Вміст фізіологічного пріона в периферичній частині пріон-реплікуючої системи щурів за дії препаратів глікозаміногліканового ряду

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН НААН УКРАЇНИ

03.00.04 - Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Вміст фізіологічного пріона в периферичній частині пріон-реплікуючої системи щурів за дії препаратів глікозаміногліканового ряду

Майор Христина Ярославівна

Львів-2010

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Науково-виробничому центрі з вивчення пріонних інфекцій Інституту біології тварин НААН України.

Науковий керівник

доктор ветеринарних наук, професор, академік НААН України

ВЛІЗЛО Василь Васильович,

Інститут біології тварин НААН України, директор інституту, керівник НВЦ з вивчення пріонних інфекцій.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

МІНЧЕНКО Олександр Григорович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу молекулярної біології, заступник директора з наукової роботи;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

КІТ Юрій Ярославович, Інститут біології клітини НАН України, старший науковий співробітник відділу регуляції проліферації клітин та апоптозу

Захист відбудеться "18" травня 2010 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин НААН України за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин НААН України (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38)

Актуальність теми. Пріонні інфекції або трансмісивні спонгіформні енцефалопатії (ТСЕ) - це захворювання людей та тварин, що характеризуються ураженням центральної нервової системи. Збудником їх є патологічний або інфекційний пріон (Prusiner S.B., 1982). Єдиним попередником інфекційного пріона (PrPsc) є фізіологічний або клітинний пріон (PrPС), який за нез'ясованими механізмами трансформується у протеїназо-резистентну конформацію (Aguzzi A. et al., 2003).

Пріони - це новий вид збудників, патогенна дія яких відрізняється від дії вірусів і мікроорганізмів, а молекулярні механізми розвитку пріонних інфекцій до цього часу залишаються мало вивченими. Унікальність патогенезу пріонних інфекцій полягає у тому, що їх збудником виступає безнуклеїновий чинник білкової природи (Влізло В.В., Вербицький П.І., 2002).

Із часу відкриття пріонів ученим вдалося встановити будову та функції пріонних білків, особливості їх структурної організації та перебіг конформаційних змін при утворенні PrPsc (Linden R. et al., 2008; Simoneau1 S. et al., 2009). Однак, у біології пріонів існує ще багато нез'ясованих аспектів, а самі ТСЕ є серйозною проблемою не лише здоров'я тварин, але й людей.

Сьогодні особливо актуальним є дослідження можливостей зниження вмісту фізіологічного пріона, як попередника PrPsc, за допомогою хімічних сполук і цим самим проводити профілактику та лікувати ТСЕ. Перспективним напрямом є застосування препаратів, здатних частково знижувати вміст PrPС, що веде до блокування активної реплікації PrPsc (Morrow T. et al., 2005).

Дослідження останніх років вказують на те, що препарати глікозаміногліканового ряду, а також їх напівсинтетичні аналоги можуть бути перспективними засобами для профілактики та лікування пріонних інфекцій. Ці поліаніонні сполуки виявились ефективними у клітинних та тваринних моделях, оскільки зменшували рівень PrPsc та пролонгували інкубаційний період інфекції (Morrow T. et al., 2005). Встановлено, що гепарин та пентосан полісульфат ефективно знижують вміст PrPС у головному та спинному мозку (Стадник В.В., 2007).

Проте, варто зазначити, що інфікування супроводжується посиленим утворенням PrPsc із PrPС не лише у клітинах нервової системи, а й у периферичних пріон-реплікуючих оранах, зокрема у тонкому кишечнику, селезінці, м'язах тощо (Herzog Ch. et al., 2005). При цьому, накопичення PrPsc у периферичних органах відбувається задовго до нейроінфікування. Виходячи з цього, актуальним є дослідження вмісту PrPС у окремих периферичних пріон-реплікуючих органах щурів, а також вплив препаратів глікозаміногліканового ряду на зменшення в них вмісту PrPC.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною планових наукових тем 28.03/017-01.01. “Вивчити етіологічні фактори, що спричиняють розвиток трансмісивних спонгіформних енцефалопатій” та 37.01/046. “ Вивчити дію деяких хімічних препаратів на експресію пріона, етіологічні чинники, що спричиняють розвиток пріонних інфекцій та розробити методи їх діагностики” Науково-виробничого центру з вивчення пріонних інфекцій Інституту біології тварин НААН України (№ Держреєстру 0105U006969). Автор досліджувала загальний вміст фізіологічного пріона та розподіл його молекулярних форм у периферичних пріон-реплікуючих органах за дії препаратів глікозаміногліканового ряду.

Мета і завдання досліджень. Мета дисертаційної роботи - встановити вплив препаратів глікозаміногліканового ряду на вміст фізіологічного пріона у периферичних пріон-реплікуючих органах лабораторних щурів.

Для досягнення цієї мети нами були поставлені наступні завдання:

встановити загальний вміст фізіологічного пріона та співвідношення його молекулярних форм у периферичних пріон-реплікуючих органах щурів;

дослідити загальний вміст PrPC та співвідношення його молекулярних форм у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах щурів при введенні їм гепарину та пентосан полісульфату;

визначити вміст мРНК фізіологічного пріона у досліджуваних органах;

визначити рівень пріон-залежних показників - вмісту купруму та цинку і активності Cu2+/Zn2+-залежної ізоформи супероксиддисмутази за введення щурам гепарину та пентосан полісульфату;

дослідити систему гемостазу після ін'єкцій запропонованих доз гепарину та пентосан полісульфату;

провести порівняльний аналіз ефективності дії гепарину та пентосан полісульфату і дослідити їх токсичність за показником пошкодження геномної ДНК у спленоцитах.

Об'єкт досліджень - фізіологічний пріон та пріон-залежні показники у периферичних пріон-реплікуючих органах у контролі та за умов введення препаратів глікозаміногліканового ряду.

Предмет досліджень - загальний вміст фізіологічного пріона та розподіл його молекулярних форм, дія гепарину та пентосан полісульфату на PrPC, залежні від нього показники (вміст цинку та купруму, активність Cu2+/Zn2+-супероксиддисмутази), систему гемостазу, вміст мРНК пріона.

Методи досліджень - біохімічні (імуноблот-аналіз вмісту молекулярних форм фізіологічного пріона, дот-блот-аналіз вмісту PrPC, активність супероксиддисмутази, показники системи гемостазу), атомно-адсорбційні, молекулярно-біологічні (полімеразна ланцюгова реакція з використанням зворотної транскриптази, ДНК-комет аналіз) та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено визначення вмісту фізіологічного пріона та його молекулярних форм у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах лабораторних щурів. Досліджено вплив препаратів глікозаміногліканового ряду (гепарину, пентосан полісульфату) на вміст PrPC, його молекулярних форм та стан пріон-залежних показників у периферичних пріон-реплікуючих органах. Доведено, що пентосан полісульфат є на два порядки ефективнішим, порівняно з гепарином, щодо зниження вмісту фізіологічного пріона. Уперше встановлено відсутність впливу пентосан полісульфату на рівень мРНК фізіологічного пріона у периферичних органах пріон-реплікуючої системи лабораторних тварин. Уперше встановлено, що пентосан полісульфат не ушкоджує молекули геномної ДНК клітин селезінки.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено метод дот-блот аналізу для детекції загального вмісту фізіологічного пріона. Показано інгібувальний вплив гепарину та пентосан полісульфату на вміст PrPC у периферичних пріон-реплікуючих органах, що може бути перспективним при застосуванні цих препаратів для профілактики та лікування пріонних інфекцій.

Дисертантом у співавторстві видано методичні рекомендації “Діагностика губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, які затверджені НМК Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 3 від 19.12.2006). Розроблено СОУ 85.20-37-669:2007 “Пріонні інфекції. Метод визначення патологічного пріона - вестерн-блот”, СОУ 85.20-37-670:2007 “Пріонні інфекції. Імуноферментний метод визначення патологічного пріона”, СОУ 85.20-37-569:2007 “Експрес-метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, СОУ 85.20-37-568:2007 “Гістологічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”, СОУ 85.20-37-570:2007 “Імуногістохімічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби”.

Особистий внесок здобувача. Дисертант опрацювала наукову літературу, виконала експериментальну частину роботи, статистичну обробку результатів, написала та оформила дисертацію. Сформулювала основні висновки та підготувала до друку матеріали дисертаційної роботи. Визначення головних завдань роботи, а також узагальнення результатів дослідження здійснено спільно з науковим керівником -академіком НААН України В.В. Влізлом.

При дослідженні системи гемостазу дисертант отримувала консультації к.б.н., доц. М.В. Кінах (Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на міжнародній конференції “Prion2007” (Единбург, Велика Британія, 2007), міжнародній конференції “Prion2008” (Мадрид, Іспанія, 2008), міжнародній конференції молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007), засіданні Наукового товариства ім. Т. Шевченка (Львів, 2007), Всесвітньому конгресі з буятрики (Будапешт, Угорщина, 2008), а також на конференціях молодих вчених Інституту біології тварин НААН України (Львів, 2007, 2008).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 7 статей у фахових наукових журналах, 4 тез матеріалів наукових конференцій, отримано один патент, опубліковано одні методичні рекомендації, 5 СОУ.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 134 сторінках друкованого тексту, проілюстрована 26 рисунками (14 сторінок), 8 таблицями (4,5 сторінки), складається зі вступу, чотирьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи виконання роботи, результати експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень), висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури, який налічує 217 джерела, в тому числі 205 англійською мовою.

Огляд літератури. В огляді літератури детально описано структуру фізіологічного пріона та його функції в організмі ссавців. Проаналізовано дані наукової літератури щодо ролі PrPС в патогенезі пріонних інфекцій, а також наведено ряд підходів до зниження вмісту цього білка у дослідженнях in vitro та in vivo.

Вибір напрямів досліджень, матеріали і методи виконання роботи. Матеріалом для дослідження були лабораторні щури Rattus norvegicus var. Alba, лінії Wistar. Відбирали статевозріліх самців щурів вагою 250-350 г. Тваринам згодовували повноцінний комбікорм. Вода була доступна ad libitum. Експерименти з тваринами проводили згідно з правилами Європейської конвенції про гуманне ставлення до лабораторних тварин (Strasburg: Counsil of Europe, 1986; витяг з протоколу №13 від 14.10.2009 р. засідання комісії з проведення біоетичної експертизи Інституту біології тварин НААН України). Досліди проводили на зразках тканин та органів, відібраних після декапітації тварин. Для досліджень відбирали селезінку, тонкий кишечник, м'яз стегна та кров. Забір крові здійснювали із хвостової вени щурів. Кров відбирали натще із додаванням в якості антикоагулянта цитрату натрію.

Під час виконання дисертаційної роботи було проведено 4 серії досліджень. Досліди проводили в трьох паралелях у кожному варіанті. У першій серії було досліджено вміст фізіологічного пріона у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах щурів та проведено порівняння розподілу молекулярних форм PrPC у цих органах.

У другій та третій серіях досліджень піддослідним тваринам вводили внутрішньом'язово гепарин (Heparin Sodium, Белмедпрепараты, Білорусь) з активністю 36,7; 1666,7 та 10000 Од/кг (1; 50 та 300 мг/кг*день) та пентосан полісульфат в дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день (Natrii pentosani polisulfate, ППС, Bene Gmbh, Німеччина) та порівнювали їх ефективність. Дози препаратів та тривалість експерименту підбирали згідно довідкових даних про оптимальні терапевтичні дози та період лікування препаратами, що проявляють антикоагуляційну дію. Ін'єкції здійснювали один раз на 24 год. упродовж 7-ми діб. На сьому добу тварин декапітували під легким ефірним наркозом, відповідні тканини та органи відбирали для дослідження впливу зазначених препаратів на вміст PrPC, розподіл його молекулярних форм та стан пріон-залежних показників - вміст купруму і цинку та активність Cu2+/Zn2+-СОД. У відібраних зразках крові досліджували показники системи гемостазу.

Для четвертої серії експериментів був обраний ефективніший із тестованих препаратів та проведено дослідження його токсичності щодо спленоцитів щурів та вплив на вміст мРНК фізіологічного пріона in vivo.

Концентрацію загального білка визначали методом Лоурі (Lowry O.H. et al., 1950). Вміст фізіологічного пріона визначали методом дот-блот гібридизації. Спектр молекулярних форм PrPC (PrPC1, PrPC2, PrPC3) встановлювали методом імуноблот-аналізу із використанням моноклональних анти-PrP антитіл 6Н4 (Prionics, Швейцарія). Вміст купруму та цинку визначали спектрофотометрично методом полум'яної фотометрії на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115М. Визначення активності Cu2+/Zn2+-супероксиддисмутази проводили згідно стандартної методики, вимірюючи оптичну густину реакції відновлення нітросинього тетразолію з інгібуванням активного центру ферментна калій ціанідом, за допомогою спектрофотометра СФ-46 (ЛОМО, Росія). Дослідження показників системи гемостазу (підрахунок тромбоцитів, адгезивність тромбоцитів, агрегація тромбоцитів, визначення вмісту фібриногена, час згортання крові, протромбіновий час, тромбіновий час згортання, активований час рекальцифікації, активований частковий тромбопластиновий час, активність фактора ХІІІ, вміст антитромбіна ІІІ, фібринолітична активність плазми, визначення продуктів деградації фібрина і розчинних комплексів мономерів фібрина, етанолова проба, протамін-сульфатний тест) проводили згідно стандартних методик у цільній крові (Балуда В.П. зі співавт., 1980). Дослідження фрагментації ДНК ядер спленоцитів щурів проводили методом ДНК-комет (Merz P.A. et al., 1981). Визначення вмісту матричної РНК фізіологічного пріона проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із використанням зворотної транскриптази. Продукт ампліфікації аналізували електрофорезом ДНК в агарозному гелі. Гель фарбували бромистим етидієм та виявляли в УФ-світлі.

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу. Розраховували середнє значення М та середню похибку m, які й представлені на діаграмах, рисунках та у таблицях. Обробку проводили за допомогою програми Statgraphics Plus 5.1 з використанням t-тесту Стґюдента та обрахунком коефіцієнту кореляції. Рівень вірогідності отриманих результатів встановлювали при р<0,05-0,001.

Результати досліджень та їх аналіз

Вміст фізіологічного пріона та його молекулярних форм в периферичних пріон-реплікуючих органах щурів. Як показали результати дот-блот аналізу (рис.1, A, В), фізіологічний пріон експресується в усіх досліджуваних периферичних пріон-реплікуючих органах щурів. Найвищий його вміст виявили у тканині селезінки (прийнято за 100 %). Загальний вміст PrPC у тканині тонкого кишечника складав близько 91 % від вмісту PrPC у селезінці. Найнижчий вміст PrPC серед досліджуваних органів був зафіксований у скелетних м'язах (на 30 % нижчим, ніж у селезінці та на 20 % нижчим порівняно із тонким кишечником). У всіх досліджуваних органах PrPC представлений молекулярними формами PrPC1 та PrPC2. Також встановлено відсутність форми PrPC3 у всіх досліджуваних органах пріон-реплікуючої системи (рис.1, Б).

Високий загальний вміст фізіологічного пріона у селезінці, встановлений методом дот-блоту, досягається завдяки обом виявленим молекулярним формам (PrPC1 та PrPC2). Подібний розподіл між молекулярними формами PrPC1 та PrPC2 також встановлений у тканинах тонкого кишечника, хоча в даному органі відмічається тенденція до зростання вмісту форми PrPC2 . У скелетних м'язах вміст молекулярної форми PrPC1 був на 70 % вищим, порівняно із PrPC2 . Цікавим є той факт, що лише у м'язах домінуючою була молекулярна форма PrPC1.

Підсумовуючи одержані результати, варто зазначити, що різний вміст фізіологічного пріона у досліджуваних органах периферичної пріон-реплікуючої системи може свідчити про неоднакову роль цих органів при патогенезі пріонних інфекцій. Встановлений розподіл молекулярних форм PrPC у тканинах селезінки, тонкого кишечника та скелетних м'язів може бути видоспецифічним фактором та змінюватись у процесі онтогенезу.

Вплив гепарину на вміст PrPC, пріон-залежні показники та систему гемостазу щурів. Результати дот-блот-аналізу вказують на те, що гепарин у дозах 1, 50 та 300 мг/кг*день знижує вміст PrPC у селезінці та тонкому кишечнику порівняно з контролем. Найефективнішою виявилась доза препарату 300 мг/кг*день, за якої спостерігалось значне (p<0,001) зниження вмісту PrPC у всіх досліджуваних органах. За дії менших кількостей гепарину реєстрували не чітко виражений ефект. Значні коливання вмісту фізіологічного пріона при застосуванні низьких доз гепарину (1 та 50 мг/кг*день) не дозволяють зробити однозначний висновок щодо їх ефективності. Попри це, препарат не спричиняв появи форми PrPC3 у жодному із зразків, а лише інгібував експресію фізіологічного пріона, моделюючи розподіл між молекулярними формами PrPC1 та PrPC2. Введення гепарину спричиняло зниження вмісту як PrPC1, так і PrPC2 форм фізіологічного пріона у селезінці, проте не проявляло чіткого дозозалежного ефекту. Інє'кції гепарину у дозі 300 мг/кг*день призводило до значного переважання у селезінці PrPC2 форми над PrPC1, чого не спостерігалось за введення нижчих доз препарату. Гепарин в дозі 1 мг/кг*день не змінював вмісту молекулярної форми PrPC1, водночас спостерігалось незначне зниження (до 15 %) вмісту форми PrPC2. Гепарин у дозах 50 та 300 мг/кг*день спричиняв вірогідне (p<0,001) зменшення вмісту молекулярної форми PrPC1 у тонкому кишечнику до 20 % та 60 % та форми PrPC2 - до 60 % та 88 % відповідно. Введення гепарину призводило до зниження вмісту PrPC2 молекулярної форми у скелетних м'язах (рис. 2).

Деяке зменшення вмісту форми PrPC1 спостерігалось при введнні препарату у низьких дозах (1; 50 мг/кг*день), проте ефективно (p<0,001) її зменшувала лише доза 300 мг/кг*день. Дослідження активності Cu2+/Zn2+- супероксиддисмутази за дії різних доз гепарину показало, що зниження вмісту PrPC, спричиняє інактивацію (р<0,05) цього ферменту у всіх досліджуваних органах порівняно із контролем.

При дослідженні вмісту купруму та цинку встановлено, що введення різних доз гепарину не впливало на вміст цих елементів у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах. Коливання вмісту цинку спостерігали у тонкому кишечнику та скелетних м'язах. Проте, вірогідних змін у вмісті цих мікроелементів зафіксовано не було. Таким чином, зниження вмісту фізіологічного пріона за дії гепарину не впливає на вміст купруму та цинку у досліджуваних периферичних пріон-реплікуючих органах та тканинах.

Зважаючи на те, що гепарин є сильним антикоагулянтом прямої дії, нами було проведено дослідження показників системи гемостазу у дослідних щурів. Підрахунок загальної кількісті тромбоцитів у крові дослідних щурів після введення гепарину у дозах 1, 50 та 300 мг/кг*день показав незначне їх зниження, порівняно з контрольними. Аналіз тромбоцитограми не вказував на істотні зміни. Тести на адгезивність та час агрегації тромбоцитів, вміст фібриногену, продуктів деградації фібрину та фібриногену і фактора ХІІІ не виявляли патологічних відхилень. Вищенаведені результати вказують на відсутність впливу досліджуваного препарату на гомеостаз тромбоцитів. Проведені паракоагуляційні тести (етаноловий, протамін-сульфатний) були негативними. Із підвищенням дози препарату до 300 мг/кг*день спостерігалось сповільнення часу ретракції згустка крові на 20 хв. та часу згортання до 214 с (р<0,05), тромбінового часу (р<0,05), активованого часткового тромбопластинового часу (р<0,01) та зниження фібринолітичної активності. Також було встановлено вірогідне (р<0,01) підвищення вмісту антитромбіну ІІІ. Зростання дози гепарину у досліджуваних межах не впливає на адгезивність тромбоцитів, тоді як спостерігається деяке підвищення їх агрегаційної здатності при застосуванні дози 50 та 300 мг/кг*день. Так само спостерігалась пролонгація часу рекальцифікації крові пропорційно до підвищення дози досліджуваного препарату. Всі вищенаведені результати говорять про активацію окремих ланок системи, що є типовими змінами при введенні антикоагулянтів групи гепариноїдів, які характеризуються підвищеним ризиком розвитку геморагічних станів, що накладає деякі обмеження на ефективність застосування високих концентрацій гепарину для зниження вмісту PrPC.

Вплив пентосан полісульфату на вміст PrPC, пріон-залежні показники та систему гемостазу щурів. Пентосан полісульфат у дозах 0,1; 0,5 і 1 мг/кг*день спричиняє різке зниження вмісту PrPC у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах щурів (рис. 3, І). Під дією препарату вміст фізіологічного пріона зменшувався у всіх дослідних групах.

Найефективніше знижувався вміст PrPC у тонкому кишечнику (рис. 3, ІІ). У той же час, в інших органах, попри значне зниження вмісту фізіологічного пріона, дозозалежний ефект не був настільки чітко виражений. Загалом, у скелетних м'язах введення ППС знижувало вміст PrPC до 60-80 % (р<0,001), у тонкому кишечнику - до 80-85 % (р<0,001), а у селезінці - до 50-70 % (р<0,001).

Імуноблот аналіз спектру молекулярних форм PrPC у селезінці тварин за дії пентосан полісульфату показав, що препарат знижує вміст обидвох молекулярних форм фізіологічного пріона - PrPC1 та PrPC2. Зниження вмісту PrPC спостерігалось при введені тваринам усіх досліджуваних доз ППС (0,1; 0,5; 1 мг/кг*день). Введення ППС щурам у дозі 0,1 мг/кг*день вело до зниження вмісту молекулярної форми PrPC1 до 50 %. Препарат в дозі 0,1 мг/кг*день зменшував вміст молекулярної форми PrPC2 у селезінці до 30 %. При підвищенні концентрації ППС до 0,5 мг/кг*день спостерігалось пропорційне дозозалежне зменшення (p<0,001) вмісту як форми PrPC1, так і форми PrPC2 у селезінці до 80 % та 60 % відповідно. ППС в дозі 1 мг/кг*день практично повністю інгібував експресію молекулярної форми PrPC1 у селезінці щурів. При цьому, спостерігалось зниження вмісту молекулярної форми PrPC2 на 65 %, порівняно із контролем (p<0,001).

Проведені дослідження показали, що введення ППС в дозах 0,1; 0,5 мг/кг*день супроводжується експресією молекулярної форми PrPC3 у тканинах кишечнику, чого не було виявлено в інших досліджуваних органах (рис. 4). Встановлено, що ППС веде до зниження вмісту PrPC1 та PrPC2 молекулярних форм фізіологічного пріона у тонкому кишечнику (p<0,001). PrPC3 форма, яку було виявлено при введенні препарату в дозах 0,1 та 0,5 мг/кг*день, є найменшою із детектованих форм. Вміст цієї форми зменшувався до 50 % при підвищенні кількості пентосан полісульфату із 0,1 мг/кг*день до 0,5. При введенні препарату у дозі 1 мг/кг*день не було виявлено молекулярної форми PrPC3.

Введений щурам ППС проявляв дозозалежний пріон-інгібувальний ефект на молекулярні форми PrPC1 та PrPC2 у скелетних м'язах. Найбільшою ефективністю володів пентосан полісульфат у дозі 1 мг/кг*день. Застосування препарату у нижчих дозах (0,1 та 0,5 мг/кг*день) було також ефективним і лише деякою мірою поступалось своїми пріон-інгібувальними властивостями максимальній дозі. ППС в дозі 0,1 мг/кг*день зумовлював зниження вмісту форми PrPC1 на 25 %, а PrPC2 - на 50 % від контрольного рівня; у дозі 0,5 мг/кг*день - зниження вмісту PrPC1 форми до 50 % (p<0,01) та PrPC2 на 35 % (p<0,001); у дозі 1 мг/кг*день зниження вмісту PrPC1 було на 45 % (p<0,01), а PrPC2 - на 30 % (p<0,001).

Встановлені нами зміни вмісту молекулярних форм PrPC, можливо, зумовлені тканиноспецифічними особливостями процесів глікозилювання-деглікозилювання у досліджуваних тканинах та органах. Отримані результати узгоджуються з даними інших робіт (Стадник В.В., 2008), в яких було чітко встановлено зниження вмісту фізіологічного пріона під впливом пентосан полісульфату в довгастому, спинному та півкулях головного мозку щурів.

Дослідження активності Сu2+/Zn2+-СОД у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах щурів показали, що зниження вмісту PrPC на фоні введення тваринам зростаючих доз ППС практично не впливає на активність даного ферменту. Так, у селезінці та тонкому кишечнику щурів спостерігалось незначне зниження активності Сu2+/Zn2+-СОД при застосуванні ППС у дозі 0,5 мг/кг/день. Незначне зростання активності проявляється в даних органах при найбільш ефективній пріон-інгібуючій дозі препарату 1 мг/кг/день. У скелетних м'язах активність Сu2+/Zn2+-СОД не змінювалась залежно від доз ППС, порівняно з контрольними тваринами.

Показано, що пентосан полісульфат у дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день спричиняв накопичення іонів купруму та цинку у периферичних пріон-реплікуючих органах. Вміст обидвох мікроелементів змінювався залежно від дози ППС. Введення ППС в дозі 0,1 мг/кг*день спричиняло незначне зростання кількості купруму та вірогідне (р<0,001) зростання вмісту цинку, а препарат у дозі 0,5 мг/кг*день та 1 мг/кг*день викликав збільшення як концентрації купруму (р<0,001) так і цинку (р<0,001).

За допомогою кореляційного двохфакторного аналізу було встановлено, що між введеною дозою ППС і вмістом купруму та цинку існує сильна позитивна кореляція для всіх досліджуваних органів та тканин щурів. Так, у селезінці коефіцієнт кореляції між дозою ППС та вмістом купруму склав +1,0; у тонкому кишечнику - +0,95; у скелетних м'язах - +0,96. Для пари пентосан полісульфат : цинк даний показник у селезінці становив +0,96; у тонкому кишечнику - +0,99; у скелетних м'язах - +0,95.

Таким чином, введення пентосан полісульфату дослідним тваринам не викликає змін активності досліджуваної ізоформи СОД, що може бути зумовлено зростанням вмісту кофакторних мікроелементів - купруму та цинку.

Введення піддослідним тваринам ППС показало, що застосовані дози препарату (0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день) не викликали значних змін з боку системи гемостазу. Підрахунок тромбоцитів у зразках крові, відібраної після введення тваринам зростаючих доз ППС, не виявив патологічних відхилень як у їх загальній кількості, так і при аналізі тромбоцитограми. Співвідношення між юними, зрілими, старими, дегенеративними тромбоцитами та формами подразнення у дослідних групах залишалося практично незмінним. При застосуванні найвищої досліджуваної дози ППС тести на визначення агрегаційних властивостей тромбоцитів показали незначне зростання часу агрегації та активованого часу рекальцифікації крові. Дослідження не виявили коливань у вмісті фібриногена у крові щурів, продуктів деградації фібрина та фібриногена. Незначні коливання тромбінового часу спостерігались при введенні ППС у дозах 0,1 і 0,5 мг/кг*день, тоді як 1 мг/кг*день не спричиняв змін даного показника у дослідних щурів. Підрахований протромбіновий індекс вказує на несуттєве зниження даного показника. ППС викликає незначне зниження протромбінового індексу, вмісту фактора ХІІІ та антитромбіна ІІІ, порівнянно із контролем. Препарат у застосованих дозах не впливав на активований частковий тромбопластиновий час та фібринолітичну активність. Проведені паракоагуляційні тести показали негативний результат. Отже, застосування пентосан полісульфату в досліджуваних дозах (0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день) не викликає змін з боку системи гемостазу лабораторних щурів.

Цитотоксичний вплив пентосан полісульфату на спленоцити щурів. Кількісна та якісна оцінка ушкоджень ДНК здійснювалась за рядом параметрів, в числі яких довжина ДНК-“хвоста”, розмір “голови” комети. Результати досліджень показали, що застосування ППС в дозі 0,1 та 0,5 мг/кг*день не викликало зростання рівня ушкодження ДНК (рис. 5).

При введенні препарату ППС у вказаних дозах не спостерігали появи ДНК-комет 1, 2, 3 чи 4 класів, у так званому “хвості” комети було <5 % ДНК, що свідчить про відсутність пошкодження ДНК і цитотоксичного ефекту доз ППС 0,1 та 0,5 мг/кг*день.

ППС у дозі 1 мг/кг*день спричиняв лише незначне зростання кількості дволанцюгових розривів ДНК у спленоцитах, про що свідчить поява комет 1-го та 2-го класу (5?40 % ушкодженої ДНК у “хвості”).

На підставі отриманих даних, можна підсумувати, що пентосан полісульфат, введений щурам у дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день не спричиняв ушкодження молекул геномної ДНК клітин селезінки.

Вміст мРНК фізіологічного пріона у периферичних пріон-реплікуючих органах щурів при введенні пентосан полісульфату. Методом РТ-ПЛР встановлено, що введення ППС у дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день не впливає на вміст мРНК пріона у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах щурів (рис. 6).

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено експериментальне і теоретичне обґрунтування зниження вмісту фізіологічного пріона у периферичних пріон-реплікуючих органах in vivo під впливом препаратів глікозаміногліканогово ряду (гепарину та пентосан полісульфату). Це може бути використано для терапії та профілактики пріонних інфекцій. Уперше визначено вміст фізіологічного пріона та його молекулярних форм у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах.

Серед досліджуваних органів периферичної частини пріон-реплікуючої системи щурів найвищий вміст (прийнято за 100 %) фізіологічного пріона виявлено у селезінці та тонкому кишечнику (91 % від вмісту PrPC у селезінці), в яких домінуючою була молекулярна форма PrPC2. У скелетних м'язах вміст фізіологічного пріона складав 70 % від вмісту PrPC у селезінці, а домінуючою була молекулярна форма PrPC1.

Внутрішньом'язове введення лабораторним щурам гепарину в дозах 1, 50 та 300 мг/кг*день викликає зниження вмісту фізіологічного пріона в селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах. Вірогідну антипріонну активність проявляє доза препарату 300 мг/кг*день, за введення якої вміст PrPC знижувався на 80?95 %, порівняно з вихідним контрольним рівнем.

У дозах 1?300 мг/кг*день гепарин не впливає на спектр молекулярних форм фізіологічного пріона в селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах.

Гепарин у дозі 300 мг/кг*день, введений щурам внутрішньом'язово, спричиняє зниження активності Cu2+/Zn2+-залежної супероксиддисмутази, активацію антикоагуляційної ланки системи гемостазу, яка полягає у сповільненні часу ретракції згустка крові та часу згортання, тромбінового часу, активованого часткового тромбопластинового часу, фібринолітичної активності й підвищення вмісту антитромбіну ІІІ. Водночас, препарат не впливає на вміст купруму та цинку в периферичних органах пріон-реплікуючої системи.

Внутрішньом'язове введення лабораторним щурам пентосан полісульфату в дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день призводить до зниження загального вмісту фізіологічного пріона у селезінці на 50?70 %, скелетних м'язах - на 60?80 % та тонкому кишечнику - на 80-85 % і не впливає на експресію мРНК клітинного пріона у досліджуваних тканинах.

Пентосан полісульфат у дозах 0,1?1 мг/кг*день не впливає на спектр молекулярних форм фізіологічного пріона в селезінці та скелетних м'язах. У тонкому кишечнику дози 0,1 та 0,5 мг/кг*день зумовлювали активацію експресії молекулярної форми PrPC3.

Внутрішньом'язове введення пентосан полісульфату у дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг*день не спричиняє вірогідних змін в активності Cu2+/Zn2+-залежної супероксиддисмутази, про- та антикоагуляційних ланках системи гемостазу, а також не ушкоджує ДНК клітини селезінки, але призводить до зростання вмісту цинку та купруму у досліджуваних органах.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Розроблений метод дот-блот аналізу PrPC можна рекомендувати як швидкий та чутливий тест для визначення вмісту фізіологічного пріона, а також як скринінг-тест для детекції PrPSC.

Внутрішньом'язове введення пентосан полісульфату у дозі 1 мг/кг*день доцільно застосовувати при профілактиці та лікуванні пріонних інфекцій.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Лабораторна діагностика трансмісивних спонгіформних енцефалопатій (ТСЕ): сучасний стан та перспективи / В.В. Влізло, Х.Я. Майор, П.І. Вербицький, В.В. Стадник // Біологія тварин. -- 2007. -- Т. 9, № 1-2. -- С. 10?24. (Дисертант брала учать у опрацюванні даних наукової літератури щодо швидких методів діагностики ТСЕ та підготовці матеріалів статті до друку).

Взаємодія фізіологічного пріона з пентосан полісульфатом in vitro / В.В. Стадник, Х.Я. Майор, П.І. Вербицький, В.В. Влізло // Експ. та клін. фізіол. та біохім. -- 2008. -- № 3 (34). - С. 33?37. (Дисертант проводила ТФ-ІФА, брала участь у написанні статті).

Вміст фізіологічної форми пріону за дії пентосанполісульфату (sp-54) у тканинах щура / В. В. Влізло, В. В. Стадник, Х. Я. Майор, М. В. Кінах, П.І. Вербицький, М. Р. Козак // Укр. біохім. журнал. - 2008. -- Т. 80, № 1. -- С. 33?39. (Дисертант визначала вміст фізіологічного пріона, купруму, цинку та активності супероксиддисмутази за дії пентосан полісульфату в периферичних пріон-реплікуючих органах, опрацювала результати, брала участь у написанні статті).

Фізіологічний пріон та його роль у функціонуванні клітини / В.В. Влізло, В.В. Стадник, Х.Я. Майор, П. І. Вербицький // Біологія тварин. -- 2008. -- Т. 10, № 1-2. -- С. 9?20. (Дисертант брала учать у написанні статті та підготовці матеріалів до друку).

Майор Х.Я. Вплив гепарину на рівень фізіологічного пріона у тканинах та органах щурів / Х.Я. Майор // Біологія тварин. -- 2008. -- Т. 10, № 1-2. -- С. 143-?149.

Вміст фізіологічного пріона та його мРНК за дії пентосан полісульфату / Х.Я. Майор, В.В. Стадник, М.В. Кінах, В.В. Влізло // Медична хімія. -- 2009. -- Т. 11, №2. -- С. 11?14. (Дисертант виконувала дослідження дот-блот гібридизації, визначення вмісту мРНК та показників системи гемостазу, опрацювала результати, брала участь у написанні статті).

Ідентифікація патологічного пріона при губчастоподібній енцефалопатії великої рогатої худоби / В.В. Влізло, В.В.Стадник, Х.Я. Майор // Біотехнологія. -- 2008. -- Т. 1, №2. -- С. 75?80. (Дисертант брала участь у опрацюванні результатів досліджень, написанні статті).

Пат. 32547 Україна, МПК (2206) А61Р 31/00. Застосування пентосан полісульфату (SP-54) як інгібуючого впливу на експресію фізіологічного пріон протеїну in vitro / В. Влізло, В. Стадник, Х. Майор; заявник і патентовласник Інститут біології тварин НААН України. -- № u 2007 12191; заяв. 05.11.2007; опубл. 26.05.2008, Бюл. № 10.

Діагностика губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби: Методичні рекомендації / В.В. Влізло, П.І. Вербицький, А.В. Абрамов, О.В. Ложкіна, Д.Д. Остапів, І.М. Петрух, Ю.В. Мартин, Х.Я. Майор, В.В. Стадник. -- Київ, 2007. -- 61 с. (Дисертант підготувала до друку підрозділи 3.4.1.1 та 3.4.1.2 третього розділу).

Стадник В.В. Вплив пентосан полісульфату (SP-54) на експресію фізіологічного пріон-протеїна / В.В. Стадник, Х.Я. Майор, В.В. Влізло // Біологія: від молекули до біосфери: міжнар. конф. студентів і мол. вчених, 19 - 21 лис. 2007 р.: тези доп. -- Харків, 2007. -- С. 4.

Polyanions and their influence on the cellular prion protein / V. Stadnyk, C. Mayor, L. Izumova, V. Vlizlo // Prion2008. -- Madrid, Spain. -- P.103.

Stadnyk V. Molecular Mechanism of Action of Pentosan Polysulphate on the Cellular Prion Protein / V. Stadnyk, Ch. Mayor, V. Vlizlo // XXV World Buiatric Congress: int. sci. conf., 6-11 July, 2008: Hungarian Veterinary Journal -- Budapest, Hungary, 2008. -- P. 76.

New Approaches in the Prophylaxis of Prion Infections / V. Vlizlo, P. Verbitskii, C. Mayor, V. Stadnyk // XXV World Buiatric Congress: int. sci. conf., 6-1 July, 2008: Hungarian Veterinary Journal. -- Budapest, Hungary, 2008. -- P. 84.

АНОТАЦІЇ

Майор Х.Я. Вміст фізіологічного пріона в периферичній частині пріон-реплікуючої системи щурів за дії препаратів глікозаміногліканового ряду. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біології тварин НААН України. Львів, 2010.

Дисертація присвячена вивченню вмісту фізіологічного пріона у ключових периферичних пріон-реплікуючих органах щурів у нормі і за дії гепарину та пентосан полісульфату.

З'ясовано вміст фізіологічного пріона та розподіл його молекулярних форм у селезінці, тонкому кишечнику та скелетних м'язах щурів. Показано, що найвищий вміст фізіологічного пріона детектується у селезінці, менший ? у тонкому кишечнику і найменший - у скелетних м'язах. Аналіз розподілу молекулярних форм фізіологічного пріона показав, що домінуючою у селезінці та тонкому кишечнику була молекулярна форма PrPC2, у скелетних м'язах ? PrPC1.

Встановлено, що препарати гепарину та пентосан полісульфату здатні знижувати вміст фізіологічного пріона у досліджуваних органах пріон-реплікуючої системи. При цьому, пентосан полісульфат володіє вищою пріон-інгібуючою активністю, не змінюючи активності Cu2+/Zn2+-залежної супероксиддисмутази та не порушуючи стану системи гемостазу.

Показано, що пентосан полісульфат у застосованих дозах не проявляє цитотоксичної дії щодо клітин селезінки щурів, а зниження вмісту фізіологічного пріона не є наслідком зміни вмісту його мРНК.

Ключові слова: щури, периферичні пріон-реплікуючі органи, фізіологічний пріон, молекулярні форми PrPC, гепарин, пентосан полісульфат.

Майор Х.Я. Содержание физиологического приона в периферической части прион-реплицирующей системы крыс при действии препаратов гликозаминогликанового ряда. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биологии животных НААН Украины. Львов, 2010.

Диссертация посвящена изучению содержания физиологического приона в ключевых периферических прион-реплицирующих органах крыс в норме, при действии гепарина и пентосан полисульфата.

Установлено содержание физиологического приона и распределение его молекулярных форм в селезенке, тонком кишечнике и скелетных мышцах. Показано, что наивысшее содержание физиологического приона детектируется в селезенке, меньшее - в тонком кишечнике и наименьшее - в скелетных мышцах. Анализ распределения молекулярных форм физиологического приона показал, что доминирующей в селезенке и тонком кишечнике является молекулярная форма PrPC2, а в скелетных мышцах - PrPC1.

Установлено, что препараты гепарин и пентосан полисульфат способны снижать содержание физиологического приона в исследованых органах прион-реплицирующей системы, при чем пентосан полисульфат владеет более выраженным прион-ингибирующим эффектом, не меняя при этом активности Cu2+/Zn2+-зависимой супеоксиддисмутазы и не вызывая значительных изменений в системе гемостаза.

Показано, что пентосан полисульфат в использованых дозах не проявляет цитотоксического действия по отношению к спленоцитам крыс, а снижение содержания физиологического приона при действии данного препарата не является следствием изменения уровня мРНК приона.

Ключевые слова: крысы, периферические прион-реплицирующие органы, физиологический прион, молекулярные формы PrPC, гепарин, пентосан полисульфат.

Mayor Ch.Ya. Level of cellular prion in the peripheral part of rats prion replicating system under the influence of preparations from glycosaminoglycan group. - Manuscript.

Thesis for a Doctor of Philosophy (PhD) scientific degree in biology, speciality 03.00.04 - biochemistry. - Institute of Animal Biology NAAS of Ukraine, Lviv, 2009.

Current thesis is focused on the investigation of the cellular prion (PrPС) level in the key peripheral prion replicating organs of rats - spleen, small intestine and skeletal muscles in normal conditions and under the action of heparin and pentosan polysulfate (PPS).

Investigation of the general PrPС level showed that in estimated organs the highest level of cellular prion was observed in spleen and small intestine of rats, while in skeletal muscles level of PrPС expression reached only 70 % from that in spleen.

It was shown that predominant molecular form of cellular prion in spleen and small intestine of rats was PrPС2, otherwise to PrPС1 that was most poor represented molecular form in listed organs. Only in skeletal muscles PrPС1 form was dominating.

PPS and heparin were chosen as agents able to interact with PrPc in vitro and were checked whether they will interact with PrPС in vivo causing decrease of its level in the tissues of prion replicating system peripheral organs.

Intramuscular injections of heparin and PPS showed promising results for decrease of PrPС level in all studied peripheral organs of rats. Moreover, PPS inhibited PrPС expression level injected in much lower active doses comparing to heparin.

Heparin in applied doses had no influence on the pattern of the PrPС molecular forms, while PPS injected in doses 0,1 and 0,5 mg/kg*day caused appearance of molecular form PrPС3.

Used compounds were checked on their influence on the prion-dependent indexes. Heparin caused decrease in Cu2+/Zn2+-superoxide dismutase activity and alterations in coagulation system. Nevertheless heparin possessed no influence on copper and zinc level in studied organs and tissues.

PPS had no influence on the activity of Cu2+/Zn2+-dependent SOD and coagulation system, while causing increase of copper and zinc concentration in all studied organs. пріон гепарин реплікуючий

PT-PCR analysis was used to estimate the level of PrPС mRNA after PPS injections. Investigation was shown that decrease of PrPС level is not caused by alterations in mRNA synthesis-degradation ratio. DNA comet assay showed that PPS in applied doses did not induce any cytotoxic effect on splenocytes.

In current research was demonstrate that PPS is an effective and promising PrPС inhibiting agent which in tested doses posses no side effects in vivo and can be used for the therapy and prophylaxis of prion infections.

Key words: rats, peripheral prion replicating organs, cellular prion, PrPС molecular forms, heparin, pentosan polysulfate.

Размещено на Allbest.ru