Біохімічна характеристика резистентності молодняку тварин за умов використання комплексних мікроелементних композицій

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХЕРСОНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.04 -- біохімія

БІОХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЗИСТЕНТНОСТІ МОЛОДНЯКУ ТВАРИН ЗА УМОВ ВИКОРИСТАННЯ КОМПЛЕКСНИХ МІКРОЕЛЕМЕНТНИХ КОМПОЗИЦІЙ

Долгая Марина Миколаївна

Херсон - 2010

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема підвищення адаптивності організму та регуляції гомеостазу залишається однією з головних у сучасній біології. Інтенсивність вільнорадикальних процесів у організмі та вплив на них різних чинників свідчить про те, що вони найчастіше виявляють себе та є найбільш значущими в тих біологічних системах, де активність метаболізму найбільш висока (Симонов А. Л., 2003, Влізло В.В., 2004).

Організм тварин характеризується сталими механізмами гомеостазу (Сиротинин Н.Н., 1981), які, однак, не безмежні. Порушення метаболізму є серйозним чинником, що пригнічує розвиток організму та негативно впливає на виробництво продукції тваринництва (Кравців Р.Й., 2000). Доведено, що зміщення балансу антиоксиданти-прооксиданти в бік останніх відбувається на різних, так званих «критичних», етапах онтогенезу тварин під впливом різних чинників: ксенобіотиків (Кучинський М.П., 2008), мікотоксинів (Рошкован Г.И., 1990), важких металів (Маслянко Р.Л., 2000), канцерогенів та оксидативного стресу (Волчегорський И.А., 2000), інфекційних та запальних процесів, а також старіння (Dove Cr., 2000; Горбачов В.В., 2002).

Установлено залежність резистентності організму від шкідливого впливу зовнішніх чинників, від мінерального обміну (Тимошенко О.П., 1970, Буштов А., 2004), проте біохімічна сутність регуляторних процесів залишається недостатньо вивченою. Порушення мінерального обміну при дефіциті живлення супроводжується зменшенням вмісту в крові імуноглобулінів (Hathcock J.N., 1997); різким заниженням активності пропердинової системи, що забезпечує природну резистентність організму до патогенної мікрофлори (Влізло В.В., 2006); сповільненням процесу утворення специфічних антитіл після вакцинації; підвищенням проникливості клітинних мембран для бактеріальних токсинів та вірусів; зниженням активності ферментів, що активізуються мікроелементами (Кучинський М.П., 2008); порушенням нормальної взаємодії антигену з антитілом (Данчук В.В., 2003). Отже, дослідження, спрямовані на пошук засобів і прийомів підвищення загальної резистентності й стабілізації антиоксидантної рівноваги організму, розробку препаратів на основі глобулярних білків сироватки крові, органічних синтетичних субстанцій і мікроелементів, є актуальними та мають важливе науково-практичне значення (Чумаченко В., 1997).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Реферована робота є складовою частиною досліджень, виконаних відповідно до плану науково-дослідних робіт відділу екологічного моніторингу та якості продукції тваринного походження Інституту тваринництва УААН протягом 2006-2008 рр. у межах виконання завдання 28.03.06-029-01 «Розробити імунобіологічні та біотехнологічні основи підвищення резистентності і збереження здоров'я тварин» (№ державної реєстрації 0106U010672).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження полягає у вивченні біохімічних показників резистентності молодняка тварин за умов застосування комплексних мікроелементних композицій «Тіометалоглобулін» («ТМГ») та «Біотам».

Для реалізації поставленої мети визначено такі завдання:

1. Визначити методичні підходи до виробництва комплексного імуноглобулінового препарату «Тіометалоглобулін».

2. Дослідити показники антиоксидантного статусу тварин за умови використання комплексного препарату «Тіометалоглобулін», з'ясувати його вплив на біохімічні процеси в організмі піддослідних тварин.

3. З'ясувати рівень впливу «Тіометалоглобуліну» та мікроелементної композиції «Біотам» на біохімічні показники крові за умов штучного оксидативного стресу на тлі вживання щурами окисленого жиру.

4. Вивчити протианемічні й імуномоделюючі властивості «Тіометалоглобуліну» і «Біотаму» за умови різних способів уведення їх поросятам.

5. Визначити стан загальної резистентності поросят при введенні їм «Тіометалоглобуліну» і «Біотаму» за умов вакцинації.

Об'єкт дослідження: загальна резистентність організму тварин.

Предмет дослідження: показники загальної резистентності організму щурів і поросят під впливом комплексних мікроелементних композицій.

Методи досліджень: хроматографічний, спектрофотометричний, турбідиметричний та статистичний.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексне дослідження показників, що характеризують функціональний стан гуморальних чинників імунітету, активність ферментативної й неферментативної ланок антиоксидантної системи в організмі щурів і поросят раннього віку під впливом комплексних мікроелементних композицій («Тіометалоглобулін» і «Біотам») та за умови вакцинації поросят проти сальмонельозу.

Розроблено спосіб виготовлення комплексного імуноглобулінового препарату з тіосульфатом натрію «Тіометалоглобулін».

Визначено спосіб уведення «Тіометалоглобуліну», уперше з'ясовано його вплив на біохімічні показники крові та неспецифічної резистентності й антиоксидантного статусу в щурів і поросят.

Установлено вплив раціону з високим вмістом жиру, перекисним і кислотним числом на біохімічні показники стану організму щурів за умов переходу на виключно самостійне харчування й корекції цих показників шляхом уведення тваринам комплексних препаратів.

Практичне значення одержаних результатів. На основі теоретичних узагальнень та проведених дослідів розроблено і запатентовано препарат «Тіометалоглобулін» для підвищення імунного статусу й антиоксидантного захисту організму тварин раннього віку за умови вакцинації (деклараційний патент на винахід № 42458). Розроблено ТУ У 24.4-00497199-055-2007 та інструкцію із застосування «Тіометалоглобуліну», затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України (13.03.2007 р.). Запатентовано спосіб годівлі поросят комплексною мікроелементною композицією «Біотам» (деклараційний патент на корисну модель № 27407).

Результати проведених у виробничих умовах досліджень з вивчення впливу комплексних препаратів «Тіометалоглобулін» і «Біотам» поглиблюють сучасні уявлення про вікові й тканинні особливості нагромадження мікроелементів, вільнорадикальних процесів і можуть бути основою для розробки науково обґрунтованих схем регуляції обміну речовин за допомогою біологічно активних речовин.

На підставі проведених досліджень розроблено та опубліковано методичні рекомендації «Використання залізовмісних сполук для тварин та птиці», затверджені секретаріатом ТК № 132 Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок (протокол № 27 від 10.12.2008 р).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота містить результати досліджень, отриманих здобувачем під час виконання науково-дослідних робіт відповідно до тематичного плану науково-дослідної установи, що підтверджено робочими програмами й звітами про науково-дослідницькі роботи. У дисертаційній роботі особисто здобувачеві належать: визначення вмісту мікроелементів, клініко-біохімічних показників крові тварин у постнатальному онтогенезі, продуктів перекисного окиснення ліпідів та проведення порівняльного вивчення активності антиоксидантних ферментів, детальне вивчення досягнень науки з цієї проблеми, виконання біохімічних досліджень; формулювання висновків. Окремі результати досліджень було отримано за участі співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем, що задекларовано у списку публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на засіданнях ученої ради та координаційних нарадах Науково-методичного центру «Інститут біології тварин УААН» (Львів, 2005-2009 рр.); засіданнях ученої ради та конференціях молодих учених в Інституті тваринництва УААН (Харків, 2004-2007 рр.); міжнародних наукових конференціях у Львівській державній академії ветеринарної медицини ім. С. З. Гжицького (2006, 2008 рр.).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 8 статей у наукових виданнях, 6 з яких затверджені переліком ВАК України як фахові, отримано 4 патенти, видано методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукових джерел, матеріалів і методів дослідження заявленої проблеми, основних результатів роботи, їх узагальнення, висновків, списку використаних джерел та додатків. Роботу викладено на 117 сторінках машинописного тексту, що містить 15 рисунків, 33 таблиці. Список використаних джерел складається з 279 найменувань, у тому числі 111 джерел іноземних авторів. У додатках подано акти випробувань використання препаратів у виробничих умовах, патенти, ТУ У.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди на білих щурах було проведено в лабораторії екологічного моніторингу і прикладної ентомології Інституту тваринництва УААН та на поросятах великої білої породи у приватному сільськогосподарському підприємстві «Світанок» Богодухівського району Харківської області.

На першому етапі дослідження було вивчено фізико-хімічні властивості препарату «Тіометалоглобулін» та визначено спосіб і дозу уведення його тваринам.

На другому етапі проведено клініко-біохімічний аналіз крові за умови перорального та парентерального способів уведення.

Окрім того, вивчено вплив «Тіометалоглобуліну» («ТМГ») на біохімічні показники крові за умови різних прийомів його введення та при згодовуванні великої кількості жиру з високими кислотним та перекисним числами, а також комплексної мікроелементної композиції «Біотам», розробленої спільно зі співробітниками Інституту фармакології і токсикології АМН України. Для вирішення визначених завдань проведено експерименти на білих щурах вагою 100 г та поросятах віком 2-3 доби. Відбір тварин для дослідів проводили з урахуванням віку та живої маси тіла, вони були розподілені за принципом пар-аналогів.

«Біотам» згодовували у складі раціону протягом трьох тижнів із розрахунку 20 мг/кг маси тіла. Відбір цільної крові, плазми та органів у щурів для досліджень (печінка, мозок, нирки, серце та м'язи стегна) проводили з дотриманням правил біоетики та вимог Ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001). Піддослідні тварини перебували на груповому утриманні з раціоном, що мав великий вміст рослинного жиру з високим перекисним й кислотним числами. Тварини контрольної групи отримували фізіологічний розчин і утримувалися окремо на стандартному для лабораторних тварин раціоні. Перша піддослідна група тварин отримувала фізіологічний розчин дозою 0,1 см³, друга група - 0,1 см³ «Тіометалоглобуліну» підшкірно через добу, третя - 0,5 см³/кг маси тіла «Тіометалоглобуліну» перорально через добу, четверта - «Біотам» перорально щоденно дозою 2 мг на тварину. Для контролю порівнювали групи тварин, що утримувалися окремо на стандартному раціоні для лабораторних тварин та таких, що утримувалися на раціоні з прогірклим жиром.

На четвертому етапі вивчено імуномоделюючі властивості препаратів за вакцинації та використання їх у господарстві (табл. 1). В усіх дослідах препарати застосовували в об'ємах, визначених відповідно до вікових та вагових особливостей тварин згідно з інструкцією фірми-виробника. Дослідження протианемічних та імуномоделюючих властивостей препаратів «Тіометалоглобулін» і «Біотам» проводилися на 59 поросятах великої білої породи. З метою контролю застосовували протианемічний препарат «Ферроглюкін», який уводили парентерально з розрахунку 1,5 см³ на тварину згідно з інструкцією до застосування. «Біотам» уводили перорально протягом усього дослідного періоду дозою 20 мг/кг ваги тіла. Починаючи з 2-4_ї діб життя поросят, вивчали вплив «Тіометалоглобуліну» за умови перорального введення дозою 1,0 см³/кг маси тіла через добу (тобто дворазово по 0,5 см³/кг), а на 35_ту добу парентерально (внутрішньом'язово) дозою 0,5 см³/кг маси тіла сумісно з плановою вакцинацією одноразово.

Таблиця 1. Схема проведення дослідів на тваринах

Забір крові для клініко-біохімічного аналізу проводили на 15_ту, 35_ту та 50_ту доби шляхом пункції передньої порожнистої вени з дотриманням вимог «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Активність супероксиддисмутази визначали за С. Чевари у співавт. (1991), каталази - за М. А. Королюком у співавт. (1988), вміст дієнових кон'югатів - за М. Д. Стальною (1977), малонового діальдегіду - за H. Ohkawa (1979), глутатіону - за Ц. М. Штурман (1979). Антиокислювальну активність (АОА) плазми крові з'ясовували за Г. І. Клебановим (1988), перекисну резистентність еритроцитів (ПРЕ) - за методом F. C. Jager (1968). Гематологічні та біохімічні показники у плазмі крові визначали, використовуючи набори реактивів фірми «Філісіт-Діагностика» (Україна). Класифікацію імуноглобулінів G та М у плазмі крові здійснювали методом радіальної імунодифузії за G. Manchini (1968), активність лізоциму - турбідиметричним методом за Перрі в модифікації Х. Я. Гранта у співавт. (1968).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Уплив препарату «Тіометалоглобулін» на біохімічні показники організму щурів за умов різних способів уведення. Під час активізації обмінних процесів та при переході на інший вид корму у тварин у ранньому постнатальному онтогенезі спостерігається зменшення вмісту гемоглобіну в крові (Kontoghiorghes G.J., 2005). У тварин піддослідних груп концентрація гемоглобіну наприкінці досліду була на 30 % вищою та становила, за умови перорального введення, 130,63 ± 3,25 г/дм³ (р < 0,05), а парентерального - 128,26 ± 3,4 г/дм³ (р < 0,05). Кількість еритроцитів у піддослідних тварин підвищувалася на третю добу, якщо «Тіометалоглобулін» уводили перорально, що свідчить про стимуляцію еритропоезу. Кольоровий показник у тварин контрольної групи, як і середній вміст гемоглобіну в еритроциті, поступово зменшувався (р < 0,05). У тварин піддослідних груп ці показники залишалися на більш високому рівні. Виявлені при застосуванні «Тіометалоглобуліну» ефекти засвідчують протианемічні властивості препарату.

Відомо, що різні структурні зміни еритроцитів відбиваються на властивостях їх клітинної мембрани, й значною мірою визначають стійкість мембран до різного виду гемолізу клітини (Luu H.C., 2001). З віком стійкість мембран еритроцитів збільшується, та цей процес відбувається досить повільно (Чумаченко В.В., 2007). Після застосування «Тіометалоглобуліну» на третю добу спостерігалася тенденція до стабілізації стійкості мембран еритроцитів щодо дії перекисів до 24,62 % гемолізу (пероральне введення) та до 24,08 % (парентеральне введення). На 21_шу добу, коли «Тіометалоглобулін» уводився перорально, перекисна резистентність еритроцитів становила 16,32 %, тобто знизилася порівняно з початком досліду на 42 %, а якщо препарат уводився парентерально - до 15,7 %, тобто - на 44,2 % від початку досліду, на відміну від контрольних груп, де ПРЕ зменшилася на 20,5 % порівняно з початком досліду (p < 0,05) та становила 22,2 % гемолізу. Таким чином, «Тіометалоглобулін» за умови різних прийомів уведення характеризується стабілізуючим впливом на структурні компоненти мембран відносно дії ендогенних перекисів. Отримані результати доводять, що використання «Тіометалоглобуліну» як імуностимулятора та донора мікроелементів позитивно впливає на процеси перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) у тварин (табл. 2).

У плазмі крові піддослідних тварин виявили зменшення кінцевих продуктів ПОЛ: малонового діальдегіду (МДА) та дієнових кон'югатів (ДК). У тварин контрольної групи спостерігали незначне підвищення МДА до 3,43 нМ/см³ у плазмі та значне нагромадження дієнових кон'югатів до 24,13 мкМ/ см³ плазми на 21_шу добу.

Таблиця 2. Показники перекисного окиснення ліпідів (М ± m, n = 6)

Примітка.* - вірогідно при р < 0,05 відносно контролю.

Показники ДК у 2 рази вищі, ніж у тварин піддослідних груп: 12,34±3,12 мкМ/см³ плазми, якщо препарат подавався перорально, і 13,17±2,32 мкМ/см³ плазми за умови, що «Тіометалоглобулін» уводився парентерально. На початку досліду цей показник був у межах 8,33±0,60 мкМ/см³ плазми.

Дослідженнями вмісту Феруму у органах щурів установлено, що його концентрація в печінці щурів контрольної групи постійно збільшувалася: на 10_ту добу в 1,35 рази та на 21_шу добу збільшилася у 2,24 рази від початку експерименту. У тварин першої піддослідної групи концентрація Феруму в печінці зростала поступово -- на 24,8 % на 10_ту добу та на 58,5 % на 21_шу, що достоту менше, ніж у тварин контрольної і другої піддослідної груп. За умови перорального застосування препарату вміст Феруму в нирках тварин першої групи на 10_ту добу підвищився на 57,5 % і знизився на 21_шу добу на 15 %, досягнувши показників контрольних груп тварин. У щурів другої піддослідної групи на 10_ту добу відзначалося зменшення концентрації Феруму в нирках порівняно з контрольною та першою піддослідною групою з подальшим її підвищенням до рівня на початку експерименту. Таким чином, “Тіометалоглобулін” підвищував уміст Феруму в плазмі крові та насичення трансферином, як на рівні формених елементів крові, так і на тканинному рівні.

Уплив комплексних мікроелементних композицій «Тіометалоглобулін» і «Біотам» на біохімічні показники білих щурів за умови годівлі кормами з високим вмістом прогірклого жиру. Перекиси, що утворюються під час прогіркання кормів, призводять до руйнації вітамінів та незамінних жирних кислот, погіршують харчову поживність корму (Свеженцов А.И., 2004).

Результати визначення перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) свідчать про те, що великий вміст рослинного жиру з високим перекисним та кислотним числами в раціоні викликають різнопланові порушення стійкості мембран еритроцитів до дії перекисів на тлі змін цього показника у тварин контрольної групи з 27,93 ± 1,85 % на початку досліду до 22,2 ± 1,6 % гемолізу наприкінці. У піддослідних тварин, яким уводили «Тіометалоглобулін», протягом 21 доби спостерігалася тенденція до стабілізації спонтанного гемолізу, а у тварин першої піддослідної групи зафіксовано зниження ПРЕ в 1,7 рази (табл. 3). За результатами досліджень установлено, що рівень активності супероксиддисмутази у тварин групи контролю та щурів, які отримували «Біотам» щоденно, залишився на рівні початку експерименту, а у тварин інших груп - збільшився в 1,5 рази.

Тварини першої піддослідної групи мали тенденцію до зниження рівня відновленого глутатіону в тканинах печінки (у 5 разів відносно контролю). Можливо, це пов'язано з активною витратою глутатіону в процесах антиокисного захисту, тому що відновлена форма глутатіону відіграє важливу роль у детоксикації різних токсинів у організмі (Дубініна Е.Е., 1983).

Таблиця 3. Показники перекисного окиснення в крові щурів (M ± m, n = 12)

Примітка. * - вірогідно при р < 0,05 відносно початкових значень.

Разом з тим, виявлено зниження глутатіону за умови оксигенного стресу у тварин інших піддослідних груп (табл. 4), що пояснюється незворотним використанням усіх форм глутатіону в реакціях кон'югації, каталізованих глутатіонтрансферазою (Herrington L.J., 1995).

Таблиця 4. Вміст відновленого глутатіону в органах щурів, мг% (М ± m, n = 12)

Примітка. *- вірогідно при р ? 0,05 відносно контролю.

Оскільки глутатіон є основним компонентом окислювально-відновної буферної системи клітини, зниження його рівня впливає на тіол-сульфідний статус структурних і розчинних білків (Оберлис Д., 2002).

Так, у стегновому м'язі щурів першої групи виявлено зниження рівня глутатіону в 1,3 рази, тоді як у тварин, які отримували досліджувані препарати, його концентрація була відповідно у 2,1, 1,5 і 2,3 рази меншою в другій, третій та четвертій групах відносно контрольної.

Значне зниження рівня глутатіону встановлено в мозку тварин першої групи, тоді як у щурів, які отримували «Тіометалоглобулін» парентерально, вміст глутатіону збільшився у 2 рази, а за умови застосування «Біотаму» зменшився в 1,25 рази, але рівень був вищим на 25 %, ніж у тварин першої групи.

Під час дослідження вмісту продуктів ПОЛ у тканинах органів щурів виявлено такі особливості: вміст МДА у стегновому м'язі щурів першої групи був достоту вищий у 4,3 рази (вільне ПОЛ) порівняно з контрольною, така ж тенденція спостерігалася й у тварин другої групи - у 4,1 рази при вільному й у 3,9 рази при Ферум-індукованому ПОЛ. За умови перорального уведення «Тіометалоглобуліну» та «Біотаму» встановлено незначне підвищення вмісту продуктів ПОЛ у цій тканині порівняно з контрольною (табл. 5). Оскільки мозок містить високу частку ліпідів, дослідження процесів ПОЛ особливо важливе в структурах мозку. Наприклад, вживання щурами корму з високим вмістом окисленого жиру сприяло підвищенню нагромадження кінцевих продуктів пероксидного окиснення у мозку у 2,7 рази у тварин першої групи порівняно з контрольною. Найбільш стабілізуючий ефект щодо процесів ПОЛ у мозку виявлено за умови перорального вживання щурами «Тіометалоглобуліну». Тканини печінки виявили найбільш високі властивості детоксикації щодо продуктів ПОЛ. Відзначення підвищення накопичення МДА у тканинах печінки в 1,5 рази у тварин першої групи та в 1,75 рази - у тварин інших піддослідних груп (табл. 5).

Таблиця 5. Рівень малонового діальдегіду в тканинах білих щурів (М ± m, n = 12)

Примітка.* - вірогідно при р ? 0,05 відносно контролю.

Отримані результати збігаються з даними, наведеними в наукових джерелах, про те що мікроелементновмісні препарати можуть певною мірою коригувати обмін речовин і власне процеси перекисного окиснення, навіть за умови штучно викликаного оксидативного стресу. У результаті надмірного утворення продуктів ПОЛ, відбувається ушкодження компартменталізації внутрішньоклітинних процесів, вихід лізосомальних кислих нуклеаз і протеаз, зрушення основних клітинних структур і загибель клітин. Тому інтенсифікація процесів ПОЛ, зазвичай, визначає деструкцію мембран клітин, у тому числі - гепатоцитів (Mertz W., 1996).

Уплив комплексних мікроелементних композицій «Тіометалоглобулін» і «Біотам» на загальну резистентність поросят. За умови застосування комплексних мікроелементних композицій рівень гемоглобіну в поросят першої піддослідної групи був вищим на 18 % порівняно з контрольною (р<0,05), а другої - на 14,7 % на 15_ту добу життя (р<0,05). Після вакцинації (50_та доба досліду) рівень гемоглобіну в поросят, які отримували імуномодулятори був також достоту вищим, ніж у поросят контрольної групи _ на 14,7 і 14,5 % відповідно.

У результаті проведеного дослідження встановлено, що після планової вакцинації ПРЕ у тварин контрольної групи була на 18 % вищою, ніж у тварин піддослідних груп, і на 31,6 % вищою від попереднього забору крові, що також підтверджує гіпотезу про стабілізуючий уплив комплексних мікроелементних композицій на мембрани еритроцитів (Бузлама В.С., 1997; Веред П.І., 2006).

Уведення комплексного препарату «Тіометалоглобулін» на основі імуноглобулінів супроводжувалося стабілізуючим ефектом на організм поросят протягом експерименту. На 50-ту добу експерименту рівень Ig G у тварин першої піддослідної групи був на 25,3 і 35,2 % вищим, ніж у тварин другої піддослідної та контрольної груп відповідно (табл. 6).

Таблиця 6. Рівень імуноглобулінів плазми крові поросят за умов використання комплексних мікроелементних композицій (M ± m, n = 6)