими нами виявлено форми ядра, мітохондрій та пластид, видозмінені під впливом вірусної інфекції, а саме: Blackcurrant reversion virus, Cucumber mosaic virus, Raspberry yellow blotch virus. Хлоропласти помітно набухали без наявного вмісту крохмальних зерен, спостерігалося злипання або відсутність тилакоїдів гран. Зустрічалися пластиди із сильно редукованою мембранною системою. Одночасно змінювалася внутрішня структура мітохондрій, у матриксі яких виявлено обширні електронно-світлі зони з короткими та сильно розширеними кристами.

Вплив вірусної інфекції на якість плодів смородини чорної та малини

Важливим показником якості плодів ягідних культур є кислотність, яка в поєднанні з цукристістю і фенолами визначає смакові властивості продукції. В результаті наших досліджень установлено, що вірусні хвороби дуже впливають на хімічний склад плодів культур, які вивчалися, зокрема, вірус махровості сприяв підвищенню кислотності та вмісту фенольних речовин в ягодах смородини чорної на 70,6 і 45,6% відповідно, при цьому кількість цукрів і вітаміну С зменшилась на 7,8 і 18,7% (табл. 5).

Подібну тенденцію відмічено при біохімічному аналізі плодів малини з рослин, уражених вірусом жовтої плямистості: порівняно з контрольними кислотність їх збільшилася в 2,3 раза, вміст фенольних речовин зріс на 72,8%, а загальна кількість цукрів і вітаміну С зменшилася відповідно на 34,6 і 15,8% (табл. 6).

Результати біохімічного аналізу плодів здорових та інфікованих рослин досліджуваних культур свідчать про істотний вплив вірусів махровості та жовтої плямистості на їх хімічний склад, що значно погіршує смакові якості й цінність як продукту харчування, а також як сировини для переробних галузей промисловості.

Зміни вмісту пластидних пігментів у листках смородини чорної та малини під впливом вірусної інфекції

Важливим показником, що характеризує роботу фотосинтетичного апарату рослин, є вміст хлорофілів a і b та їх співвідношення. Вони не тільки визначають колір листя, але й беруть безпосередню участь у поглинанні квантів енергії світла, її міграції до реакційних центрів фотосистем хлоропластів і подальшому перетворенні в енергію хімічних зв'язків.

Результати наших досліджень свідчать, що сумарна кількість хлорофілів (а+b) у здорових листках смородини чорної в активний період росту з розрахунку на одиницю як площі, так і маси листкової пластинки вища відповідно на 27,6 і 23,4%, ніж в інфікованих рослин (табл. 7).

Зниження вмісту зелених пігментів проявилося також під впливом вірусу жовтої плямистості малини. Так, концентрація хлорофілів (а+b) в інфікованих листках малини зменшується відповідно на 22,7 та 30,2% з розрахунку на одиницю як маси, так і площі листкової пластинки порівняно зі здоровими рослинами (табл. 8). Це свідчить про патологічну дію вірусів махровості смородини чорної та жовтої плямистості малини, що спричиняють гальмування синтезу хлорофілу і деструкцію хлоропластів.

Аналіз співвідношення а/b у хлоропластах листків смородини чорної та малини показав, що віруси махровості і жовтої плямистості обумовлюють зниження його величини на 15,2 і 7,1% відповідно (див. табл. 7, 8).

У літературі дані стосовно цього показника досить розрізнені та суперечливі. Результати наших досліджень узгоджуються з думкою В.З. Улинець (2002), О.О. Дьячкової (2003), Л.А. Єфремової (2003) і Л.Т. Міщенко (2004) про те, що вірусна інфекція спричиняє зниження відношення хлорофілів а/b у фотосинтетичних мембранах.

Індукційні зміни флуоресценції хлорофілу в листках смородини чорної та малини, спричинені вірусною інфекцією

Відомо, що несприятливі умови довкілля негативно впливають у першу чергу на процес фотосинтезу рослин. Порушення стану фотосинтетичних мембран під впливом зовнішніх факторів супроводжується відповідною зміною оптичних властивостей хлорофілу а фотосистеми 2 (ФС 2). Зміни його флуоресценції свідчать про стан реакційних центрів (РЦ) цієї фотосистеми, що є джерелом інформації для ранньої діагностики рослин [Карапетян, 1986; Корнеев, 2000; Зеленянська, 2009]. При активному фотосинтезі, коли всі РЦ знаходяться у відкритому робочому процесі, використовується майже вся поглинута енергія сонячного світла і тільки невелика її кількість (до 3%) переходить в енергію світла у вигляді фонової флуоресценції (F_о). У нормальних умовах її величина невелика, що свідчить про активне використання клітинами поглинутих квантів світла. За будь-яких несприятливих умов (у нашому випадку це вірусна інфекція) порушується стан фотосинтетичних мембран і реакційні центри стають неактивними, призупиняючи потік електронів. При цьому поглинута енергія світла вже не може використовуватися в процесі фотосинтезу і тому флуоресценція хлорофілу зростає, що й підтвердили результати наших досліджень стосовно впливу вірусів махровості та жовтої плямистості на фотосинтетичний апарат (ФСА) рослин смородини чорної та малини. Залежність параметрів ІФХ від дії вірусу махровості показано у вигляді кривих Каутського.

Зокрема, спостерігався ріст інтенсивності F_о на 23,3% в інфікованих ВМ листках смородини чорної в період до цвітіння, що обумовлено збільшенням кількості неактивного хлорофілу, який не передає енергію збудження реакційним центрам. Навпаки, в період активного росту (після цвітіння) значення F_о зменшилося на 25,0% порівняно з контролем, що свідчить про наявність у клітинах меншої кількості хлоропластів та руйнування їх структури під впливом вірусної інфекції.

Серед параметрів, які характеризують індукцію флуоресценції хлорофілу, найістотніших змін набуло співвідношення dFpl/Fv, збільшення якого до й після цвітіння відповідно на 34,1 і 70,2% порівняно з контрольним варіантом, характеризує наявність і патологічну дію вірусу на функціональний стан рослини.

Подібні індукційні криві були виведені при вивченні впливу вірусу жовтої плямистості на ФСА рослин малини. Форма кривих Каутського показує, що фонова флюоресценція під дією вірусної інфекції зросла порівняно з контролем до й після цвітіння на 27,7 і 52,8% відповідно.

При цьому параметр dFpl/Fv, який відповідає відносній кількості Q_b-невідновлювальних комплексів ФС2, що не беруть участі в лінійному транспорті електронів, збільшується відповідно у 2,9 і 2,7 раза до й після цвітіння. Величина співвідношення dFpl/Fv, як і під впливом збудника махровості, перевищує значення 0,5 відносних одиниць, що зумовлено наявністю вірусної інфекції. Результати наших досліджень стосовно змін флуоресценції хлорофілу під її впливом узгоджуються з даними інших авторів (С.О. Чернюк та ін., 1999; 2002; В.З. Улинець, 2002; Л.Т. Міщенко, 2004), які вивчали це питання на інших культурах, уражених властивими їм вірусами.

Оздоровлення смородини чорної та малини від вірусної інфекції з використанням методу культури апікальної меристеми

Застосування методу культури in vitro з метою звільнення рослин від фітопатогенів є одним з найважливіших та найактуальніших аспектів сільськогосподарської біотехнології. На основі багатьох комбінацій “вірус-хазяїн” установлено, що біля верхівки пагона та кінчика кореня існує зона більшого або меншого розміру, що зовсім не містить або містить вірус у дуже малій кількості. Цю властивість використовують для отримання клонів клітин, вільних від вірусної інфекції [Метьюз, 1973]. Оскільки довести наявність вірусу в апікальній меристемі досить важко, ми протягом 5-6 місяців вивчали ріст і розвиток ізольованих верхівкових тканин досліджуваних культур з урахуванням таких закономірностей: якщо в них присутня хоч незначна кількість вірусу, та цей збудник міг би розмножитися і його пощастило б виявити. На четвертому субкультивуванні, коли рослини-регенеранти добре сформувались, їх перевіряли за допомогою електронно-мікроскопічного аналізу на наявність вірусних часток. На основі одержаних результатів установлено, що вихід рослин смородини чорної, вільних від вірусу махровості та залежно від розміру апексів (?0,3 до ?1 мм), дорівнює 100-56,6% відповідно (табл. 9).

Таблиця 9 - Вплив розміру апікальної меристеми на оздоровлення рослин смородини чорної від вірусу махровості (сорт Козацька)

Аналогічні дані одержано стосовно оздоровлення малини від вірусу жовтої плямистості. Цей збудник у меристематичний купол завдовжки до 0,3 мм не проникає, а кількість вільних від нього рослин, одержаних із більших експлантів (?1 мм), становить 75,7% (табл. 10).

Отримані нами результати дають можливість у подальшому вивчати і вдосконалювати заходи оздоровлення та масового розмножування цінних сортів смородини чорної та малини.

Відбір вільних від вірусів клонів для створення маточних насаджень

На основі результатів візуальної діагностики, біотестування, ІФА та електронної мікроскопії ми відібрали безвірусні клони 11 сортів смородини чорної (Казкова, Радужна, Надійна, Ювілейна Копаня, Вербна, Німфа, Санюта, Софіївська, Вернісаж, Володимирська, Черешнева), на основі яких у відділі вірусології, оздоровлення та розмноження плодових і ягідних культур ІС НААН України був закладений супер-суперелітний (ССЕ) маточник у кількості 185 кущів, та 7 - малини (Марія, Бальзам, Іскра, Гусар, Ольга, Геракл, Феномен), що також стали базою для створення супер-суперелітного маточника (265 кущів).

ВИСНОВКИ

1. У результаті обстеження насаджень смородини чорної та малини в Лісостепу України встановлено поширення вірусних хвороб. Зокрема, на смородині чорній найчастіше спостерігалися махровість (0,1-80,7%) і зелена крапчастість (1,0-13,9%), а на малині - жовта плямистість (3-100%) і хлороз жилок (1,2-100%). Вони відповідно спричиняються вірусами Blackcurrant reversion virus, Cucumber mosaic virus 1 Smith, Raspberry yellow blotch virus і Raspberry vein chlorosis virus. На обох культурах за допомогою ІФА були виявлені Raspberry ringspot virus, Raspberry bushy dwarf virus, Arabis mosaic virus і Strawberry latent ringspot virus, які знаходились у латентній формі.

2. У тканинах листків і пелюсток квіток смородини чорної зі симптомами махровості наявний бацилоподібний вірус Blackcurrant reversion virus. Його частки мали розмір 271±7,19 х 78±2,31 нм. Серед 15 сортів указаної культури, штучно інфікованих цим збудником, на 11-ти проявилась асиметрія листкової пластинки. Лише на Альті розвинулася властива для реверсії патологія квіток (махровість). На сортах Ювілейна Копаня, Вернісаж, Черешнева та Українка симптомів хвороби не виявлено, що характеризує їх стійкість проти патогену.

3. На основі діагностичних симптомів, виявлених на рослинах-господарях і механічно інфікованих трав'янистих рослинах-індикаторах, ідентифіковано вірус огіркової мозаїки 1 (Cucumber mosaic virus 1 Smith). Розмір його часток становив 29±0,59 нм.

4. Рослини малини з типовими ознаками хлорозу жилок у тканинах містили бацилоподібні вірусні частки, що були поодиноко розкидані по цитоплазмі або утворювали невеликі скупчення, оточені клітинними мембранами, розмірами 473±4,80 х 79±0,95 нм.

5. У рослинах малини зі симптомами жовтої плямистості виявлено ізометричні частки розміром 112±2,82 нм, локалізовані в цитоплазмі та перинуклеарному просторі. Удосконалено електронно-мікроскопічний метод діагностики вірусу жовтої плямистості малини (Raspberry yellow blotch virus), який включає попередню фіксацію фрагментів рослинних тканин у 6,5%-му розчині глютеральдегіду на фосфатному буфері рН 7,2. При штучному ураженні рослин малини цим збудником установлено, що сорти Солнишко і Персея характеризуються більшою сприйнятливістю, а Гусар і Баб'є лєто - стійкістю.

6. Електронно-мікроскопічним методом виявлено морфологічні і структурні зміни клітинних органел у тканинах хворих рослин обох досліджуваних культур: різні конфігурації форм ядра, мітохондрій, пластид, редукція їх внутрішніх структур.

7. Установлено, що віруси махровості смородини чорної та жовтої плямистості малини спричиняють біохімічні зміни в їх плодах, а саме: збільшення кислотності (у 1,7 і 2,3 раза відповідно) і вмісту фенольних речовин (45,6 і 72,8%) та зменшення загальної кількості цукрів (7,7 і 34,6%) і вітаміну С (18,7 і 15,8%).

8. Виявлено зменшення загальної кількості хлорофілів (а+b) у листках рослин смородини чорної та малини, уражених відповідно вірусами махровості і жовтої плямистості, що є наслідком реакції фотосинтетичних систем цих культур на вірусну інфекцію.

9. Дослідження стану фотосинтетичного апарату хворих рослин порівняно зі здоровими методом індукції флуоресценції хлорофілу показало, що величина параметра dFpl/Fv перевищує 0,5 відносних одиниць. Цей показник може бути використаний для визначення наявності вірусної інфекції.

10. Доведено, що віруси махровості смородини чорної та жовтої плямистості малини в апікальну верхівку завдовжки до 0,3 мм не проникають. Це дає можливість застосовувати метод культури in vitro в оздоровленні цих культур від інфекції.

11. За результатами візуальної діагностики, тестування на рослинах-індикаторах та ІФА відібрано безвірусні клони смородини чорної та малини і закладено маточні насадження. Маточний фонд включає 11 сортів першої культури (Казкова, Радужна, Надійна, Ювілейна Копаня, Вербна, Німфа, Санюта, Софіївська, Вернісаж, Володимирська, Черешнева) та 7 - другої (Марія, Бальзам, Іскра, Гусар, Ольга, Геракл, Феномен).

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Для тестування рослин смородини чорної на наявність вірусу махровості рекомендується використовувати рослини сорту Альта, в яких діагностичні симптоми аномальності квіток проявляються на третій рік після штучного інфікування. Сорти Ювілейна Копаня, Вернісаж, Черешнева та Українка доцільно впроваджувати у селекційний процес при створенні сортів і гібридів, стійких проти махровості, а сорти малини Гусар і Баб'є лєто - проти жовтої плямистості.

Для оздоровлення рослин смородини чорної від вірусу махровості, а малини - від жовтої плямистості рекомендується метод культури in vitro, при цьому розмір апексів не повинен перевищувати 0,3 мм.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті у наукових виданнях

1. Таранухо Ю.М. Попередні результати тестування смородини чорної і порічок на наявність вірусної інфекції / Ю.М. Таранухо, М.П. Таранухо, С.О. Васюта // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2007. - Вип. 109. - С. 146-150. (Здійснено пошук та узагальнення літературних даних, відібрано рослинні зразки та проведено механічну інокуляцію трав'янистих рослин-індикаторів).

2. Таранухо Ю.М. Відбір здорових вихідних рослин смородини чорної та прискорене їх розмноження / Ю.М. Таранухо, М.П. Таранухо // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2008. - Вип. 126. - С. 163-167. (Проаналізовано літературні дані, проведено візуальне обстеження насаджень, біотестування на рослинах-індикаторах. Наведено інтерпретацію одержаних результатів і підготовлено статтю до друку).

3. Таранухо Ю.М. Махровість смородини чорної / Ю.М. Таранухо, М.П. Таранухо, О.І. Китаєв, В.А. Скряга // Карантин і захист рослин. - 2009. - № 8. - С. 13-15. (Вивчено і освоєно методичний матеріал досліджень, виконано пошук і узагальнено літературі дані. Проведено обробку одержаних результатів і підготовлено рукопис статті до друку).

4. Таранухо М.П. Ультратонкі зміни в рослинних клітинах ягідних культур при вірусній інфекції / М.П. Таранухо, Ю.М. Таранухо // Садівництво. - 2004. - Вип. 55. - С. 343-349. (Проведено пошук літературних даних, вивчено та освоєно методику електронної мікроскопії під час діагностики вірусів).

5. Таранухо Ю.М. Реверсивний вірус смородини чорної з родини Rhabdoviridae / Ю.М. Таранухо,Кирик М.М., М.П. Таранухо // Наукові доповіді. - 2009. - 3 (15). Режим доступу: http://www.nbuv.gov.ua/e-journals/Nd/2009-3/09tmjvfr.pdf. (Виконано пошук, узагальнено літературні дані, опрацьовано методичний матеріал, проведено електронно-мікроскопічний аналіз відібраних рослинних зразків, підгототлено рукопис статті).

6. Таранухо Ю.М. Сокопереносні віруси смородини чорної та малини / Ю.М. Таранухо // Науковий вісник Національного університету біоресурсів і природокористування України. - 2009. - Вип. 140. - С. 142-146.

Тези доповідей на конференціях

7. Таранухо М.П. Крупний ізометричний вірус при жовтій плямистості малини / М.П. Таранухо, С.О. Васюта, В.М. Удовиченко, Ю.М. Таранухо, Т.М. Чорноіван // Біоресурси і віруси: VI міжнар. конф., 27-30 вересня 2004 р.: тези доп. - К., 2004. - С. 96-97.

8. Таранухо М.П. Електронно-мікроскопічний аналіз клітини при вірусній інфекції у смородини та малини / М.П. Таранухо, С.О. Васюта, Ю.М. Таранухо, Р.І. Кременчук // Біоресурси і віруси: V міжнар. конф., 10-13 вересня 2007 р.: тези доп. - К., 2007. - С. 200.

9. Таранухо Ю.М. Вірусні хвороби смородини чорної та малини в Лісостепу України / Ю.М. Таранухо // Проблеми адаптації та перспективи розвитку ягідництва: всеукр. наук. конф. молодих вчених і спеціалістів, 8-10 грудня 2008 р.: тези доп. - К., 2008. - 142-144.

10. Таранухо Ю.М. Бацилоподібні віруси, виявлені в рослинах смородини чорної та малини / Ю.М. Таранухо, М.П. Таранухо // Молодь і поступ біології: V міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів, 12-15 травня 2009 р.: тези доп. - Львів, 2009. - С. 209-210.

Размещено на Allbest.ru