Вплив антропогенно навантаженого атмосферного повітря на цинкметаболізуючі клітини людини і тварин

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

ВПЛИВ АНТРОПОГЕННО ЗАБРУДНЕНОГО АТМОСФЕРНОГО ПОВІТРЯ НА ЦИНКМЕТАБОЛІЗУЮЧІ КЛІТИНИ ЛЮДИНИ І ТВАРИН

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВАЖНЕНКО ОЛЕКСАНДРА ВОЛОДИМИРІВНА

Львів - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Запорізькому національному університеті Міністерства освіти і науки України.

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор Бовт Валентина Дем'янівна, Запорізький національний університет, завідувач кафедри прикладної екології та зоології;

доктор біологічних наук, професор Антоняк Галина Леонідівна, Львівський національний університет імені Івана Франка, професор кафедри конструктивної географії і картографії.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, член-кореспондент УААН Федорук Ростислав Степанович, завідувач лабораторії екологічної фізіології та якості продукції Інституту біології тварин УААН;

доктор біологічних наук, професор Столяр Оксана Борисівна, професор кафедри хімії Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України, науковий керівник науково-дослідної лабораторії порівняльної біохімії і молекулярної біології.

Захист дисертації відбудеться “07” вересня 2010 р. о 15 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 по захисту дисертацій в Львівському національному університеті імені Івана Франка МОН України за адресою: 79000, м. Львів, вул. Грушевського, 4, ауд. 333.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка МОН України за адресою: 79601, м. Львів, вул. Драгоманова, 5.

Автореферат розісланий “09” липня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Манько В. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Якість атмосферного повітря - це один з пріоритетних чинників, що визначають стан здоров'я людини, особливо в індустріально-урбанізованих регіонах (Cидоренко Г. И., 1999; Павлов С. Б. 2005; Шкуро В. В., 2005; Рахманин Ю. А. и др., 2006). Рівень забруднення атмосфери викидами промислових підприємств часто корелює з демографічними показниками, а наявність шкідливих речовин у високих концентраціях може відігравати провідну роль в етіології деяких захворювань населення (Музичук Н. Т., 2000; Єжова О. О. та ін., 2003; Гоц Т. Ю., 2004; Лихолат О. А., 2005; Батлук В. А. та ін., 2008). Попри те, що вивченню впливу атмосферних забруднень на здоров'я мешканців України присвячена низка експериментальних праць (Киреева И. С. и др., 1997; Савіна О. Л., 2003; Мухин В. В. и др., 2003;), проблеми ранніх функціональних порушень в організмі мешканців м. Запоріжжя та інших індустріальних центрів не з'ясовані. Тому важливим є пошук біологічних індикаторів метаболічних змін, що відбуваються на клітинному рівні під впливом шкідливих речовин, які надходять до організму з атмосферним повітрям.

Реакція організму на несприятливі чинники середовища охоплює комплекс адаптаційних реакцій, відомий під назвою НАСКС (неспецифічний адаптаційний синдром клітинної системи) (Браун А. Д., 1987). Однак роль біометалів у механізмах адаптаційного синдрому вивчена мало. Особливо це стосується цинку - ессенціального мікроелемента, потрібного для багатьох життєво важливих процесів (синтез і стабілізація нуклеїнових кислот і білків, контроль експресії генів, проліферація та диференціювання клітин, енергетичний обмін, імунний та антиоксидантний захист, підтримання інтегральної структури та функцій біомембран) (Valleе B. L., Falchuk K. H., 1993; Valleе B. L., Auld D. S., 1995; Єщенко Ю. В., 2004). Проблема ролі цинку в механізмах НАСКС постає на підставі відомостей щодо потреби цього металу для біологічної активності понад 200 білків (серед яких ферменти, фактори транскрипції, структурні білки). Через це внутрішньоклітинний вміст цинку та його зміни під впливом токсикантів, які надходять до організму в складі повітря, що вдихається, може бути інформативним показником стану клітинного метаболізму та порушень, викликаних екзогенними полютантами. Водночас виявлення динаміки цього біометалу в клітинах відкриває шлях до розробки способів попередження хворобливих станів та їхньої корекції препаратами цинку.

Особливе значення в таких дослідженнях мають клітини, здатні акумулювати цинк у високих концентраціях. До таких клітин належать нейтрофільні гранулоцити крові, ?-клітини острівців Лангерганса підшлункової залози, клітини гіпокампу, базальних відділів кишкових крипт (клітини Панета) і кінцевих відділів передміхурової залози (Prasad A. S., 1982; Гольдберг Е. Д. и др., 1993; Бовт В. Д. та ін., 2001; Єщенко Ю. В., 2004).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано відповідно до основного плану науково-дослідної роботи Запорізького національного університету, біологічного факультету, кафедри фізіології людини і тварин з курсом ЦО, вона є фрагментом держбюджетних тем № 14/03 “Стрес і клітинний метаболізм металів” (№ держреєстрації 0103У000723) та № 6/06 “Розробка та обґрунтування методів оцінки функціонального стану клітин за допомогою хелантів-хромофорів” (№ держ-реєстрації 01069008392).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було на підставі аналізу екологічного стану окремих районів м. Запоріжжя та експериментальних моделей дослідити вплив техногенного навантаження атмосферного повітря, як стресового чинника, на процес акумуляції цинку в клітинах, здатних активно нагромаджувати і метаболізувати цей елемент в організмі людини і тварин; проаналізувати вплив вдихання антропогенно забрудненого повітря на внутрішньоклітинний баланс цинку і міді та з'ясувати змогу корекції порушень метаболізму застосуванням цинквмісних препаратів.

Щоб досягнути поставленої мети, треба було вирішити такі завдання:

1. Здійснити комплексну оцінку екологічного стану атмосферного повітря окремих районів м. Запоріжжя застосуванням інтегральних показників забруднення та окремих видів токсичної дії забруднювальних речовин.

2. Дослідити динаміку акумуляції цинку, асоціацію Zn2+ з білками в складі секреторного матеріалу гранул і зв'язок між вмістом катіонів цинку та міді в нейтрофільних гранулоцитах людей, що проживають у районах з різним рівнем техногенного забруднення атмосфери.

3. Дослідити процес акумуляції цинку та міді в нейтрофільних гранулоцитах та інших клітинах, здатних активно нагромаджувати й метаболізувати Zn2+ (?-інсулоцити панкреатичних острівців, клітини гіпокампу, базальних відділів кишкових крипт та кінцевих відділів передміхурової залози) в організмі піддослідних тварин за умов впливу антропогенного забруднення атмосферного повітря та дії стресових чинників.

4. З'ясувати змогу корекції порушень обміну цинку в клітинах мешканців м. Запоріжжя застосуванням цинквмісних препаратів.

5. Дослідити доцільність застосування цинквмісних препаратів з метою корекції порушень метаболізму біометалів (цинк, мідь) за умов впливу на організм стресових чинників.

Об'єкт дослідження: процеси акумуляції й метаболізму цинку в клітинах людини і тварин за умов впливу забрудненого атмосферного повітря індустріальних міст і стресових чинників та корекція порушень у цинкметаболізуючих клітинах.

Предмет дослідження: акумуляція цинку в клітинах, підтримання внутрішньоклітинного балансу цинк-купрум, включення цинку в секреторний матеріал клітин в організмі людей і тварин; механізми порушень у цинкметаболізуючих клітинах.

Методи досліджень: фізіологічні, цитологічні, хімічні, санітарно-гігієнічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше за умов великого індустріального центру - м. Запоріжжя встановлено вплив вдихання антропогенно забрудненого атмосферного повітря на процес акумуляції цинку в нейтрофільних гранулоцитах та функціональний стан клітин за рівнем включення Zn2+ до складу секреторного матеріалу. Вперше встановлено зменшення вмісту цинку та збільшення вмісту міді в нейтрофільних гранулоцитах людей, що проживають на території з високим рівнем забруднення атмосферного повітря. Вперше встановлено, що вдихання забрудненого повітря призводить до зменшення вмісту цинку та збільшення вмісту міді в нейтрофільних гранулоцитах, ?-інсулоцитах панкреатичних острівців, клітинах гіпокампу, базальних відділів кишкових крипт та кінцевих відділів передміхурової залози тварин. Уперше встановлено збільшення вмісту міді в цинкметаболізуючих клітинах за умов впливу на організм тварин забрудненого атмосферного повітря та стресових чинників (фізичне навантаження, іммобілізація, охолодження, перегрівання). Вперше обґрунтовано доцільність застосування показника вмісту цинку в клітинах як біологічного індикатора ранніх метаболічних змін в організмі, за впливу забрудненого атмосферного повітря та інших стресових чинників. Показано можливість корекції мікроелементного статусу клітин за допомогою препарату “Цинктерал” та цинку ацетату.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально доведено відповідність металохромних індикаторів (дитизон, 8-(n-толуолсульфоніламіно)-хінолін, дитиоксамід) для цитохімічного визначення внутрішньоклітинного розподілу катіонів цинку та купруму під час клінічних обстежень населення, що проживає в зоні впливу промислових об'єктів, для оцінки мікроелементного статусу клітин за різного фізіологічного стану організму. Аналітичне визначення вмісту мікроелемента в клітинах, здатних активно нагромаджувати та метаболізувати цинк, може слугувати діагностичним тестом під час вивчення впливу на організм різноманітних стресових і патогенних чинників. Результати, отримані із застосуванням препарату “Цинктерал” і цинку ацетату, доводять ефективність застосування сполук цинку для нормалізації вмісту цинку та міді в клітинах.

Основні результати роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрі фізіології людини та тварин з курсом ЦО ЗНУ при викладанні спецкурсу “екологічна фізіологія” для біологічних спеціальностей.

Результати дисертаціної роботи впроваджено в практику, що підтверджено Актами впровадження від 21.01.2009 в медичну практику Клінічної лікарні м. Запоріжжя № 3, від 30.01.2009 в практику підприємства ВАТ “Запорізький абразивний комбінат”.

Особистий внесок дисертанта. Автор дисертації самостійно здійснила аналіз літературних джерел, виконала експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написала та оформила всі розділи дисертації. Аналіз отриманих результатів та їхню інтерпретацію виконано спільно з науковими керівниками. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, автору належать опрацювання даних літератури та результати досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи обговорено на засіданнях кафедри, матеріали дисертації апробовано на 15 міжнародних та 3 Всеукраїнських конференціях і конгресах: ІІІ Міжнародна науково-практична конференція “Наука и образование без граница-2007” в м. Софія (Болгарія, 2007), ІІ-V Міжнародні науково-практичні конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2006-2009), ІІ Міжнародна конференція молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007), Міжнародна науково-практична конференція “Здорове довкілля-здорова нація” (Бердянськ, 2008), Міжнародна науково-практична конференція “Екологія: наука, освіта, природоохоронна діяльність” (Умань, 2007), Міжнародна конференція “Сучасні проблеми біології, екології та хімії” (Запоріжжя, 2007), V Міжнародна науково-методична конференція “Культура здоров'я як предмет освіти” (Херсон, 2006), Міжнародна науково-практична конференція “Наука та інновації-2005” (Дніпропетровськ, 2005) та інші.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 32 наукові праці, з яких 12 - статті у фахових наукових журналах, 20 - у збірниках наукових праць, збірниках матеріалів і тезах науково-практичних конференцій та конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота має такі розділи: вступ, огляд літературних джерел, матеріали та методи досліджень, результати аналіз та узагальнення результатів, висновки, список використаних джерел, що налічує 337 найменувань. Дисертація містить 17 таблиць, 18 рисунків. Загальний обсяг дисертаційної роботи - 168 сторінок.

кров атмосферний цинк секреторний

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Проаналізовано сучасні літературні дані щодо обміну та біологічної ролі цинку в організмі людини і тварин. Описано взаємозв'язок цинку і купруму на рівні клітинного метаболізму та наслідки порушення балансу цих мікроелементів. Описано стан атмосферного повітря в м. Запоріжжя - індустріальному центрі України.

Матеріали та методи дослідження. Для вирішення завдань роботи аналізували зразки змішаної капілярної крові мешканців м. Запоріжжя, отримані за лабораторних умов згідно зі стандартною методикою, та лейкоцити і клітини внутрішніх органів 99 нелінійних білих лабораторних мишей.

Частину роботи, скеровану на вивчення впливу антропогенно забрудненого атмосферного повітря на організм жителів м. Запоріжжя, виконували в клінічній лабораторії Запорізької міської лікарні № 3. Перед проведенням досліджень у всіх обстежених осіб отримано письмову згоду на участь в експерименті. У процесі дослідження вибрано 116 клінічно здорових добровольців, постійних мешканців Хортицького та Заводського районів м. Запоріжжя, з яких було сформовано контрольну і дві дослідні групи осіб. До складу кожної з груп входила приблизно однакова кількість чоловіків і жінок працездатного віку (25-40 років). У всіх учасників експерименту кількісний вміст клітинних компонентів крові, показники загального біохімічного аналізу крові та сечі знаходились у межах фізіологічної норми.

До групи осіб, яких вважали за контроль, входили 42 мешканці екологічно безпечного Хортицького району м. Запоріжжя, які проживають на великій віддалі від промислових підприємств та дихають повітрям, у якому вміст забруднювальних інгредієнтів не перевищував допустимих концентрацій. Групи Д1 і Д2 сформували з 74 постійних мешканців Заводського району, де загальний рівень забруднення повітря техногенними домішками досягав найбільших значень, а вміст окремих полютантів у деяких випадках багатократно перевищував встановлені нормативи. До групи Д1 входило 39 осіб, які постійно проживають на території Заводського району і не мають жодних клінічних ознак будь-яких захворювань. До групи Д2 входило 35 здорових мешканців Заводського району, які приймали препарат “Цинктерал” (виробництва АТ ТЕВА КУТНО, Польща) одна таблетка якого містить 124 мг сульфату цинку (еквівалентно 45 мг йону цинку), відповідно до інструкції за схемою: по 1 таблетці двічі на добу впродовж 30-добового періоду.

Дослідження з використанням тварин проводили за вимогами ст. 26 Закону України “Про захист тварин від жорстокого поводження”, “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1986) і принципів біоетики. Використовуючи білих мишей, проведено модельні експерименти:

1. Створення умов вдихання техногенно забрудненого атмосферного повітря утримуванням тварин на території одного з виробничих цехів заводу “Запоріжсталь” упродовж 30 діб;

2. Моделювання різних видів стресу (фізичне навантаження, іммобілізація, охолодження та перегрівання) в організмі піддослідних тварин.

У дослідженнях впливу вдихання забрудненого атмосферного повітря на нейтрофільні гранулоцити та клітини внутрішніх органів використано 45 мишей, які поділили на групи: контрольну (К, 20 тварин) і дві дослідні (Д1, Д2). Тварин групи Д1 (14 особин) впродовж 30 діб утримували на території ВАТ “Запоріжсталь”. Тварини групи Д2 (11 особин) перебували в тих самих умовах, але щодоби через зонд отримували цинку ацетат (10 мг/кг). Мишей контрольної групи утримували 30 діб у приміщенні віварію Запорізького національного університету. З цієї групи 8 тварин щодоби отримували через зонд 0,5 мл фізіологічного розчину впродовж 30 діб, а 12 мишей були інтактними. До складу кожної з груп входила приблизно однакова кількість самок і самців.

Стресові стани в організмі тварин моделювали тривалим впливом екстремальних чинників: фізичне навантаження (група Д3), іммобілізація (група Д4), переохолодження (група Д5) та перегрівання (група Д6). Групи Д3, Д4, Д5 і Д6 налічували, відповідно, 14, 15, 12 і 13 особин.

Стрес, зумовлений фізичним навантаженням, створювали, поміщаючи мишей в акваріум з температурою води 32 ?С, де вони плавали впродовж 1 год. Іммобілізаційний стрес створювали прив'язуванням мишей м'якими пов'язками до станку в положенні на спині на 6 год. Стрес, зумовлений охолодженням, створювали, поміщаючи мишей на півгодини у ванну з водою (t = 21 ?С), а перегріванням - у гарячу ванну (t = 40 ?С). Кожну процедуру повторювали щоденно впродовж 10 діб.

Після закінчення експериментів у тварин дослідних і контрольних груп отримували кров із хвостової вени та приготовляли мазки за стандартною методикою. Евтаназію мишей проводили декапітацією під легким ефірним наркозом та відбирали внутрішні органи (підшлункова залоза, головний мозок, тонка кишка, передміхурова залоза), поміщаючи їх на лід. Препарування органів і виділення клітин для досліджень проводили в холодній кімнаті (t = 4 ?С). Процедури отримання експериментального матеріалу займали не більше 4-х годин.

Вміст цинку в клітинах загалом та в складі білків секреторних гранул визначали цитохімічними методами за допомогою високочутливих металохромних індикаторів дитизону (дифенілтіокарбазон) та 8-(n-толуолсульфоніламіно)-хіноліну (8-ТСХ), які рекомендовані для цитохімічного визначення цього елемента (Ещенко В. А., 1978; Гольдберг Е. Д. та ін., 1993). Використання зазначених реагентів ґрунтується на їхній здатності специфічно утворювати комплекси з катіонами Zn2+, вилучаючи цей елемент із клітинних біомолекул, що містять цинк (Иванчев Г. 1961; Торопцев И. В., 1975). На препаратах, забарвлених дитизоном, у цитоплазмі нейтрофільних гранулоцитів виявлялись червоні гранули - показник вмісту цинку в клітинах. Мазки крові та парафінові зрізи тканин піддослідних тварин, оброблені 8-ТСХ за методикою (Ещенко В. А., 1978), розглядали під люмінесцентним мікроскопом. На препаратах, флуорохромованих за допомогою 8-ТСХ, у цитоплазмі клітин виявлялися гранули, які люмінесціювали жовто-зеленим світлом.

Оскільки цинк бере участь у процесах формування секреторних гранул, де цей елемент міститься у комплексах з білками, проводили дослідження секреторного матеріалу в клітинах, який визначали за допомогою гранулярних барвників метилового зеленого та еозину (МЗЕ) та альдегідфуксину (АФ). Метод виявлення специфічної зернистості нейтрофільних гранулоцитів комплексним фарбуванням мазків крові МЗЕ розроблений у лабораторії кафедри фізіології людини і тварин з курсом ЦО ЗНУ (Пат. 30460). На забарвлених препаратах у цитоплазмі нейтрофілів виявляли фіолетові гранули - показник вмісту секреторного матеріалу. Кількість гранул свідчить про функціональний стан нейтрофілів. Досліджуючи вміст секреторного метеріалу (інсуліну) за допомогою реакції з альдегідфуксином на препаратах у цитоплазмі ?-клітин панкреатичних острівців, визначали синьо-фіолетову зернистість - показник вмісту інсуліну.

Вміст катіонів купруму в клітинах визначали за допомогою дитиоксаміду (ДТО). Медод розроблений працівниками кафедри фізіології людини і тварин з курсом ЦО ЗНУ (Пат. 23158). Препарати розглядали під світловим мікроскопом. Мідь визначали в цитоплазмі гранулоцитів крові за темно-зеленим забарвленням гранул.

Оцінка цитохімічних реакцій. Інтенсивність цитохімічних реакцій оцінювали напівкількісним методом, який полягає у визначенні інтенсивності реакції за трибальною системою (Соколовський В. В. 1971; Hayhoe F., Quaglino D., 1983). На підставі підрахунку 100 клітин обчислювали середню величину інтенсивності реакції. Водночас використовували кількісний метод, який полягав у підрахунку кількості гранул з розрахунку на одну клітину.

Статистичне опрацювання результатів проводили з використанням програмного пакету Statistc Soft 6,0 з використанням критерію Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Еколого-гігієнічна та комплексна оцінка забруднення атмосферного повітря викидами підприємств адміністративних районів м. Запоріжжя. Запорізька область - це одна з областей, які формують основу індустріального потенціалу України. В області зосереджено всі основні галузі промисловості, до того ж більшість підприємств розташовані у м. Запоріжжі. Потужне промислове виробництво призводить до забруднення повітряного басейну міста. Серед промислових центрів Південного Сходу України м. Запоріжжя 2006 року зайняло третє місце за кількістю викидів забрудників в атмосферу. Тому необхідним початковим етапом роботи було здійснити еколого-гігієнічний аналіз повітряного басейну м. Запоріжжя по районах і за даними п'ятирічного екологічного моніторингу (2002-2006) визначити найбільше і найменше забруднені райони міста. Цей етап роботи виконано за участю СЕС та ЗОЦГМ у рамках наукової співпраці. Крім того, проаналізовано дані, надані Головним управлінням статистики та Держуправлінням ОНПС в Запорізькій області, та звіти окремих промислових підприємств.

Результати аналізу свідчать, що найбільше навантажений забрудниками техногенного походження Заводський район, де обсяг викидів становить понад 124 тис. т (83 % від загальноміського рівня). У цьому ж районі зафіксовано найбільше перевищень ГДК забруднювальних речовин у повітрі. Найменше підприємств розміщено у Хортицькому районі і в цьому ж районі відзначено найменший рівень забруднення повітряного басейну. Впродовж усього періоду досліджень рівень техногенного навантаження атмосферного повітря в Заводському районі був у десятки разів більший, ніж у Хортицькому.

Оцінюючи сумарні показники шкідливої дії всіх забруднювальних речовин підприємств м. Запоріжжя відносно його площі, встановлено, що на кожну одиницю території міста 66,5 % токсичної дії викидів припадає на підприємства саме Заводського району, а Хортицького району - менш ніж 1 %. Така сама тенденція простежується і під час дослідження специфічних впливів. Отже, в Заводському районі створилась ситуація надзвичайно підвищеної небезпечності стану навколишнього середовища, тоді як Хортицький район - найбільше екологічно безпечний у межах м. Запоріжжя. Саме ці райони були обрані для подальшого вивчення метаболізму цинку в організмі їх мешканців.

Вплив техногенного навантаження атмосферного повітря на вміст цинку та секреторного матеріалу в нейтрофільних гранулоцитах крові людей. Функціональний стан клітин залежить від наявності в них цинку, що міститься у складі молекул життєво необхідних білків. На думку деяких дослідників (Prasad A. S., 1982), вміст цинку в нейтрофільних гранулоцитах крові людини і тварин віддзеркалює статус цього мікроелемента в інших клітинах і в організмі загалом. Через це важливим завданням роботи було з'ясувати вплив вдихання навантаженого техногенними забрудниками повітря на процеси акумуляції цинку в нейтрофільних гранулоцитах людей.

Одержані дані свідчать, що порівняно з особами контрольної групи, інтенсивність реакції з дитизоном на наявність цинку в лейкоцитах людей, які зазнавали впливу техногенно навантаженого повітря, вірогідно знижується (на 30,8 %, P < 0,001). У нейтрофілах осіб групи Д2 досліджуваний показник близький до контрольних значень. Аналіз результатів, отриманих у групах Д1 і Д2, свідчить про те, що в осіб, які отримували цинквмісний препарат “Цинктерал”, інтенсивність реакції підвищилась на 22,2 % порівняно з особами групи Д1 (P < 0,05).

Підрахунок цинквмісних гранул у нейтрофільних гранулоцитах свідчить про значно меншу їхню кількість у клітинах осіб, що проживають у Заводському районі, ніж у мешканців Хортицького району. У лейкоцитах людей групи Д2 показник гранулоутворення більший на 9,8 % порівняно з клітинами осіб, що не отримували цинквмісного препарату.

Іншим високоселективним реагентом на наявність цинку є 8-ТСХ, який, зв'язуючись з катіонами цинку, утворює люмінесціюючий жовто-зелений комплекс. У переважній більшості клітин осіб контрольної групи відзначалась висока інтенсивність люмінесценції. У клітинах мешканців Заводського району інтенсивність реакції на 30 % нижча (P < 0,01). У клітинах осіб групи Д2 інтенсивність реакції вірогідно більша, ніж у групі Д1.

Подібна динаміка спостерігається також і щодо кількості гранул у нейтрофільних гранулоцитах досліджуваних груп людей.

Звертає на себе увагу той факт, що кількість гранул, визначена за допомогою дитизону і 8-ТСХ, майже не відрізняється у всіх обстежених осіб. Обидва типи зернистості мають подібну локалізацію в клітинах. Усе це дає змогу говорити про роль цинку в процесах формування секреторних гранул, де цей елемент міститься у комплексах з білками.

Для з'ясування вмісту цинку в секреторному матеріалі проаналізовано вміст гранул нейтрофільних лейкоцитів мешканців досліджуваних районів м. Запоріжжя за допомогою фарбування методом МЗЕ.

Як видно з наведених результатів, у осіб контрольної групи більшість клітин інтенсивно забарвлювалась, а в групі Д1 інтенсивність реакції була меншою майже наполовину (40 %, P < 0,001). В осіб групи Д2, які, зазнаючи негативного впливу забрудненого повітря, отримували добавку цинку, інтенсивність реакції була меншою від контролю на 20 % (P < 0,05), але порівняно з групою Д1 - вірогідно вищою.

Підрахунок кількості гранул показав, що в мешканців Заводського району цей показник був нижчий від контролю на 32 % (P < 0,001), а в тих, що отримували препарат “Цинктерал” - лише на 12 % (P < 0,05). Це означає, що вживання добавки цинку призводить до вірогідного збільшення кількості гранул у нейтрофільних гранулоцитах та підвищення вмісту в них цього мікроелемента.

Під час аналізу даних привертає увагу однотипність динаміки концентрації катіонів цинку та цинквмісного секреторного матеріалу в нейтрофільних гранулоцитах крові людей, розвиток дефіциту цих клітинних компонентів у випадку вдихання забрудненого техногенними викидами атмосферного повітря та збільшення значень досліджуваних показників за умов вживання аліментарної добавки цинку. Коефіцієнт кореляції r між вибірками показників інтенсивності МЗЕ- та дитизонової реакцій у всіх випадках вищий від 0,5. На підставі встановленої закономірності можна підтвердити, що цинк знаходиться в нейтрофільних гранулоцитах крові у складі секреторного матеріалу. Що до цинквмісних білків секреторних гранул лейкоцитів, то до них, зокрема, належать деякі протеолітичні ферменти, які, як відомо, відіграють життєво важливу роль у функціональній активності цих клітин (Valleе B.L., Falchuk K.H., 1993).

Вплив техногенного навантаження атмосферного повітря на вміст міді в нейтрофільних гранулоцитах крові людей. З літературних джерел відомо, що в організмі та клітинах існують певні співвідношення між вмістом катіонів цинку і купруму (Авцын А. П. и др., 1991; Скальний А. В., 2004). Надходження в організм різноманітних ксенобіотиків у складі атмосферного повітря може спричиняти дисбаланс між цими елементами, що, в свою чергу, пов'язане з можливими метаболічними змінами та порушеннями у стані здоров'я людей, які проживають на забруднених територіях. Наші дослідження були скеровані на з'ясування вмісту катіонів купруму в нейтрофільних гранулоцитах крові мешканців Заводського та Хортицького районів міста Запоріжжя.

Як видно з представлених результатів, у осіб контрольної групи інтенсивність цитохімічної реакції з ДТО в нейтрофільних гранулоцитах менша, ніж у клітинах осіб дослідних груп. Зокрема, в клітинах осіб групи Д1 інтенсивність реакції збільшується на 60 % (P < 0,001). Отримані дані вказують на обернено пропорційну залежність між вмістом у клітинах катіонів цинку і купруму та підтверджують наявність своєрідного „антагонізму” між цими елементами на рівні трансмембранного транспорту та внутрішньоклітинної акумуляції (Скальний А. В., 2004). Вірогідно, що зумовлена зовнішніми чинниками нестача цинку в організмі призводить до посиленого нагромадження міді в клітинах, а це, у свою чергу, може поглиблювати порушення, зумовлені дефіцитом цинку.

Водночас показник інтенсивності реакції в групі Д2 значно менший, ніж у осіб групи Д1, але вірогідно перевищує показник, притаманний особам контрольної групи на 20 % (P < 0,05). Отже, вживання цинквмісного препарату не призводить до повної нормалізації вмісту міді в нейтрофільних гранулоцитах крові, але значно знижує вміст цього мікроелемента в клітинах осіб, що зазнають впливу забрудненого атмосферного повітря.

Показники інтенсивності цитохімічних реакцій із застосуванням металохромних реагентів (дитизон, 8-ТСХ), комбінованого фарбування метиловим зеленим та еозином та дитиоксамідом у загальному вигляді подано в табл. 1. Аналізуючи дані, можна стверджувати про вміст цинку, секреторного матеріалу та міді в гранулоцитах крові жителів м. Запоріжжя за умов проживання в екологічно безпечному районі та в районі, де повітряне середовище забруднене техногенними викидами, а також про вплив на ці показники аліментарної добавки цинку в складі препарату “Цинктерал”. Має місце поступове зниження вмісту цинку та секреторного матеріалу в гранулоцитах крові людей, які зазнають впливу забрудненого атмосферного повітря, в той час як вміст міді під впливом несприятливого екологічного чинника підвищується. різноспрямованість установлених змін за умов впливу на організм забруднень атмосферного повітря (який можна віднести до стресових чинників) підтверджує положення щодо антагоністичного зв'язку між катіонами цинку та купруму в організмі.

Результати досліджень динаміки цинку в клітинах людей після призначення цинквмісного препарату неоднозначні та, вірогідно, залежать від застосованої методики аналізу. Так, дані, отримані із застосуванням дитизону, свідчать про нормалізацію вмісту цинку в нейтрофільних гранулоцитах людей, які, проживаючи в антропогенно забрудненому районі, приймали добавку мікроелемента в складі фармакологічного препарату “Цинктерал”.

Таблиця Вміст цинку, секреторного матеріалу та міді в нейтрофільних гранулоцитах крові людей

Примітка: *- Р < 0,05; **- Р < 0,01; ***- Р < 0,001 порівняно з контролем; # - Р < 0,05 порівняно з групою Д1

Водночас результати, отримані за допомогою 8-ТСХ та комбінованого фарбування зразків метиловим зеленим та еозином, вказують на те, що, попри відмінності в показниках порівняно з групою осіб, які не отримували добавки цинку, нормалізації цього елемента в клітинах крові людей не відбувається. Вірогідно, що призначенням аліментарної добавки цинку в складі препарату “Цинктерал” можна лише частково покращити статус цинку в клітинах, які метаболізують цей елемент в організмі людей, що зазнають негативного впливу. Водночас результати проведених досліджень становлять зацікавлення з погляду розробки способів корекції порушень обміну цинку в клітинах під впливом різноманітних патогенних чинників.

Вплив техногенно навантаженого атмосферного повітря на вміст цинку, міді та секреторного матеріалу в нейтрофільних гранулоцитах крові та клітинах внутрішніх органів тварин. Наступним етапом досліджень була постановка модельного експерименту з використанням піддослідних мишей, у якому вивчали вплив вдихання забрудненого атмосферного повітря на внутрішньоклітинний статус цинку не лише в нейтрофільних гранулоцитах, але і в інших цинк-акумулюючих клітинах.

Результати досліджень реакції з дитизоном свідчать, що напрямок змін у внутрішньоклітинному статусі цинку та інтенсивності гранулоутворення в лейкоцитах тварин, яких утримували на території ВАТ “Запоріжсталь” був таким самим, як і в мешканців Заводського району м. Запоріжжя. А саме: процеси акумуляції мікроелементу та утворення гранул пригнічувались за умов вдихання забрудненого повітря. Введення мишам групи Д2 розчину цинку ацетату сприяє нормалізації вмісту цього мікроелемента в лейкоцитах крові.

Аналогічні результати отримано і в дослідженні вмісту мікроелемента в складі секреторного матеріалу нейтрофілів тварин дослідних груп за допомогою МЗЕ-реакції.

Для підтвердження положення щодо можливого антагоністичного зв'язку між вмістом цинку та міді в клітинах проведені дослідження вмісту катіонів купруму в нейтрофільних гранулоцитах крові тих самих груп тварин. Отримані дані узгоджуються з результатами аналізу динаміки міді в клітинах мешканців Хортицького і Заводського районів м. Запоріжжя.

Відомо, що цинк інтенсивно акумулюють інсулін-синтезуючі клітини, в яких цей елемент відкладається у формі комплексів з молекулами інсуліну в секреторних гранулах. Для з'ясування впливу забрудників, що надходять до організму інгаляційним шляхом, на акумуляцію цинку в інсулоцитах і функціональну активність інсулярного апарату, досліджували вміст цинку та інсуліну за допомогою реакцій з 8-ТСХ і альдегідфуксином в ?-клітинах панкреатичних острівців мишей контрольної та дослідних груп.

Результати досліджень свідчать, що в клітинах тварин груп Д1 і Д2 вміст цинку в ?-клітинах зменшується, відповідно, на 26 % (P < 0,01) і 10,5 % (P > 0,05), а інсуліну - на 31 % (P < 0,01) і 8 % (P > 0,05), відповідно.

Отже, вдихання забрудненого атмосферного повітря призводить не лише до розвитку дефіциту цинку, а й до порушень синтезу та відкладання молекул інсуліну в ?-клітинах панкреатичних острівців піддослідних тварин. Установлений ефект, з одного боку, підтверджує положення про зв'язок між вмістом цинку та функціональним станом інсулярного апарату підшлункової залози, а з іншого - дає підставу розглядати зменшення внутрішньоклітинного вмісту цинку як одну з ланок механізмів пригнічення секреторної активності ?-інсулоцитів під впливом стресових чинників.

З метою повнішого аналізу зв'язку між рівнем акумуляції цинку та функціональним станом клітин за умов антропогенного забруднення середовища життя організму проведено дослідження й деяких інших клітин (нейрони гіпокампу, клітини Панета та передміхурової залози), здатних нагромаджувати та інтенсивно метаболізувати цей елемент. Установлено, що в усіх цих клітинах, різних за походженням і спеціалізованих за функціями, забрудники, які вдихаються з атмосферним повітрям, зумовлюють розвиток подібних ефектів - пригнічують процес внутрішньоклітинної акумуляції цинку. Пероральне введення тваринам цинкової добавки сприяє нормалізації вмісту мікроелемента в усіх перелічених клітинах.

Вплив стресових чинників на вміст цинку, міді та секреторного матеріалу в нейтрофільних гранулоцитах крові та клітинах внутрішніх органів тварин. З наукових джерел відомо, що тривалий вплив забрудненого атмосферного повітря на організм людини і тварин призводить до розвитку хронічного стресу, що супроводжується гормональною перебудовою та глибокими змінами обмінних процесів. Вірогідно, що ці ефекти пов'язані з періодичним надходженням до організму багатьох шкідливих речовин, які можуть виявляти і специфічний, і неспецифічний вплив на клітини. За таких умов адаптаційні реакції організму неможливі без відповідного забезпечення мікроелементами, а особливо, катіонами цинку, які входять до складу супероксиддисмутази - незамінного ферменту антиоксидантної системи. Вичерпання запасів цинку в клітинах може вказувати на напружений стан системи НАСКС в організмі та сигналізувати про створення передумов для розвитку патологічного стану.

Для експериментального обґрунтування цього положення ми провели дослідження динаміки вмісту цинку в клітинах під впливом інших чинників, що зумовлюють розвиток стресового стану в організмі. При цьому вивчали вплив тривалого фізичного навантаження, іммобілізації, охолодження та перегрівання на статус мікроелемента в цинкметаболізуючих клітинах внутрішніх органів і крові тварин. Водночас аналізували взаємозв'язок між вмістом цинку і купруму в зазначених клітинах за умов впливу на організм стресових чинників.

Результати досліджень вказують на те, що, попри фізіологічні особливості впливу досліджуваних чинників, всі вони призводять до зменшення вмісту цинку в нейтрофільних гранулоцитах крові. Судячи з отриманих даних, фізичне навантаження та перегрівання організму спричиняють найвиразніші зміни цього показника, тоді як переохолодження впливає на нього меншою мірою.

Водночас стресові чинники зумовлюють збільшення вмісту міді в клітинах, хоча виразної обернено пропорційної залежності між вмістом біометалів у цьому випадку не спостерігається. Наприклад, охолодження найбільше сприяє нагромадженню в клітинах катіонів купруму, а іммобілізаційний стрес - найменше.

Як свідчать отримані дані, під впливом досліджуваних стресових чинників відбувається зменшення вмісту цинку та пригнічення акумуляції інсуліну в ?-інсулоцитах, причому високе значення коефіцієнта кореляції (r) вказує на взаємозалежність цих двох процесів.

У дослідженнях вмісту цинку в інших клітинах внутрішніх органів мишей установлено, що під впливом тривалого фізичного навантаження вміст цього мікроелемента знижується в гіпокампі - на 22 % (P < 0,05), в клітинах Панета та кінцевих відділів передміхурової залози - відповідно на 40 % (P < 0,01) і 46 % (P < 0,01). Приблизно такі самі масштаби змін у вказаних клітинах викликає переохолодження, іммобілізація та перегрівання організму.

Наведені дані свідчать про те, що дія стресових чинників різної природи, зокрема, й забруднення атмосферного повітря, спричиняє істотне зменшення вмісту цинку в клітинах, які акумулюють цей мікроелемент, тобто розвивається його дефіцит. Схожість змін вмісту цинку в нейронах гіпокампу та гранулоцитах крові, клітинах Панета і простати вказує на єдиний механізм цих змін, які можуть бути віднесенні до ознак неспецифічного адаптаційного синдрому. Це підтверджується і позитивними значеннями коефіцієнтів кореляції.

ВИСНОВКИ

На підставі вивчення особливостей екологічного стану повітряного басейну м. Запоріжжя та динаміки вмісту цинку в клітинах крові мешканців районів з різним рівнем антропогенного забруднення атмосфери, а також з використанням експериментальних моделей, запропоновано новий підхід до розв'язання проблеми - застосування еколого-фізіологічного аналізу для комплексної оцінки ризику відхилень у стані здоров'я населення екологічно небезпечних територій, експериментально обґрунтовано доцільність цитологічного визначення вмісту цинку в клітинах як біологічного індикатора ранніх метаболічних порушень за умов вдихання забрудненого повітря та дії інших стресових чинників, доведено ефективність вживання цинквмісних препаратів для нормалізації вмісту цинку у клітинах.

1. У процесі еколого-гігієнічного аналізу атмосфери м. Запоріжжя встановлено істотні відмінності між окремими районами за рівнем антропогенного забруднення повітряного басейну, що зумовлено специфікою в концентрації окремих галузей промисловості та екологічними особливостями територій розміщення промислових підприємств. Як екологічно небезпечний визначено Заводський район м. Запоріжжя. Водночас встановлено, що стан атмосферного повітря в Хортицькому районі безпечний для здоров'я населення.

2. Застосуванням селективних металохромних індикаторів - дитизону та 8-(n-толуолсульфоніламіно)-хіноліну показано, що в нейтрофільних гранулоцитах мешканців Заводського району концентрація катіонів цинку, вміст цинквмісних секреторних гранул та рівень включення мікроелемента до складу секреторного матеріалу клітин вірогідно менші (Р < 0,05-0,001), ніж у лейкоцитах мешканців Хортицького району. В групи осіб, які, проживаючи на території Заводського району, отримували впродовж 30 діб препарат „Цинктерал”, вміст цинку та кількість секреторних гранул у лейкоцитах наближались до значень, притаманних клітинам мешканців Хортицького району, яких вважали за контроль. Вживання препарату “Цинктерал” не призводило до нормалізації вмісту цинку в секреторному матеріалі лейкоцитів цих осіб, проте вірогідно збільшувало значення показника порівняно з мешканцями Заводського району, які не отримували препарату “Цинктерал”.

3. З використанням піддослідних тварин установлено, що вдихання забрудненого техногенними викидами атмосферного повітря призводить до зменшення вмісту цинку, секреторних гранул та продуктів секреції в нейтрофільних гранулоцитах, ?-клітинах панкреатичних острівців, нейронах гіпокампу, базальних крипт тонкої кишки та передміхурової залози (Р < 0,05-0,001), до зменшення вмісту молекул інсуліну в ?-інсулоцитах.

4. У дослідах на лабораторних мишах установлено, що стресові чинники різної природи зумовлюють вірогідне зменшення вмісту цинку та секреторного матеріалу в нейтрофільних гранулоцитах, ?-інсулоцитах панкреатичних острівців, клітинах гіпокампу, базальних крипт тонкої кишки та передміхурової залози (Р < 0,05-0,001). За умов введення цинку ацетату на фоні дії стресових чинників, зокрема забрудненого атмосферного повітря, відбувається нормалізація вмісту цинку та секреторного матеріалу в нейтрофільних гранулоцитах крові та інших цинкметаболізуючих клітинах внутрішніх органів тварин.

5. Установлено обернено пропорційну залежність між рівнем внутрішньоклітинної акумуляції катіонів цинку і купруму. Свідченням цієї закономірності є такі результати: 1) у нейтрофільних гранулоцитах мешканців Заводського району вміст катіонів купруму вірогідно більший, ніж у клітинах жителів Хортицького району; 2) у нейтрофільних гранулоцитах лабораторних мишей зменшення вмісту цинку супроводжується підвищенням вмісту катіонів купруму; 3) дія на організм тварин деяких стресових чинників зумовлює, одночасно із зменшенням вмісту цинку, збільшення рівня внутрішньоклітинної акумуляції катіонів купруму; 4) надходження до організму аліментарних добавок цинку (препарат “Цинктерал”, цинку ацетат) зумовлює вірогідне зниження вмісту катіонів купруму в клітинах людей і тварин, що зазнають впливу забрудненого атмосферного повітря.

6. Еколого-фізіологічним аналізом статусу цинку в організмі мешканців м. Запоріжжя та моделюванням стресових станів у лабораторних мишей доведено, що тривале інгаляційне надходження забрудників атмосферного повітря призводить до хронічного стресу в організмі людини і тварин і супроводжується розвитком неспецифічного адаптаційного синдрому клітинної системи, однією з ланок якого є зменшення вмісту катіонів цинку в клітинах.

СПИСОК ОСНОВНИХ ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Григорова Н. В. Вплив охолодження на вміст цинку в клітинах щурів різного віку/ Н. В. Григорова, К. П. Миргородська, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко, О. В. Важненко// Питання біоіндикації та екології. - 2006. - Вип. 11, № 2. - С. 140-145. (Дисертант -виконання цитохімічних реакцій).

2. Важненко О. В. Використання цитохімічної біомаркерної моделі гранулоцитів крові людини при оцінці стану забруднення атмосферного повітря м. Запоріжжя/ О. В. Важненко, Ю. В.Єщенко, В. Д. Бовт, В. А.Єщенко// Довкілля та здоров'я. - 2007. - № 2 (41). - С.66-68. (Дисертант - ідея, збір матеріалів, проведення цитохімічних реакцій, статистична обробка та аналіз результатів).

3. Григорова Н. В. Вплив охолодження та алоксану на вміст цинку та секреторного матеріалу в клітинах/ Н. В. Григорова, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко, К. П. Миргородська, О. В. Важненко, В. Ю. Задорожня// Питання біоіндикації та екології. - 2007. - Вип. 12, №2. - С. 159-166. (Дисертант - проведення частини експерименту, збір експериментального матеріалу).

4. Важненко О. Оцінка стану атмосферного повітря Запорізької області та зміни гранулоцитів крові людей, які мешкають на територіях з високим рівнем техногенного навантаження/ О. Важненко, Ю. Єщенко, В. Бовт, В. Єщенко// Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2007. - Вип. 45. - С. 109-114. (Дисертант - ідея, збір матеріалів, проведення цитохімічних реакцій, статистична обробка та аналіз результатів).

5. Важненко О. В. Стан повітряного басейну Запорізької області та вміст цинку в гранулоцитах крові людей, які мешкають на території з високим рівнем забруднення атмосферного повітря/ О. В. Важненко, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко// Проблеми екології та медицини. - 2007. - Т. 11, № 3-4. - С. 21-25. (Дисертант - ідея, збір матеріалів, проведення цитохімічних реакцій, підготовка матеріалів для друку).

6. Важненко О. В. Дослідження цинкової недостаньості у людей, що виникає в умовах впливу техногенно навантаженого середовища індустріального центру/ О. В. Важненко, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко// Проблеми екології та охорони природи техногенного регіону. -2008. - Вип. 8. - С. 310-317. (Дисертант - ідея, проведення частини експерименту, збір матеріалів, підготовка матеріалів для друку).

7. Важненко О. В. Комплексна оцінка забруднення атмосферного повітря м. Запоріжжя/ О. В. Важненко// Питання біоіндикації та екології. - 2008. - Вип. 13, № 2. - С. 196-203.

8. Важненко О. В. Розвиток дефіциту цинку в гранулоцитах крові під впливом забруднення атмосферного повітря/ О. В. Важненко, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко// Питання біоіндикації та екології. - 2008. - Вип. 13, № 1. - С. 126-132. (Дисертант - ідея, проведення цитохімічних реакцій, підготовка матеріалів для друку).

9. Важненко О. В. Зміна вмісту цинку та секреторного матеріалу в клітинах людей та тварин під впливом високого рівня забруднення атмосферного повітря в умовах м. Запоріжжя/ О. В. Важненко, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А.Єщенко// Гігієна населених місць. - 2008. - Вип. 51. - С. 34-40. (Дисертант - ідея, проведення експерименту, підготовка тварин до досліду, підготовка матеріалів для друку).

10. Важненко О. Оцінка техногенного навантаження на атмосферне повітря та визначення стану гранулоцитів крові мешканців різних за рівнем забруднення районів м. Запоріжжя/ О. Важненко, Ю. Єщенко, В. Бовт, В. Єщенко// Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2008. - Вип. 47. - С. 116-122. (Дисертант - ідея, збір матеріалів, проведення еколого-гігієнічного аналізу, проведення цитохімічних реакцій).

11. Важненко О. В. Еколого-гігієнічна оцінка повітряного басейну Запорізької області та м. Запоріжжя/ О. В. Важненко// Питання біоіндикації та екології. - 2009. - Вип. 14, № 1. - С. 151-159.

12. Єщенко В. А. Вплив екстремальних факторів на клітинний метаболізм цинку/ В. А. Єщенко, Н. В. Григорова, В. Д. Бовт, Ю. В. Єщенко, О. М. Кучковский, К. П. Миргородська, В. Ю. Задорожня, О. В. Важненко// Вісник Запорізького національного університету. Серія: фізико-математичні науки, біологічні науки. - 2007. - № 1. - С. 78-81. (Дисертант - збір експериментального матеріалу; виконання цитохімічних реакцій).

13. Григорова Н. В. Стан інсулярного апарату в живих тест-об'єктах при дії шкідливих промислових речовин/ Н. В. Григорова, А. В. Важненко, В. Ю. Задорожня, О. М. Васічева// Збірник наукових праць Всеукраїнської наукової студентської конференції [“Актуальні проблеми дослідження довкілля”], (Суми, 13-14 трав. 2004 р.) - Суми: СумДПУ. - 2004. - С. 153-156. (Дисертант - збір експериментального матеріалу, статистична обробка та аналіз результатів).

14. Григорова Н. В.Спосіб оцінки функціонального стану нейтрофілів крові/ Н. В. Григорова, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко, В. Ю. Задорожня, О. В. Важненко// Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції [“Наука та інновації - 2005”], (Дніпропетровськ, 17-31 жовт. 2005 р.) - Дніпропетровськ: ДНУ. - Т.2 - С. 14-16. (Дисертант-проведення цитохімічних реакцій).

15. Григорова Н. В. Вміст цинку та інсуліну в клітинах мишей при введенні токсичних металів/ Н. В. Григорова, Ю. В. Єщенко, О. В. Важненко, В. Д. Бовт// ІІ Міжнародна науково-практична конференція. студентів і аспірантів [“Молодь та поступ біології”], (Львів, 21-24 бер. 2006 р.).- Львів: ЛНУ ім. І. Франка. - С. 415. (Дисертант - підготовка мазків для досліджування, підготова піддослідних тварин, виконання частини цитохімічних реакцій).

16. Григорова Н. В. Тестування по гранулоцитах крові для профілактики професійних захворювань/ Н. В. Григорова, Ю. В. Єщенко, В. Д. Бовт, В. А. Єщенко, К. П. Миргородська, О. Г. Михалевич, О. В. Важненко// Збірник наукових праць „Культура здоров'я” за матеріалами V Міжнародної науково-методичної конференції [“Культура здоров'я як предмет освіти”], (Херсон, 7-9 черв. 2006 р.).- Херсон: ХДУ. - 2006. - С. 64-66. (Дисертант - виконання цитохімічних реакцій).

17. Важненко О. В. Динаміка забруднення атмосферного повітря Запорізької області та зміни в організмі мешканців територій з високим рівнем техногенного навантаження/ О. В. Важненко, Н. В. Григорова, Ю. В. Єщенко// Міжнародна науково-практична конференція [“Екологія: наука, освіта, природоохоронна діяльність”], (Умань, 21-23 бер. 2007 р.) - Умань, 2007. - С. 11-12. (Дисертант - ідея, виконання цитохімічних реакцій).

18. Важненко О. В. Вивчення впливу викидів забруднюючих речовин на стан гранулоцитів крові/ О. В. Важненко, В. Д. Бовт, Ю. В. Єщенко, Н. В. Григорова, К. П.Миргородська, В. А Єщенко., І. М. Деревинська// Міжнародна конференція [“Сучасні проблеми біології, екології та хімії”], (Запоріжжя, 29 бер.-01 квіт. 2007 р.). - Запоріжжя: ЗНУ. - 2007. - С. 277. (Дисертант - ідея, збір експериментального матеріалу, статистична обробка та аналіз результатів).

19. Григорова Н. В. Цитохимическая реакция дитизона в гранулоцитах крови у работников металлургического объекта./ Н. В. Григорова, А. В. Важненко, Е. П. Миргородская, В. Ю. Задорожняя, А. К. Карпов, Ю. Г Апопий, А. М. Лукина, В. В. Порхоменко, И. Н. Деревинская// Міжнародна конференція [“Сучасні проблеми біології, екології та хімії”], (Запоріжжя, 29 бер.-01 квіт. 2007 р.). - Запоріжжя: ЗНУ. - 2007. - C. 278. (Дисертант - збір експериментального матеріалу, статистична обробка та аналіз результатів).

20. Важненко О. В. Деякі зміни гранулоцитів крові людей за негативних промислових факторів/ О. В. Важненко, В. Д. Бовт, Н. В. Григорова, В. А. Єщенко, Ю. В. Єщенко// ІІІ Міжнародна науково-практична конференція студентів і аспірантів [“Молодь та поступ біології”], (Львів, 23-27 квіт. 2007 р.).- Лвів: ЛНУ ім. І. Франка. - С. 457-458. (Дисертант - проведення цитохімічних реакцій, статистична обробка та аналіз результатів).